Məlumat

Niyə tam qan əvəzinə müəyyən ağ qan hüceyrələrindən DNT çıxarmaq?

Niyə tam qan əvəzinə müəyyən ağ qan hüceyrələrindən DNT çıxarmaq?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Laboratoriyamda insan DNT-si tam qan nümunələrindən çıxarılır.

Mən faktiki olaraq ekstraksiya etmirəm və xüsusi protokolla tanış deyiləm, lakin mən başa düşürəm ki, trombositlərin və qırmızı qan hüceyrələrinin nüvələri yoxdur və buna görə də DNT-si yoxdur, ona görə də hesab edirəm ki, nümunənin ağ qan hüceyrələrinin təcrid edilməsi prosesin bir hissəsidir. prosedur.

Mən həmçinin başa düşürəm ki, müxtəlif növ ağ qan hüceyrələrinin çox loblu nüvələri var, lakin bunun onlardan çıxarıla bilən DNT-yə necə təsir etdiyini bilmirəm.

Mən bu kimi bir neçə sənəd görmüşəm: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15113441, onların ağ qan hüceyrələrinin xüsusi növlərindən DNT çıxardıqlarını; Bu vəziyyətdə limfositlər. Bu sənədlər immunitet funksiyasına diqqət yetirməmək və ya hətta müraciət etmək deyil.

Niyə yalnız bir növ ağ qan hüceyrəsindən DNT çıxarmaq lazımdır?

Limfositlərin tərkibində digər ağ qan hüceyrələri ilə müqayisədə xəstənin genomunu daha çox təmsil edən DNT varmı?

Bəzi ağ qan hüceyrələrinin təcrid edilməsi digərlərindən daha asandır?

Bu, yalnız standart DNT-nin qandan çıxarılması prosedurudur, yoxsa tədqiqat məqsədlərinizdən asılı olaraq seçim etmək üçün bir neçə variant varmı?


Laboratoriyanın tam qan əvəzinə lenfositlərdən DNT almağı seçməsinin bir neçə səbəbi var. Tam qandan genomik DNT yaratmaq heç də ən yaxşı fikir deyil, çünki bütün artıq zülalları (əsasən qırmızı qan hüceyrələrindən olan hemoglobin) bir anda qurtarmaq lazımdır. Yalnız DNT olan hüceyrələri daxil etmək üçün girişinizi daraltmaqla, mövcud DNT-nin ümumi miqdarı ilə müqayisədə çıxarmaq üçün lazım olan zülalın miqdarını azaldarsınız.

Limfositlərə T hüceyrələri, B hüceyrələri və NK hüceyrələri daxildir və xüsusilə lazımi təcrübəyə və reagentlərə/avadanlığa malik laboratoriyada tez təmizlənmək nisbətən asandır. Onlar heç bir halda DNT-ni təmizləmək mümkün olan yeganə ağ qan hüceyrələri növü deyil - məsələn, periferik qanın mononükleer hüceyrələri (PBMCs) də istifadə edilə bilər. Onların tərkibində limfositlər, eləcə də monositlər, makrofaqlar, dendritik hüceyrələr və s. kimi digər hüceyrə növləri var. (Mənim təcrübəmə görə, onları tam qandan təmizləmək sadəcə limfositlərdən daha sadədir, çünki bu, mahiyyətcə bir neçə yuyulma ilə bir addımlı protokoldur. sonra.) Son nəticə eyni olsa da - limfalardan DNT PBMC-lərdən, qranulositlərdən və ya neytrofillərdən DNT ilə eyni olmalıdır.

Bədəndəki hər hansı bir somatik nüvəli hüceyrə ehtiva edir "nümayəndəsi" DNT, T və B hüceyrələri kimi bir neçə ixtisaslaşdırılmış hüceyrə növü istisna olmaqla, müvafiq olaraq T- və B-hüceyrə reseptorlarını meydana gətirmək üçün genomik quruluşa məruz qalır, fərdin bütün hüceyrələri eyni genomik DNT ardıcıllığını ehtiva edir. Xəstələrdən və klinik tədqiqat iştirakçılarından qan nisbətən asandır, buna görə də, məsələn, dəri yumruqları və ya ağız yaxmalarının əvəzinə tədqiqatlar üçün DNT mənbəyi olur.


Tam qan nümunələrindən genomik DNT-nin çıxarılması üsulları: cari perspektivlər

Xülasə: Dezoksiribonuklein turşusunun (DNT) çıxarılması ilkin olaraq 1869-cu ildə həyata keçirildiyi üçün əhəmiyyətli dərəcədə inkişaf etmişdir. Bu, molekulyar biologiya sahəsində istifadə olunan bir çox aşağı axın tətbiqləri üçün tələb olunan ilk addımdır. Tam qan nümunələri DNT əldə etmək üçün istifadə edilən əsas mənbələrdən biridir və belə nümunələrdə nuklein turşusu ekstraksiyasını həyata keçirmək üçün çoxlu müxtəlif protokollar mövcuddur. Bu üsullar çox sadə əl protokollarından avtomatlaşdırılmış DNT hasilatı protokollarına daxil olan daha mürəkkəb metodlara qədər dəyişir. Mövcud seçimlərin geniş spektrinə əsaslanaraq, sərfəli və vaxt səmərəliliyi baxımından ən yaxşı performans göstərənləri müəyyən etmək ideal olardı. Biz DNT ekstraksiya tarixini və tam qan nümunələrindən DNT çıxarılması üçün ən çox istifadə edilən üsulları nəzərdən keçirdik, onların fərdi üstünlüklərini və mənfi cəhətlərini vurğuladıq. Ən yaxşı mövcud seçimi müəyyən etmək üçün müxtəlif nuklein turşularının çıxarılması üsullarını müqayisə edən tədqiqatlar tapmaq üçün cari elmi ədəbiyyatı da axtardıq. Tədqiqatımız əsasında müəyyən etdik ki, tam qan nümunələrindən müəyyən bir DNT çıxarılması metodunu dəstəkləmək üçün kifayət qədər elmi dəlil yoxdur. Uyğun metodun seçilməsi hələ də bir çox müxtəlif amillərin nəzərə alınmasını tələb edən prosesdir və bütün dünyada obyektlərdə edilən seçimləri təsdiqləmək üçün daha çox araşdırma tələb olunur.

Açar sözlər: genomik DNT ekstraksiyası, tam qan nümunələri, məhlul əsaslı DNT ekstraksiyası, bərk fazalı DNT ekstraksiyası, xərc-effektivlik, vaxt səmərəliliyi

Molekulyar biologiya sahəsində insan sağlamlığı tədqiqatları dezoksiribonuklein turşusu (DNT), ribonuklein turşusu (RNT) və zülal nümunələrinin istifadəsini tələb edir. Mövcud aşağı axın proqramlarından müvəffəqiyyətlə istifadə yüksək miqdarda və yüksək keyfiyyətli DNT-nin istifadəsindən faydalanacaq. Buna görə də, nuklein turşusunun çıxarılması sonrakı molekulyar tədqiqat tətbiqlərini yerinə yetirmək üçün tələb olunan laboratoriya prosedurlarında əsas addımdır. Uyğun hasilat üsulunu seçmək vacibdir və mövcud variantları qiymətləndirərkən nəzərə alınmalı olan bir neçə məqam var. Bunlara texniki tələblər, vaxtın səmərəliliyi, iqtisadi səmərəlilik, həmçinin istifadə olunacaq bioloji nümunələr, onların toplanması və saxlanması tələbləri daxil ola bilər. 1

Tam qan genomik DNT (gDNA) əldə etmək üçün bir çox müxtəlif mövcud mənbələrdən biridir və bütün dünyada müəssisələrdə geniş şəkildə istifadə olunur. Buna görə də, biz tam qan nümunələrindən istifadə edərək DNT çıxarma protokollarına diqqət yetirəcəyik. İnsan tam qan nümunələrinin toplanması, saxlanması və əl ilə idarə edilməsi ilə bağlı məsələlər bu nəşrin əhatə dairəsindən kənarda qalır və əhatə olunmayacaq. Bununla belə, onlar vacibdir və nəzərə alınmalıdır, çünki seçilmiş hər hansı DNT hasilatı texnikasının performansına və uğuruna potensial təsir göstərə bilər.

DNT çıxarma üsullarının ilkin inkişafı

Fridrix Mişer hüceyrələrin kimyəvi tərkibini öyrənərkən DNT-ni təcrid edən ilk alim olub. 1869-cu ildə o, təzə cərrahi sarğılarda nümunələrdən topladığı leykositlərdən istifadə etdi və bu hüceyrələrdə olan zülalları təmizləmək və təsnif etmək üçün təcrübələr apardı. Təcrübələri zamanı o, nüvələrdə “nüklein” adlandırdığı yeni bir maddə müəyyən etdi. 2 Sonra o, hüceyrələrin nüvələrini sitoplazmadan ayırmaq və zülallardan və digər hüceyrə maddələrindən fərqlənən bu gün DNT kimi tanınan bu yeni birləşməni təcrid etmək üçün iki protokol hazırladı. Bu elmi tapıntı, istifadə edilən izolyasiya protokolları ilə birlikdə 1871-ci ildə onun mentoru Feliks Hoppe-Seyler ilə əməkdaşlıqda nəşr edilmişdir. 2,3 Bununla belə, yalnız 1958-ci ildə Meselson və Stahl 3,4 DNT hasilatı üçün adi laboratoriya prosedurunu inkişaf etdirdilər. Onlar bakteriya nümunələrindən DNT çıxarılmasını həyata keçirdilər Escherichia coli duz sıxlığı gradient sentrifuqa protokolundan istifadə etməklə. O vaxtdan bəri, DNT çıxarma üsulları bir çox müxtəlif növ bioloji mənbələrdə ekstraksiyaları yerinə yetirmək üçün uyğunlaşdırılmışdır.

DNT ekstraksiya üsulları hüceyrələrin effektiv pozulmasına, nukleoprotein komplekslərinin denaturasiyasına, nükleazların və digər fermentlərin inaktivasiyasına, bioloji və kimyəvi çirkləndiricilərin çıxarılmasına və nəhayət, DNT-nin çökməsinə nail olmaq məqsədi daşıyan bəzi ümumi prosedurlara əməl edir. 5 Onların əksəriyyəti oxşar əsas addımları izləyir və üzvi və qeyri-üzvi reagentlərin və sentrifuqa üsullarının istifadəsini əhatə edir. Nəhayət, onlar müxtəlif avtomatlaşdırılmış prosedurlara və kommersiya üçün mövcud dəstlərə çevrilmişlər. 1,5𔃅

Əvvəlcə, tam qan nümunələrindən DNT çıxarılması zamanı oxşar prosedurlar və/və ya reagentlər tələb edən hüceyrə lizisi, hüceyrə fermentlərinin inaktivasiyası, hüceyrə komplekslərinin denatürasiyası və DNT çöküntüsünə nail olmaq məqsədi daşıyan protokolları və addımları müzakirə edəcəyik. Bioloji və kimyəvi çirkləndiricilərin çıxarılmasına yönəlmiş addımlardakı əsas fərqlər hər bir protokolu ətraflı müzakirə etdiyimiz zaman vurğulanacaqdır.

Daha əvvəl qeyd edildiyi kimi, hüceyrələrin lizisi əksər DNT ekstraksiya protokollarında ümumi bir addımdır və bu, adətən yuyucu vasitələrdən və fermentlərdən istifadə etməklə əldə edilir. Natrium dodesil sulfat (SDS) və Triton's X-100 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABŞ) hüceyrə membranlarını həll etmək üçün istifadə edilən məşhur yuyucu vasitələrin nümunələridir. Fermentlər həmçinin hüceyrə səthini və ya sitozolik komponentləri hədəf almaq üçün yuyucu vasitələrlə birləşdirilir. Proteinaz K, qlikoproteinləri parçalamaq və RNaz və DNazları təsirsiz hala gətirmək üçün müxtəlif protokollarda istifadə edilən çox istifadə edilən bir fermentdir. Karbamid, guanidinium duzları və kimyəvi xaotroplar kimi digər denaturantlar da hüceyrələri pozmaq və hüceyrə fermentlərini təsirsiz hala gətirmək üçün istifadə edilmişdir, lakin bunlar keyfiyyət və nuklein turşusu məhsuldarlığına təsir göstərə bilər. 1,7𔃇

DNT çöküntüsü, DNT tərkibli məhlullara yüksək konsentrasiyalarda duz əlavə etməklə əldə edilir, çünki ammonium asetat kimi duzların kationları fosfat onurğasının mənfi yükünün yaratdığı itələmənin qarşısını alır. Etanol (son konsentrasiyalar 70'821180') və ya izopropanol (son konsentrasiyalar 40''821150') kimi həlledicilərin iştirakı ilə DNT və duzların qarışığı nuklein turşularının çökməsinə səbəb olur. Bəzi protokollara DNT-dən artıq duzu çıxarmaq üçün 70° etanol ilə yuyulma addımları daxildir. Nəhayət, nuklein turşuları suda və ya TE tamponunda (10 mM Tris, 1 mM etilendiamintetraasetik turşu [EDTA]) yenidən dayandırılır. 7𔃇 TE tamponu adətən uzunmüddətli DNT saxlanması üçün istifadə olunur, çünki o, onun nukleazlar, qeyri-adekvat pH, ağır metallar və sərbəst radikallar tərəfindən oksidləşməsi ilə zədələnməsinin qarşısını alır. Tris təhlükəsiz pH 7'yi təmin edir və EDTA nukleaz aktivliyində istifadə olunan ikivalent ionları xelatlaşdırır və ağır metalların oksidləşdirici zədələnməsinə qarşı çıxır. 9

İnsan tam qan nümunələrindən DNT çıxarılması üsullarının əsas növləri

Cədvəl 1 dünya üzrə tədqiqat müəssisələrində ümumiyyətlə istifadə olunan tam qan nümunələrindən DNT çıxarılması üsullarının əsas kateqoriyalarını və alt kateqoriyalarını göstərir. Nuklein turşusunun çıxarılması protokolunun hər bir mərhələsi üçün adətən istifadə olunan laboratoriya reagentləri, aralarındakı oxşarlıqları və fərqləri vurğulamaq üçün bu cədvələ daxil edilmişdir.

Cədvəl 1-ə daxil edilmiş DNT hasilatı üsulları, texnikanın tarixi və arxa planının qısa xülasəsi ilə yanaşı, sonrakı bölmələrdə daha ətraflı müzakirə olunacaq. Son illərdə bu protokolların bəziləri miniatürləşdirilmiş ümumi kimyəvi analiz sistemləri və ya mikrofluidik genetik analiz mikroçiplərini inkişaf etdirən mikro cihazlara uyğunlaşdırılmışdır. 7,10 Bununla belə, biz araşdırmamızın əhatə dairəsini makromiqyaslı nuklein turşusunun çıxarılması üçün mövcud olan üsullarla məhdudlaşdıracağıq.

Cədvəl 1 Ümumi qan nümunələrindən ekstraksiya üçün istifadə edilən DNT ekstraksiya üsulları
İxtisarlar: DNT, deoksiribonuklein turşusu N/A, tətbiq edilmir SDS, natrium dodesil sulfat.

Məhlul əsaslı DNT çıxarma üsulları

Daha əvvəl qeyd edildiyi kimi, məhlul əsaslı protokolların iki əsas yanaşması var: 1) üzvi həlledicilərdən istifadə edən məhlul əsaslı üsullar və 2) duzlama texnikasına əsaslananlar. Hər iki üsulun daha ətraflı təsviri aşağıda verilmişdir.

Üzvi həlledicilərdən istifadə edərək məhlul əsaslı DNT çıxarma üsulları

Orjinal olaraq bir sıra əlaqəli RNT çıxarma üsullarından əldə edilən üzvi həlledicilərdən istifadə edərək DNT hasilatı protokolları. Bu üsullarda istifadə edilən əsas addımlardan bəziləri bunlardır: 1) SDS və ya N-Lauroyl sarkozin daxil olmaqla yuyucu/xaotrop tərkibli məhlulun əlavə edilməsi ilə həyata keçirilən hüceyrə lizisi 2) DNazların və RNazların adətən üzvi həlledicilərin istifadəsi ilə inaktivasiyası 3) DNT-nin təmizlənməsi və RNT, lipidlərin və zülalların çıxarılması və 4) ekstraksiya edilmiş nuklein turşularının resuspenziyası. 1,5,11

Bu üsul ilk olaraq 1977-ci ildə plazmid DNT-ni təcrid etmək üçün Ullrich et al 12 tərəfindən guanidium isothiocyanate istifadə edərək RNT hasilatı texnikasından istifadə edildikdə hazırlanmışdır. Bu texnika daha sonra 1979-cu ildə Chirgwin və başqaları 13 tərəfindən dəyişdirilmişdir. Bu, guanidium tiosiyanatdan istifadəni və sezium xlorid yastığı vasitəsilə uzun saatlar ərzində ultrasentrifuqasiyanı tələb edirdi. Bu metodu təkmilləşdirmək üçün Chomczynski və Sacchi 14,15 1987-ci ildə guanidium tiosiyanat'fenol'xloroform və daha qısa sentrifuqadan istifadə edərək RNT çıxarılması üçün protokol hazırladılar. Bu son RNT ekstraksiya protokolu RNT, DNT və zülalları təcrid edə bildi, lakin DNT ekstraksiya üsulu kimi istifadə olunmaq üçün guanidium tiosiyanat fenol xloroform sonradan fenol, xloroform və izoamil spirtinin qarışığı ilə əvəz olundu. keçmiş həlledici RNaz fəaliyyətini tamamilə maneə törətməmişdir. 11 Fenol zülalları tez denatürasiya edən bir karbol turşusudur, lakin o, yüksək dərəcədə aşındırıcı, zəhərli və alışqandır. Bu üzvi həlledici adətən nümunəyə əlavə edilir və sonra mərkəzdənqaçma qüvvəsindən istifadə edərək ikifazalı emulsiya əldə edilir. Üst hidrofilik təbəqədə seyreltilmiş DNT, alt hidrofobik təbəqə isə üzvi həlledicilərdən, hüceyrə zibilindən, zülallardan və digər hidrofobik birləşmələrdən ibarətdir. DNT daha sonra sentrifuqadan sonra 2:1 və ya 1:1 nisbətində natrium asetat və etanol və ya izopropanol kimi yüksək konsentrasiyalarda duz əlavə edilərək çökdürülür. Həddindən artıq duz 70º etanol əlavə etməklə çıxarıla bilər və nümunə daha sonra steril distillə edilmiş suda və ya TE tamponunda (10 mM Tris 1 mM EDTA pH 8.0) yenidən dayandırıla bilən DNT qranulunu toplamaq üçün sentrifuqa edilir. 1,5

Bu üsullar zəhərli və aşındırıcı üzvi həlledicilərin istifadəsini nəzərdə tutduğundan, təhlükəsizlik əsas narahatlıq doğurur. Fərdi qoruyucu vasitələr, biotəhlükə başlıqının istifadəsini əhatə edən təhlükəsizlik tədbirləri və təlim tələb olunur. Fenolxloroformu adekvat pH-a tarazlaşdırmaq lazımdır və protokol şərtləri optimallaşdırılmalıdır. 7 Bu protokolların təhlükəsizliyini və istifadəsinin asanlığını artırmaq məqsədilə həlledicilərlə fiziki təmasın qarşısını almaq üçün müəyyən modifikasiyalar tətbiq edilmişdir. Bunlara silisium gel polimerinin 16 daxil edilməsi və ya həlledicilərin benzil spirti kimi digər maddələrlə əvəz edilməsi daxildir. 17

Tuzlama istifadə edərək məhlul əsaslı DNT hasilatı üsulları

Üzvi həlledicilərin istifadəsindən yayınan bəzi nuklein turşusu ekstraktı üsulları da illər ərzində işlənib hazırlanmışdır. 1,6,11 1988-ci ildə Miller və digərləri 18 yüksək duz konsentrasiyasında zülal çöküntüsü vasitəsilə DNT-nin təmizlənməsinə nail olan bir protokol dərc etdilər. Ənənəvi protokol SDS–proteinaz K ilə ilkin hüceyrənin pozulmasını və həzmini, daha sonra yüksək konsentrasiyalı duzların, adətən 6 M natrium xloridin əlavə edilməsini nəzərdə tutur. Qarışıq sonra zülalların dibinə çökməsinə imkan vermək üçün sentrifuqadan keçirilir, tərkibində DNT olan supernatant daha sonra yeni flakona köçürülür. DNT daha sonra üzvi həlledici üsulları üçün təsvir edildiyi kimi etanol və ya izopropanoldan istifadə edərək çökdürülür. 1,18󈞀

Bununla belə, proteinaz K-nin istifadəsi müxtəlif məhlul əsaslı yanaşmalarda istifadə olunan digər reagentlərlə müqayisədə vaxt aparan və bahalı ola bilər, buna görə də DNT-nin deproteinləşdirilməsi üçün alternativ reagentlər tapmaq üçün bir neçə cəhdlər olmuşdur. 21󈞄 1991-ci ildə Lahiri və Nurnberger 21 üzvi həlledicilərin istifadəsini və proteinaz K ilə uzun müddətli inkubasiyanı aradan qaldıran qan nümunələrindən DNT çıxarma protokolunu işləyib hazırladılar. Onların protokolunda Nonidet™ P-40 (NP-40 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABŞ) qan hüceyrələrini və yüksək duz tamponlarını və çirkləndiriciləri təsirsiz hala gətirmək və çıxarmaq üçün 10-37 SDS-ni parçalamaq üçün. Başqa bir protokol, 2005-ci ildə Nasiri və digərləri tərəfindən nəşr olunan dəyişdirilmiş duzlama üsuludur, 25, proteinaz K həzmini camaşırxana tozunun istifadəsi ilə əvəz etdi. Bu dəyişdirilmiş texnika, dünyanın bir çox müəssisələrində DNT çıxarma protokolu kimi uğurla istifadə edilmişdir. 26󈞎

Bərk fazalı DNT-nin çıxarılması üsulları

Maye/bərk faza yanaşmasından istifadə edərək DNT-nin təmizlənməsi 1979-cu ilə qədər izlənilə bilər, Vogelstein və Gillespie 35 əvvəllər agaroz gel elektroforezi ilə ayrılmış DNT fraqmentlərini təmizləmək üçün öz protokollarında şüşə toz şəklində silisiumdan istifadə etdikdə. Qan nümunələrindən DNT çıxarılması üçün bərk fazalı ekstraksiya üsulları ilk dəfə 1989-cu ildə DNT-nin təmizlənməsinə imkan vermək üçün zülallarla qarşılıqlı əlaqədə olan fenola kimyəvi cəhətdən oxşar, silisli əsaslı həll olunmayan hissəciklərdən istifadə edən bir texnika nəşr edən 36 yaşlı McCormick tərəfindən təsvir edilmişdir. O vaxtdan bəri maye/bərk DNT ekstraksiya yanaşmasından istifadə edən bir sıra müxtəlif prosedurlar işlənib hazırlanmışdır və kommersiyada mövcud olan ekstraksiya dəstlərinin əksəriyyətində istifadə olunur.

Bu üsullar aşağıdakı prinsiplərdən hər hansı biri vasitəsilə xüsusi pH və duz məzmunu şəraitində DNT-ni udacaq: 1) hidrofilik matrisə xaotrop agentin iştirakı ilə hidrogenin bağlanması, 2) sulu şəraitdə anion dəyişdiricidən istifadə edərək ion mübadiləsi və 3) yaxınlıq və ölçü istisna mexanizmləri. 5,7 Bu üsulların əksəriyyəti hüceyrənin pozulmasına, DNT adsorbsiyasına, nuklein turşusunun yuyulmasına və son elüsiyaya nail olmaq üçün bir sıra oxşar addımları izləyir. Əksər bərk faza üsulları mərkəzdənqaçma qüvvəsi altında nuklein turşusunu bağlamaq üçün spin sütunundan istifadə edir. Spin sütunları silisium matrislərindən, şüşə hissəciklərindən və ya tozdan, diatomlu torpaqdan və ya anion mübadiləsi daşıyıcılarından hazırlanır və bu birləşmələr ümumiyyətlə tələb olunan kimyəvi formaya çevirmək üçün müəyyən bir pH-da tampon məhlullarından istifadə etməklə şərtləndirilməlidir. Xüsusi lizis tamponlarından istifadə edərək əvvəllər parçalanmış qan hüceyrələri sütunlara tətbiq edilir və sentrifuqalanır və DNT bağlayıcı məhlulların təmin etdiyi pH və duz konsentrasiyası şərtlərinin köməyi ilə sütuna bağlanır. Bəzi zülallar və digər biokimyəvi birləşmələr də sütuna bağlana bilər və onlar daha sonra bir sıra yuma addımları zamanı rəqabətli maddələr olan yuyucu tamponlardan istifadə etməklə çıxarılır. DNT nəhayət steril distillə edilmiş suda və ya TE tamponunda yuyulur. 1,5,7

Silisium və silisium matrislərindən istifadə edərək DNT çıxarma üsulları

Silisium matrisləri DNT bağlaması üçün unikal xüsusiyyətlərə malikdir. Onlar müsbət yüklüdür və DNT onurğasının mənfi yükünə yüksək yaxınlığa malikdirlər. Yüksək duz şərtləri və pH, DNT-nin fosfat onurğasında mənfi yüklü oksigenlə sıx bağlanan natrium kationlarından istifadə etməklə əldə edilir. Çirkləndiricilər bir sıra yuma addımları ilə çıxarılır, ardınca TE tamponu və ya steril distillə edilmiş su istifadə edərək aşağı ion gücü (pH 𕟹) altında DNT elüsyonu aparılır. Silisium əsaslı yanaşmadan istifadə edən kommersiya dəstləri Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, ABŞ (NucleoSpin™) MO BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, ABŞ (UltraClean ® BloodSpin ®) tərəfindən istehsal olunur. ) QIAGEN Pty Ltd, Victoria, Avstraliya (QIAamp ® ), Promega Corporation, Fitchburg, WI, ABŞ (Wizard ® ) Epoch Life Science, Missouri City, TX, USA (EconoSpin ® ) və Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, ABŞ (GenElute™), digərləri arasında. Bu protokollarda qan nümunələri lizis tamponu ilə bir neçə dəqiqə inkubasiya edilir. Əksər protokolların tamamlanması təxminən 40 dəqiqədən 1 saata qədər vaxt aparır və minimum çirklənmə ilə yüksək DNT məhsulu verir. 1,5,7

Kieselgur, diatomit və ya diatomlu torpaq kimi tanınan yüksək miqdarda silisium (94-37-ə qədər) olan bir maddə də DNT-nin təmizlənməsi üçün istifadə edilmişdir. O, ilk olaraq 1990-cı ildə Boom et al 8 tərəfindən təsvir edilmişdir. O, xaotrop agentlərin iştirakı ilə DNT-ni bağlayır, ardınca spirt olan buferlə yuyulur və nəhayət, DNT az duzlu tamponda və ya steril distillə edilmiş suda yuyulur. Quantum Prep ® (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ABŞ) diatomlu torpaqdan istifadə edərək hazırlanmış DNT ekstraksiya məhsulunun nümunəsidir. 7

DNT ekstraksiya dəstləri də inkişaf etmişdir və onlar nümunə lizisindən BioRobot EZ1 ® Advanced (QIAGEN) və Biomek kimi polimeraza zəncirvari reaksiya (PCR) kimi bəzi aşağı axın tətbiqlərinə qədər protokolları yerinə yetirə bilən yarı və tam avtomatlaşdırılmış avadanlıqlara daxil edilmişdir. ® 4000 Laboratoriya Avtomatlaşdırma İş Stansiyası (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, ABŞ) və başqaları. Pipetləmə xətası riskinin az olması, nümunə köçürmələrinin sayının azaldılması və daha az protokol vaxtı bu cihazların üstünlükləri arasındadır. Bununla belə, bəzi mövcud avadanlıq seçimlərinin yüksək qiymətini nəzərə alaraq, onlar diqqətlə nəzərdən keçirilməlidir. Onlar həmçinin DNT-nin təmizlənməsinin ayrılması və aşkarlanmasının əldə edildiyi silikon mikroçiplər olan miniatürləşdirilmiş ümumi kimyəvi analiz sistemlərinə daxil edilmişdir. 7

Anion mübadiləsi qatranlarından istifadə edərək DNT-nin çıxarılması

Mənfi yüklü nuklein turşularına və ya çirkləndiricilərə və ya fermentlərə, məsələn, nukleazlara bağlana bilən müsbət yüklü kimyəvi maddələr anion mübadilə qatranları adlanır və onlar qan nümunələrindən DNT çıxarma protokollarının bir hissəsi kimi də istifadə edilmişdir. 9

Chelex ® 100 qatranı (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ABŞ) qoşalaşmış iminodiasetat ionlarını ehtiva edən stirol divinilbenzol kopolimerlərindən hazırlanmışdır. DNT ekstraksiya protokollarında məhkəmə nümunələrindən DNT ekstraksiyasında tez-tez istifadə olunan nukleazlar kimi polivalent metal ionlarını bağlayan xelatlaşdırıcı ion dəyişdirici qatran kimi istifadə olunur. Bioloji mənbə kimi qandan istifadə edən ilkin laboratoriya protokolu 1991-ci ildə Walsh et al 37 tərəfindən təsvir edilmişdir. Bu ilkin yanaşma əsasında tam qan nümunələrindən nuklein turşusunun çıxarılmasını həyata keçirmək üçün digər protokollar hazırlanmışdır. Onlar kiçik nümunə həcmləri (1 ml qandan az) tələb edir və adətən müxtəlif mərhələlər və reagentlərin iştirakı ilə tək boru reaksiyasında həyata keçirilir. Qan nümunələri proteinaz K və/yaxud yüksək temperaturda inkubasiya ilə parçalana bilər və çirkləndiricilərin çıxarılması onları çökdürən Chelex ® 100 qatranının əlavə edilməsi ilə əldə edilir. Tək zəncirli DNT əldə edilir və supernatantda dayandırılır, o, dərhal aşağı axın tətbiqində istifadə edilə bilər və ya uzunmüddətli saxlama üçün yeni flakona köçürülə bilər. 37󈞓

Seligson və digərləri 40 tam qan nümunələri də daxil olmaqla müxtəlif mənbələrdən nuklein turşusu nümunələrini təcrid etmək üçün ixtiralarının bir hissəsi kimi anion mübadiləsi materiallarından istifadə etdilər. Seligson və digərlərinin protokolu DNT onurğasının mənfi yüklü fosfatlarını bağlamaq üçün səthində müsbət yüklü dietilaminoetil selüloz qrupları olan qatran olan bir sütundan istifadə edir. DNT-nin sütuna bağlanmasının gücü, həmçinin RNT və digər çirklər bu nuklein turşusu təcrid protokolunda istifadə olunan tamponların duz konsentrasiyası və pH şərtləri vasitəsilə dəyişdirilə bilər. Zülal və RNT kimi çirkləndiricilər orta duz tamponlarından istifadə edərək DNT tərkibli sütundan yuyula bilər. 5,40

Maqnit muncuqlardan istifadə edərək DNT çıxarma üsulları

1990-cı illərin əvvəllərindən etibarən maqnit ayırma istifadə edərək nuklein turşusu hasilatı üsulları ortaya çıxdı. Onlar əvvəlcə 1994-cü ildə Hawkins və başqaları 41 və 2006-cı ildə tam qan nümunələrindən genomik DNT çıxarılması üçün çılpaq maqnit nanohissəciklərdən istifadə edərək protokol hazırlayan və təsdiqləyən Saiyed və başqaları 42,43 tərəfindən bakteriya hüceyrə lizatlarından plazmid DNT çıxarmaq üçün istifadə edilmişdir.

Maqnit hissəcikləri bir və ya bir neçə maqnit nüvədən hazırlanır, məsələn, maqnetit (Fe3O4) və ya maqhemit (qamma Fe2O3), polimerlər, silisium oksidi və ya terminal funksional qrupları olan hidroksiapatit matrisi ilə örtülmüşdür. Saiyed və digərləri tərəfindən hazırlanmış protokolda 42,43 30 μL tam qan bərabər həcmdə 1% (çəki/həcm [w/v]) SDS məhlulu ilə qarışdırılır. Boru iki və ya üç dəfə inversiya ilə qarışdırılır və otaq temperaturunda 1 dəqiqə inkubasiya edilir. Bu qarışığa on mikrolitr maqnit nanohissəcikləri əlavə edilir, ardınca 75 μL bağlayıcı tampon (1,25 M natrium xlorid və 10 % polietilen qlikol 6000) əlavə edilir. Məhlul inversiya yolu ilə qarışdırılır və otaq temperaturunda 3 dəqiqə dincəlməyə icazə verilir və maqnit qranulları supernatantı atmaq üçün xarici maqnitdən istifadə edərək hərəkətsizləşdirilir. Maqnit qranul 70° etanol ilə yuyulur və qurudulur. Maqnit qranul 50 º956L TE tamponunda yenidən dayandırılır və DNT-yə bağlanmış maqnit hissəcikləri davamlı çalkalama ilə 65ºC-də inkubasiya yolu ilə yuyulur. 42,43

Müvafiq protokolun seçilməsi

İdeal ekstraksiya üsulu aşağıdakı meyarlara uyğun olmalıdır: o, həssas, ardıcıl, sürətli və istifadəsi asan olmalıdır və istifadə olunduğu ölkədən asılı olaraq, xüsusi avadanlıq və ya biokimyəvi bilikləri minimuma endirmək vacib ola bilər. O, həmçinin istifadəçilər üçün minimum risk yaratmalı, eləcə də nümunələrin mümkün çarpaz çirklənməsinin qarşısını almalıdır. Nəhayət, və ən əsası, seçilmiş DNT hasilatı texnikası aşağı axın molekulyar tətbiqlərdə istifadə olunmağa hazır olan təmiz DNT nümunələrini çatdıra bilməlidir. 7,8,44

Qan nümunələrindən çıxarılan genomik DNT-nin keyfiyyəti və kəmiyyəti əksər müəssisələr protokol seçərkən nəzərə aldıqları əsas xüsusiyyətdir. Müxtəlif dalğa uzunluqlarında (230 nm, 240 nm, 260 nm və 280 nm) spektrofotometriyadan istifadə edərək ultrabənövşəyi işığın udulmasının ölçülməsi nuklein turşusu nümunələrinin saflığını və konsentrasiyasını təyin etmək üçün ilkin sürətli və səmərəli üsuldur. Konsentrasiya adətən Beer's Lambert qanunundan istifadə edərək 260 nm-də DNT absorbsiyasının oxunmasından hesablanır. Nuklein turşusu nümunələrinin təmizliyi 260/280 udma nisbətində qiymətləndirilir və 1.8𔃀.0 diapazonunda olan dəyərlər ümumiyyətlə məqbul hesab olunur. 2.0 və 2.2 arasında olan 260/230 absorbans nisbətləri də DNT üçün ikinci dərəcəli təmizlik ölçüsü kimi adekvat hesab olunur. 11,45󈞛

Lahiri və digərləri 44 1991-ci ildə bir araşdırma dərc etdilər, burada mənbə kimi tam qandan istifadə edərək DNT çıxarılması üçün on məhlul əsaslı ekstraksiya üsulunu müqayisə etdilər. Onlar daha əvvəl öz qrupları tərəfindən hazırlanmış protokolu (metod 10a və 10b), 21 üzvi həlledicilərdən və ya fermentlərin həzmindən istifadəni tələb etmir, əvvəllər nəşr olunmuş və qandan DNT çıxarılması üçün istifadə edilən doqquz digər üsulla müqayisə etdilər. Tədqiqatlarında Lahiri və digərləri 44 yuxarıda qeyd olunan üsullardan istifadə edərək beş nəfərdən tam qan nümunələrini üç nüsxədə çıxardılar. Onlar 260 nm-də spektrofotometriya udma oxunuşundan istifadə edərək nümunələrdən DNT konsentrasiyasını təyin etdilər və keyfiyyəti 260/280 udma nisbəti və agaroza gel üzərində elektroforez, həmçinin ferment həzminin məhdudlaşdırılması və cənub ləkəsi vasitəsilə qiymətləndirdilər. Bəzi protokol xüsusiyyətlərinin xülasəsi, həmçinin tapıntılar Cədvəl 2-də təqdim olunur.

Cədvəl 2 Lahiri və digərləri tərəfindən DNT çıxarılması üsullarının müqayisəli tədqiqinin xülasəsi 44
İxtisarlar: DNT, deoksiribonuklein turşusu RNTaz, ribonuklein turşusu.

Test edilmiş bütün protokollar DNT-ni nisbətən yaxşı təmizliklə (1.7-dən 1.94-ə qədər 260/280 nisbəti) təcrid edə bildi, lakin 2, 5 və 6-cı üsullarla əldə edilən DNT gel elektroforezində sübut olunmuş müxtəlif miqdarda deqradasiya göstərdi. Test edilmiş protokollardan yeddisi, üsul 3, üzvi həlledicilərin və/yaxud fenolxloroform və ya xloroform kimi təhlükəli maddələrin istifadəsini tələb edir. 1 və 2-ci üsullar üzvi birləşmələrdən istifadə etməyib, lakin 1-ci üsul ən çox vaxt aparan üsuldur. Bu, proteinaza K ilə bir gecədə inkubasiya tələb etdi, bu problem protokol 2-də həm proteinaza K, həm də RNase A ilə nümunələri 30 dəqiqə inkubasiya etməklə həll edildi, DNT ekstraksiya müddətini 5 saata qədər azaldıb. Metod 10 (versiya a və b) bütün DNT təcrid üsulları arasında ən sürətli idi (1 saat) və fermentin həzmini və üzvi həlledicilərin/təhlükəli maddələrin istifadəsini aradan qaldırdı. Bu protokolun hər iki versiyası təxminən 260/280 nisbəti ilə digər sınaqdan keçirilmiş protokollara nisbətən oxşar və ya daha yüksək DNT məhsuldarlığını bərpa edə bildi. Tədqiqatın nəticələrinə əsasən, Lahiri və digərləri 44 belə nəticəyə gələ bildilər ki, onların inkişaf etdirdiyi DNT çıxarma üsulu sınaqdan keçirilmiş məhlul əsaslı metodların ən sürətli və ən təhlükəsizi olub, müqayisə oluna bilən keyfiyyət və kəmiyyət DNT-ni bərpa edir.

Abd El-Aal və digərləri 48 tam qan nümunələrindən DNT çıxarılması üçün əl ilə və avtomatlaşdırılmış ekstraksiya üsullarının birləşməsini müqayisə etdilər. Onların tədqiqatına altı üsul daxil idi: fenolxloroformun təmizlənməsi, mikrodalğalı termal şokdan istifadə edərək DNT ekstraksiyası, Wizard Genomik DNT Təmizləmə Kiti (Promega Korporasiyası) ilə DNT çıxarılması, maqnit ayırma (LC MagNA Pure Compact Instrument Roche Diagnostics GmbH, Manheim, Almaniya) Biotek Instruments şirkətinin (Vermont, ABŞ) Precision™ XS Microplate Sample prosessorundan istifadə etməklə qismən avtomatlaşdırıldı və nəhayət, onlar MagNA Pure təmizləmə metodundan istifadə edərək maqnit ayırma ilə birləşdirərək Wizard SV 96 Genomik DNT Təmizləmə Kitini (Promega Korporasiyası) dəyişdirdilər. Onlar 96 qan nümunəsi çıxardılar və ilkin həcm olaraq 100 μ L istifadə etdilər. Bununla belə, onlar hər bir üsuldan istifadə etməklə neçə nümunənin çıxarıldığını və həyata keçirilən eksperimental təkrarların sayını qeyd edə bilmədilər. Onların nəticələri 0,50 μg/μL ilə 0,98 μg/μL arasında dəyişən yekun konsentrasiyalarla hər bir protokol üçün çıxarılan DNT-ni göstərdi. Fenolxloroform, əl ilə maqnit ayırma və birləşdirilmiş Promega'MagNA Pure üsulu nisbətən oxşar DNT konsentrasiyaları göstərsə də (0,72''956g/'956L), maqnit ayırma və mikrodalğada soba texnikası ən yüksək və ən aşağı DNT konsentrasiyalarına nail oldu. 0,98 μg/μL və 0,50 μg/μL. Müqayisələrində onlar hasilatın sadəliyi üçün beş kateqoriya müəyyən etdilər: son dərəcə sadə, sadə, daha az sadə, daha sadə və çətin, lakin onların sistemi hər bir kateqoriya üçün istifadə olunan meyarları təqdim edə bilmədiyi üçün çaşqınlıq yarada bilər. Bununla belə, onlar fenolxloroformu daha əvvəl qeyd olunan kateqoriya sistemindən istifadə edərək çətin və avtomatlaşdırılmış MagNA Pure kimi son dərəcə sadə kateqoriyalara ayırdılar. Onlar həmçinin hər bir protokolun dəyərinə görə beş kateqoriyaya malikdirlər, avtomatlaşdırılmış MagNA Pure texnikası ən bahalı, mikrodalğalı soba isə ən ucuz üsuldur. Onların maya dəyəri kateqoriyaları da müəyyən edilməmişdir və onların öyrənilməsində hər bir metod üçün konkret xərclər haqqında faktiki qeyd yoxdur. Daha əvvəl qeyd olunan tapıntılara əsaslanaraq, onlar ən yüksək qiymətə malik olmasına baxmayaraq, avtomatlaşdırılmış protokoldan istifadə edərək maqnit ayırmanın çıxarılmasının sadəliyi, çıxarılan DNT-nin saflığı və sürət baxımından ən yaxşı nəticə verdiyi qənaətinə gəldilər. Onlar həmçinin belə qənaətə gəldilər ki, seçilmiş hər hansı metodu optimallaşdırmaq vacibdir və onlar maqnit ayırmanın istifadəsini tövsiyə ediblər, çünki bu, minimal başlanğıc material tələb edir və həm sərfəli, həm də istifadəçi üçün əlverişlidir. Bununla belə, əvvəllər qeyd edildiyi kimi, xərc-effektivliyin necə müəyyən edildiyi barədə heç bir məlumat yoxdur. 48

Lee və digərləri 49 üç avtomatlaşdırılmış ekstraksiya sistemindən istifadə edərək 22 tam qan nümunəsindən DNT çıxardılar. Müqayisə edilmiş hər üç protokol bərk fazalı ekstraksiya üsullarına əsaslanırdı: QIAamp ® Qan Mini Kiti (QIAGEN, Hilden, Almaniya) QIAcube ® ilə, DNT-ni bağlamaq üçün spin kolonunun içərisində silisium membran və qatranlardan istifadə edir və iki maqnit əsaslı DNT təcrid üsullarına əsaslanan digər protokollar MagNA Pure LC ilə MagNA Saf LC Nuklein Turşusu İzolyasiya Kiti I (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Almaniya) və Magtration-Magnazorb DNT Common Kit-200N Magtration Science System 12GC (P) ilə Co, Ltd, Tokio, Yaponiya). DNT konsentrasiyası spektrofotometriya ilə ölçüldü və təmizlik 260/280 nisbəti, agaroz gel üzərində DNT elektroforezi və PCR ilə qiymətləndirildi. Tədqiqatın nəticələrini təsdiqləmək üçün statistik təhlil aparılmışdır və onlar Cədvəl 3-də ümumiləşdirilmişdir.

Cədvəl 3 Lee və başqalarının DNT çıxarma üsulları üzrə müqayisəli tədqiqatının nəticələrinin xülasəsi 49
İxtisarlar: DNT, dezoksiribonuklein turşusu min, minimum maks, maksimum SD, standart sapma.

Results showed no statistical difference between DNA concentrations obtained among the three commercial methods, but DNA purity was slightly lower for the Magtration-Magnazorb DNA Common Kit-200N when compared with the other two methods. DNA extracted was of similar quality based on results from PCR and electrophoresis on agarose gel. Therefore, they concluded that effectiveness for all systems was equivalent and that they all produced acceptable nucleic acid isolation. 49

Table 4 was adapted from a review published by Carpi et al 1 in 2011, where they reviewed DNA extraction methods used in a wide range of biological sources, including six methods used on whole blood samples. A summary of the three evaluated features for nucleic acid isolation methods, such as use of toxic compounds, cost per sample, and time required, is shown in Table 4.

Table 4 Summary of features evaluated for deoxyribonucleic acid (DNA) extraction methods reviewed by Carpi et al 1

Based on the methods included in Table 4, it can be noted that the magnetic bead-based method is the quickest DNA extraction protocol, requiring over 30 minutes to be performed, whereas all the other protocols require more than 3 hours. Also, the magnetic bead-based method is the most expensive one, costing more than ŭ per sample extracted. However, there is no mention in this review of the differences when comparing quality and quantity of nucleic acid isolated for each method. 1

Chacon-Cortes et al 50 evaluated cost-effectiveness and time efficiency of three available DNA extraction techniques from whole blood samples: a traditional salting out method, a modified salting out method, and a commercially available kit based on a solid-phase DNA extraction method QIAamp ® DNA blood maxi kits (QIAGEN ® Pty Ltd, Clifton Hill, VIC, Australia). The modified salting out protocol 25 replaced the sample overnight incubation step from the traditional salting out method, 18 required for contaminant removal using proteinase K, with the use of laundry detergent to reduce time of extraction to about 1 hour. Five microliters of whole blood from six breast cancer patients was manually extracted using each protocol, and techniques were compared in terms of quality and quantity of DNA extracted, as well as cost and time required. DNA quantity was measured using spectrophotometry, and DNA quality was assessed by both 260/280 ratio and agarose gel electrophoresis of PCR product. A summary of findings is presented in Table 5. 50

Table 5 Summary of results from comparative study of DNA extraction methods by Chacon-Cortes et al 50
Abbreviations: AUD, Australian dollars gDNA, genomic deoxyribonucleic acid.

As shown in Table 5, QIAGEN QIAamp DNA Blood Maxi Kits produced the highest yield and 260/280 ratio from all methods evaluated, with an average measure of 61.86 μg and 2.02, respectively, but traditional and modified salting out protocols both produced similar results in terms of DNA yield and 260/280 ratios. However, statistical analysis using analysis of variance showed that DNA yield and 260/280 ratio results were not significantly different for all three methods (P-value of 0.110 and 0.05, respectively). On the other hand, the traditional salting out method required an overnight incubation step, and the QIAGEN QIAamp DNA Blood Maxi Kit was the most expensive of all the methods included, costing about 12.30 Australian dollars, almost seven times the modified salting out protocol. Therefore, based on these findings, the modified salting out protocol developed by Nasiri et al 25 proved to be the most cost-effective and time-efficient technique to isolate gDNA from whole blood samples. 50 Unfortunately, no other solid-phase extraction methods for DNA extraction were included in this study.

DNA extraction has evolved for the past 145 years and has developed into a diversity of laboratory techniques. This review highlights the currently available methods for DNA extraction from whole blood samples, and it summarizes comparison studies using different nucleic acid extraction approaches published to date. DNA extraction has evolved from solution and solid-phase manual techniques initially performed manually into incorporating these into automated methods. There is no consensus on a gold standard method for DNA extraction from whole blood samples, and they all differ in many different aspects. Studies comparing extraction techniques and highlighting their strengths and weaknesses are limited, and to our knowledge there is no publication that evaluates all approaches in terms of all possible features. Therefore, it is very difficult to determine the best choice available. Facilities around the world usually choose a method based on the availability of equipment, samples, and reagents, as well as considering speed, extraction efficiency and quality, technical requirements, and cost, but based on our review findings there is not enough scientific evidence to support these choices.

The authors of this publication certify that there are no conflicts of interest with any financial or scientific organization regarding the material discussed in the manuscript.

Carpi FM, Di Pietro F, Vincenzetti S, Mignini F, Napolioni V. Human DNA extraction methods: patents and applications. Recent Pat DNA Gene Seq. 20115(1):1𔃅.

Dahm R. Friedrich Miescher and the discovery of DNA. Dev Biol. 2005278(2):274�.

Holmes FL. Meselson, Stahl, and the Replication of DNA: A History of the Most Beautiful Experiment in Biology. New Haven, CT: Yale University Press 2001.

Meselson M, Stahl FW. The replication of DNA in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 195844(7):671�.

Tan SC, Yiap BC. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 20092009:574398.

Greene JJ, Rao VB, editors. Recombinant DNA Principles and Methodologies. 1-ci nəşr. New York: Marcel Dekker, Inc. 1998.

Price CW, Leslie DC, Landers JP. Nucleic acid extraction techniques and application to the microchip. Lab Chip. 20099(17):2484�.

Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 199028(3):495�.

Herzer S. DNA purification. Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide. New York: John Wiley & Sons, Inc. 2001:167�.

Duarte GR, Price CW, Littlewood JL, et al. Characterization of dynamic solid phase DNA extraction from blood with magnetically controlled silica beads. Analitik. 2010135(3):531�.

Sambrook J, Russell DW. Molekulyar Klonlaşdırma: Laboratoriya Təlimatı. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001.

Ullrich A, Shine J, Chirgwin J, et al. Rat insulin genes: construction of plasmids containing the coding sequences. Elm. 1977196(4296):1313�.

Chirgwin JM, Przybyla AE, MacDonald RJ, Rutter WJ. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biokimya. 197918(24):5294�.

Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 1987162(1):156�.

Chomczynski P, Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 20061(2):581�.

Thomas S, Tilzer L, Moreno R, Inventors. Use of silica gel for DNA extraction with organic solvents. US patent US 5175271. December 29, 1992.

Ness JV, Cimler BM, Rich B, Meyer J, Vermeulen NMJ, Inventors. Non toxic compositions and methods useful for the extraction of nucleic acids. US patent US 5393672. February 28, 1995.

Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nuklein turşuları Res. 198816(3):1215.

Greene F, Balch C, Haller D, Morrow M. AJCC Cancer Staging Manual. 6th Ed. New York: Springer 2002.

Grimberg J, Nawoschik S, Belluscio L, McKee R, Turck A, Eisenberg A. A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood. Nuklein turşuları Res. 198917(20):8390.

Lahiri DK, Nurnberger JI Jr. A rapid non-enzymatic method for the preparation of HMW DNA from blood for RFLP studies. Nuklein turşuları Res. 199119(19):5444.

Bahl A, Pfenninger M. A rapid method of DNA isolation using laundry detergent. Nuklein turşuları Res. 199624(8):1587�.

Drabek J, Petrek M. A sugar, laundry detergent, and salt method for extraction of deoxyribonucleic acid from blood. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Çexiya Respublikası. 2002146(2):37󈞓.

Gaaib JN, Nassief AF, Al-Assi AH. Simple salting-out method for genomic DNA extraction from whole blood. Tikrit Journal of Pure Science. 201116(2):9󈝷.

Nasiri H, Forouzandeh M, Rasaee MJ, Rahbarizadeh F. Modified salting-out method: high-yield, high-quality genomic DNA extraction from whole blood using laundry detergent. J Clin Lab Anal. 200519(6):229�.

Arévalo-Herrera M, Soto L, Perlaza BL, et al. Antibody-mediated and cellular immune responses induced in naive volunteers by vaccination with long synthetic peptides derived from the plasmodium vivax circumsporozoite protein. Am J Trop Med Hyg. 201184(Suppl 2):35󈞖.

Garcia-Sepulveda C, Carrillo-Acuña E, Guerra-Palomares S, Barriga-Moreno M. Maxiprep genomic DNA extractions for molecular epidemiology studies and biorepositories. Mol Biol Rep. 201037(4):1883�.

Iri-Sofla FJ, Rahbarizadeh F, Ahmadvand D, Rasaee MJ. Nanobody-based chimeric receptor gene integration in Jurkat cells mediated by PhiC31 integrase. Exp Cell Res. 2011317(18):2630�.

Liu B, Zhang Y, Jin M, et al. Association of selected polymorphisms of CCND1, p21, and caspase8 with colorectal cancer risk. Mol Carcinog. 201049(1):75󈟀.

Liu H, Jiang X, Zhang M-W, et al. Association of CASP9, CASP10 gene polymorphisms and tea drinking with colorectal cancer risk in the Han Chinese population. J Zhejiang Univ Sci B. 201314(1):47󈞥.

Trejo-de la OA, Torres J, Pérez-Rodríguez M, et al. TLR4 single-nucleotide polymorphisms alter mucosal cytokine and chemokine patterns in Mexican patients with Helicobacter pylori-associated gastroduodenal diseases. Clin Immunol. 2008129(2):333�.

Wu Y, Jin M, Liu B, et al. The association of XPC polymorphisms and tea drinking with colorectal cancer risk in a Chinese population. Mol Carcinog. 201150(3):189�.

Zhang Y, Jin M, Liu B, et al. Association between H-RAS T81C genetic polymorphism and gastrointestinal cancer risk: a population based case-control study in China. BMC Cancer. 20088:256.

Zhang Y, Liu B, Jin M, et al. Genetic polymorphisms of transforming growth factor-⓵ and its receptors and colorectal cancer susceptibility: A population-based case-control study in China. Cancer Letters. 2009275(1):102�.

Vogelstein B, Gillespie D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc Natl Acad Sci U S A. 197976(2):615�.

McCormick RM. A solid-phase extraction procedure for DNA purification. Anal Biochem. 1989181(1):66󈞶.

Walsh PS, Metzger DA, Higuchi R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotexnika. 199110(4):506�.

DNA Analyst Training-Laboratory Training Manual Protocol 3.05 Chelex ® 100 Non Differential Extraction. National Forensic Science Technology Center 2006.

Butler JM. DNA Extraction from Forensic Samples Using Chelex. Cold Spring Harbor Protocols. 20094(6).

Seligson DB, Shrawder EJ, Inventors Syngene, Inc, assignee. Method of isolating and purifying nucleic acids from biological samples. US patent 4,935,342. June 19, 1990.

Hawkins TL, O’Connor-Morin T, Roy A, Santillan C. DNA purification and isolation using a solid-phase. Nuklein turşuları Res. 199422(21):4543�.

Saiyed ZM, Bochiwal C, Gorasia H, Telang SD, Ramchand CN. Application of magnetic particles (Fe3O4) for isolation of genomic DNA from mammalian cells. Anal Biochem. 2006356(2):306�.

Saiyed ZM, Ramchand CN, Telang SD. Isolation of genomic DNA using magnetic nanoparticles as a solid-phase support. J Phys Condens Matter. 200820(20):204153.

Lahiri DK, Bye S, Nurnberger JI Jr, Hodes ME, Crisp M. A non-organic and non-enzymatic extraction method gives higher yields of genomic DNA from whole-blood samples than do nine other methods tested. J Biochem Biophys Methods. 199225(4):193�.

Huberman JA. Importance of measuring nucleic acid absorbance at 240 nm as well as at 260 and 280 nm. Biotexnika. 199518(4):636.

Troutman T, Prasauckas KA, Kennedy MA, Stevens J, Davies MG, Dadd AT. How to properly use and maintain laboratory equipment. Molecular Biology Problem Solver: New York: John Wiley & Sons, Inc. 2002:49�.

Sahota A, Brooks AI, Tischfield JA. Preparing DNA from Mammalian sources for genotyping. CSH Protoc. 20072007:pdb.top19.

Abd El-Aal AA, Abd Elghany NA, Mohamadin AM, El-Badry AA. Comparative study of five methods for DNA extraction from whole blood samples. International Journal of Health Science. 2010III(1):285�.

Lee J-H, Park Y, Choi JR, Lee EK, Kim H-S. Comparisons of three automated systems for genomic DNA extraction in a clinical diagnostic laboratory. Yonsei Med J. 201051(1):104�.

Chacon-Cortes D, Haupt L, Lea R, Griffiths L. Comparison of genomic DNA extraction techniques from whole blood samples: a time, cost and quality evaluation study. Mol Biol Rep. 201239:5961�.

/>This work is published and licensed by Dove Medical Press Limited. The full terms of this license are available at https://www.dovepress.com/terms.php and incorporate the Creative Commons Attribution - Non Commercial (unported, v3.0) License. By accessing the work you hereby accept the Terms. Non-commercial uses of the work are permitted without any further permission from Dove Medical Press Limited, provided the work is properly attributed. For permission for commercial use of this work, please see paragraphs 4.2 and 5 of our Terms.

© Copyright 2021 &öküz Dove Press Ltd &bull software development by maffey.com &bull Web Design by Adhesion

The opinions expressed in all articles published here are those of the specific author(s), and do not necessarily reflect the views of Dove Medical Press Ltd or any of its employees.

Dove Medical Press is part of Taylor & Francis Group, the Academic Publishing Division of Informa PLC
Copyright 2017 Informa PLC. Bütün hüquqlar qorunur. This site is owned and operated by Informa PLC ( “Informa”) whose registered office is 5 Howick Place, London SW1P 1WG. Registered in England and Wales. Number 3099067. UK VAT Group: GB 365 4626 36

In order to provide our website visitors and registered users with a service tailored to their individual preferences we use cookies to analyse visitor traffic and personalise content. You can learn about our use of cookies by reading our Privacy Policy. We also retain data in relation to our visitors and registered users for internal purposes and for sharing information with our business partners. You can learn about what data of yours we retain, how it is processed, who it is shared with and your right to have your data deleted by reading our Privacy Policy.

If you agree to our use of cookies and the contents of our Privacy Policy please click 'accept'.


A universal, rapid, and inexpensive method for genomic DNA isolation from the whole blood of mammals and birds

There is no ‘one’ procedure for extracting DNA from the whole blood of both mammals and birds, since each species has a unique property that require different methods to release its own DNA. Therefore, to obtain genomic DNA, a universal, rapid, and noncostly method was developed. A very simple biological basis is followed in this procedure, in which, when the blood is placed in water, it rapidly enters the RBCs by osmosis and causes cells to burst by hemolysis. The validity of extracting genomic DNA was confirmed by several molecular biological experiments. It was found that this method provides an efficient and versatile alternative for extracting bulk amounts of highly-qualified DNA from the blood of a wide range of species. This is the first manuscript that describes use of distilled water as the only eliminator of RBCs among all other known DNA extraction techniques.

Bu, abunə məzmununun, qurumunuz vasitəsilə girişin önizləməsidir.


Step 3: Some Protease.

Now that we've busted open the cells, they've spilled their guts all over the place in our saliva solution. in this step we try and get rid of as much of the protein part of those guts as we can.

A protease is a type of enzyme that can break down other enzymes. Meat tenderizer, pineapple juice, and soft contact lens cleaning solution all contain (different) proteases. A tiny bit of any of those should reduce the amount of protein that precipitates out with our DNA later on.


Option 1: Most Realistic Looking Blood Model

5A. To make a model that looks a bit more like blood than the below two models,

  • pour 1/2 cup of corn syrup into a clear plastic cup (or use a jar with a lid if you want the children to keep it). This will be the plasma.
  • Add a scant 1/2 cup of red Fruit Loops for the red blood cells. If you are doing this for a large group, you could instead use Cheerios dyed red.
  • Add 1 cotton ball for the white blood cell.
  • Add a sprinkle of Fruit Loop crumbs for the platelets.

YOU WILL NEED PER CHILD: 1 clear plastic cup or jar, 1 plastic spoon, 1/2 cup of corn syrup,scant 1/2 cup of red Fruit Loops or Cheerios dyed red, 1 cotton ball, and a sprinkle of Fruit Loop or Cheerio crumbs


The extraction of DNA is pivotal to biotechnology. It is the starting point for numerous applications, ranging from fundamental research to routine diagnostic and therapeutic decision-making. Extraction and purification are also essential to determining the unique characteristics of DNA, including its size, shape and function.

DNA was first isolated by the Swiss physician, Friedrich Miescher, in 1869 while working in the laboratory of the biochemist Felix Hoppe-Seyler. This he did as part of a project to determine the chemical composition of cells which he saw as the means to unravelling the fundamental principles of the life of cells. Initially, he began this research by using lymphocytes drawn from lymph nodes but was unable to get sufficient quantities for analysis so switched to using leucocytes, white blood cells, which he gathered from pus found on fresh surgical bandages collected from a nearby surgical clinic. In the course of his work on leucocytes he noticed the precipitation of a substance when acid was added and that this dissolved following the addition of alkali. Mierscher decided to call the new substance 'nuclein' by virtue of its presence in the nuclei of the cell. Upon further analysis, Miescher noted that the chemical composition of the substance differed from proteins and other known molecules. He speculated that it played a central role in cells and was involved in the division of cells. Following this, Miescher developed a method for isolating nuclein from salmon sperm. Many advances have been made to the methods for extracting and purifying DNA since Miescher's time. From the 1950s routine laboratory extraction of DNA became reliant on the use of density gradient centrifuges. Until very recently most methods for extracting DNA remained complex, labour-intensive and time-consuming. They also provided only small quantities of DNA. Today there are many specialised extraction methods. These are generally either solution-based or column-based. The extraction of DNA has become much easier with the emergence of commercial kits and the automation of the process. Such changes have both sped up production and increased the yield of DNA.


Monocytes can be further separated from lymphocytes using density gradient centrifugation because they are less dense and slightly larger. In other words, monocytes are faster to float during centrifugation in a density gradient than lymphocytes. This separation can be done with either the combination of two different density layers 3 or one layer 4 . Following centrifugation, the monocytes should be found in a layer above the leukocytes and any other components of the whole blood that was included.

A few tips for isolating mononuclear cells:

  1. Avoid too much vortexing. This may activate or kill the cells.
  2. There may be residual RBCs following centrifugation. Use hypotonic lysis to remove these RBCs.

1. DNT nümunəsi alın

DNT ağ qan hüceyrələri, sperma, saç kökləri və bədən toxuması da daxil olmaqla bədənin əksər hüceyrələrində olur. DNT izləri tüpürcək və tər kimi bədən mayelərində də aşkar edilə bilər, çünki onların tərkibində epitel hüceyrələri də var. Məhkəmə ekspertləri və polis əməkdaşları cinayət yerindən DNT nümunələri toplayırlar. DNT də ağız tamponu (daxili yanaq hüceyrələrini toplayan) istifadə edərək birbaşa insandan toplana bilər. Cinayət yeri sübutları məqaləsində daha çox məlumat əldə edin.

2. DNT-ni çıxarın

DNT hüceyrələrin nüvəsində yerləşir. Hüceyrələri açmaq, DNT-ni çıxarmaq və onu digər hüceyrə komponentlərindən təcrid etmək üçün kimyəvi maddələr əlavə edilir.

3. DNT-ni kopyalayın

Çox vaxt məhkəmə analizi üçün yalnız kiçik miqdarda DNT mövcuddur, buna görə də profil yaratmaq üçün kifayət qədər DNT əldə etmək üçün hər bir genetik lokusdakı STR-lər polimeraza zəncirvari reaksiyadan (PZR) istifadə edərək dəfələrlə kopyalanır. Məqalədə daha çox öyrənin PCR nədir?

Kopyalanan STR-lərə flüoresan etiket əlavə edən xüsusi primerlər PCR zamanı istifadə olunur.

4. STR-lərin ölçüsünü müəyyən edin

Hər bir genetik lokusda STR-lərin ölçüsü genetik analizatordan istifadə etməklə müəyyən edilir. Genetik analizator kopyalanmış DNT-ni gel elektroforezi ilə ayırır və hər bir STR-də flüoresan boyanı aşkar edə bilir. Bu, laboratoriyada DNT sıralaması üçün istifadə edilən eyni avadanlıqdır.

5. Uyğunluq varmı?

Hər STR-də nukleotid ardıcıllığının təkrarlanma sayı STR-lərin ölçüsündən hesablana bilər. Məhkəmə tibb alimi bu məlumatdan bədən mayesinin nümunəsinin müəyyən bir şəxsdən gəlib-gəlmədiyini müəyyən etmək üçün istifadə edə bilər.

Fərqli nümunələrdən iki DNT profili eynidirsə, nümunələrin fərqli insanlardan gəlmə şansı aşağıdır. Bu, nümunələrin ümumi mənbəyə malik olduğuna dair güclü sübutlar təqdim edir.


Amerika

Sayt ingilis dilində göstəriləcək.

Biz bu kukilərdən saytımızın təhlükəsiz və düzgün işləməsini təmin etmək üçün istifadə edirik ki, onlar xidmətlərimizin işləməsi üçün zəruridir və sistemlərimizdə söndürülə bilməz. Onlar adətən yalnız daxil olmaq, alış-veriş səbətindən istifadə etmək və ya formaları doldurmaq kimi xidmətlər üçün sorğuya bərabər olan sizin etdiyiniz hərəkətlərə cavab olaraq təyin edilir. Siz brauzerinizi bu kukilər haqqında sizi bloklamaq və ya xəbərdar etmək üçün təyin edə bilərsiniz, lakin xidmətlərimizin bəzi hissələri onlarsız işləməyəcək. İstifadə etdiyimiz digər kukilər kimi, ciddi şəkildə zəruri olan kukilər birinci tərəf kukiləri və ya üçüncü tərəf kukiləri ola bilər.

Biz bu kukilərdən parametrlərinizi və seçimlərinizi yadda saxlamaq üçün istifadə edirik. Məsələn, biz sizin dil seçimlərinizi yadda saxlamaq üçün bu kukilərdən istifadə edə bilərik.
Üstünlük kukilərinə icazə verin

Biz bu kukilərdən xidmətlərimizlə qarşılıqlı əlaqəniz haqqında məlumat toplamaq və onları ölçmək və təkmilləşdirməkdə bizə kömək etmək üçün istifadə edirik. Məsələn, sizin müəyyən bir səhifə ilə əlaqə saxlayıb-etmədiyinizi müəyyən etmək üçün bu kukilərdən istifadə edə bilərik.
Performans/Statistika kukilərinə icazə verin

Biz və reklam partnyorlarımız bu kukilərdən reklamları çatdırmaq, onları sizin üçün daha uyğun və mənalı etmək, həm xidmətlərimizdə, həm də digər internet saytlarında və sosial mediada reklam kampaniyalarımızın səmərəliliyini izləmək üçün istifadə edirik.
Marketinq kukilərinə icazə verin


What happens to the donor's DNA in a blood transfusion?

Studies have shown that donor DNA in blood transfusion recipients persists for a number of days, sometimes longer, but its presence is unlikely to alter genetic tests significantly. Red blood cells, the primary component in transfusions, have no nucleus and no DNA. Transfused blood does, however, host a significant amount of DNA-containing white blood cells, or leukocytes&mdasharound a billion cells per unit (roughly one pint) of blood. Even blood components that have been filtered to remove donor white cells can have millions of leukocytes per unit.

Investigators have detected donor DNA after transfusion with a process called polymerase chain reaction (PCR) that amplifies minuscule amounts of genetic material for detection and identification of specific genes. Studies using PCR to amplify male genes in female recipients of transfusions from male donors have demonstrated that donor DNA endures in recipients for up to seven days. And a study of female trauma patients receiving large transfusions showed the presence of donor leukocytes for up to a year and a half.

All these results, however, were found using very sensitive techniques whereby donor DNA was selectively amplified over the more plentiful recipient DNA. In studies where genes common to both donors and recipients were amplified, the results reflected the dominance of the transfusion recipient&rsquos own DNA, showing the donor&rsquos DNA to be a relatively inconsequential interloper.

Note: This question was submitted by W. McFarland, Winter Springs, Fla. and printed in the February 2009 issue of Elmi amerikalı


Videoya baxın: Qan azlığı və onun fəsadları. Анемия - лечение, диагностика, классификация анемий (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Gorg

    Üzr istəyirəm, amma məncə, siz haqlı deyilsiniz. Mən mövqeyi müdafiə edə bilərəm. PM-ə yazın, danışarıq.

  2. Ramses

    It seems to me, you were mistaken

  3. Riocard

    Silindi (qarışıq bölmə)

  4. Hud

    I print ... on the wall in the most conspicuous place !!!

  5. Irven

    Hesab edirəm ki, səhv edirsiniz. Bunu sübut edə bilərəm. PM-də mənə yazın, danışacağıq.

  6. Aelfdene

    Məlumat üçün təşəkkür edirik.

  7. Gakus

    Can we find out?

  8. Mikael

    Təbrik edirəm, çox gözəl fikir



Mesaj yazmaq