Məlumat

Pbmcs CD40L ilə 3 gün ərzində becərildikdə niyə mən özünəməxsus B hüceyrə populyasiyasını tapıram?

Pbmcs CD40L ilə 3 gün ərzində becərildikdə niyə mən özünəməxsus B hüceyrə populyasiyasını tapıram?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

B hüceyrələrində hüceyrədaxili sitokin analizini həyata keçirərkən, mən özünəməxsus bir populyasiya tapıram. Hər bir funksional markeri öyrənmək üçün 2*10^6 xana istifadə edirəm. Pbmcs 72 saat ərzində becərilir, CD40L dozası örtükdən sonra 0 saatda və BFA 48-ci saatda verilir. Təhlil etdikdə, limfositlərdən iki CD19+ populyasiyasını alıram. Həqiqətən nə baş verdiyini kimsə mənə izah edə bilərmi?


Pbmcs CD40L ilə 3 gün ərzində becərildikdə niyə mən özünəməxsus B hüceyrə populyasiyasını tapıram? - Biologiya

Xroniki HBV-də B hüceyrə reaksiyaları əsasən HBsAg-ə deyil, HBcAg-ə qarşı yönəlir.

HBcAg spesifik yaddaş B hüceyrələri HBV-nin klinik fazaları ilə əlaqələndirilir.

Antiviral müalicə zamanı HBcAg spesifik B hüceyrə reaksiyaları azalır.

Fon və Məqsədlər

Xroniki infeksiya zamanı HBV spesifik B hüceyrələrinin tezliyi, fenotipi və funksiyası haqqında çox az şey məlumdur. Burada biz xroniki HBV infeksiyasının müxtəlif kliniki fazalarında HBcAg və HBsAg-ə məxsus B hüceyrələrini öyrənirik.

Metodlar

Biz xroniki HBV olan 118 sadəlövh müalicəni və 34 nukleos(t)ide analoqu ilə müalicə olunan xəstələri və 23 sağlam HBsAg peyvəndi olan nəzarəti daxil etdik. Qlobal və HBV-spesifik B limfositləri yem kimi flüoresan etiketli HBsAg və HBcAg istifadə edərək FACS tərəfindən tədqiq edildi. Funksional HBV spesifik B hüceyrə cavabları B hüceyrə ELISPOT analizlərində ölçüldü. Anti-HBs və anti-HBc antikorları serumda və ELISPOT supernatantında ELISA vasitəsilə ölçüldü.

Nəticələr

HBcAg-yə yönəlmiş daha yüksək B hüceyrə reaksiyaları HBV-nin klinik fazalarında aşkar edilmişdir. vs. HBeAg statusundan asılı olmayaraq aşağı serum alanin aminotransferaza (ALT) səviyyələri. Bunun əksinə olaraq, HBsAg yönümlü cavablar daha aşağı idi və əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmədi. Fərdi xəstələrdə dövriyyədə olan B hüceyrələri HBsAg yemlərindən orta hesabla 17,8 dəfə çox HBcAg-ni hədəf alır. Bu HBcAg spesifik B hüceyrələri klassik yaddaş B hüceyrə profilini təqdim edir və qlobal yaddaş B hüceyrələri ilə müqayisədə bir qədər yüksək CD69 ifadə səviyyələrinə malikdir. Viral supressiya və müalicə zamanı ALT normallaşması, serum anti-HBc antikorlarının mütərəqqi azalması ilə müşayiət olunan HBcAg-ə xüsusi B hüceyrə reaksiyalarının ədədi və funksional azalmasına gətirib çıxardı.

Nəticə

HBcAg-a xas yaddaş B hüceyrələri klassik yaddaş B hüceyrəsi fenotipini təqdim edir, HBV-nin təbii tarixi boyu say və funksiya baxımından dəyişir və antiviral müalicə zamanı əhəmiyyətli dərəcədə azalır.

Xülasə qoyun

Son illərdə xroniki hepatit B virusu infeksiyası zamanı B hüceyrələrinin rolunu araşdıran tədqiqatlar yenidən maraq qazanmışdır. Biz göstəririk ki, dövran edən B hüceyrələri hepatitin səthi antigenindən daha çox hepatit B əsas antigenini hədəf alır. Bundan əlavə, bu hepatit B əsas spesifik B hüceyrələri xroniki HBV-nin təbii tarixi ilə əlaqələndirilir və onların cavabları effektiv antiviral müalicə zamanı azalır.


Giriş

Normal diferensiallaşmış insan hüceyrələrinin çoxalma qabiliyyətinin məhdud olduğuna inanılır in vivoin vitro. Hər bir hüceyrə bölünməsi ilə telomerlərin - xromosomların uclarında təkrarlanan DNT ardıcıllığının mütərəqqi qısalması son nəticədə böyümənin daimi dayanması ilə xarakterizə olunan replikativ qocalmaya gətirib çıxarır [1], [2]. Telomerin qısalmasına xromosomların uclarına telomerik təkrarlar əlavə edən və germline hüceyrələrində ifadə olunan telomeraz təsir göstərir, lakin aktivləşdirilmiş limfositlər kimi müəyyən somatik hüceyrələrdə də induksiya edilə bilər [3]–[6]. Hüceyrə ölümsüzləşməsi telomerləri saxlamaq üçün bir mexanizm tələb edir və adətən telomeraz fəaliyyətinin yuxarı tənzimlənməsini əhatə edir [1].

İnsan hüceyrələrinin ölümsüzləşməsi üçün tələblər in vitro hüceyrə tipinə xasdır. İnsan embrionunun kök hüceyrə klonları konstruktiv olaraq güclü telomeraz aktivliyi nümayiş etdirir və ölümsüzləşir. in vitro genetik manipulyasiya tələb etmədən [7]. İnsan fibroblastları və T limfositləri üçün telomeraza ilə transduksiya telomerləri sabitləşdirmək və in vitro ölümsüzləşməyə nail olmaq üçün zəruri və kifayət idi [8]-[10]. T hüceyrələrinin aktivləşməsi endogen telomeraza aktivliyinin induksiyası ilə əlaqələndirilir [11], lakin onların ölümsüzləşməsinə nail olmaq üçün kifayət qədər görünməyən səviyyələrdə. Epitelial hüceyrələr üçün telomerazanın ektopik ifadəsi onların ölümsüzləşməsi üçün kifayət deyildi, əlavə olaraq Rb/p16 yolunun inaktivasiyası tələb olundu [12]. Spontan in vitro İnsan somatik hüceyrələrinin ölümsüzləşməsi indiyədək yalnız tək insan donorları ilə aparılan təcrübələrdə və ya xərçəngə meylli olan irsi genetik pozğunluğu olan xəstələrdən alınan hüceyrələrdə müşahidə edilmişdir [13], [14].

Aktivləşdirilmiş insan B limfositləri güclü telomeraz aktivliyi nümayiş etdirir [3]-[6], bu, yalnız saxlanma ilə deyil, həm də germinal mərkəzlərdə B hüceyrələrinin aktivləşdirilməsindən sonra telomerlərin uzanması ilə əlaqədardır [4]. Bununla belə, normal insan B hüceyrələrinin çox uzunmüddətli yayılması və ya ölümsüzləşməsi ehtimalı in vitro İnsan onkogen Epstein-Barr virusu (EBV) tərəfindən çevrilən B hüceyrələri istisna olmaqla, bu günə qədər araşdırılmamışdır. Normal insan B hüceyrələrinin EBV infeksiyası ümumiyyətlə avtonom proliferasiya edən limfoblastoid hüceyrə xətlərinin yaradılması ilə nəticələnir [15]. Bu proses tez-tez birmənalı şəkildə “EBV ölümsüzləşməsi” adlandırılsa da, əsasən ölümcül olan və aşağı səviyyədə telomeraz aktivliyinə malik hüceyrə xətləri istehsal edir [16], [17].

Alternativ olaraq, insan B limfositləri aktivləşdirilə və proliferasiyaya səbəb ola bilər in vitro interleykin-4 [18], T köməkçi hüceyrələri tərəfindən B hüceyrələrinin aktivləşdirilməsini təqlid edən siqnalların birləşməsi varlığında onların səthi CD40 reseptorunu tetikleyerek. CD40 ilə stimullaşdırılan B hüceyrə mədəniyyətləri B hüceyrələrinin yaddaş B hüceyrələrinə və ya plazma hüceyrələrinə fərqləndirməsini modelləşdirmək üçün istifadə edilmişdir. in vitro [19]. Onların otolog immunoterapiya üçün in vitroda antigenə spesifik T hüceyrələri yaratmaq üçün antigen təqdim edən hüceyrələr kimi fəaliyyət göstərmək potensialı ətraflı araşdırılmışdır [20], [21]. Bununla belə, bu tədqiqatlarda CD40/IL4 reseptoru ilə idarə olunan B hüceyrə kulturaları dörd-on həftədən çox saxlanılmamışdır [18], [20], [22]-[25]. Bu müddətdən sonra B hüceyrə kulturları, yəqin ki, kortəbii olaraq, ölür [18] və ya həbs edilir və plazmasitlərə [23] differensiallaşır. Bu hüceyrə ölümünün və ya differensiasiyasının tetikleyicisi və fərqli tədqiqatçılar tərəfindən bildirilən CD40-stimullaşdırılmış B hüceyrələrinin diferensiallaşma kinetikasında və maksimum mədəniyyət müddətlərindəki fərqlərin səbəbi müəyyən edilməmişdir. Üstəlik, CD40 ilə stimullaşdırılan B hüceyrələrinin nisbətən uzunmüddətli mədəniyyətini (on həftəyə qədər) təsvir edən tədqiqatlarda donor mənşəli Epstein-Barr virusunun (EBV) zamanla mədəniyyətlərə yayıldığı müşahidə edilmişdir [18], [20] , EBV üçün ümumiyyətlə müsbət olan normal insan yetkin donorları ilə ciddi virussuz CD40-stimullaşdırılmış B hüceyrə kulturalarının yaradılmasının mümkün olub-olmadığı sualını açıq qoyaraq.

Burada CD40 ilə stimullaşdırılan B hüceyrə mədəniyyətlərinin dəyişdirildikdə əvvəllər bildiriləndən xeyli uzun müddət ərzində çoxaldığını təsvir edirik. in vitro stimullaşdırma şərtləri tətbiq edilir. Biz belə çox uzunmüddətli B hüceyrələrinin sağlam yetkin donorların əksəriyyətindən yaradıla biləcəyinə, aktivləşdirilmiş B hüceyrələrinin daimi fenotipinə malik olduğuna, EBV-dən azad olduğuna, müntəzəm təkrarlanan CD40 liqand/IL-4 stimullaşdırılmasından asılı qaldığına dair sübut təqdim edirik. və beləliklə in vitro şərti olaraq ölümsüzləşmiş kimi görünür. Bu nəticələr göstərir ki, differensiallaşdırılmış insan hüceyrə növünə, B hüceyrəsinə xas olan ölümsüzləşdirmə proqramına yalnız ekzogen stimullaşdırma ilə daxil olmaq olar.


B limfositləri hüceyrə səthi GARP-TGF- vasitəsilə immun tolerantlıq təmin edir.β kompleks

3 Tibb Fakültəsi, Cənubi Karolina Tibb Universiteti, Charleston, Cənubi Karolina, ABŞ.

4 İmmunologiya şöbəsi, Pittsburq Universiteti, Pittsburq, Pensilvaniya, ABŞ.

5 Birinci Bağlı Xəstəxana, Zhengzhou Universiteti Tibb Məktəbi, Zhengzhou, Çin.

Yazışmaları ünvanlayın: Zihai Li və ya Bei Liu, Jonathan Lucas Street 86, Hollings Cancer Center, HO612B (Z. Li) və ya HO612H (B. Liu), Charleston, South Carolina 29425, USA. Telefon: 843.792.1034 E-poçt: [email protected] (Z. Li). Telefon: 843.792.8994 E-poçt: [email protected] (B. Liu).

Wallace, C. tərəfindən məqalələr tapın: JCI | PubMed | Google Alim

1 Mikrobiologiya və İmmunologiya kafedrası,

2 Patologiya və Laboratoriya Tibb Kafedrası və

3 Tibb Fakültəsi, Cənubi Karolina Tibb Universiteti, Charleston, Cənubi Karolina, ABŞ.

4 İmmunologiya şöbəsi, Pittsburq Universiteti, Pittsburq, Pensilvaniya, ABŞ.

5 Birinci Bağlı Xəstəxana, Zhengzhou Universiteti Tibb Məktəbi, Zhengzhou, Çin.

Yazışmaları ünvanlayın: Zihai Li və ya Bei Liu, Jonathan Lucas Street 86, Hollings Cancer Center, HO612B (Z. Li) və ya HO612H (B. Liu), Charleston, South Carolina 29425, USA. Telefon: 843.792.1034 E-poçt: [email protected] (Z. Li). Telefon: 843.792.8994 E-poçt: [email protected] (B. Liu).

1 Mikrobiologiya və İmmunologiya kafedrası,

2 Patologiya və Laboratoriya Tibb Kafedrası və

3 Tibb Fakültəsi, Cənubi Karolina Tibb Universiteti, Charleston, Cənubi Karolina, ABŞ.

4 İmmunologiya şöbəsi, Pittsburq Universiteti, Pittsburq, Pensilvaniya, ABŞ.

5 Birinci Bağlı Xəstəxana, Zhengzhou Universiteti Tibb Məktəbi, Zhengzhou, Çin.

Yazışmaları ünvanlayın: Zihai Li və ya Bei Liu, Jonathan Lucas Street 86, Hollings Cancer Center, HO612B (Z. Li) və ya HO612H (B. Liu), Charleston, South Carolina 29425, USA. Telefon: 843.792.1034 E-poçt: [email protected] (Z. Li). Telefon: 843.792.8994 E-poçt: [email protected] (B. Liu).

1 Mikrobiologiya və İmmunologiya kafedrası,

2 Patologiya və Laboratoriya Tibb Kafedrası və

3 Tibb Fakültəsi, Cənubi Karolina Tibb Universiteti, Charleston, Cənubi Karolina, ABŞ.

4 İmmunologiya şöbəsi, Pittsburq Universiteti, Pittsburq, Pensilvaniya, ABŞ.

5 Birinci Bağlı Xəstəxana, Zhengzhou Universiteti Tibb Məktəbi, Zhengzhou, Çin.

Yazışmaları ünvanlayın: Zihai Li və ya Bei Liu, Jonathan Lucas Street 86, Hollings Cancer Center, HO612B (Z. Li) və ya HO612H (B. Liu), Charleston, South Carolina 29425, USA. Telefon: 843.792.1034 E-poçt: [email protected] (Z. Li). Telefon: 843.792.8994 E-poçt: [email protected] (B. Liu).

Ansa-Addo, E. tərəfindən məqalələr tapın: JCI | PubMed | Google Alim

1 Mikrobiologiya və İmmunologiya kafedrası,

2 Patologiya və Laboratoriya Tibb Kafedrası və

3 Tibb Fakültəsi, Cənubi Karolina Tibb Universiteti, Charleston, Cənubi Karolina, ABŞ.

4 İmmunologiya şöbəsi, Pittsburq Universiteti, Pittsburq, Pensilvaniya, ABŞ.

5 Birinci Bağlı Xəstəxana, Zhengzhou Universiteti Tibb Məktəbi, Zhengzhou, Çin.

Yazışmaları ünvanlayın: Zihai Li və ya Bei Liu, Jonathan Lucas Street 86, Hollings Cancer Center, HO612B (Z. Li) və ya HO612H (B. Liu), Charleston, South Carolina 29425, USA. Telefon: 843.792.1034 E-poçt: [email protected] (Z. Li). Telefon: 843.792.8994 E-poçt: [email protected] (B. Liu).

Metelli, A. tərəfindən məqalələr tapın: JCI | PubMed | Google Alim

1 Mikrobiologiya və İmmunologiya kafedrası,

2 Patologiya və Laboratoriya Tibb Kafedrası və

3 Tibb Fakültəsi, Cənubi Karolina Tibb Universiteti, Charleston, Cənubi Karolina, ABŞ.

4 İmmunologiya şöbəsi, Pittsburq Universiteti, Pittsburq, Pensilvaniya, ABŞ.

5 Birinci Bağlı Xəstəxana, Zhengzhou Universiteti Tibb Məktəbi, Zhengzhou, Çin.

Yazışmaları ünvanlayın: Zihai Li və ya Bei Liu, Jonathan Lucas Street 86, Hollings Cancer Center, HO612B (Z. Li) və ya HO612H (B. Liu), Charleston, South Carolina 29425, USA. Telefon: 843.792.1034 E-poçt: [email protected] (Z. Li). Telefon: 843.792.8994 E-poçt: [email protected] (B. Liu).

1 Mikrobiologiya və İmmunologiya kafedrası,

2 Patologiya və Laboratoriya Tibb Kafedrası və

3 Tibb Fakültəsi, Cənubi Karolina Tibb Universiteti, Charleston, Cənubi Karolina, ABŞ.

4 İmmunologiya şöbəsi, Pittsburq Universiteti, Pittsburq, Pensilvaniya, ABŞ.

5 Birinci Bağlı Xəstəxana, Zhengzhou Universiteti Tibb Məktəbi, Zhengzhou, Çin.

Yazışmaları ünvanlayın: Zihai Li və ya Bei Liu, Jonathan Lucas Street 86, Hollings Cancer Center, HO612B (Z. Li) və ya HO612H (B. Liu), Charleston, South Carolina 29425, USA. Telefon: 843.792.1034 E-poçt: [email protected] (Z. Li). Telefon: 843.792.8994 E-poçt: [email protected] (B. Liu).

Gilkeson, G. tərəfindən məqalələri tapın: JCI | PubMed | Google Alim

1 Mikrobiologiya və İmmunologiya kafedrası,

2 Patologiya və Laboratoriya Tibb Kafedrası və

3 Tibb Fakültəsi, Cənubi Karolina Tibb Universiteti, Charleston, Cənubi Karolina, ABŞ.

4 İmmunologiya şöbəsi, Pittsburq Universiteti, Pittsburq, Pensilvaniya, ABŞ.

5 Birinci Bağlı Xəstəxana, Zhengzhou Universiteti Tibb Məktəbi, Zhengzhou, Çin.

Yazışmaları ünvanlayın: Zihai Li və ya Bei Liu, Jonathan Lucas Street 86, Hollings Cancer Center, HO612B (Z. Li) və ya HO612H (B. Liu), Charleston, South Carolina 29425, USA. Telefon: 843.792.1034 E-poçt: [email protected] (Z. Li). Telefon: 843.792.8994 E-poçt: [email protected] (B. Liu).

Shlomchik, M. tərəfindən məqalələr tapın: JCI | PubMed | Google Alim

1 Mikrobiologiya və İmmunologiya kafedrası,

2 Patologiya və Laboratoriya Tibb Kafedrası və

3 Tibb Fakültəsi, Cənubi Karolina Tibb Universiteti, Charleston, Cənubi Karolina, ABŞ.

4 İmmunologiya şöbəsi, Pittsburq Universiteti, Pittsburq, Pensilvaniya, ABŞ.

5 Birinci Bağlı Xəstəxana, Zhengzhou Universiteti Tibb Məktəbi, Zhengzhou, Çin.

Yazışmaları ünvanlayın: Zihai Li və ya Bei Liu, Jonathan Lucas Street 86, Hollings Cancer Center, HO612B (Z. Li) və ya HO612H (B. Liu), Charleston, South Carolina 29425, USA. Telefon: 843.792.1034 E-poçt: [email protected] (Z. Li). Telefon: 843.792.8994 E-poçt: [email protected] (B. Liu).

Liu, B. tərəfindən məqalələr tapın: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 Mikrobiologiya və İmmunologiya kafedrası,

2 Patologiya və Laboratoriya Tibb Kafedrası və

3 Tibb Fakültəsi, Cənubi Karolina Tibb Universiteti, Charleston, Cənubi Karolina, ABŞ.

4 İmmunologiya şöbəsi, Pittsburq Universiteti, Pittsburq, Pensilvaniya, ABŞ.

5 Birinci Bağlı Xəstəxana, Zhengzhou Universiteti Tibb Məktəbi, Zhengzhou, Çin.

Yazışmaları ünvanlayın: Zihai Li və ya Bei Liu, Jonathan Lucas Street 86, Hollings Cancer Center, HO612B (Z. Li) və ya HO612H (B. Liu), Charleston, South Carolina 29425, USA. Telefon: 843.792.1034 E-poçt: [email protected] (Z. Li). Telefon: 843.792.8994 E-poçt: [email protected] (B. Liu).

Oxşar video:

İmmun tolerantlıqda B hüceyrələrində GARP-TGF-β-nin rolu

Transmembran zülalı GARP gizli TGF-&beta üçün reseptor kimi xidmət edir və nəticədə bu sitokinin aktivləşməsi baş verir. GARP Tregs, şişlər və trombositlərin səthində ifadə edilir və xərçəng immun işğalında iştirak etmişdir. Bu epizodda Zihai Li və həmkarları GARP-TGF-&beta kompleksinin aktivləşdirilmiş, lakin istirahətdə olmayan insan və siçan B hüceyrələrində olduğunu aşkar edirlər. Çoxlu fare genetik modellərindən istifadə edərək, müəlliflər bu kompleksin immun tolerantlığın qorunması və otoimmün xəstəliklərin qarşısının alınması üçün vacib olduğunu müəyyən etdilər. Bu nəticələr terapevtik hədəf və mümkün diaqnostika vasitəsi kimi B hüceyrə GARP-nin daha da araşdırılmasını dəstəkləyir.

Gizli TGF-β-nın bağlanması və aktivləşdirilməsi üçün hüceyrə səthində dok reseptoru olan GARP trombositlər və aktivləşdirilmiş Treglər tərəfindən yüksək şəkildə ifadə edilir. GARP xərçəngdə immun invaziyasında iştirak etsə də, sistemli otoimmün xəstəliklərdə GARP-TGF-β oxunun rolu məlum deyil. Baxmayaraq ki, B hüceyrələri GARP-ı ilkin olaraq ifadə etmir, biz aşkar etdik ki, GARP-TGF-β kompleksi aktivləşdirilmiş insan və siçan B hüceyrələrində TLR4, TLR7 və TLR9 daxil olmaqla bir çox TLR üçün liqandlar tərəfindən induksiya olunur. B hüceyrələrində GARP həddindən artıq ifadəsi onların yayılmasını maneə törətdi, IgA sinfinin dəyişməsinə səbəb oldu və T hüceyrəsindən müstəqil antikor istehsalını azaldıb. Bunun əksinə olaraq, GARP kodlaşdıran genin B hüceyrəsinə xas silinməsi Lrrc32 siçanlarda kortəbii olaraq sistemik otoimmün xəstəliklərin inkişafına, eləcə də pristana səbəb olan lupusa bənzər xəstəliyin pisləşməsinə səbəb oldu. Kanonik TGF-β siqnalı, dalaq B hüceyrələrinə nisbətən Peyer patch B hüceyrələrində GARP-ni daha asan tənzimləyir. Bundan əlavə, GARP vasitəsilə T hüceyrəsindən asılı antigenlərin oral tolerantlığının induksiyası üçün B hüceyrələrinin tələb olunduğunu nümayiş etdirdik. Tədqiqatlarımız ilk dəfə məlumatımıza məlum oldu ki, hüceyrə səthi GARP-TGF-β B hüceyrəsinin periferik tolerantlığını tənzimləmək üçün vacib bir nəzarət nöqtəsidir və otoimmün xəstəliklərin patogenez mexanizmini vurğulayır.

Glikoprotein A təkrarları üstünlük təşkil edir (GARP), gen tərəfindən kodlanır Lrrc32, gizli transformasiya edən böyümə faktoru-β (LTGF-β) üçün hüceyrə səthinin dok reseptoru kimi xidmət edən tip 1 transmembran zülaldır (1, 2). LTGF-β, GARP-nin hüceyrədənkənar bölgəsinə bağlanaraq Tregs və trombositlərin səthində bolca mövcuddur (2-7). Tregs-də bir çox tədqiqatlar GARP-nin TGF-β biogenezini və LTGF-β aktivasiyasını təşviq etdiyini nümayiş etdirdi (8-10). Bundan əlavə, GARP ifadəsi yüksək TGF-β aktivliyi olan hüceyrələrdə müşahidə edilmişdir: qaraciyər ulduz hüceyrələrində (11), mezenximal stromal hüceyrələrdə (12) və çoxsaylı aqressiv xərçəng növləri (13-15).

TGF-β immunoloji tolerantlığın qorunması üçün əsas sitokindir: erkən tədqiqatlar göstərdi ki, TGF-β1 –/– siçanlarda antinüvə antikoru (ANA) daxil olmaqla, yüksək səviyyədə otoantikorlarla ölümcül çox orqan iltihabi xəstəliyi inkişaf edir (16, 17). TGF-β biologiyası geniş şəkildə xarakterizə edilmişdir və molekul müxtəlif biokimyəvi formalarda mövcuddur: aktiv və sərbəst həll olunan TGF-β LTGF-β, gecikmə ilə əlaqəli peptid (LAP) ilə əlaqəli TGF-β tərəfindən əmələ gəlir. TGF-β-bağlayıcı protein (LTBP) və GARP ilə birlikdə LTGF-β-nin (mLTGF-β) membran forması (18-20). Yalnız LAP-sız həll olunan TGF-β, həm inteqrindən asılı, həm də müstəqil mexanizmlər tərəfindən aktivləşdirilir, bioloji aktivdir (21, 22).

TGF-β həm kanonik, həm də qeyri-kanonik siqnal yolları vasitəsilə fəaliyyət göstərsə də, B hüceyrələri TGF-β-induksiya etdiyi apoptoz üçün kanonik yola ehtiyac duyur (23, 24). TGF-β siqnalizasiyası I və II tip TGF-β reseptorları vasitəsilə hüceyrə səthində başlayır və aşağı axın Smad2 fosforilasiyasına səbəb olur (25).B hüceyrələri həm parakrin, həm də avtokrin TGF-β siqnalından istifadə edərkən, əvvəlki tədqiqatlar göstərir ki, B hüceyrələrində apoptozun TGF-β tənzimlənməsi avtokrin mexanizmdir (24, 26). Bununla belə, B hüceyrələrinin TGF-β-induksiya etdiyi apoptozu özünü tənzimləmək üçün hansı hüceyrə daxili mexanizmlərindən istifadə etdiyi aydın deyil. B hüceyrələrində TGF-β siqnalının əlavə rollarına (a) yetkin B hüceyrələrinin IgA istehsal edən plazma hüceyrələrinə differensasiyası zamanı Ig-nin IgA-ya sinif keçid rekombinasiyasının (CSR) induksiyası və (b) Hüceyrə avtonom hüceyrələri vasitəsilə B hüceyrələrinin tənzimlənməsi daxildir. TGF-β1 istehsalı (27 – 29). Cre-dən istifadəloxP sistemi, Cazac və Roes bunu nümayiş etdirdi Tgfbr2 –/– adi B hüceyrələrinin ömrü qısaldı, genişlənmə var idi Tgfbr2 –/– peritoneal B-1 hüceyrələri, Peyer yamaqlarında (PP) B hüceyrə hiperplaziyası və yüksək serum Ig. Qeyd edək ki, bu siçanlarda ağır IgA çatışmazlığı var idi (30). Bu iş qrupu B hüceyrə biologiyasında TGF-β-nın kritik funksiyalarını vurğulayır.

Həm mərkəzi, həm də periferik tolerantlıq yoxlama məntəqələri B hüceyrəsi tərəfindən idarə olunan otoimmünizmin qarşısını almaq üçün lazımdır (31-33). TGF-β kontekstində GARP üzrə son iş tolerogen mühitin təşviqində GARP-nin rolunu həll etməyə çalışmışdır (6, 34-36). Bununla belə, heç bir tədqiqat in vivo tolerantlıqda GARP-nin fizioloji roluna toxunmamışdır. Xüsusilə, B hüceyrəsi tərəfindən idarə olunan otoimmün xəstəliklər kontekstində GARP-ın rolları məlum deyil. Bu araşdırmada B hüceyrələrinin çoxlu TLR liqandlarına cavab olaraq hüceyrə səthində GARP ifadə etdiyini gördük. Biz həm qazanc, həm də funksiya itkisi tədqiqatlarından istifadə edərək GARP induksiyasının mexanizmini, eləcə də immun tolerantlıqda B hüceyrəsi-intrinsik GARP-nin immunoloji uyğunluğunu öyrəndik. Bildiyimiz kimi ilk dəfə olaraq, B hüceyrəsi GARP-LTGF-β oxunun B hüceyrəsinə tolerantlıq və siçanlarda lupus kimi otoimmün xəstəliklərin qarşısının alınması üçün mühüm immun nəzarət nöqtəsi kimi xidmət etdiyini aşkar etdik.

Həm siçan, həm də insan B hüceyrələrinin TLR aktivasiyası hüceyrə səthi GARP və LTGF-β ifadəsini induksiya edir. TLR-lər patogenlə əlaqəli molekulyar nümunələri hiss edən və immun cavabların aktivləşdirilməsini tənzimləyən əsas fitri immun reseptorlardır. B hüceyrələrində TLR-lərin aktivləşdirilməsi birbaşa B hüceyrələrinin proliferasiyasına səbəb olur və antigen təqdimatını, sitokin ifrazını, plazma hüceyrələrinin diferensiasiyasını, CSR və yaddaş B hüceyrələrinin diferensiasiyasını artırır (37, 38). Keçmiş tədqiqatlar yüksək TLR fəaliyyəti ilə otoimmün xəstəliklər arasında əhəmiyyətli bir əlaqəni geniş şəkildə nümayiş etdirdi (39-43).

TLR stimullaşdırılmasının B hüceyrələrinin hiperaktivliyinin qarşısını almaq üçün GARP-LTGF-β kimi mənfi tənzimləyici yollara çevrildiyini fərz etdik. Bu məqsədlə, CD19 + B hüceyrələri WT siçan dalaqlarından təcrid edildi və B hüceyrə reseptorunun (BCR) stimullaşdırılması və ya müxtəlif TLR liqandları üçün anti-μ antikor (15 μg / ml) ilə 24-120 saat ərzində becərildi: LPS (TLR4 liqand) , R848 (TLR7/8 liqand) və CpG (TLR9 ​​liqand). Çoxlu TLR liqandlarının GARP və LTGF-β-nın hüceyrə səthi ifadəsini güclü şəkildə induksiya etdiyini, BCR stimullaşdırılmasının isə yalnız təvazökar GARP ifadəsini induksiya etdiyini aşkar etdik (Şəkil 1A). GARP səthinin ifadəsinin kinetikası istifadə edilən TLR liqandlarından asılı olaraq fərqlənirdi (Şəkil 1B). GARP-nin yüksəldilməsi də immunoblot tərəfindən təsdiq edilmişdir (Şəkil 1C). Maraqlıdır ki, MyD88-dən asılı olmayan TLR3-ün bağlanmasının səthi GARP ifadəsini induksiya etmədiyini, lakin mənfi nəzarət kimi GARP-KO B hüceyrələri ilə müqayisədə IL-1β və Poly I:C kombinasiyasının yaratdığını aşkar etdik (Şəkil 1D). LPS ilə müalicə olunan dalaq CD19 + B hüceyrələrinin fenotipik təhlili göstərdi ki, GARP + hüceyrələri daha böyükdür (FSC və SSC-də artım) və GARP - hüceyrələrdən daha yüksək dərəcədə aktivləşdirilmiş, CD86, CD80 və CD44 səviyyələri əhəmiyyətli dərəcədə yüksəkdir. CD23 və PD-L1 səviyyələri də əhəmiyyətli dərəcədə yüksəldi, eyni zamanda IgM, CD62L, MHC sinif II, CD1d və PD-1 ifadəsi üçün LPS-ə cavab olaraq heç bir dəyişiklik görülmədi (Şəkil 1E).

Çoxlu TLR liqandları həm insan, həm də siçan B hüceyrələrində GARP ifadəsini yaradır. Dalaq B hüceyrələri CD19 + maqnit muncuqlarından istifadə edərək WT siçan dalaqlarından təcrid edilmişdir. (A) Hüceyrələr 120 saat ərzində siçan anti-μ (15 μg/ml), LPS, R848 və ya CpG ilə stimullaşdırılıb. Canlı B hüceyrələrində GARP + LAP + ifadəsini ölçmək üçün 24 saatlıq fasilələrlə axın sitometriyası istifadə edilmişdir. Rəqəmlər bütün CD19 + B hüceyrə populyasiyası üzərində GARP + LAP + kvadrantdakı hüceyrələrin faizini təmsil edir. Axın qrafikləri 3 müstəqil təcrübəni təmsil edir. Nümunəvi əsas axın qrafiki də göstərilir. (B) GARP və LAP ifadəsinin kəmiyyəti (n = 4 bioloji təkrar). MFI, GARP-in orta flüoresan intensivliyi. Statistik təhlil 2 tərəfli ANOVA ilə aparılmışdır ***P < 0,001. (C) Təmizlənməmiş (UT) WT B hüceyrələrinin bütün hüceyrə lizatında və ya göstərilən şərtlərlə 72 saat ərzində stimullaşdırıldıqdan sonra GARP immunoblotu. 3 immunoblotun nümayəndəsi. (D) İlkin WT və GARP-KO dalaq B hüceyrələri 72 saat ərzində LPS, Poly I:C və ya IL-1β plus Poly I:C ilə becərildi. Hüceyrələr GARP və LAP üçün boyandı və axın sitometriyası ilə təhlil edildi. 3 müstəqil eksperimentin nümayəndəsi. (E) LPS ilə müalicə olunan (48 saat) GARP – və GARP + B hüceyrələrinin axın sitometriyası ilə fenotipik təhlili. Histoqram planları təmsil edir n = 3 bioloji təkrar və 2 müstəqil təcrübə. Qara xətlər GARP - hüceyrələri, qırmızı xətlər GARP + hüceyrələr kölgəli sahələr izotipi ifadə edir. Rəqəmlər orta floresan intensivliyi (MFI) təmsil edir. (F) İnsan B hüceyrələri insan anti-CD19 + maqnit muncuqlarından istifadə edərək normal subyektlərdən təcrid edilmişdir. Hüceyrələr 72 saat ərzində insan anti-μ, R848 və ya CpG ilə təzə analiz edilmiş və ya becərilmişdir. GARP + LAP + səviyyələri axın sitometriyası ilə təhlil edilmişdir. 3 müstəqil eksperimentin nümayəndəsi. (G) Sağlam donorlardan 3 bioloji təkrarda GARP + LAP + ifadəsinin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi. Hər bir məlumat nöqtəsi fərdi donoru təmsil edir. Statistik təhlil 2 quyruqlu tərəfindən aparılmışdır t test (E) və Tukey-nin çoxsaylı müqayisələri ilə 1-yollu ANOVA (G) *P < 0,05, **P < 0.01, ***P < 0,001. Səhv çubuqları SD-ni təmsil edir.

Sıçan B hüceyrələri kimi, insan CD19 + B hüceyrələri həm R848 (TLR7/8 liqand) həm də CpG (TLR9 ​​liqand) cavab olaraq GARP-ni tənzimlədi. Bununla belə, siçan B hüceyrələrindən fərqli olaraq, BCR stimullaşdırılması TLR siqnalından daha aşağı səviyyələrdə olsa da (Şəkil 1, F və G) bu yaxınlarda təsvir edildiyi kimi insan B hüceyrələrində səth GARP və LAP-ı da yüksəltdi. Həm siçan, həm də insan B hüceyrələri TLR stimullarına cavab olaraq GARP-ni tənzimlədi, lakin TLR-induksiya etdiyi GARP ifadəsinin B hüceyrə funksiyalarını necə tənzimlədiyi məlum deyil. GARP LTGF-β-nin səthi ifadəsi və aktivləşdirilməsi üçün zəruri olduğundan (4, 5), bizim tapıntılarımız TLR aktivləşməsinə cavab olaraq B hüceyrə GARP ifadəsinin B hüceyrəsinin aktivləşdirilməsi üçün mühüm mənfi yoxlama nöqtəsi ola biləcəyini göstərir (41).

B limfositlərində GARP həddindən artıq ekspressiyası proliferasiyanı azaldır, IgA CSR-ni artırır və T hüceyrəsindən müstəqil antikor istehsalını zəiflədir. B hüceyrə GARP ifadəsinin bioloji əhəmiyyətini anlamaq üçün biz GARP ifadəsini farmakoloji cəhətdən idarə etmək üçün induksiya olunan siçan modeli yaratdıq (45). Biz içəri girdik Tet-on trans-endogen GARP geninin promotor bölgəsinə təsir edən element; Lrrc32. keçid Lrrc32 TetOn ilə siçanlar Rosa26 rtTA siçanlar doksisiklin istifadə edərək induksiya olunan GARP həddindən artıq ifadəsinə (OE) icazə verdi (Şəkil 2A). B hüceyrələrində GARP-ın əsas funksiyası TGF-β-nin aktivləşdirilməsini və mövcudluğunu tənzimləməkdirsə, GARP-nin transgenik OE-nin IgA CSR-ni, B hüceyrə proliferasiyasını və antikor reaksiyasını dəyişdirmək ehtimal edilir (27, 29).

GARP həddindən artıq ifadəsi B hüceyrələrinin yayılmasını azaldır və antikor istehsalını dəyişdirir. rtTA GARP OE siçanlarına GARP ifadəsini geniş şəkildə stimullaşdırmaq üçün doksisiklin verildi. (A) Təcrübə sxeminin diaqramı. (B) WT və GARP OE dalaq CD19 muncuqla təmizlənmiş B hüceyrələri üzərində GARP və LAP-ın təhlili dərhal ex vivo (UT) və anti-μ antikor, LPS və ya anti-μ antikoru, CD40L və kombinasiyası ilə 96 saatlıq müalicədən sonra LPS. Rəqəmlər qapalı CD19 + B hüceyrə populyasiyası üzərində B220 + GARP + hüceyrələrin faizini təmsil edir. Axın planları təmsil edir n = 4 bioloji təkrar. (C) WT və OE dalaq CD19 + təmizlənmiş B hüceyrələri CFSE ilə etiketləndi və LPS ilə 3 gün ərzində becərildi. CFSE seyreltməsi 24 saatlıq fasilələrlə axın sitometriyası ilə ölçüldü. CD19 + təmizlənmiş CFSE etiketli B hüceyrələri də 72 saat ərzində WT qeyri-B hüceyrəli dalaq hüceyrələri ilə becərildi və CFSE seyreltməsi axın sitometriyası ilə qiymətləndirildi. Histoqramlar 2 müstəqil təcrübəni təmsil edir. (D) 96 saatlıq stimullaşdırılmış hüceyrələrin canlı hüceyrə sayı tripan mavisi istisnası ilə təhlil edilmişdir (n = 4). (E) 96 saatlıq supernatantlarda ümumi IgA səviyyələri ELISA ilə ölçüldü (n = 4). (F) WT və GARP OE siçanlarına TNP-ficoll ilə immunizasiyadan əvvəl 1 həftə müddətində içməli suda doksisiklin verilmiş və bu, təcrübə boyu davam etdirilmişdir. Göstərilən siçanların seralarında TNP-ə xas IgM səviyyələri ölçüldü (n = 6 WT və n = 7 OE bioloji təkrarı). Statistikalar 2 tərəfli ANOVA tərəfindən həyata keçirilmişdir *P < 0,05. (G) Splenik və Peyer yamağı CD19 + muncuqla təmizlənmiş B hüceyrələri doksisiklinlə müalicə edilmiş WT və GARP OE siçanlarından təcrid olundu və dərhal rəngləndi və axın sitometriyasından istifadə edərək hüceyrədaxili pSmad2/3 səviyyələri üçün qiymətləndirildi (n = 3 bioloji təkrar). 3 müstəqil eksperimentin nümayəndəsi. Histoqrammalarda pSmad2/3 boyanmış boz rəngli kölgələr izotip nəzarətini, qara xətlər WT-ni, yaşıl xətlər isə OE-ni təmsil edir. Bütün statistik təhlillər 2 quyruqlu tərəfindən aparılmışdır t başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə test *P < 0,05, **P < 0.01, ***P < 0,001. Səhv çubuqları SD-ni təmsil edir.

WT və ya GARP OE siçanlarından CD19 mikro muncuqla təmizlənmiş dalaq B hüceyrələri, doksisiklin varlığında anti-μ antikor, LPS və ya anti-μ antikor, CD40L və LPS kombinasiyası ilə stimullaşdırıldı. Daha yüksək GARP ifadəsi GARP OE B220 + dalaq B hüceyrələrində ən azı 96 saat davam etdi (Şəkil 2B). TGF-β-nın aktivləşdirilməsində GARP-ın rollarına uyğun olaraq, GARP OE hüceyrələri CFSE seyreltmə və hüceyrə sayına əsaslanaraq stimullaşdırmadan sonra WT hüceyrələrindən daha az çoxaldı (Şəkil 2, C və D). IgA səviyyəsi GARP OE B hüceyrə kulturalarında tək anti-μ antikoru ilə müalicə də daxil olmaqla bütün şəraitlərdə əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 2E). B hüceyrə GARP-nin funksional əhəmiyyətini in vivo araşdırmaq üçün biz WT və GARP OE siçanlarını T hüceyrəsindən müstəqil antigen, 2,4,6-Trinitrofenil-AECM-fikol (TNP-ficoll) ilə immunizasiya etdik. Məlum olan TGF-β-induksiya ilə B hüceyrə reaksiyasının nəmləndirilməsinə uyğun olaraq (46), biz GARP OE siçanlarının immunizasiyadan sonra TNP-xüsusi IgM səviyyəsində azalma olduğunu aşkar etdik (Şəkil 2F). Bundan əlavə, biz ex vivo dalaq və PP B hüceyrələrində Smad2 və Smad3-ün fosforlaşma vəziyyətini qiymətləndirdik və GARP OE B hüceyrələrində pSmad2/3 səviyyələrində əhəmiyyətli artım olduğunu aşkar etdik (Şəkil 2G). Birlikdə götürdükdə, B hüceyrələrindəki GARP ifadəsinin yüksək TGF-β siqnalının biologiyasını sədaqətlə təkrarladığı qənaətinə gəlirik.

B hüceyrəsi GARP periferik tolerantlığı qoruyur və otoimmünizmin qarşısını alır. Tapıntılarımız indiyə qədər B hüceyrəsi GARP-LTGF-β oxunun TLR vasitəçiliyi ilə əlaqəli otoimmün xəstəliklərin qarşısını almaq üçün bir nəzarət nöqtəsi kimi xidmət etməsi ilə bağlı maraqlı bir ehtimal qaldırdı. Biz bu fərziyyəni genetik olaraq B hüceyrəsinə məxsus GARP-KO siçan modellərində funksiya itkisi tədqiqatlarından istifadə edərək həll etdik. Siçanlarda hər ikisi CD19Lrrc32 7-ci xromosomda, F bölgəsində (47) yerləşərək, CD19-Cre-nin sürücüsü kimi istifadə edir. Lrrc32 silmək çətindir. Bunu aradan qaldırmaq üçün biz qarışıq sümük iliyi kimera (BM kimera) modeli yaratdıq (Şəkil 3A). Əvvəlcə inkişaf etdirdik Rosa26 cre Lrrc32 f/f siçanlar və siçanları tamoksifenlə müalicə edərək GARP-nin silinməsi. Rosa26 WT Lrrc32 f/f siçanlar nəzarət kimi istifadə edilmişdir. Ölümcül şüalanmış WT CD45.1 C57BL6/J siçanları B hüceyrəsi çatışmazlığı olan μMT siçanlarından və tamoksifenlə müalicə olunan qarışıq sümük iliyi hüceyrələri ilə 1:1 nisbətində yenidən quruldu. Rosa26 cre Lrrc32 f/f və ya Rosa26 WT Lrrc32 f/f siçan. Bu modeldə bütün B hüceyrələri ya GARP WT, ya da KO idi və qalan bütün immun hüceyrələrin ən azı 50%-i WT idi. Stabil B hüceyrəsi GARP KO 72 saatlıq LPS ilə müalicə olunan periferik B hüceyrələrində sümük iliyinin bərpasından 3 ay sonra təsdiqləndi (Şəkil 3B).

GARP çatışmazlığı olan B hüceyrələri olan siçanlar spontan lupusa bənzər xəstəlik inkişaf etdirir. (A) Xüsusi B hüceyrəsinin nəslinin sxemi Lrrc32-Qarışıq sümük iliyi kimera (BM kimera) strategiyasından istifadə edən KO siçanları. (B) Sümük iliyinin bərpasından 3 ay sonra B hüceyrələrində effektiv GARP KO-nun təsdiqi. Siçanlardan qan töküldü və PBMC-lər GARP ifadəsini induksiya etmək üçün 72 saat ərzində LPS ilə becərildi. GARP və LAP ifadəsi axın sitometriyası ilə təhlil edilmişdir. nümayəndəsi n = 5 bioloji təkrar. (C) IgM spesifik ANA-lar (1:80 seyreltmə) sümük iliyinin bərpasından 6 ay sonra təhlil edilmişdir (n = 5 WT və n = 6 KO). (D) Seradakı IgG-spesifik ANA-lar Hep-2 slaydlarından istifadə etməklə sümük iliyinin bərpasından 6 ay sonra göstərilən seyreltmələrdə ölçüldü. Nümayəndə şəkillər göstərilir (n = 5 WT və n = 6 KO). Ölçək çubuğu: 50 μm. (EF) Beş μm böyrək bölmələri anti-IgM-FITC ilə boyandı (E) və anti-IgG-FITC (F) glomerulidə Ig çöküntüsünü aşkar etmək. Kəmiyyət və təmsilçi şəkillər göstərilir (n = 5 WT və n = 6 KO). Ölçək çubuğu: 50 μm. (G) Sümük iliyinin yenidən qurulmasından 3 ay sonra siçanların serumunda ümumi Ig ELISA ilə ölçüldü (n = 15 WT və n = 16 KO). (H) Sümük iliyinin bərpasından 3 ay sonra siçanların serumunda IgM, IgG1 və IgG2b səviyyələri ELISA üsulu ilə ölçüldü. (I) BM kimera siçanlarının serasından cəmi IgA ELISA ilə ölçüldü. (J) Bağırsaq bakteriyasına xas IgA sümük iliyinin bərpasından 6 ay sonra siçanların serumunda ölçüldü (n = 5 WT və n = 6 KO). Statistik təhlil 2 tərəfli ANOVA ilə aparılmışdır *P < 0,05. (K) CD19+ hüceyrələri axın sitometriyası ilə dalaq və mezenterik limfa düyünlərində (mLN) aşkar edilmişdir (n = 5). Bütün statistika 2 quyruqlu tərəfindən həyata keçirilir t test, başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə *P < 0,05, **P < 0.01, ***P < 0,001. Səhv çubuqları SD-ni təmsil edir.

Qarışıq BM kimerik siçanları sümük iliyinin yenidən qurulmasından sonra 6 ayda qiymətləndirildi və təəccüblü şəkildə biz BM kimera GARP-KO siçanlarında spontan autoimmunitetin sübutunu tapdıq, o cümlədən ANA (Şəkil 3, C və D), glomerulidə IgM və IgG çöküntüsü. böyrək (Şəkil 3, E və F) və hiperqammaglobulinemiya (Şəkil 3, G və H). Biz həmçinin bağırsaq tolerantlığının itirilməsi səbəbindən bağırsaq keçiriciliyi indeksi kimi serumda bakteriyaya xas olan IgA səviyyələrini ölçdük (48-50). Ümumi IgA-da sistematik bir azalma olsa da (Şəkil 3I), B hüceyrəsinə məxsus GARP-KO siçanlarının bağırsaq bakteriyalarına qarşı IgA səviyyəsində əhəmiyyətli bir artım olduğunu müşahidə etdik (Şəkil 3J).

İkincil immun bölmələrinin təhlili dalaqda CD19 + hüceyrə faizində heç bir fərq göstərmədi, lakin KO siçanlarının mezenterik limfa düyünlərində (mLN) CD19 + hüceyrələrin əhəmiyyətli dərəcədə artması var (Şəkil 3K). Hüceyrədaxili Ki67 tərəfindən müəyyən edildiyi kimi yüksək proliferativ B hüceyrələrində artım mLN və nazik bağırsaqda müşahidə edilmişdir (Əlavə Şəkil 1C əlavə materialı bu məqalə ilə onlayn əldə etmək olar https://doi.org/10.1172/jci.insight.99863DS1). GARP KO siçanlarının selikli qişasında B hüceyrə faizinin və Ki67 + B hüceyrələrinin artmasının müşahidəsi in vivo B hüceyrəsinin genişlənməsinə səbəb olur ki, bu da B hüceyrəsi-intrinsik GARP-nin B hüceyrələrinin yayılması üçün vacib bir mənfi nəzarət nöqtəsi olduğunu güclü şəkildə göstərir. Bundan əlavə, BM kimera GARP-KO siçanlarında dalaq miyeloid hüceyrələrində (Əlavə Şəkil 1A), həmçinin dalaqda, mLN, PP və nazik bağırsaq lamina propriasında Treglərdə (Əlavə Şəkil 1B) artım müşahidə etdik ki, bu da potensial olaraq kompensasiya mexanizmini əks etdirir. B hüceyrə hiperaktivasiyasına cavab olaraq otoimmüniteyi idarə etmək (51, 52). İmmunitet hüceyrələrindəki dəyişikliklərə baxmayaraq, aktiv və ya ümumi TGF-β1-in sistem səviyyəsində heç bir fərq yox idi (Əlavə Şəkil 1D). nin silinməsi qənaətinə gəldik Lrrc32 siçanlarda B hüceyrələrindən Tregs-də kompensasiya artımına baxmayaraq, spontan lupus kimi xəstəliyə səbəb olur.

BM kimera GARP-KO siçanları kimyəvi təsirli eksperimental lupusa qarşı həssaslığı artırdı. Sistemik lupus eritematosusun (SLE) çoxlu spontan və genetik siçan modelləri sistemli otoimmün xəstəliklərin patogenezini araşdırmaq üçün istifadə olunur (53). Əvvəlcə GARP-nin lupusa meylli NZM2410 siçan modelində immun hüceyrələrdə anormal şəkildə ifadə edilib-edilmədiyini araşdırdıq. İnsan tədqiqatlarına bənzər şəkildə, lupusa meylli siçanlarda əvvəlki təcrübələr azalmış TGF-β səviyyələrini nümayiş etdirdi, bu da sistemi immun disregulyasiyaya və otoantikor istehsalına meylləndirdi (54, 55). GARP-nin lupuslu, lakin gənc sağlam siçanlar olmayan 24 həftəlik NZM2410 siçanlarının dalaq bölməsində CD19 + B hüceyrələrində əhəmiyyətli dərəcədə yüksəldiyini aşkar etdik (Əlavə Şəkil 2A). Əlavə araşdırmalar göstərdi ki, marjinal zona B hüceyrə populyasiyası ən yüksək GARP ifadə edir, keçid (CD21 – CD23 –) B hüceyrələrində isə GARP və LAP ifadəsi yoxdur (Əlavə Şəkil 2B).

Daha sonra eksperimental lupusa səbəb olmaq üçün qarışıq BM kimera WT və GARP-KO siçanlarına pristan ilə etiraz etdik. Pristan ilə induksiya olunan lupus (PIL) modeli insan SLE-ni təkrarlayır, çünki onun patogenezi TLR hiperaktivasiyası və təkmilləşdirilmiş tip I IFN imzası ilə verilir (56). WT və ya B hüceyrəli-selektiv GARP-KO BM kimera siçanlarına bir doza pristan i.p. Sümük iliyinin bərpasından 3 ay sonra. GARP-KO siçanlarının pristan inyeksiyasından 2 həftə sonra 3 ayda yüksək olaraq qalan IgG ANA-larını inkişaf etdirdiyini müşahidə etdik (Şəkil 4A). Proteinuriya (Şəkil 4B), IgG (Şəkil 4C) və IgM böyrək çökməsi (Şəkil 4D) kimi otoimmünitetin digər əlamətləri, WT siçanları ilə müqayisədə KO siçanlarında əhəmiyyətli dərəcədə daha aydın idi. BM kimerik siçanları, C57BL6/J fonunda, pristan inyeksiyasına cavab olaraq anti-dsDNA Ig və ya anti-xromatin IgG inkişaf etdirmir (57). SLE xəstələrindəki müşahidələrə bənzər (58, 59), xəstəliyin şiddəti artan GARP-KO siçanlarında ümumi TGF-β1 deyil, aktiv TGF-β1 əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır (Şəkil 4E). Maraqlıdır ki, biz PIL ilə WT siçanlarında yüksək B hüceyrə GARP ifadəsini müşahidə etdik, orijinal müalicədən əvvəl başlanğıcda minimal GARP ifadəsi ilə müqayisədə (Şəkil 4F). PIL modelində C57BL6/J siçanlarının ağciyər alveolyar qanaxmaya meylli olduğu anlayışı ilə razılaşaraq, BM kimera GARP-KO siçanlarının WT siçanları ilə müqayisədə (Şəkil 4G) ağciyər qanamasını və immun hüceyrə infiltrasiyasını artırdığını aşkar etdik (57) .

B hüceyrəsinə xasdır Lrrc32-KO siçanları kimyəvi səbəb olan eksperimental lupusa qarşı həssaslığı artırdı. WT və B hüceyrəsinə məxsus GARP-KO sümük iliyi kimerik siçanlarına 500 μl pristan i.p. sümük iliyinin bərpasından 3 ay sonra. Pristane inyeksiyadan üç ay sonra siçanlar qurban edildi və lupusa bənzər imzanın olması üçün analiz edildi (n = 6 WT və n = 6 KO). (A) Serumda IgG ANA-lar pristan inyeksiyasından 2 həftə 3 ay sonra aşkar edilmişdir. Serum 2 həftəlik analiz üçün 1:80 və 3 aylıq analiz üçün 1:300 nisbətində seyreltildi. (B) Sidik zülalının konsentrasiyası sidik 1:50 nisbətində seyreltilmiş son nöqtədən (pristandan 3 ay sonra) Bradford analizi ilə ölçüldü.n = 4 WT və n = 5 KO), çünki bütün siçanlardan sidik alınmayıb. (CD) IgG (C) və IgM (D) böyrəklərdə çöküntünün miqdarı müəyyən edilmişdir. Nümayəndə şəkillər göstərilir (n = 4 WT və n = 5-6 KO). Ölçək çubuğu: 50 μm. (E) Aktiv və ümumi TGF-β1 səviyyələri ELISA istifadə edərək siçanların seralarında ölçüldü. (F) WT və GARP-KO siçanlarında periferik B hüceyrələrinin səthində GARP və LAP ifadəsi ilkin mərhələdə və pristan müalicəsindən 3 ay sonra ölçüldü və axın sitometriyası ilə təhlil edildi. (G) WT və GARP-KO BM kimera siçanlarının ağciyərləri 4% paraformaldehid ilə perfuziya edilmiş və pristan inyeksiyasından 3 ay sonra rezeksiya edilmişdir. Ağciyərlər kəsilmiş və H&E ilə boyanmışdır. Qara oxlar immun hüceyrə infiltrat qruplarına işarə edir, bu qruplar patoloji göstəricisi ilə ölçülür. Hər bir şəkil 1 siçanı təmsil edir. Ölçək çubuğu: 200 μm. Statistik təhlil 2 quyruqlu tərəfindən aparılmışdır t test *P < 0,05, **P < 0.01, ***P < 0,001. Səhv çubuqları SD-ni təmsil edir.

Erkən otoimmün induksiyanı azaltmaqda B hüceyrəsinə xas GARP-nin ayrılmaz təbiətini təsdiqləmək üçün biz keçdik. hCD20-ER cre transgen siçanlar (60) ilə Lrrc32 f/f yaratmaq üçün siçanlar hCD20-ER cre Lrrc32 f/f siçan. Siçanlar B hüceyrələrində GARP-ı silmək üçün tamoksifenlə müalicə olundu, ardınca lupusun əmələ gəlməsinə səbəb olmaq üçün təmiz inyeksiya edildi (Əlavə Şəkil 3, A və B). Bunu tapdıq hCD20-ER cre Lrrc32 f/f B hüceyrəsinə xas olan GARP-KO siçanları, WT siçanları ilə müqayisədə pristan inyeksiyadan 2 həftə sonra ANA-da əhəmiyyətli bir artım göstərmişdir (Əlavə Şəkil 3, C və D). Birlikdə götürdükdə, GARP-nin B hüceyrəsinə xas silinməsinin siçanlarda həm kortəbii, həm də kimyəvi səbəbli lupusu təşviq etdiyini və GARP ifadəsinin lupusa meylli siçanlarda B hüceyrələrində induksiya olunduğunu nümayiş etdirdik.

Əgər GARP otoimmün xəstəliklərin qarşısının alınması üçün periferik nəzarət nöqtəsidirsə, biz GARP OE-nin siçanlarda PIL-ni azaldacağını güman etdik. Həqiqətən, biz GARP-nin sistemli OE-nin pristan inyeksiyasından sonra 1 ay və 4 ayda IgG ANA-nı azaltdığını aşkar etdik (Əlavə Şəkil 4A). WT siçanları ilə müqayisədə GARP OE siçanlarında IgG glomerulyar çöküntüdə cüzi azalma da olmuşdur (Əlavə Şəkil 4B). GARP OE bu modeldə B hüceyrə bölməsi ilə məhdudlaşmasa da, B hüceyrələri 4 aylıq son nöqtə analizində ən çox dəyişdirilmişlər idi. Dalaqda cücərmə mərkəzi B hüceyrələrinin (GL7 + CD19 +) faizi, həmçinin Ki67 + B hüceyrələrinin faizi (Əlavə Şəkil 4C) əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır. Gr1 + CD11b + qranulositik hüceyrələrin faizi B hüceyrəsinə xas GARP-KO BM kimerik siçanlarında müşahidə olunan qranulositik hüceyrələrin artımından fərqli olaraq GARP OE siçanlarında (Əlavə Şəkil 4D) də əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır (Əlavə Şəkil 1A). PP və mLN-lərdə (Əlavə Şəkil 4E) CD4 + və CD8 + T hüceyrələri bölmələrində dəyişikliklər oldu. GARP OE siçanlarında ümumi TGF-β1 pre-PIL-də əhəmiyyətli artım olsa da, aktiv TGF-β1 həm GARP WT, həm də OE siçanlarında pristan müalicəsindən sonra əhəmiyyətli dərəcədə azaldı (Əlavə Şəkil 4F). Təəccüblüdür ki, GARP OE siçanlarında tolerantlığın təşviqində iştirak edən pristan müalicəsindən sonra serumda həll olunan GARP-də artım müşahidə edilmişdir (Əlavə Şəkil 4G) (13, 34). Beləliklə, GARP-LTGF-β1-in immun tolerantlıqda və sistemli otoimmünitetdəki rolları həm funksiya itirmə, həm də funksiya qazanma tədqiqatları ilə təsvir edilmişdir.

PP B hüceyrələri GARP-LTGF-β oxuna artan həssaslıq vasitəsilə periferik tolerantlığı tənzimləyir. B hüceyrələri (61, 62), həmçinin PP-lər (63) həm özünə, həm də oral antigenlərə qarşı mukozal tolerantlıq üçün tələb olunur. PP-dən olan GARP OE B hüceyrələrinin pSmad2/3 səviyyəsini yüksəltdiyini müşahidə etdik (Şəkil 2G) və B hüceyrəsinə xas GARP-KO siçanlarının ümumi B hüceyrələrində, həmçinin mLN-lərdə Ki67 + B hüceyrələrində əhəmiyyətli artım var, lakin dalaq (Şəkil 3K və Əlavə Şəkil 1C). Bu məlumatlar GARP-LTGF-β oxunun selikli qişa tolerantlığı üçün strateji əhəmiyyətli rol oynaması ilə bağlı maraqlı bir ehtimal yaratdı. Bu fərziyyə ilə razılaşaraq, WT PP B hüceyrələrinin yüksək səviyyələri ifadə etdiyini gördük Lrrc32 dalaq WT B hüceyrələri ilə müqayisədə ilkin transkript (Şəkil 5A). artması ilə uyğundur Lrrc32 ifadə səviyyəsində, PP B hüceyrələri, dalaq B hüceyrələri ilə müqayisədə GARP-ni yüksək səviyyədə tənzimləməklə həm BCR ligasiyasına, həm də TLR stimullaşdırılmasına cavab verdi (Şəkil 5B). Stimulyasiyadan 48 saat sonra anti-μ antikoru və LPS ilə müalicə olunan GARP-KO PP B hüceyrələri WT hüceyrələri ilə müqayisədə proliferasiyanı artırdı (Şəkil 5C), bu da GARP OE B hüceyrələrinin proliferasiyanı azaltdığı tapıntısına uyğundur. 96 saatlıq LPS ilə müalicə olunan PP B hüceyrələrindən IgA ifrazının GARP-KO hüceyrələrində azaldığına dair tapıntı (Şəkil 5D) azalmış avtokrin TGF-β siqnalı ilə də uyğundur.

Peyer patch B hüceyrələri GARP-TGF-β oxuna yüksək həssaslığa malikdir. (A) qRT-PCR analizi Lrrc32 mRNA-da n = Yaşa uyğun 4 aylıq WT və GARP-KO dalaqlarından və Peyer yamaqlarından CD19 + B hüceyrələrinin 3 bioloji təkrarı. nin nisbi ifadəsi Lrrc32 transkriptlər β-aktinə normallaşdırılır. 2 müstəqil eksperimentin nümayəndəsi. (B) WT Peyer yamağı və dalaq CD19 + hüceyrələri anti-μ və ya LPS varlığında 24-96 saat ərzində kultura edildi. Hər zaman nöqtəsində GARP + LAP + hüceyrələrin ümumi CD19 + hüceyrələri üzərində faizi kəmiyyətlə müəyyən edilir (n = 3 bioloji təkrar və 3 müstəqil eksperimentin nümayəndəsi). (C) Hüceyrə nömrələri tripan mavisi istisnasından istifadə edərək 48 saatda ölçüldü (n = 3 bioloji təkrar və 2 müstəqil eksperimentin nümayəndəsi). (D) Peyer patch B hüceyrə supernatantlarının 96 saatlıq hüceyrə mədəniyyətindən alınan IgA səviyyəsi ELISA ilə ölçüldü (n = 5 WT və n = 2 müstəqil təcrübədən birləşdirilmiş 6 KO bioloji təkrar). (E) WT CD19 + hüceyrələri dalaq və Peyer yamaq bölmələrindən təcrid olundu və göstərilən səth markerləri üçün boyandı (n = 4 dalaq və n = 3 PP). Qrafikdəki hər bir nöqtə fərdi bioloji təkrarı təmsil edir. MFI, orta floresan intensivliyi. (F) Dalaq və Peyer yamaqlarından olan CD19 + B hüceyrələri 96 saat ərzində anti-μ antikor və ya LPS ilə müalicə olundu. Smad2/3 fosforilasiyası axın sitometriyası ilə ölçüldü. Qrafik məlumatlar pSmad2/3 MFI-ni təmsil edir n = 3 bioloji təkrar. (G) WT və KO Peyer yamaq B hüceyrələri arasında pSmad2/3 fərqlərinin reprezentativ histoqramı (n = 2 müstəqil təcrübəni təmsil edən 3 bioloji təkrar). (H) Peyer yamaqlarından olan CD19 + B hüceyrələri serum ac qaldı və TGF-βRI inhibitoru (“i”) ilə və ya onsuz TGF-β (“β”) ilə 1 saat müalicə olundu. Smad2/3 fosforilasiyası axın sitometriyası ilə ölçüldü. Nömrələr pSmad2/3 MFI-ni göstərir. Məlumatlar 3 müstəqil eksperimentin nümayəndəsidir. Statistik təhlil 2 quyruqlu tərəfindən aparılmışdır t test *P < 0,05, **P < 0.01, ***P < 0,001. Səhv çubuqları SD-ni təmsil edir.

Mukoza toxumaları aktiv TGF-β və əlaqəli kofaktorlar (məsələn, retinoik turşu, BAFF və APRIL) ilə yüksək dərəcədə zənginləşdirilmişdir, bu da bağırsaqla əlaqəli limfoid toxumalarda IgA CSR-nin digər ikincili limfoid orqanlarla müqayisədə niyə daha aydın olduğunu izah edir (64). Əsas odur ki, bağırsaq B hüceyrələri avtokrin şəkildə TGF-β istehsal edir (65, 66). Fenotipik analiz WT dalaq və PP B hüceyrələri arasında ilkin fərqləri, o cümlədən PP B hüceyrələrində CD1d, MHC sinif I, MHC sinif II, CD40 və CD86 ifadəsini aşkar etdi (Şəkil 5E), bu da PP bölməsindəki B hüceyrələrinin daha çox olduğunu göstərir. dalaq B hüceyrələrindən daha çox antigenlərə cavab verməyə hazırlaşır. PP B hüceyrələrində proliferasiya və IgA CSR-dəki dəyişiklikləri GARP-TGF-β oxu ilə əlaqələndirmək üçün biz 96 saat ərzində anti-μ antikor və ya LPS ilə müalicə olunan GARP KO B hüceyrələrinə qarşı WT-də pSmad2/3 səviyyələrini qiymətləndirdik. WT hüceyrələrində yüksək endogen GARP ifadəsi. WT və KO dalaq və PP B hüceyrələrinin ex vivo təhlili göstərdi ki, GARP çatışmazlığı olan PP B hüceyrələri pSmad2/3 siqnalında (Şəkil 5, F və G) əhəmiyyətli azalma nümayiş etdirir, dalaq B hüceyrələrində isə bu GARP əsaslı fərq yoxdur. . PP WT və GARP-KO B hüceyrələri ekzogen TGF-β-ya bərabər cavab verdi (Şəkil 5H), TGF-β siqnal mexanizminin deyil, TGF-β bioavailability GARP ifadəsi ilə təsirləndiyini göstərir.

GARP-TGF-β-nın hüceyrə səthinin PP B hüceyrə biologiyasına dərin təsiri daha sonra BM kimera GARP-KO siçanlarında in vivo aşkar edilmişdir. GARP-nin B hüceyrələrindən silinməsi siçanlarda PP-lərin əhəmiyyətli dərəcədə artması ilə nəticələndi (Şəkil 6A). Sümük iliyinin bərpasından 6 ay sonra Ki67 + boyanması ilə ölçüldüyü kimi, PP-lərin daha çox sayı, həmçinin artan PP hüceyrəliliyi (Şəkil 6B) və yüksəlmiş CD19 + B hüceyrə proliferasiyası ilə əlaqələndirilir (Şəkil 6C). Əksinə, GARP OE PP-lərin ümumi sayını (Əlavə Şəkil 5A), B hüceyrələrinin faizini (Əlavə Şəkil 5B) və B hüceyrə Ki67 + ifadə səviyyəsini (Əlavə Şəkil 5C) azaldıb. B hüceyrə homeostazının itirilməsinin əlavə sübutu kimi, BM kimera GARP-KO siçanlarında kiçik bağırsaq uzunluğunun artdığı (Şəkil 6D), eləcə də daha böyük PP-lərin (Şəkil 6E) olduğu müşahidə edildi. Nəcis IgA səviyyələri (Şəkil 6F) və PP-lərdə IgA istehsal edən hüceyrələrin sayı (Şəkil 6G) WT siçanları ilə müqayisədə GARP-KO siçanlarında nəzərəçarpacaq dərəcədə azalmışdır. PP B hüceyrələrinin TGF-β-yə artan reaksiyası, dalaq B hüceyrələri ilə müqayisədə TGF-βRII ifadəsinin əhəmiyyətli dərəcədə artması ilə izah olunur (Əlavə Şəkil 5D). Qeyd edək ki, WT və OE B hüceyrələri arasında TGF-βRII mRNA səviyyəsində heç bir fərq olmasa da, GARP OE B hüceyrələrində TGF-β siqnal yolunda aşağı axın hədəfi olan p21-də əhəmiyyətli artım var (Əlavə Şəkil 5D).

B hüceyrəsinə xasdır Lrrc32 –/– siçanlarda Peyer yamağı B hüceyrə hiperplaziyası və selikli qişanın IgA-nın azalması var. Peyer yamaqları 6 aylıq BM kimera siçanlarında təhlil edildi. (A) Yaşa uyğun gələn 6 aylıq dişi WT və KO BMC siçanları arasında Peyer yamaqlarının ümumi sayındakı fərqlər (n = 5 WT və n = 6 KO bioloji təkrar 2 müstəqil eksperimentin nümayəndəsi). (B) WT və KO BMC siçanları arasında Peyer yamaqlarının hüceyrəliliyindəki fərqlər (n = 5 WT və n = 6 KO bioloji təkrar 2 müstəqil eksperimentin nümayəndəsi). TNC, ümumi nüvəli hüceyrələr. (C) Sümük iliyinin bərpasından 6 ay sonra WT və KO siçanlarının Peyer yamaqlarından CD19 + hüceyrələrində Ki67 ifadəsinin axın sitometriyası ilə ölçülməsi (n = 3 təkrar). 3 müstəqil eksperimentin nümayəndəsi. (D) Sümük iliyinin bərpasından 6 ay sonra WT və KO siçanlarında ümumi nazik bağırsaq uzunluğunun (duodenumdan ileum) kəmiyyəti (n = 5 WT və n = 6 KO bioloji təkrar). 2 müstəqil eksperimentin nümayəndəsi. (E) Sümük iliyinin bərpasından 6 ay sonra GARP WT və KO siçanlarının Peyer yamaqları arasında ölçü fərqlərinin təsviri təsvirləri (n = 5). Ölçək çubuğu: 0,5 mm. (F) WT və GARP-KO BM kimera siçanlarından alınan nəcis IgA səviyyələri sümük iliyinin bərpasından 6 ay sonra ELISA ilə ölçüldü (n = 5 WT və n = 7 KO bioloji təkrar). (G) WT və KO BM kimera siçanlarından təzə dondurulmuş Peyer yamaq bölmələrində IgA IHC. Nümayəndə şəkilləri n = 3 bioloji təkrar. Ölçək çubuğu: 20 μm. Statistik təhlil 2 quyruqlu tərəfindən aparılmışdır t test *P < 0,05, **P < 0.01, ***P < 0,001. Səhv çubuqları SD-ni təmsil edir.

B hüceyrəsi-intrinsik GARP oral tolerantlıq üçün əvəzolunmazdır. Biz daha sonra bir neçə səbəbə görə B hüceyrəsi-intrinsik GARP-nin oral tolerantlıqda roluna toxunduq: birincisi, PP B hüceyrələri GARP tərəfindən tənzimlənməyə daha həssas görünür, ikincisi, oral tolerantlıq üçün PP-lər tələb olunur (67) və üçüncüsü, GARP-TGF Sistemli tolerantlığın qorunması üçün B hüceyrələrində -β oxu lazımdır. Bu məqsədlə, ağız tolerantlığının GARP + B hüceyrələri tərəfindən həyata keçirildiyini müəyyən etmək üçün cücə ovalbumin (OVA) oral tolerantlıq modelindən (Şəkil 7A) (68, 69) istifadə etdik. BM kimera WT siçanları immunizasiyadan əvvəl yüksək dozalı oral OVA-ya qarşı dözümlü olsalar da, BM kimera GARP-KO siçanlarında anti-OVA antikoru ilə ölçülən sistemli OVA-xüsusi antikor reaksiyasında əhəmiyyətli bir azalma olmadı (Şəkil 7B) və OVA spesifik antikor əmələ gətirən hüceyrələr (AFC) (Şəkil 7C). OVA-nın T hüceyrəsindən asılı antigen olması ilə uyğun olaraq, B hüceyrəsinə məxsus GARP-KO siçanlarının antigenə spesifik T hüceyrə reaksiyasını xeyli artırdığını gördük. Əhəmiyyətli olan odur ki, antigenin əvvəlcədən oral tətbiqi KO siçanlarında yüksəlmiş T hüceyrə reaksiyalarına dözə bilmədi (Şəkil 7D). Proksimal nazik bağırsağın patoloji təhlili daha sonra BM kimera GARP-KO siçanlarında tolerantlığın itirilməsinə dair sübutlar nümayiş etdirdi (Şəkil 7E). Belə nəticəyə gəlirik ki, B hüceyrəsi-intrinsik GARP oral tolerantlıqda mühüm rol oynayır.

B hüceyrəsi-intrinsik GARP oral tolerantlıq üçün əvəzolunmazdır. (A) Şifahi tolerantlıq modelinin sxemi. Nəzarət olaraq siçanlara 25 mq OVA (tolerasiya edilmiş) və ya PBS (tolerant deyil) vasitəsilə verildi, bundan sonra bütün siçanlar 100 μl CFA s.c-də emulsiya edilmiş 100 μq OVA qəbul etdilər. Son nöqtə analizi siçanlar qurban verildiyi 21-ci gündə baş verdi. (B) ELISA metodu ilə siçanların serasında OVA spesifik IgG və IgM aşkar edilmişdir (n = 4-5 bioloji təkrar). (C) Dalaq mononükleer hüceyrələr mexaniki ayırma yolu ilə siçanlardan əldə edilmiş və sonra 20 saat ərzində OVA ilə örtülmüş ELISPOT lövhələrində becərilmiş, sonra siçan əleyhinə IgG1 və IgM ilə aşkar edilmişdir. Kəmiyyət məlumatları və təmsil quyu şəkilləri göstərilir. (D) CD4 + T hüceyrələri WT və KO-ya dözümlü və dözülməz siçanların dalaqlarından maqnit muncuq-müsbət seçim yolu ilə təcrid edilmişdir. CD4 + T hüceyrələri 4 gün ərzində OVA-nın iştirakı ilə şüalanmış WT sadəlövh splenositləri ilə 1:1 nisbətində becərildi. Heç bir müalicə (NT) OVA olmadan yetişdirilmiş CD4 + hüceyrələri göstərir. Supernatantlar toplandı və IL-6 və IFN-γ səviyyələri ELISA ilə ölçüldü. (E) Proksimal (duodenum) nazik bağırsaq toxumaları sabitləndi və kəsildi, ardınca H&E boyandı. Nümayəndə şəkilləri onikibarmaq bağırsağın villisini göstərir. Müalicəyə kor olan bir patoloq tərəfindən təhlil edilən patoloji skorunun qrafik analizi göstərilir. Statistik təhlil 2 quyruqlu tərəfindən aparılmışdır t test (BC) və Tukey-nin çoxsaylı müqayisələri ilə 1-yollu ANOVA (DE) *P < 0,05, **P < 0.01, ***P < 0,001. Səhv çubuqları SD-ni təmsil edir.

TGF-β immun hüceyrə inkişafında, homeostazda və tolerantlıqda kritik rolu olan pleiotropik sitokindir (20). Bununla belə, xüsusilə GARP vasitəsilə tənzimləmə kontekstində çoxlu cavabsız suallar qalmaqdadır. Tədqiqatımız hüceyrə səthi ifadəsinin molekulyar əsaslarını başa düşmədiyi üçün bu sahədən bu qədər uzun müddət qaçan periferik immun tolerantlıqda hüceyrə səthi TGF-β ilə məşğul olur. Bu yaxınlarda, TGF-β, GARP üçün hüceyrə səthi dok reseptorunun ifadəsi Tregs (3, 4, 10), trombositlər (4, 7) və xərçəng hüceyrələrində (13) təsvir edilmişdir. GARP-ın toxunulmazlıqdakı rollarını araşdırarkən, GARP-nin sistemli otoimmün xəstəliklərdə periferik B hüceyrələrində əhəmiyyətli dərəcədə tənzimləndiyini və GARP ifadəsinin hüceyrə səthində TGF-β varlığının əsasını təşkil etdiyini aşkar etdik. Əhəmiyyətli olan odur ki, TLR4, TLR7 və TLR9 üçün liqandlar da daxil olmaqla çoxsaylı MyD88-dən asılı TLR liqandlarının (70) normal B hüceyrələrində GARP səthinin ifadəsini idarə edərək, aktivləşdirilmiş B hüceyrələrində GARP-TGF-β oxunun maraqlı bir ehtimalını artırdığını aşkar etdik. B hüceyrəsinin periferik tolerantlığını qorumaq üçün nəzarət nöqtəsidir. Biz bu fərziyyəni GARP şərti KO və OE sistemləri də daxil olmaqla çoxsaylı genetik modellərdən istifadə edərək tənqidi şəkildə nəzərdən keçirdik. Biz qəti şəkildə nümayiş etdirdik ki, (a) B hüceyrələrindən GARP itkisi siçanlarda kortəbii və kimyəvi səbəbli lupusa bənzər xəstəliyi təşviq edir (b) GARP artımı T hüceyrəsindən müstəqil antikor istehsalını və B hüceyrələrinin yayılmasını azaldır, eyni zamanda IgA CSR (c) PP B hüceyrələri proliferasiyanı, IgA istehsalını tənzimləmək üçün xüsusilə GARP-TGF-β oxundan asılıdır və beləliklə, tolerantlıq və B hüceyrələrində (d) GARP T hüceyrəsindən asılı antigenlərin oral tolerantlığında əvəzsiz rol oynayır.

Mexanik olaraq, B hüceyrəsi-intrinsik GARP-TGF-β oxunun periferik B hüceyrə tolerantlığı üçün vacib olmasının bir çox mümkün səbəbləri var. Birincisi, TLR liqandları tərəfindən induksiya edilən GARP ifadəsi TGF-β-nin avtokrin antiproliferativ təsiri ilə B hüceyrələrinin aktivləşdirilməsinin nəzarətdən çıxmamasını təmin edir. İkincisi, GARP TGF-β fəaliyyətini artırmaq yolu ilə IgA CSR-ni təşviq edir, bu, son in vitro tədqiqat (44) tərəfindən təklif olunur və indi otoimmün xəstəliklər kontekstində in vivo olaraq selikli qişada IgA istehsalının öyrənilməsi ilə qəti şəkildə aşkar edilir. Mukozal IgA istehsalı, təsadüfən bağırsaq epitelinin maneələrini keçən patogenlərə və ya kommensal bakteriyalara qarşı selikli qişanın müdafiəsində mühüm rol oynayır (71-73). Üçüncüsü, GARP ifadəsi TLR ilə aktivləşdirilmiş B hüceyrələrinin TGF-β-dan asılı mexanizm vasitəsilə proinflamatuar sitokinlər istehsal etmək qabiliyyətini də maneə törədə bilər ki, bu da laboratoriyamızda fəal şəkildə tədqiq olunur.

İşimizin ən təəccüblü tapıntılarından biri odur ki, PP B hüceyrələri homeostaz üçün dalaq B hüceyrələri ilə müqayisədə GARP-TGF-β oxundan daha çox asılıdır. GARP olmadan, PP B hüceyrələri gücləndirilmiş proliferasiya və aktivləşməyə məruz qalır, lakin bu B hüceyrələrinin IgA istehsal edən hüceyrələrə diferensiallaşma qabiliyyəti pozulur. Bu məlumatlar göstərir ki, PP-lər selikli qişanın B hüceyrə tolerantlığı üçün kritik orqanlardır. PP limfoid orqanları təhlükəli vəziyyətdədirlər, çünki onlar bağırsaq mikrobiomu vasitəsilə daim müxtəlif səviyyələrdə TLR agonistlərinə məruz qalırlar (74). PP B hüceyrələrinin GARP-TGF-β oxu kimi daha möhkəm periferik tolerantlıq mexanizmləri ilə təchiz edilməsi teleoloji məna daşıyır. İnsanlarda B hüceyrələrinin klonal paylanmasının son hərtərəfli tədqiqi iki geniş klonal şəbəkə aşkar etdi: biri qan, sümük iliyi, dalaq və ağciyərləri əhatə edir, digəri isə mədə-bağırsaq traktının toxumaları ilə məhdudlaşır (75).Qrup, mədə-bağırsaq traktının klonlarının daha yüksək somatik hipermutasiya tezliyinə malik olduğunu müşahidə etdi ki, bu da özünü və oral antigenləri tolerasiya etmək üçün PP immun bölməsində GARP üçün artan əhəmiyyətin bioloji əhəmiyyətini göstərir. Bu arqumentin əlavə sübutu 2016-cı ildə GWAS-ın araşdırmasında tapıldı: the C11orf30-LRRC32 lokus iltihablı bağırsaq xəstəlikləri və allergiya kimi bir çox "immunitetlə əlaqəli fenotiplər" ilə əlaqələndirilir (76-78).

Lupusun siçan modellərində B hüceyrələrində GARP-nin artan ifadəsi var. Tədqiqatımızda aşkar edilmiş B hüceyrə GARP-nin tolerogen rollarına əsaslanaraq, otoimmün şəraitdə GARP-nin yüksəldilməsinin B hüceyrələrini normal homeostazaya qaytarmaq üçün kompensasiya mexanizmini təmsil etdiyinə inanırıq. Bu, TLR siqnalının lupusda (79, 80) üstünlük təşkil etməsi, həm də GARP ifadəsini induksiya etməsi faktı ilə tamamilə uyğundur. Bu əsaslandırma gələcək tədqiqatların iki mühüm xəttini tələb edir: birincisi, GARP-ni tənzimləyə bilməyən və beləliklə daha pis klinik xəstəliklər inkişaf etdirə bilməyən SLE xəstələri varmı? İkincisi, bioloji cəhətdən aktiv həll olunan GARP otoimmün xəstəliklər üçün terapevtik olaraq istifadə edilə bilərmi? Sıçan xərçəngi modellərində GARP-nin antikor vasitəsilə bloklanmasının faydalı olduğu nümayiş etdirilmişdir (13, 36). TGF-β-nin multifaktorial funksiyalarına görə, TGF-β-ni birbaşa klinikada hədəfləmək çətindir (81). GARP əsaslı terapevtik strategiya klinikada otoimmunitetin müalicəsi üçün daha məqsədəuyğun bir üsul ola bilər, lakin xərçəngə qarşı immun nəzarəti və immun dözümlülüyü arasında tarazlığı saxlamaq lazım olduğu üçün ehtiyatlı olmaq lazımdır.

Tədqiqatda maraqlı tapıntıların olmasına baxmayaraq, B hüceyrə GARP və tolerantlıq kontekstində hələ də bir çox suallar qalmaqdadır. NF-κB çoxlu MyD88-dən asılı TLR siqnal kaskadlarının ümumi aşağı axını molekuludur (70). Mümkündür ki, TLR siqnalı NF-κB vasitəsilə GARP ifadəsini induksiya edir. Lrrc32 ( 82 ). Bununla belə, GARP-nin TLR yolları ilə necə tənzimləndiyini aydınlaşdırmaq üçün əlavə araşdırma lazımdır. GARP-nin TGF-β1, TGF-β2 və TGF-β3-ə bağlanması məlumdur (45). İstirahət vəziyyətində olan B hüceyrələrinin aktivləşdirilmiş B hüceyrələrindən daha yüksək səviyyədə TGF-β3 ifadə etdiyinə və TGF-β3-dən asılı mexanizmdə Treg populyasiyalarını genişləndirə bildiyinə dair sübutlar var (83). Bununla belə, GARP istirahət edən B hüceyrələri ilə ifadə olunmur, bu da bizi GARP-nin B hüceyrələrində tənzimləyici rollarını yerinə yetirmək üçün TGF-β3 deyil, ilk növbədə TGF-β1 və TGF-β2 izoformalarının bioavailability tənzimlədiyinə inanmağa vadar edir. Bundan əlavə, bu iş mərkəzi B hüceyrə dözümlülüyünə deyil, periferik tolerantlığa yönəlmişdir, çünki ilk növbədə sümük iliyində yetişməmiş B hüceyrələrində GARP aşkar edilməmişdir. Bununla belə, sümük iliyindəki B hüceyrələrinin mənfi seçimində TGF-β-nin mərkəzi rollarını nəzərə alsaq (84), prosesdə GARP-nin rollarını tamamilə istisna etmək olmaz. Nəhayət, bu iş tolerantlığın tənzimlənməsində GARP-nin B hüceyrəsinin daxili roluna diqqət yetirdi, lakin B hüceyrələri də T hüceyrələri ilə qarşılıqlı əlaqə vasitəsilə tolerantlığı tənzimləyə bilər. Məsələn, LPS ilə astarlanmış B hüceyrələri CD8 + T hüceyrələrinin anti-Ig/anti-CD40-stimullaşdırılmış B hüceyrələrindən daha az güclü stimulyatorlarıdır ki, bu da TGF-β1-dən asılı mexanizmi göstərir (85).

Bu, hüceyrə səthinin GARP-TGF-β oxunun avtokrin TGF-β siqnalı vasitəsilə B hüceyrəsi-intrinsik şəkildə sistem tolerantlığını modullaşdırdığını nümayiş etdirən ilk araşdırmadır. Nəticəmizi bir neçə genetik strategiya vasitəsilə əldə etdik. Biz gözləyirik ki, bu tədqiqat insan otoimmün xəstəliklərinin patogenezində GARP-ın rolu, eləcə də otoimmün xəstəliklər üçün yeni diaqnostik və terapevtik strategiya kimi GARP-nin hədəflənməsi imkanları ilə bağlı əlavə araşdırmalar üçün başlanğıc nöqtəsi olacaqdır.

Siçan. Biz “Flexible Accelerated STOP TetO knockin system” (İngenious Targeting Laboratory) istifadə edərək induksiv GARP OE siçan modelini hazırladıq ( 86 ). GARP-FAST siçan modelinin inkişafı daha əvvəl təsvir edilmişdir (45). GARP OE 1% saxaroza içməli suda doksisiklin (50 μg/ml MilliporeSigma) ilə induksiya edilmişdir. Lrrc32 flox/flox siçanlar Rikendən (9) alınmış və onlarla çarpazlaşdırılmışdır Roza 26-ER cre siçanları (Jakson Laboratoriyası) tamoksifenlə səbəb olan ümumi bədənli GARP-KO siçanlarını yaratmaq üçün. hCD20-ER cre Lrrc32 f/f siçanlar keçid yolu ilə yaradılıb hCD20-ER cre daha əvvəl təsvir edilmiş siçanlar (60) ilə Lrrc32 f/f siçan. Hər iki modeldə GARP KO induksiyası i.p. fıstıq yağında həll edilmiş tamoksifen (MilliporeSigma) inyeksiyası. Siçanlar 7 gün ərzində gündəlik 5 mkq/q bədən çəkisi dozası qəbul etdilər. C57BL6/J və μMT siçanları Cekson Laboratoriyasından alınıb. NZM2410 siçanları Qari Gilkesondan (Cənubi Karolina Tibb Universiteti [MUSC]) hədiyyə olub. B hüceyrəsinə xas sümük iliyi kimera siçanları ölümcül şüalanma (2 doza 550 Gy, 6 saat ara ilə) CD45.1 C57BL6/J dişi siçanlarla yaradılıb. Ölümcül şüalanmadan iyirmi dörd saat sonra siçanlar i.v. μMT-dən 2 × 10 6 sümük iliyi hüceyrələri ilə enjekte edilmiş və tamoksifenlə müalicə edilmişdir Rosa26 cre Lrrc32 f/f və ya Rosa26 WT Lrrc32 f/f siçanlar 1:1 nisbətində qarışdırılır. NZM2410 ştammı istisna olmaqla, bütün siçanlar təmiz C57BL6/J fonunda idilər və təcrübələr üçün yaşa uyğunlaşdırılmışdılar. Başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə, siçanlar təcrübələr üçün 6 həftə ilə 6 ay arasında idi. Dişi siçanlar kişi siçanlarda müşahidə edilən otoimmunitetin aşağı nisbətinə görə bütün lupus və tolerantlıq təcrübələri üçün istifadə edilmişdir.

İnsan nümunələri. Sağlam nəzarətlərdən identifikasiya edilmiş tam qan nümunələri MUSC Multidissiplinar Klinik Tədqiqat Mərkəzindən heparinlə örtülmüş borularda qəbul edilmişdir. Periferik qan limfositləri Ficoll-Paque PLUS gradientindən (GE Healthcare) istifadə edərək təcrid edilmişdir.

Hüceyrə mədəniyyəti. Təmizlənmiş siçan B hüceyrələrini əldə etmək üçün dalaqlar və PP-lər aseptik şəkildə təcrid olunmuş və tək hüceyrəli suspenziya əldə etmək üçün 40 μM filtrdən əzilmiş və RBC-ni lize etmək üçün ACK tamponu (MilliporeSigma) ilə müalicə edilmişdir. Siçan B hüceyrələri istehsalçının protokoluna (Miltenyi Biotec) uyğun olaraq siçan CD19 + maqnit muncuqlarından istifadə edərək splenositlərdən və ya PP limfositlərindən təcrid olundu. İnsan CD19 + maqnit muncuqları (Miltenyi Biotec) insan PBMC-lərindən B hüceyrələrini təcrid etmək üçün istifadə edilmişdir. Bütün təcrübələrdə hüceyrələr 10% FBS (Atlas Biologicals), 1% penisilin/streptomisin (ThermoFisher) və 0,1% 2-merkaptoetanol (MilliporeSigma) ilə əlavə edilmiş RPMI (Corning) içərisində becərildi. Siçan B hüceyrələri anti-μ (5 μg/ml, başqa cür qeyd edilmədiyi təqdirdə Jackson ImmunoResearch), LPS (10 μg/ml) ilə müalicə olundu. E. coli 055:B5, MilliporeSigma), R848 (2,5 μg/ml InvivoGen) və ya CpG (1 μM, BW-006 InvivoGen). Ekzogen TGF-β müalicəsi və TGF-βRI inhibisyonu ilə aparılan təcrübələrdə hüceyrələr 2 ng/ml TGFβ1 (PeproTech) əlavə edilməzdən əvvəl DMSO-da (SB 431542 hidrat, MilliporeSigma) həll edilmiş TGF-βRI inhibitoru ilə 1 saat müalicə olundu.

Lupus induksiyası və otoimmün analiz. Dişi BM kimera və ya doksisiklinlə müalicə olunan GARP OE siçanlarına tək i.p. pristan inyeksiyası (500 μl/20 q siçan MilliporeSigma). GARP OE və WT tullantıları təcrübə boyu içməli suda doksisiklin (50 μg/ml) ilə qidalandırılmışdır.

ANA. ANA-lar NOVA Lite Hep-2 slaydlarından (Inova Diaqnostika) və FITC ilə birləşdirilmiş siçan əleyhinə IgG və ya anti-siçan IgM antikorundan (ThermoFisher) istifadə edərək aşkar edilmişdir. Serum PBS-də göstərilən nisbətlərdə seyreltildi. Floresan intensivliyi kor şəkildə təhlil edildi və əvvəllər təsvir edildiyi kimi Zeiss mikroskopunda 0-4 miqyasında qeyd edildi (87).

İmmunitet çökməsi. Böyrəklərdə immun çöküntü Cryomatrix məhluluna (ThermoFisher) daxil edilmiş təzə dondurulmuş böyrək bölmələrindən istifadə edərək təhlil edilmişdir. Slaydlar buz kimi soyuq asetonda bərkidildi və sonra M.O.M. dəst (Vektor Laboratoriyaları). Slaydlar otaq temperaturunda 30 dəqiqə ərzində IgM-FITC və ya IgG-FITC anticisimləri (ThermoFisher) ilə boyandı və sonra solmaya qarşı montaj mühiti (Southern Biotech) ilə örtüldü. 25 üst-üstə düşməyən glomerulinin flüoresan intensivliyi, əvvəllər təsvir edildiyi kimi böyrək çökmə xalını əldə etmək üçün orta hesabla götürüldü (88).

Sidik proteini. Siçanlardan 3 aylıq son nöqtədə sidik toplandı. Protein konsentrasiyası PBS-də seyreltilmiş 1:50 sidik və BSA standart əyrisindən istifadə edərək Bradford analizi (Bio-Rad) ilə ölçüldü.

Histologiya. Siçan ağciyərləri rezeksiyadan əvvəl 10% formalinlə perfuziya edilib və 4% formalinlə fiksasiya edilib. Sabit ağ ciyərlər parafinə yerləşdirildi, bölmələrə bölündü və standart H&E boyama protokoluna uyğun olaraq boyandı.

Axın sitometriyası. Dalaqlar, mLN-lər və PP-lər təkhüceyrəli suspenziyaya ayrıldı və splenositlər RBC lizis tamponu (MilliporeSigma) ilə qırmızı qan hüceyrələri ilə tükəndi. Fc-reseptor blokundan sonra hüceyrələr FACS tamponunda səth markerləri üçün boyandı. Siçan CD4 (klon RM4-5), FoxP3 (FJK-16), CD11b (M1/70), GARP (YGIC86), LAP (TW7-16B4), IgD (11 - 26), IgM (eb121-15F9) əleyhinə antikorlar , CD23 (B3B4), CD86 (GL1), MHC-I (SF-1.1.1), MHC-II (M5/114.15.2), CD44 (IM7), CD62L (MEL-14), PD-L1 (B7) -H1), CD1d (L363), Helios (22F6) və CD5 (53-7.3) ThermoFisher-dən alınıb. Anti-siçan CD8a (53-6.7), Gr1 (RB6-8C5), CD21 (7G6), CD80 (16-10A1), PD-1 (J43), Ki67 (SolA15) və pSmad (O72-670) alınıb. BD Biosciences-dən. Anti-siçan B220 (RA3-6B2), CD19 (6D5) və GL7 BioLegend-dən alınıb. Bütün hüceyrədaxili boyanma kommersiya FoxP3/Transkripsiya Faktoru Boyama Bufer Dəsti (Affymetrix) istifadə edərək həyata keçirilmişdir. pSmad2/3 təhlili istehsalçının protokoluna (BD) uyğun olaraq BD Phosflow bufer dəstlərindən istifadə etməklə həyata keçirilib. Nümunələr BD LSR sitometrində təhlil edildi və FlowJo Software (Tree Star) tərəfindən təhlil edildi. Təhlil edilən hüceyrələrin canlılığı 7-AAD və ya Fixable Canlılıq Boyasının (Affymetrix) olmaması ilə göstərildiyi kimi, təklilər və canlı hüceyrələr üzərində qapılar vasitəsilə təmin edilmişdir.

TNP-ficoll immunizasiyası. Doksisiklinlə müalicə olunan WT və GARP OE siçanlarından serum toplamaq üçün ilkin mərhələdə üz venasından qan töküldü və periton boşluğuna yeridilmiş TNP-AECM-Ficoll (PBS Biosearch Technologies-də 50 μq/ml) ilə immunizasiya edildi. Siçanlar 5 həftə ərzində həftəlik qanaxma aparıblar. TNP-ficoll-spesifik IgM antikor səviyyələri ELISA ilə aşkar edilmişdir. ELISA plitələri (Corning) gecə ərzində 4°C-də TNP-fikolla (PBS-də 50 μg/ml) ilə örtülmüş, ardınca 3 saat ərzində 1% BSA ilə bloklanmışdır. Seyreltilmiş zərdab 1 saat otaq temperaturunda inkubasiya edildi, silkələnmə zamanı TNP-ə xas IgM antikorları siçan əleyhinə IgM-HRP (Cənubi Biotech) ilə aşkar edildi.

Şifahi tolerantlıq modeli. Beş aylıq yenidən qurulmuş dişi sümük iliyi kimera WT və GARP-KO siçanları oral gavage vasitəsilə nəzarət olaraq ya 25 mq OVA peptid (MilliporeSigma) və ya PBS ilə qidalandı. Yeddi gün sonra həm OVA, həm də PBS ilə müalicə olunan siçanlara 100 μl Tam Freund Adjuvantı (InvivoGen) s.c.-də emulsiyalaşdırılmış 100 μg OVA peptid (BioVendor) verildi. Siçanlar s.c.-dən 14 gün sonra qurban verildi. immunizasiya. Serum OVA-xüsusi IgM və IgG ELISA, eləcə də ELISPOT və OVA-induksiya etdiyi CD4 + T hüceyrə sitokin istehsalı analizi üçün splenositlər üçün toplandı.

ELİSPOT. Tolerasiya edilmiş (OVA gavage və OVA-CFA s.c. immunizasiya) və dözülməmiş (PBS gavage və OVA-CFA s.c. immunizasiya) WT və GARP-KO BM kimera siçanlarından alınan dalaqlar tək hüceyrəli suspenziyaya püresi edilmişdir. Hüceyrələr 30% etanol ilə aktivləşdirilən və 100 μg/ml OVA ilə əvvəlcədən örtülmüş yüksək proteinli İmmobilon-P (Millipore) plitələrində 1 × 10 6 hüceyrə/çuxurda örtülmüşdür. Hər siçandakı splenositlər üç nüsxədə becərildi və 20 saat 37°C-də inkubasiya edildi. Plitələr 3 dəfə PBS ilə yuyulduqdan sonra 0,5% Tween-20 ilə PBS ilə 3 dəfə yuyuldu, sonra ya siçan əleyhinə IgG1-HRP, ya da siçan əleyhinə IgM-HRP aşkarlama antikorları 2 saat ərzində əlavə edildi. Sonrakı yuyulmadan sonra, AECM substratı (MilliporeSigma) əlavə edildi və rəng inkişaf etdikdən sonra distillə edilmiş su ilə reaksiya dayandırıldı. Şəkillər və kəmiyyət müəyyənləşdirilməsi AID EliSpot Reader System ELR04 (Autoimmun Diagnostika GmbH) istifadə edərək həyata keçirilib.

OVA-induksiya etdiyi CD4 + T hüceyrəsi sitokin istehsal analizi. CD4 + T hüceyrələri anti-siçan CD4 + MACS muncuqlarından (Miltenyi Biotech) istifadə edərək RBC tükənmiş splenositlərdən təcrid edilmişdir. Tolerasiya edilmiş və dözülməmiş WT və GARP-KO siçanlarından təmizlənmiş CD4 + T hüceyrələri antigen təqdim edən hüceyrələrin mənbəyini təmin edən WT ilə şüalanmış müalicə olunmamış splenositlərlə 1:1 nisbətində becərildi. Hər quyuya 100 μg/ml OVA peptidi əlavə edildi və hüceyrələr 37°C-də 96 saat inkubasiya edildi. Supernatantlar toplanmış və ELISA ilə IL-6 və IFN-γ üçün təhlil edilmişdir.

ELISA. Hüceyrə mədəniyyəti supernatantlarında və serumda aktiv və ümumi TGF-β1-ni ölçmək üçün ELISA plitələri (Corning) gecə ərzində 4°C-də anti-siçan/insan TGF-β1 tutma antikoru (BioLegend) ilə örtülmüş, sonra 1% BSA ilə bloklanmışdır. otaq temperaturunda 1 saat. Nümunələr HCl ilə 10 dəqiqə müalicə olundu və ümumi TGF-β əldə etmək üçün Tris/NaOH ilə neytrallaşdırıldı. Həm aktiv, həm də ümumi TGF-β1 siçan əleyhinə Biotin-TGF-β antikoru (BioLegend), Streptavidin-HRP (BioLegend) və TMB Substrat reagentlərindən (BD) istifadə edilməklə aşkar edilmişdir. Həm siçanda, həm də insan serumunda həll olunan GARP-ı aşkar etmək üçün istehsalçının protokoluna (BioLegend) uyğun olaraq insan/siçan GARP ELISA dəsti istifadə edilmişdir. İmmunoqlobulin səviyyələri siçan antikor İzotip dəsti (Cənubi Biotech) istifadə edərək həm serumda, həm də hüceyrə mədəniyyətinin supernatantında aşkar edilmişdir. Plitələrin bir gecədə örtülməsindən sonra, plitələr 3 saat ərzində 1% BSA ilə bağlandı, sonra yuxarıda təsvir edilən standart ELISA proseduru həyata keçirildi. Nəcisdə IgA səviyyəsini təyin etmək üçün nəcis qranulları toplanmış və çəkilmişdir. Proteaz inhibitor kokteyli (MilliporeSigma) ilə PBS-də 10 μl 1% BSA hər mq nəcisə əlavə edildi və homogenləşdirildi. Santrifüjdən sonra nəcis supernatantı bloklanmış ELISA boşqabına 1:1000 seyreltmə ilə əlavə edildi. Serumda bakteriyaya xas olan IgA-nı aşkar etmək üçün yuxarıda təsvir edilən üsulla μMT siçanlarından nəcis supernatantı hazırlanmış və zülal konsentrasiyası Bradford analizi (Bio-Rad) istifadə edərək ölçülmüşdür. ELISA boşqabının hər bir quyusu 0,5 μg/ml μMT nəcis supernatantı ilə örtülmüşdür. IL-6 və IFN-γ ELISA-lar istehsalçının protokoluna (BD) uyğun olaraq yerinə yetirilmişdir.

qRT-PCR və immunoblot. RNT istehsalçının protokoluna (Life Technologies) uyğun olaraq Trizol Reagentindən istifadə edərək təmizlənmiş dalaq və PP B hüceyrələrindən təcrid edilmişdir. cDNA istehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq iScript cDNA sintez dəsti (Bio-Rad) ilə hazırlanmışdır. Primer ardıcıllıqlar aşağıdakı kimi idi: siçan GARP irəli 5′-CGCTTCGTCACCTGGATTTA-3′, siçan GARP tərs 5′-ATTGTGGGCCAGGTTAAGG-3′, siçan β-aktin irəli 5′-AGCTGAGAGGGAAATCGTGC-3′ və siçan 5′ tərs TCCAGGGAGGAAGAGGATGC-3′. qRT-PCR StepOne Plus maşınında (Applied BioSystems) icra edilib. İmmunoblot analizi üçün proteaz inhibitor kokteyli (MilliporeSigma) ilə əlavə edilmiş RIPA buferindən istifadə edərək hüceyrə lizatları hazırlanmışdır. 75 μg lizat 10% SDS-PAGE üzərində işlədilib. PVDF membranına (Millipore) köçürüldükdən sonra GARP siçan əleyhinə GARP antikoru (R&D Systems) istifadə edərək yoxlanıldı və β-aktinə (MilliporeSigma) normallaşdırıldı.

İmmunohistokimya. PP ilə nazik bağırsaq bölmələri Cryomatrix dondurma mühitinə yerləşdirilib və dondurulub. Beş μm kəsiklər kəsildi və buz kimi soyuq aseton ilə sabitləndi, ardınca IgA-HRP (Cənubi Biotech) ilə bloklandı və inkubasiya edildi. Rəng DAB Peroksidaza İnkişaf etdirmə Kitindən (Vektor Laboratoriyaları) istifadə edilməklə aşkar edilmişdir. Şəkillər Olympus mikroskopunda əldə edilib.

Statistika. Məlumatların təhlili GraphPad Prism proqram təminatından (GraphPad Software Inc.) istifadə edilib. Təhlillər cütləşməmiş 2 quyruqlu istifadə edərək aparılmışdır t test və ya Mann-Whitney parametrik olmayan məlumatlar və ya göstərildiyi kimi ANOVA üçün. Çoxsaylı müqayisəli təhlillər üçün Tukey müqayisəsi ilə birtərəfli ANOVA istifadə edilmişdir. P 0,05-dən az olan dəyərlər əhəmiyyətli hesab edilmişdir.

Tədqiqatın təsdiqi. Sağlam nəzarətçilər MUSC-də Revmatik Xəstəliklər üzrə Multidisiplinar Klinik Tədqiqat Mərkəzi tərəfindən periferik qan nümunəsinin toplanması üçün məlumatlı razılıq verdilər. MUSC IRB bu tədqiqatlar üçün protokolları (Pro00021985 və Pro27985) təsdiqləyib və layihə Helsinki Bəyannaməsinə uyğun olaraq həyata keçirilib. Bu işdəki bütün heyvan prosedurları MUSC İnstitusional Heyvanlara Qulluq və İstifadə Komitəsi tərəfindən təsdiq edilmiş protokola əsasən aparılmışdır. Heyvanlar xüsusi patogen olmayan şəraitdə saxlanılırdı.

ZL layihəyə nəzarət edirdi. CHW, BL və ZL təcrübələri tərtib etdilər. CHW və BXW təcrübələri həyata keçirdi. SS histoloji analizin çoxunu etdi. GG klinik nümunələrin alınmasını asanlaşdırdı. MJS siçanları təmin etdi. MS, EAAA və AM daxil olmaqla bütün müəlliflər məlumatların təhlilinə öz töhfələrini verdilər və əlyazmanın hazırlanmasına kömək etdilər.

Bu layihə NIH-nin çoxsaylı qrantları ilə dəstəklənib: UL1TR001450 və TL1TR001451 (CHW-ə) R01AI077283 (ZL-ə) R01CA213290 (ZL-ə) R01CA188419 və P01CA186866 (CA19-dan RBL19-a) (CA19-dan RBL19-a qədər). O, həmçinin qismən Hüceyrə Qiymətləndirməsi və Müalicəsinin Paylaşılan Resursu, Hollinqs Xərçəng Mərkəzi, MUSC (P30CA138313) və Multidissiplinar Klinik Tədqiqat Mərkəzində (NIH/Milli Artrit və Əzələ-skelet və Dəri Diskləri İnstitutu) Revmatologiya və İmmunologiya Bölməsi tərəfindən dəstəklənib. ) və P60AR062755 (GG-yə). Wei Jiang-a (MUSC) laboratoriyasında AID ELISPOT oxucu istifadə etdiyi üçün təşəkkür edirik. Müəlliflər Li laboratoriyasının keçmiş və indiki üzvlərinə tədqiqat boyu müzakirələri stimullaşdırdıqları üçün təşəkkür edirlər.

Maraqların toqquşması: Müəlliflər heç bir maraq toqquşmasının olmadığını bəyan ediblər.


Müzakirə

Splenektomiyaya məruz qalmış/asplenik uşaqlarda və böyüklərdə pnevmokok xəstəliyinin qarşısının alınması tibbi prioritetdir. Asplenik xəstələrdə polisaxaridin və/və ya konyuqasiya olunmuş peyvəndin istifadəsini optimallaşdırmaq üçün hərtərəfli araşdırma hələ də yoxdur. Əslində, təlimatlara tez-tez pnevmokok infeksiyaları riski daha yüksək olan immun çatışmazlığı və immunosupressiyaya məruz qalan daha geniş kateqoriyalı asplenik xəstələr daxildir 17, 19. Peyvəndin immunogenliyini qiymətləndirmək üçün ən çox istifadə edilən immunoloji korrelyasiya müəyyən bir antigen üçün spesifik dövran edən IgG səviyyəsidir. Ümumdünya Səhiyyə Təşkilatı konjugat peyvənddən sonra qorunmanın korrelyasiyası kimi PnPS-ə qarşı ≥0.35 μg/mL IgG ehtimalını tövsiyə etmişdir 24 . 1997-ci ildə CDC tərəfindən verilən asplenik fərdlərdə peyvənd üçün ilk tövsiyələr bu qrup xəstələrdə PnPS peyvəndi ilə induksiya olunan antikor səviyyələrinin sağlam fərdlərinkləri ilə müqayisə oluna biləcəyi müşahidəsinə əsaslanır 25 . Digər tədqiqatlar bu tapıntıları dəstəklədi 26, 27 . Bəzi müəlliflər, asplenik fərdlərdə PnPS peyvəndinə cavabın azala və ya olmaya biləcəyini 28-30 və antikor titrlərinin sağlam fərdlərə nisbətən daha sürətli çürüyə biləcəyini göstərdilər 31, 32. Beləliklə, ilk dozadan 5 il sonra revaksinasiya üçün tövsiyə 16 tərtib edilmişdir. Pnevmokok konjugat peyvəndləri asplenik fərdlərdə immunogendir 33, 34 və son təlimatlar 16, 19, 35 bu yüksək riskli xəstələr qrupu üçün peyvənd protokoluna PCV13-ü daxil edir. PnPS peyvəndi ilə immunizasiya hələ də tövsiyə olunur, əsasən onun PCV13 ilə müqayisədə daha çox serotipi ehtiva edən daha geniş antigenik repertuarına görə.

Antikorlar immunizasiya reaksiyasının məhsullarından yalnız birini təmsil edir. Əslində, təbii infeksiyaya və ya peyvəndlərə cavab olaraq germinal mərkəzin reaksiyası fərqli, lakin bir-birini tamamlayan qoruyucu funksiyaları olan iki mürəkkəb alət yaradır: uzun ömürlü plazma hüceyrələri və yaddaş B hüceyrələri 36 . Xüsusi sümük iliyi yuvalarına sahib olan birincilər, demək olar ki, əbədi olaraq sağ qalırlar, antigen 37-ni hiss edə bilmirlər, lakin davamlı olaraq əvvəlki immunoloji təcrübələrlə seçilmiş yüksək yaxınlıqlı antikorlar istehsal edirlər. Dalaqda üstünlük təşkil edən yaddaş B hüceyrələri səth antigen reseptorları kimi antigenlə seçilmiş antikorları daşıyır və buna görə də sürətli geri çağırma reaksiyaları qura bilir.

Beləliklə, əvvəllər rast gəlinən patogen orqanizmə daxil olduqda, qorunma uzunömürlü plazma hüceyrələri tərəfindən istehsal olunan "istifadəyə hazır" serum immunoqlobulinləri ilə təmin edilir. Bu vaxt yaddaş B hüceyrələri antigeni bağlayır, reaksiya verir və bir neçə gün ərzində plazma hüceyrə bölməsini həyata keçirərək spesifik antikorların səviyyəsini artırır. Xəstəlikdən qaçmaq üçün bu iki qoruyucu qoldan yalnız birinin kifayət edib-etmədiyini söyləmək nəzəri cəhətdən çətindir 38 . Biz göstəririk ki, splenektomiya edilmiş xəstələrdə eyni yaşda olan sağlam şəxslərlə müqayisədə pnevmokok üçün spesifik dövran edən anticisimlər eyni miqdarda olur. Bu tapıntıya əsasən, əlavə peyvənd tələb olunmamalıdır.

Araşdırmamız göstərir ki, dalağı olan və ya olmayan fərdlər arasındakı fərq yaddaş B hüceyrələrinin tezliyindədir. Artıq məlum olduğu kimi, splenektomiyadan sonra ümumi yaddaş B hüceyrələri azalır. İndi nümayiş etdiririk ki, bu hüceyrə populyasiyasının olmaması həm pnevmokok infeksiyasına qarşı həssaslığın artması, həm də asplenik fərdlərdə polisaxarid peyvəndlərinə reaksiyanın azalması ilə izah olunur: əslində, bizim tapıntılarımıza görə, S. pneumoniae-Xüsusi yaddaş B hüceyrələri azalır və təmiz polisaxarid antigenləri ilə peyvənd edilmiş xəstələrdə aşağı qalır. Son tədqiqat 39 ilə təsdiqləndiyi kimi, T-müstəqil antigenlər dəyişdirilmiş yaddaş B hüceyrələri yaratmır və polisaxarid peyvəndləri hətta xüsusi dəyişdirilmiş yaddaş B hüceyrələrinin 40 mövcud hovuzunu tükəndirə bilər. Bunun əksinə olaraq, göstərilmişdir ki, PnPS peyvəndi siçan 41-də uzun ömürlü plazma hüceyrələrinə səbəb ola bilər. Beləliklə, asplenik xəstələrin zərdabındakı antikorlar, ehtimal ki, ya əvvəlki təbii infeksiyalar, ya da peyvənd nəticəsində yaranan uzun ömürlü plazma hüceyrələrindən yaranır.

Yaddaş B hüceyrələrinin pnevmokok xəstəliyinə qarşı müdafiədə rol oynayıb-oynamayacağı sualını ümumi dəyişən immun çatışmazlığı halını nəzərdən keçirməklə həll etmək olar. Bu ilkin immun çatışmazlıq bütün immunoqlobulin izotiplərinin serum səviyyəsinin azalması və peyvəndlərə reaksiya olmaması ilə xarakterizə olunur. Əksər xəstələr üçün tənəffüs yoluxucu infeksiyalar əsas simptomlardır və ağciyərin qalıcı zədələnməsinə səbəb ola bilər. Bir neçə il əvvəl, standart immunoqlobulin əvəzedicisi alan bir qrup xəstədə IgM yaddaş B hüceyrələrinin olması ilə bronşektazi hallarının azalması arasında korrelyasiya göstərilmişdir 42, 43. Buna görə də, IgM yaddaş B hüceyrələrinin təkrarlanan ağciyər infeksiyalarından və sonradan ağciyər zədələnməsindən qorunmada iştirak edə biləcəyi təklif edildi. Bununla belə, qeyd etmək lazımdır ki, uyğunlaşdırılmış immunoqlobulinin dəyişdirilməsi və düzgün həyat tərzi eyni zamanda bütün ümumi dəyişən immun çatışmazlığı xəstələrini tənəffüs yolu infeksiyalarından və ağciyər zədələnmələrindən qoruya bilər 44 .

Burada göstəririk ki, anti-pnevmokok antikorları istehsal edə bilən IgM yaddaş B hüceyrələri splenektomiyadan sonra normaldan on dəfə aşağıdır.

Biz göstəririk ki, sağlam fərdlərdə dövran edən PnPS-ə məxsus IgM yaddaş B hüceyrələrinin IgM yaddaş B hüceyrələrinin ümumi sayına nisbəti yüksəkdir (4%).

Bu yüksək tezlik immun sistemimizin həyatın ilk günlərindən insanlara yoluxan hər yerdə yayılmış patogenlə birgə təkamülünün nəticəsi ola bilər. Əslində, pnevmokoklar 8-30% sağlam yetkinlərin və 45 yaşa qədər 4 yaşından kiçik sağlam uşaqların 20-50% -nin nazofarenksini kolonizasiya edən insan kommensallarıdır. Buna görə də, hər hansı bir peyvənd olmadıqda, bir çox böyüklərdə artıq anti-PnPS IgM və IgG antikorları var 46 . Üstəlik, IgM yaddaş B hüceyrələri funksional olaraq siçan B-1 B hüceyrələrinə ekvivalentdir ki, onlar öz-özünə antigenlər və ya hər hansı bir antigen stimullaşdırmanın tam olmaması ilə dəyişdirilmiş öz-antigenlər tərəfindən yaranan təbii antikorlar istehsal edirlər. Bu əvvəlcədən mövcud olan təbii IgM antikorları bakterial polisaxaridlər də daxil olmaqla çoxsaylı antigenləri bağlayaraq patogen replikasını birbaşa neytrallaşdırır və maneə törədir.

Qrip virusu infeksiyası zamanı pnevmokok daşıyıcılığı artır və virusa qarşı yerli immun reaksiya selikli qişanın epitelial təbəqəsində dəyişikliklərə səbəb olduğundan, bakteriyalar tənəffüs yollarına daha asan nüfuz edə və infeksiyaya səbəb ola bilər 48 . Əslində, mövsümi respirator sinsitial virus (RSV) və ya qrip epidemiyaları tez-tez səbəb olduğu pnevmoniya ilə əlaqələndirilir. S. pnevmoniyae 49. Artıq OPSI riski altında olan asplenik xəstələrin xüsusi vəziyyətində, bakterial invaziv xəstəliklərdən qorunmaq üçün əlavə vasitə kimi qripə qarşı illik peyvənd (T-dən asılı immun cavab yaradan) istifadə edilə bilər. Bu yaxınlarda aparılan bir araşdırma göstərdi ki, qrip peyvəndi splenektomi edilmiş xəstələrdə ölümü 54% 50 azaldır.

Peyvənddən sonra yaranan dəyişdirilmiş yaddaş B hüceyrələrinin böyük bir hissəsi dalaqda yerləşir və onun çıxarılması ilə itirilir 51. Bu, asplenik yetkinlərin periferik qanında tetanus əleyhinə IgG yaddaş B hüceyrələrinin niyə əhəmiyyətli dərəcədə azaldığını izah edir. Asplenik uşaqlarda bu fərq əhəmiyyətli deyildi, ehtimal ki, peyvəndin həyatın 2 ayından 11 yaşına qədər bir neçə vaxt nöqtəsində, hətta splenektomiyadan sonra da tətbiq edildiyi üçün. Beləliklə, tetanusa xas olan dəyişdirilmiş yaddaş B hüceyrələri inyeksiya yerini drenaj edən limfa düyünlərinin cücərmə mərkəzlərində "de novo" istehsal edilə bilər. Əksinə, böyüklərin əksəriyyəti splenektomiyadan sonra tetanoza qarşı revaksinasiya olunmur.

Tetanoz əleyhinə vaksinin gücləndirici dozasını hər on ildən bir tətbiq etmək üçün mövcud tövsiyəyə baxmayaraq, bu tövsiyəyə uyğunluq zəifdir. Hazırkı tədqiqatımız bu tövsiyənin əhəmiyyətini, həmçinin splenektomiyadan sonra dəyişdirilmiş yaddaş B hüceyrələrinin hovuzunu doldurmaq üçün digər antigenlərə qarşı revaksinasiya ehtiyacını gücləndirir.

İmmunçatışmazlığı, autoimmuniteti, hematoloji şişləri olan və ya immunosupressiv terapiya altında olanlar istisna olmaqla, asplenik xəstələrimizi seçdiyimizə görə, bütün müşahidələrimiz dalağın çıxarılmasının “saf” təsirlərini əks etdirir. Beləliklə, splenektomiyadan sonra spesifik yaddaş B hüceyrələrinin yaradılması üçün qlikokonjugasiya edilmiş vaksinlərin ən məqbul seçim ola biləcəyini fərz edə bilərik.

Tədqiqatımızın bəzi məhdudiyyətləri var: tədqiqat nümunəmizdə asplenik uşaqlar nəzarətlərdən daha yaşlı idi. Yaddaş B hüceyrələrinin yaşla artması gözlənildiyi üçün bu, nəticəmizi fərqin düzgün qiymətləndirilməməsinə yönəldib. Üstəlik, müşahidə dizaynı asplenik şəxslərdə müvafiq immun cavab yaratmaq üçün PCV-nin effektivliyinə dair qəti nəticələr çıxarmağa imkan vermir.

Nəticə olaraq, tədqiqatımız daha əvvəl başqaları tərəfindən bildirilmiş nəticələri təsdiq edir və genişləndirir, kapsullaşdırılmış bakteriyaların səbəb olduğu infeksiyalara immunoloji reaksiyada dalağın həlledici roluna işıq salır. Splenektomiya edilmiş şəxslərdə T-dan asılı peyvəndin effektivliyini daha yaxşı qiymətləndirmək üçün müvafiq perspektivli klinik sınaq tələb olunur.


3 T HÜCEYƏRİ VƏ PENİSİLLİNLƏRƏ MƏNS REAKSİYALAR

αβT hüceyrələri iki əsas alt qrupa, CD4 + və CD8 + T hüceyrələrinə bölünə bilər və yüksək spesifik T-hüceyrə reseptorları (TCR) vasitəsilə aktivləşdirilir. Antigen təqdim edən hüceyrənin (APC) insan leykosit antigeni (HLA) molekulları tərəfindən təqdim edilən yad və ya qeyri-özünə peptidlərin (məsələn, viral) tanınması ilə T hüceyrəsi ilə əlaqəli immunitet yarana bilər.

DHR-lərdə T-hüceyrələrinin penisilinlər tərəfindən aktivləşdirilməsinin, penisillinlərin immun sistemi tərəfindən əvvəllər rast gəlinməyən neoantigenləri meydana gətirmək üçün zülalları kovalent şəkildə dəyişdirmək qabiliyyətinə görə baş verdiyi düşünülür. Bu, ya birbaşa nümayiş olunan peptid daxilində qalığın kovalent modifikasiyası, ya da mənbə zülalının ifadəsinin və ya işlənməsinin dəyişdirilməsi yolu ilə yeni öz-özünə törəmə peptidlərin yaranmasına səbəb ola bilər.

3.1 Penisilin spesifik T hüceyrələrinin aşkarlanması

T hüceyrələri aktivləşdikdən sonra klonal genişlənmə kimi tanınan bir prosesə məruz qalır və aşağı axın immun aktivasiyası üçün sitokinlər buraxırlar. Penisillinə cavab olaraq limfositlərin çoxalması hələ 1960-cı illərdə müşahidə edilmişdir. 21, 22 Limfositlərin mitotik aktiv hüceyrələrə çevrilməsinin kortəbii şəkildə baş verdiyi bildirildi. in vitro reaksiyanın kəskin fazası zamanı xəstələrdən alınan kulturalar, lakin sağlam nəzarətdə və ya allergiyası olmayan və ya sağalmış xəstələrdə deyil. Allergik xəstələrdən alınan nümunələrdə sağlam subyektlərə nisbətən daha yüksək sürətlə penisilinlə stimulyasiya zamanı transformasiya da müşahidə edilmişdir. 22 Müasir limfosit transformasiya testləri (LTT) ümumiyyətlə bölünən hüceyrələrin 3 H-timidin qəbulunun ölçülməsi və ya axın sitometriyası ilə karboksiflüoresein diasetat suksinimidil esterinin (CFSE) boyanmasının seyreltilməsi ilə proliferasiyanı aşkar edir. 23, 24 Digər dərmanlara gəldikdə, penisilin DHR-lərinin diaqnostikası üçün LTT-nin həssaslığı və spesifikliyi tədqiqatlar arasında dəyişir və DHR-nin klinik mərhələsindən və təbiətindən təsirlənə bilər. 25, 26 Məsələn, 3 tədqiqatda DHR üçün BP və AX üçün LTT müvafiq olaraq 62,5%-75% və 85%-100% həssaslıq və spesifiklik diapazonları göstərmişdir. 27-29

Bu yaxınlarda IFNγ ELISpot şübhəli DHR-lərdə dərmana məxsus T-hüceyrələrinin iştirakını göstərmək üçün əsas diaqnostik testlərdən biri kimi müəyyən edilmişdir. 18, 30 Rozieres və digərləri AX-DTH xəstələrinin periferik qan mononükleer hüceyrələrində (PBMC) dövran edən AX-ə xüsusi limfositləri müəyyən etmək üçün həm LTT, həm də IFNγ ELISpot imkanlarını müqayisə etdilər (n = 22). Onlar göstərdilər ki, IFNγ ELISpot analizi LTT vasitəsilə 68%-lə müqayisədə AX-DTH xəstələrinin 91%-də AX-ə xas limfositləri aşkar edərək daha yüksək həssaslıq nümayiş etdirib. 29 Alternativ olaraq, sitotoksik hüceyrələrin mövcudluğunu qiymətləndirmək üçün qranzim B ELISpot analizlərindən istifadə edilmişdir. 31, 32 Qeyd edək ki, ENDA/EAACI Drug Allergy Interest Group-un bir hissəsi kimi Mayorga və digərləri tərəfindən möhkəm qiymətləndirmə üçün LTT və ELISpot analizlərinin kombinasiyasının aparılması tövsiyə olunur. 23

ELISpot analizi dərmana cavab verən T hüceyrələrinin aşkarlanması üçün yüksək həssas olsa da, axın sitometriya üsulları hər ikisində T-hüceyrə fenotiplərinin səciyyələndirilməsində mühüm əhəmiyyət kəsb etmişdir. in vitro genişlənmiş T hüceyrələri və birbaşa ex vivo. 33 Bundan əlavə, birbaşa immunohistokimyəvi tədqiqat üçün biopsiyaların alınması iltihab sahəsinə nüfuz edən immun hüceyrə populyasiyaları haqqında məlumat verdi. 34, 35 birləşmələri in vitroin vivo texnikalar hazırda penisilinlə induksiya olunan DHR-lərin müxtəlif klinik fenotiplərində iştirak edən T hüceyrələrini aşkar etmək, təcrid etmək və xarakterizə etmək üçün müntəzəm olaraq istifadə olunur (Cədvəl 2). 36 Hüceyrə növlərinin, miqrasiya davranışının və sitokin imzasının xarakteristikası vasitəsilə tədqiqatçılar müxtəlif sitokinlər (məsələn, CXC kemokin liqandı [CXCL] 10 və IL-4) və reseptorlar (məsələn, CC kemokin reseptoru [CCR] 4 və CCR9) üçün potensial rolları vurğulamışlar. penisilin səbəb olan DHR-lərin patologiyasında 37-39 (Cədvəl 3). Həqiqətən, daha geniş şəkildə DHR in vitro tədqiqatlar yalnız sitokin imzalarını və T tənzimləyici hüceyrələri və 40-43 xəstəlik patologiyasında dendritik hüceyrələr üçün rolları aşkar etmədi, həm də inkişaf etmiş diaqnostik oxunuşlar üçün onların manipulyasiyasının tövsiyə edilməsinə səbəb oldu. 23

Penisilin spesifik T-hüceyrələrinin aktivləşdirilməsi mexanizmi

  • İxtisarlar: ELISA, fermentlə əlaqəli immunosorbent analizi ELISpot, fermentlə əlaqəli immun absorbent nöqtə IFNγ, interferon-γ LTT, limfosit transformasiya testi PBMC, periferik qan mononüklear hüceyrə TCR, T-hüceyrə reseptoru.
Narkotik) DHR Davalar Başlama vaxtı İmmunoanalizlər T-hüceyrə alt tipləri İmmunoprofil İstinad
Amp SJS 1 25 d MTT ilə LTT IFNγ 156
Amp, BP Şiddətli eritema multiforme, hərarət, halsızlıq, qabarıqlıq 2 gecikdi 5-7 d İmmunohistokimya, zədələnmiş epidermisin FC analizi, LTT, proliferasiya analizi, ELISA CD8 + & gt CD4 + IL-2, IFNγ (CD8 + T-hüceyrə klonları, n = 7). IL-4 (CD4 + T-hüceyrə klonu, n = 1), HLA-DR 34
Amp, Piperacillin MPE 2 1 d İmmunohistokimya CD4 + & gt CD8 + HLA-DR 35
Gücləndirici, AX, AC, BP SJS 2 2-3 d LTT CD4 + 109
Amp, BP, Penisilin V BP-yə qarşı həssaslıq 4 LTT, yayılma analizi, FC CD4 + & gt CD8 + 106
Gücləndirici, AX, BP, Flux Ekzantema, qızdırma, ödem, ürtiker 7 LTT, ELISA, FC CD4 + (62%-90%), CD8 + (10%-38%) 154
AX MPE, Lyell sindromu 23 gecikmə (müsbət dəri yamaq testi) 6-48 saat LTT, IFNγ ELISpot IFNγ 29
MPE 11 nəzarət (mənfi dəri yamaq testi)
Anafilaktik şok 15 dərhal <30 dəq
AC MPE 1 3 d Scratch-patch, immunohistokimya, LTT, ELISA, FC CD4 + /CD45RO + (2/3), CD8 + /CD45RO + (1/3) HLA-DR, CD45, perforin, IL-5, TNFα 50
AX, AC MPE, anjioödem 3 9-54 saat Dərman təxribatı, immunohistokimya, LTT, FC CD8 + (reaksiya zamanı dominant), CD4 + HLA-DR, CLA, qranzim B, CXCL9, CCL27, CXCR3, CCR10 59
AX MPE 4 7-8 d LTT 153
10 sağlam nəzarət
5 dözümlü nəzarət
AX, AC AGEP, 2 4-36 saat İmmunohistokimya, LTT, ELISA, ELISpot CD4 + (60%-70%), CD8 + (30%-40%) HLA-DR, CD25, IL-4, IL-5, IFNγ, RANTES (CCL5), GM-CSF, IL-8, CXCR1 39
Qeyri-AGEP (dərman təyin olunmayıb) 4 nəzarət
AC MPE, pnevmoniya, dəri infeksiyası, artrit 3 3-10 d İmmunohistokimya, LTT IL-5, eotaksin, RANTES (CCL5), MCP-3 57
9 nəzarət
AX 4 MPE, 1 eritema ekssudativ multiforme 5 LTT, 17-pleks muncuq əsaslı immunoassay (Bio-Rad) İlkin ifraz: CCL2, CCL4, IL-6 (P < .05) PBMC stimullaşdırılması: IL-5, IL-13, IFNγ, TNFα və GM-CSF 55
5 nəzarət
AX, AC MPE 13 Kəmiyyət real vaxt PCR, immunohistokimya CD4 + , CD8 + TNF, IFNγ, CCR6, CCL20 və CCL27 Dəri: CXCR2, CXCL9 və CXCL10 Qan: CXCR3 Periferik qan: CCR10 Dəri: CCL20, CXCL9, CXCL10, CCL27 Hər ikisi: TNFα, IFNγ, C6CR3, perforin 38
Qeyri-penisilinlər tərəfindən törədilən MPE 14
26 dərmana dözümlü nəzarət
AX, BP DİLİ 1 4 həftə LTT 76
AX, BP Morbilliform ekzantema 12 <2 həftə LTT, yayılma analizi 27
6 nəzarət
AX, AC, Cloxacillin, Penisilin V Ekzantema 4 >6 h FK CLA (median = 20,4 və 9,4) (P < .001). HLA-DR 63
10 sağlam nəzarət
8 dözümlü nəzarət
AC DİLİ 7 2-39 d LTT, IFNγ ELISpot, FC CD4 + > CD8 + > CD4 + /CD8 + IFNγ, perforin, qranzim B, FasL, IL-17, IL-22, CCR4, CCR9, CXCR3 79
BP Ürtiker, anjioödem, MPE, ishal, qızdırma, nəfəs darlığı, ümumi qaşınma 10 LTT, ELISA, FC CD4 + (16 klon) & gt CD8 + (3 klon) BP: IL-4, IL5 > IFNγ BP-HSA: IFNγ > IL-4, IL-5 hər ikisi: IL-2, IFNγ, TNFα 54
BP Dərhal üzün şişməsi, eritematoz döküntü 2 Dərhal LTT 92
8 nəzarət
BP Sağlam 10 IFNγ ELISpot CD4 + / CD45RA + IFNγ 108
BP Anafilaksi, ekzantema, anjioödem, ürtiker, təngnəfəslik, ümumiləşdirilmiş qaşınma, dərman qızdırması 5 dərhal LTT, IFNγ ELISpot CD4 + / CD45RA + IFNγ 93
Ürtiker, dərman atəşi, ekzantema 2 gecikdi
33 nəzarət
BP, AX Ürtiker, anjioödem, anafilaksi 31 dərhal <60 dəq LTT 28
Ürtiker, MPE 19 gecikdi 9-48 saat
28 nəzarət
BP, Amp MPE, dərhal astmatik reaksiya 4 LTT, yayılma analizi ELISA, FC CD4 + (85%-95%)> CD8 + (5%-15%) L-selektin 53
10 nəzarət
BP, Amp BP-yə yüksək həssaslıq 2 LTT, yayılma analizi, ELISA, FC CD4 + (2 klon) IL-4 107
BP Ekzantema, ürtiker, anafilaksi 6 LTT 155
6 sağlam nəzarət
BP 7 sağlam IFNγ ELISpot, IFNγ/granzyme-B fluorospot analizi CD8+ IFNγ, qranzim B 112
Flux, AX, BP, piperacillin Flux-DILI 6 (4/6 HLA-B*57:01+) 3-4 həftə LTT, IFNγ ELISpot, FC, kemotaksis analizi Xəstə: CD8 + (35 klon) & gt CD4 + (10 klon) Dərman istifadə olunmamışdır: CD8 + IFNγ, FasL, perforin, qranzim B, CCR2, CCR4, CCR9, CXCR3 37
6 dözümlü nəzarət
3 HLA- B*57:01 + dərman sadəlövh
Flux 9 Sağlam, Flux-naif, HLA-B*57:01+ LTT, IFNγ ELISpot, FC CD8 + & gt CD4 + IFNγ, CD107a 89
8 Sağlam, Flux-naif, HLA-B*57:01-nəzarət
Piperasilin PIP-həssaslıq 4 LTT, IFNγ ELISpot, FC, kemotaksis analizi Qan: 84,25% CD4 + , 15,75% CD8 + İltihablı dəri: 85,5% CD4 + , 14,5% CD8 + IFNγ, IL-13, IL-22, qranzim B, CCR4, CCR5, CCR8, CCR10, CXCR3, CXCR6 62
4 nəzarət
Piperasilin MPE, qızdırma, ürtiker püskürmələri, qripə bənzər simptomlar 28 2-11 d İmmunohistokimya, LTT, IFNγ ELISpot CD4 + & gt CD8 + IFNγ, IL-13, qranzim B, IL-1β, IL-6, TNF, MIP-1α 56
9 dözümlü nəzarət
  • İxtisarlar: AC, amoksisillin və klavulan turşusu AGEP, kəskin generalizə olunmuş ekzantematöz püstüloz Amp, ampisilin AX, amoksisillin BP, benzilpenisilin CCL, CC kemokin liqand CCR, CC chemokine reseptor CLA, dəri antihipertenziv CCL-assoseptor, CXCXCXnd chemokine reseptor DILI, dərmanla əlaqəli qaraciyər zədəsi ELISA, fermentlə əlaqəli immunosorbent analizi ELISpot, fermentlə əlaqəli immun uducu ləkə FasL, Fas liqand FC, axın sitometri Flux, flukloksasillin GM-CSF, qranulosit-makrofaqlar, HİFN koloniyasını stimullaşdıran insan albomu , interferon-γ IL, interleykin LTT, limfosit transformasiya testi MCP, monosit kemoatraktan zülal MIP, makrofaq iltihabi zülallar MPE, makulopapulyar eksantema MTT, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium periferik qan mononükleer hüceyrə SJS, Stevens-Johnson sindromu TNF, şiş nekrozu faktoru.

3.2.Penisilinlə induksiya olunan dəridə dərman preparatlarının mənfi reaksiyaları

Dərinin mənfi dərman reaksiyaları (cADRs) səpgi şəklində təqdim olunan yüngül, həyati təhlükə yaratmayan reaksiyalardan AGEP, DRESS və Stevens-Conson sindromu (SJS)/toksik epidermal nekroliz (TEN) kimi potensial ölümcül vəziyyətlərə qədər dəyişir. 39, 44-48 Cədvəl 3-də ümumiləşdirildiyi kimi, T-hüceyrə tədqiqatlarının əksəriyyətinə dərman qəbulundan 24-48 saat sonra klinik olaraq geniş yayılmış dəri lezyonları kimi təqdim olunan MPE-dən əziyyət çəkən xəstələr daxil edilmişdir. 49

MPE xəstələrindən təcrid olunmuş BP, AX, Flux və piperacillin-reaktiv T-hüceyrə xətləri və klonlar əsasən CD4 + T-hüceyrə bölməsindəndir (müxtəlif strategiyalardan istifadə etməklə müəyyən edilmiş T-hüceyrə klonlarının 55%-100%-i [hər 1-10 xəstə) tədqiqat] Cədvəl 3). 30, 50-54 CD4 + T-hüceyrə klonlarının əlavə fenotiplənməsi, axın sitometriyası, ELISpot və ya kommersiyada mövcud olan sitokin aşkarlama dəstləri (məsələn, Bio-Plex Pro™ 55) daxil olmaqla, immunoanalizlərdən istifadə edərək, əsasən Th2-sitokindən (Th2-sitokin) ibarət olan heterojen immunoprofil aşkar etdi. 4, IL-5 və IL-13) 30, 51, 52, 54-57 və daha az dərəcədə Th1 sitokinləri (IFNγ, IL-2). 30, 54 Həm Th1, həm də Th2 sitokin profillərinin qarışığı və eotaksinlərin aşkarlanması onların MPE patologiyasına uyğun olaraq eozinofillərin yetişməsi və işə götürülməsinin həyati tənzimləyiciləri olması anlayışına yaxşı uyğun gəlir. 57, 58 Maraqlıdır ki, kəskin faza reaksiyası zamanı qandan əmələ gələn CD8 + T hüceyrələrinin yüksək yayılması (

Ümumi T hüceyrələrinin 55-75%-i) klavulan turşusunun (AC) səbəb olduğu anjioödem və ümumiləşdirilmiş eritema ilə birlikdə AX- və ya AX keçirmiş xəstə PBMC-lərdə aşkar edilmişdir. 59 Bundan əlavə, bu hüceyrələr keratinosit apoptozuna və epidermal lezyonlara birbaşa töhfə verdiyi başqa yerlərdə nümayiş etdirilən proinflamatuar sitokinləri və sitotoksik molekulları (yəni IFNγ, şiş nekrozu faktoru (TNF), perforin, qranzim B) buraxırdı. 60

Penisilinlə induksiya olunan MPE və kəskin generalizə olunmuş ekzantematöz püstülozu (AGEP) keçirən xəstələrin iltihablı dərisinin immunohistokimyəvi müayinəsi əsasən CD4+T hüceyrələrinin perivaskulyar infiltrasiyasını (ümumi T hüceyrələrinin 60%-70%-i) göstərdi, burada dərinin qabarcığı yoxdur. 35, 39, 50, 59, 61 AGEP-də fərqli xüsusiyyət lezyon yerinə neytrofillərin yığılmasında rol oynaya bilən IL-8-in sərbəst buraxılmasıdır. 39 İnfiltrasiya edən CD4+T hüceyrələrinin ümumi CD4+T-hüceyrə populyasiyasının 80-100%-də HLA-DR-nin (gec aktivasiya markeri) yuxarı tənzimlənmiş səviyyələrini ifadə etdiyi göstərilmişdir (Yawalkar və s.: 9 nəzarət, 3 penisillinə yüksək həssaslıq). xəstələr Britschgi və digərləri: 4 nəzarət, 2 penisillinə həssas xəstələr).39, 57 Bundan əlavə, penisilin-cADR-lərin spektrində infiltrasiya edən T hüceyrələri üzərində dəri limfositləri ilə əlaqəli antigen (CLA), CCR10 və C-X-C motivli kemokin reseptoru (CXCR) 3 kimi dəri təyinedici markerlərin gücləndirilmiş ifadəsi adətən aşkar edilir. 59, 62, 63 Bu reseptorlar CXCR3 üçün CXCL9 və CCR10 üçün C-C kemokin liqandı (CCL)27 daxil olmaqla, müvafiq ligandların istehsal olunduğu dermisə T hüceyrələrinin cəlb edilməsində əsasdır. 38, 59, 64

Bunun əksinə olaraq, büllöz dəri lezyonlarında infiltrasiya edən T hüceyrələri (yəni AX və BP səbəb olduğu qabarcıq dəri) əsasən CD8 + T-hüceyrə bölməsindən (CD3 + T hüceyrələrinin 74%-90%-i) əmələ gəlir. 34 Büllöz reaksiyalarda CD8 + T-hüceyrə reaksiyalarının dəstəklənməsi (yəni SJS və TEN), eyni xəstələrin T-hüceyrə klonları keratinosit apoptozuna səbəb olan perforin, qranzim B və FasL-nin sərbəst buraxılmasını təşviq edən IL-2 və IFNγ proinflamatuar sitokinlərin yüksək səviyyələrini buraxdılar. 65, 66

Beləliklə, bu müxtəlif patologiyaların altında yatan sitokinlərin üst-üstə düşməsinə baxmayaraq, fenotipik fərqlər dominant T-hüceyrə alt qruplarına - MPE-də CD4 + T hüceyrələrinə və SJS/TEN-də CD8 + T hüceyrələrinə uyğun gəlir. Nə üçün CD4 + və ya CD8 + T hüceyrələrinə qarşı qərəzlilik inkişaf edir və bu fərqli patologiyalara səbəb olur, hələ də zəif başa düşülür. Əraziyə xas olan və rezident immun hüceyrələri və APC-lər (məsələn, Langerhans və dermal dendritik hüceyrələr) üzrə əlavə araşdırmalar təsviri ayırmağa kömək edə bilər.

3.3 Dərmanla bağlı qaraciyərin zədələnməsi

Penisilinlər həmçinin dərmanlarla əlaqəli qaraciyər zədələnməsinə (DILI) səbəb ola bilər, bu, zəhərli hepatiti və ya dərmanlarla əlaqəli hepatotoksikliyi təsvir etmək üçün istifadə olunan bir termindir. Xəstənin serumunda alanin aminotransferaza və ya qələvi fosfatazanın səviyyəsinin dəyişməsi ilə DILI-nin nümunəsi biokimyəvi olaraq müəyyən edilə bilər. 67 Penisilin-DILI adətən dərman qəbulundan sonra 1-3 həftə ərzində özünü göstərir və adətən xolestatik və ya qarışıq xolestatik və hepatosellüler zədə kimi özünü göstərir (ümumi DILI xəstələrinin 75%-i), burada həm hepatositlərin funksiyası pozulur, həm də qaraciyər hüceyrələri zədələnir. 68, 69 DILI-yə səbəb olan ən çox bildirilən penisilinlər AC (AC-DILI) 69-71 və Flux (Flux-DILI)-dir. 72-75

DILI-də T-hüceyrələrinin iştirakı ilə bağlı ilk hesabat Bauer və Bircher tərəfindən nəşr olundu, burada DILI-xəstə PBMC-lərdən BP və AX-ə qarşı dərmana xas T hüceyrələri aşkar edildi. 76 DILI ilə əlaqəli T hüceyrələrinin immunoprofili daha sonra Flux-DILI xəstələrinin PBMC-lərindən Flux-spesifik CD4+ və CD8+ T-hüceyrə klonlarının (müvafiq olaraq n = 4 və n = 35) böyüməsindən sonra Naisbitt qrupu ilə xarakterizə edildi. 37 Bundan əlavə, DILI ilə əlaqəli T-hüceyrə klonlarının CCR2 və CCR9-un qaraciyəri birləşdirən reseptorların yüksək səviyyələrini ifadə etdiyi bildirilmişdir. 77, 78 Transwell miqrasiya analizlərində CCR9 + T hüceyrələrinin CCL25-ə (CCR9 liqandına) doğru miqrasiya etdiyi göstərildi (liqand nəzarəti olmadan 2-4 dəfə dəyişmə miqrasiya). 37, 77 Bu təsir eyni qrup tərəfindən AC-DILI xəstələrinə yönəlmiş təqib tədqiqatında da müşahidə edilmişdir. Burada AX-ə məxsus CD4+ və CD8+ T-hüceyrə klonları (müvafiq olaraq n = 40 və n = 65) CCR9-un yuxarı tənzimlənməsini nümayiş etdirdi. 79 Nəhayət, Flux-DILI xəstəsinin qaraciyər biopsiyası ilə bağlı immunohistopatoloji sorğu-sual zamanı CD3 + CD8 + T hüceyrələri tərəfindən infiltrasiya göstərildi ki, bu da Flux-DILI patologiyasında CD8 + T hüceyrələrinin təklif olunan cəlb olunmasına uyğundur. 80


Müzakirə

Sıçan keçid B hüceyrələrinin biologiyası haqqında çox şey məlumdur, lakin insan keçid B hüceyrələri haqqında anlayışımız yenicə açılmağa başlayır. Burada insan keçid B hüceyrələrinin 2 populyasiyasını müəyyən etdik və xarakterizə etdik: CD21 lo və CD21 hi. Məlumatlarımız, bu 2 populyasiyanın CD21 yüksək alt çoxluğu ilə daha yüksək CD23, CD44, IgD və BAFF-R ifadəsi ilə fərqli fenotiplərə malik olduğunu ortaya qoydu (Şəkil 1). Qeyd edək ki, CD21, CD23 və IgD-nin CD21-də CD21-ə nisbətən daha böyük ifadəsi siçan keçid B hüceyrələrinin fenotipləri ilə əlaqələndirilir və bu molekulların ifadəsi də T1 → T2 → T3 gradienti boyunca artır 7,8

Fenotipik məlumatlar, CD21 yüksək keçid B hüceyrələri tərəfindən daha çox proliferasiya və Ig ifrazı ilə birlikdə (Cədvəl 2-3), CD21 lo və CD21 yüksək CD10 + B hüceyrələrinin CD21 lo ilə B-hüceyrə inkişafının fərqli mərhələlərinə uyğun olduğunu göstərir. daha az yetkin əhalini təmsil edən alt çoxluq. Bu nəticəyə daha inandırıcı dəstək XLA olan və ya HSCT-dən sağalmış xəstələrdə B-hüceyrə bölməsinin tərkibinin qiymətləndirilməsi, eləcə də mikroarray analizləri nəticəsində əldə edilmişdir. Birincisi, baxmayaraq ki BTK mutasiyalar B-hüceyrəsinin inkişafında ciddi blokadaya səbəb olur 21 (Şəkil 4), XLA xəstələrində aşkar edilən bir neçə dövran edən B hüceyrələri əsasən CD21-dən çox keçid hüceyrələri idi, bu da Btk-nin itirilməsinin CD21-dən aşağı keçid B hüceyrələrinin CD21-ə keçidinin qarşısını aldığını göstərir, və sonradan sadəlövh, B hüceyrələri (Şəkil 4). İkincisi və XLA xəstələrindəki müşahidələrə uyğun olaraq, CD21 keçid B hüceyrələri HSCT-dən sonra periferiyanı dolduran ilk B-hüceyrə alt dəsti idi. Vaxt keçdikcə bu hüceyrələrin sayı azaldı və bu, CD21 yüksək keçid hüceyrələrinin görünüşü ilə üst-üstə düşdü və beləliklə, CD21 keçid B hüceyrələrinin sonradan CD21 yüksək keçid alt çoxluğuna çevrilən BM emiqrant B hüceyrələrinin ilkin populyasiyasını təmsil etdiyini göstərir (Şəkil 5) ). Üçüncüsü, gen profili bunu ortaya qoydu SOL-1 CD21 keçid B hüceyrələrində ən yüksək səviyyədə ifadə edildi, ifadə CD21 yüksək keçid B hüceyrələrində azaldı və yetkin sadəlövh və yaddaş hüceyrələrində söndü (Şəkil 2). Hystad və digərləri bu yaxınlarda məlumat verdilər SOL-1 insan erkən B hüceyrələrində (CD34 + CD10 + CD19 -) yox idi, pro-B hüceyrələrində (CD34 + CD10 + CD19 +) induksiya edildi, daha sonra B-dən əvvəlki hüceyrələrdə (CD34 + CD10 + CD19 -) tənzimləndi və azaldılmış, lakin hələ də yetişməmiş B hüceyrələrində ifadə edilmişdir (CD34 - CD10 + CD19 +). 37-nin azalan səviyyəsi SOL-1 İnsan BM-dən əvvəl B hüceyrələri ilə yetişməmiş B hüceyrələri, keçid B hüceyrələrinin 37 və CD21 lo və CD21 yüksək alt qrupları arasında ifadə və CD21 yüksək keçid və sadəlövh B hüceyrələri arasında daha da aşağı tənzimləmə B-hüceyrəsinin inkişafının aşağıdakı mərhələlərdə irəlilədiyini göstərir. xətti üsul: yetişməmiş → CD21 çox keçid → CD21 yüksək keçid → sadəlövh (Şəkil 6). CD21 keçid hüceyrələrinin avtoreaktiv Ab üçün zənginləşdirilməsinə dair tapıntı CD21 keçid B hüceyrələrinin əvvəlki BM emiqrantları olması və onların hələ də mənfi seçimdən keçməsi anlayışı ilə uyğun gəlir.

İnsan B-hüceyrələrinin inkişafının təklif olunan modeli. Biz təklif edirik ki, BM-dən periferiyaya köç edən B hüceyrələri sonradan CD21 yüksək keçid/T2 B hüceyrələrinə diferensiallaşan CD21 keçid/T1 B hüceyrələridir. Bu yetkinləşmə addımı BCR-nin iştirakı üçün rolu göstərən Btk tələb edir və təkmilləşdirilmiş sağ qalma və Ig ifraz edən hüceyrələrə yayılma və fərqlənmə potensialı ilə müşayiət olunur. Avtoreaktivliyin azalması da var ki, bu da keçid B-hüceyrəsinin inkişafının bu 2 mərhələsi arasında özünə dözümlülük üçün nəzarət nöqtəsinin mövcud olduğunu göstərir. Fenotipik olaraq, CD21 yüksək keçid B hüceyrələri CD21, CD23 CD44, Bcl-2, BAFF-R və IgD ifadəsini artırır. Bu arada ifadəsi SOL-1, KIAA1199, Dtx-1, və AKAP12 hüceyrələr yetkin B hüceyrə repertuarına daxil olduqda azalır. CD21 yüksək keçid/T2 B hüceyrələri daha sonra T3/prenaiv CD5 + B hüceyrələrinin yaranmasına səbəb olur, 38 bunlar CD10-un ifadəsinin itirilməsi, CD21-in yüksək ifadəsi, lakin R123-ün ekstruziyasının pozulması ilə xarakterizə olunur. Bu populyasiyanın avtoreaktiv spesifikliyini müəyyən etmək qalır.

İnsan B-hüceyrələrinin inkişafının təklif olunan modeli. Biz təklif edirik ki, BM-dən periferiyaya köç edən B hüceyrələri sonradan CD21 yüksək keçid/T2 B hüceyrələrinə diferensiallaşan CD21 keçid/T1 B hüceyrələridir. Bu yetkinləşmə addımı BCR-nin iştirakı üçün rolu göstərən Btk tələb edir və təkmilləşdirilmiş sağ qalma və Ig ifraz edən hüceyrələrə yayılma və fərqlənmə potensialı ilə müşayiət olunur. Avtoreaktivliyin azalması da var ki, bu da keçid B-hüceyrəsinin inkişafının bu 2 mərhələsi arasında özünə dözümlülük üçün nəzarət nöqtəsinin mövcud olduğunu göstərir. Fenotipik olaraq, CD21 yüksək keçid B hüceyrələri CD21, CD23 CD44, Bcl-2, BAFF-R və IgD ifadəsini artırır. Bu arada ifadəsi SOL-1, KIAA1199, Dtx-1, və AKAP12 hüceyrələr yetkin B hüceyrə repertuarına daxil olduqda azalır. CD21 yüksək keçid/T2 B hüceyrələri daha sonra T3/prenaiv CD5 + B hüceyrələrinin yaranmasına səbəb olur, 38 bunlar CD10-un ifadəsinin itirilməsi, CD21-in yüksək ifadəsi, lakin R123-ün ekstruziyasının pozulması ilə xarakterizə olunur. Bu populyasiyanın avtoreaktiv spesifikliyini müəyyən etmək qalır.

Tədqiqatımızın nəticələri insan B-hüceyrəsinin periferiyada inkişafı ilə bağlı yeni və əhəmiyyətli fikirlər təqdim edir və bu proses üçün tələblər haqqında anlayışımızı aydınlaşdırır. Əvvəlcə bir neçə gen müəyyən etdik (məsələn, LEF1, KIA 1199CD21 keçid B hüceyrələrində yüksək şəkildə ifadə olunan və B-hüceyrəsinin inkişafının sonrakı mərhələlərində aşağı tənzimlənən (Şəkil 2). İnsan B-hüceyrələrinin inkişafında bu genlərin dəqiq rolları məlum deyil. Bununla belə, LEF-1 çatışmazlığı olan siçanlarda dölün qaraciyərində və perinatal BM-də B hüceyrələrinin ümumi sayında azalma olur, 39 beləliklə, B-hüceyrəsinin inkişafına nəzarətdə bu genin əhəmiyyətini vurğulayır. Bunun əksinə olaraq, xərçəng hüceyrələrində KIAA1199 40-ın həddindən artıq ekspressiyası artan hüceyrə ölümü və/və ya böyümənin yatırılması ilə əlaqələndirildi. Bu müşahidələrə əsasən, ifadəsinin yüksəldilməsi mümkündür KIAA1199 keçid B hüceyrələrində onların sağ qalma müddətini və sadəlövh B hüceyrələrinə nisbətən in vitro proliferasiyasını azaldır. İmmun hüceyrələrdə bu genlərin sonrakı tədqiqi onların insan B-hüceyrəsinin inkişafı zamanı rolu haqqında daha çox məlumat verməlidir.

Bunu tapmağımız BTK mutasiyalar CD21-in keçid mərhələsində B-hüceyrəsinin inkişafını ciddi şəkildə bloklayır (Şəkil 4) BTK-nın insanlarda B-hüceyrə tolerantlığını yaratmaq üçün tələb olunduğuna dair əvvəlki tapıntıya sual verir. 41 Ng et al, XLA PB-də keçid (yəni, CD10+) B hüceyrələrinin üstünlük təşkil etdiyini qeyd edərək, 41 bu hüceyrələrin normal donorların CD10 + B hüceyrələrindən daha çox avtoreaktivlik tezliyinə (~ 55-60%) malik olduğunu nümayiş etdirdilər. 37%). 41 Onlar mutasiyalar nəticəsində BCR vasitəsilə dəyişdirilmiş siqnalın olduğu qənaətinə gəldilər BTK avtoreaktiv B hüceyrələrinin artan nisbətinin qaçmasına imkan verdi, beləliklə, B-hüceyrələrinin tolerantlığının qorunması üçün bütöv BTK funksiyası lazım idi. 41 Bununla belə, alternativ şərh ondan ibarətdir ki, XLA B hüceyrələrində qeyd olunan autoreaktivliyin artması 41 sadəcə olaraq bu xəstələrdə keçid B hüceyrələrinin təxminən 80%-nin CD21 alt çoxluğuna aid olması faktını əks etdirir (Şəkil 4) və bunların daha çox tezliyi. sağlam donorlarda CD10+ populyasiyasının çoxunu təşkil edən CD21 yüksək alt dəsti (Şəkil 2C) ilə müqayisədə hüceyrələr avtoreaktiv Absdir (Şəkil 1D). Beləliklə, ola bilsin ki, BTK tolerantlığın qurulmasında rol oynamır, əksinə, CD21 keçid B hüceyrələrinin CD21 yüksək keçid B hüceyrələrinə yetişməsi üçün lazımdır.

CD21 lo və CD21 yüksək keçid B-hüceyrə alt çoxluqları çoxsaylı fərqlər nümayiş etdirsələr də, onlar bir neçə fenotipik və funksional atributları bölüşürdülər. Məsələn, replikasiya tarixinə əsasən, bu 2 B-hüceyrə alt dəsti hər ikisi in vivo olaraq yayılmayan hüceyrələr idi (Şəkil 1F). Beləliklə, CD21 lo keçid hüceyrələrinin CD21 yüksək keçid hüceyrələrinə inkişafı çoxalmanı əhatə etmir. Maraqlıdır ki, sadəlövh B hüceyrələri in vivo bir neçə bölünməyə məruz qalmışdır (Şəkil 1F), 30,31 bu, keçid B hüceyrələrinin sadəlövh hüceyrələrə diferensiasiyasının proliferativ fazadan ibarət ola biləcəyini nəzərdə tutur. Qeyd edək ki, BAFF-R-nin aşkar edilə bilən ifadəsinə baxmayaraq, BAFF keçid B-hüceyrə alt çoxluğunun sağ qalmasına çox az təsir göstərmişdir (Şəkil 1,3). Biz həmçinin aşkar etdik ki, BAFF in vitro insan keçid B hüceyrələrində CD21 və ya CD23 ifadəsini modullaşdırmayıb (əlavə Şəkil 3). BAFF siçan B hüceyrələrində 13,42-nin in vivo yaşaması və həm CD21, həm də CD23 43-ün ifadəsinin yuxarı tənzimlənməsi üçün kritik olduğundan, insanlarda B-hüceyrəsinin inkişafının siçanlara nisbətən BAFF-dan daha az asılı olması mümkündür. Bu, mutasiyaları olan 2 əlaqəli şəxsin son təsviri ilə təsdiqlənir TNFRSF13C (kodlaşdırma BAFF-R) kimdən fərqli olaraq Baffr-qüsurlu siçanlar, 13,42 normal sağlam nəzarətlərlə müqayisədə azaldılmış tezliklərdə olsa da, hələ də sadəlövh və yaddaş B hüceyrələrini inkişaf etdirdi. 44

Bir sıra tədqiqatlar insan keçid B hüceyrələrini fenotip və/və ya funksiyaya görə alt qruplara bölmüşdür. Anolik və digərləri, T1 B hüceyrələri CD38 +++ CD24 +++ və T2 B hüceyrələri CD38 ++ CD24 ++ olmaqla, CD24 və CD38 ifadə səviyyələrinə əsaslanan insan "T1" və "T2" keçid hüceyrələrini təyin etdilər. 26 Bu keçid alt qrupları B-hüceyrələrinin tükənməsi terapiyasından sağalmış xəstələrin PB-də aşkar edilmişdir. 26 Bu yaxınlarda bu qrup sadəlövh B hüceyrələrinin fenotipini (yəni, CD10 − CD24 int CD38 int IgD + CD27) nümayiş etdirən, lakin onların səmərəsizliyi ilə sadəlövh hüceyrələrdən həll edilə bilən insan keçid B hüceyrələrinin (T3 adlanır) üçüncü populyasiyasını müəyyən etdi. ekstrudingdə R123. 45 HSCT xəstələrindən əldə etdiyimiz məlumatlara uyğun olaraq, T1 alt dəstinin görünüşü B-hüceyrəsinin tükənməsindən sonra B-hüceyrəsinin bərpası şəraitində T2 və T3 populyasiyalarından əvvəl idi. 26,45 Maraqlıdır ki, başqa bir araşdırmada CD9, CD10 və CD38-in aralıq ifadə səviyyələri və R123-ün axması ilə keçid və sadəlövh B hüceyrələrindən fərqləndirilə bilən insan CD5 + prenaiv B hüceyrələrinin populyasiyası təsvir edilmişdir. 38 Səth fenotipinə, onların CB-də üstünlük təşkil etməsinə və in vitro sadəlövh B hüceyrələrinə yetişmə qabiliyyətinə əsasən, 38,45 T3 hüceyrələri və CD5 + prenaiv B hüceyrələrinin inkişaf etməkdə olan B hüceyrələrinin eyni populyasiyasını təmsil etməsi ehtimal olunur. Tədqiqatımız keçid B hüceyrələrini müəyyən etmək üçün CD10 ifadəsinə əsaslandığı üçün nə CD21 lo, nə də CD21 yüksək alt çoxluğu T3/CD5 + (CD10 -/lo) prenaiv B hüceyrələrinə uyğun gəlmir. Təhlillərimiz göstərdi ki, normal donorların PB-də CD21 lo və CD21 hi keçid B hüceyrələri CD24 və CD38-in müqayisəli səviyyələrini ifadə edir, onların CD38 +++ CD24 +++ T1 və CD38 ++ CD24 ++ ilə uyğun gəlməməsi ehtimalını artırır. T2 keçid hüceyrələri, müvafiq olaraq. Bununla belə, biz HSCT sonrası xəstələrdə keçid B-hüceyrə alt dəstləri üzrə CD24 və CD38-i qiymətləndirdiyimiz zaman, Anolik və digərləri kimi, 26 müşahidə etdik ki, analizin ən erkən dövrlərində CD21 keçid B hüceyrələri ilə müqayisədə hər iki markerin daha yüksək səviyyələrini ifadə etdi. CD21 yüksək keçid B hüceyrələri ilə (əlavə Şəkil 4). Bu ilkin fərqə baxmayaraq, keçid B-hüceyrə alt çoxluqlarında CD24 və CD38 ifadəsi nəhayət bir-birinə yaxınlaşdı (əlavə Şəkil 4), beləliklə, keçid B-hüceyrə alt çoxluqlarında CD24 və CD38-in ifadə səviyyələrinin onların yaranması və ixracından sonrakı vaxtı əks etdirdiyini təklif edir. BM-dən, keçid alt çoxluqları arasındakı sərhəddən daha çox. Buna əsaslanaraq, ehtimal olunur ki, CD21 lo və CD21 yüksək keçid B-hüceyrə alt çoxluqları CD38 +++ CD24 +++ T1 və CD38 ++ CD24 ++ T2 hüceyrələridir. 26 Bu, CD21 və CD23-ün ifadəsinin T1/CD21 keçid B hüceyrələri ilə müqayisədə T2/CD21 yüksək-də artdığı və heç bir populyasiyanın in vitro sağ qalma və ya differensiasiya testlərində BAFF-a cavab vermədiyi tapıntıları ilə daha da dəstəklənir. 26,45

Hazırkı tədqiqatımızdan və bu yaxınlarda dərc edilənlərdən əldə edilən məlumatları birləşdirərək, insanın periferik B-hüceyrə inkişafının xəritəsini təklif etmək mümkündür, bununla da yetişməmiş B hüceyrələri BM-dən CD21-dən çox keçid/T1 hüceyrələri kimi çıxır və bu hüceyrələrdə CD21 yüksək keçid/T2 hüceyrələrinə çevrilir. BTK-dan asılı üsul (Şəkil 6). Maraqlıdır ki, CD21 lo və CD21 yüksək keçid mərhələləri arasında avtoreaktivliyin azalması bu addımda özünə dözümlülük üçün nəzarət nöqtəsinin mövcud olduğunu göstərir. Bu, erkən yetişməmiş və yetişməmiş B hüceyrələri ilə avtoreaktiv B hüceyrələrinin repertuardan silindiyi keçid və sadəlövh B hüceyrələri arasındakı nəzarət nöqtələrinə bənzəyir, 5 və bəzi xəstələrdə T1/CD21 keçid B hüceyrələrinin tezliyi ilə uyğun gəlir. sistemik lupus eritematosus. 24,46 CD21 yüksək keçid B hüceyrələri daha sonra sadəlövh B hüceyrələrinə çevrilmək üçün son yetişmə prosesindən keçən T3/prenativ B hüceyrələrinə çevrilir (Şəkil 6). Bu hüceyrələrin sadəlövh bölməyə inkişafı üçün replikasiyanın lazım olub-olmadığını və autoreaktiv hüceyrələrin silinməsinin B-nin CD10 + mərhələsindən kənarda baş verib-vermədiyini müəyyən etmək üçün T3/prenaiv B-hüceyrə populyasiyasının avtoreaktivliyini və proliferativ tarixini araşdırmaq vacib olacaq. -hüceyrə inkişafı. Bütövlükdə, bu çərçivə immun çatışmazlığı, otoimmünitet və bədxassəli şişlər kimi pozulmuş B-hüceyrə davranışı ilə xarakterizə olunan immunoloji diskraziyalar zamanı insanın B-hüceyrələrinin inkişafının dəqiq molekulyar tədqiqinə imkan verəcək.

Keystone Simpoziumunda şifahi formada təqdim edilmişdir, B hüceyrələri kontekstdə, Taos, NM, 28 fevral 2009-cu il.


İnsan iştirakçılarının iştirak etdiyi tədqiqatlar Freiburg 239/1999 və 121/11 və Freiburg 66/13 tərəfindən nəzərdən keçirilmiş və təsdiq edilmişdir. Xəstələr/iştirakçılar bu tədqiqatda iştirak etmək üçün məlumatlandırılmış yazılı razılıqlarını təqdim etdilər.

MR təcrübələr apardı, məlumatları təhlil etdi və şərh etdi və əlyazmasını yazdı. KP, VS və IH təcrübələr həyata keçirdilər. RV xəstələrin toplanmasına və nümunə toplanmasına töhfə verdi və əlyazmanı tənqidi şəkildə yenidən nəzərdən keçirdi. KW və BK tədqiqatı tərtib etdi və əlaqələndirdi, məlumatları şərh etdi və əlyazmanı yazdı. Bütün müəlliflər məqaləyə öz töhfələrini verdilər və təqdim olunan versiyanı təsdiq etdilər.


NƏTİCƏLƏR

RV daha çox insan İBC-ni yoluxdurur.

RV-nin insan CBC və IBC-ni diferensial şəkildə yoluxdurduğunu müəyyən etmək üçün böyüklər qan donorlarından və ya bariatrik cərrahiyyə əməliyyatı keçirən xəstələrdən asılı olmayaraq təmizlənmiş B hüceyrələri 5 MOI-də iRRV, RRV və ya Wa ilə saxta yoluxmuş və ya yoluxmuşdur. NSP2-nin hüceyrədaxili ifadəsi qiymətləndirilmişdir. infeksiyadan sonrakı müxtəlif vaxtlarda axın sitometriyası ilə. Anti-NSP2 (MAb 191) və ya anti-NSP4 (MAb B4-2) ilə boyandıqdan sonra RV ilə yoluxmuş CBC-nin müqayisə edilə bilən tezliyi müşahidə edilmişdir (n = 2 məlumat göstərilməyib) və sonradan yalnız NSP2 boyanması istifadə edildi. CBC və IBC ilə müvafiq olaraq iki və bir təcrübədə 2 hpi heç bir NSP2 + hüceyrəsi aşkar edilmədi (məlumatlar göstərilmir). Bunun əksinə olaraq, NSP2 + hüceyrələrinin əhəmiyyətli tezlikləri RRV- və Wa-yoluxmuş, lakin saxta və ya iRRV-ə yoluxmuş hüceyrələrdə 10 hpi-də aşkar edilmişdir (Şəkil ​ (Şəkil 1A). 1A). IBC, CBC ilə müqayisədə viral replikasiyanı dəstəkləmək üçün 4 dəfə daha çox idi (P < 0,0001, Mann-Whitney testi). Əhəmiyyətli Wa infeksiyası həm CBC, həm də IBC-də RRV ilə müqayisədə daha aşağı səviyyədə baş verdi. Baxmayaraq ki, Wa ilə yoluxmuş bağırsaq və dövran edən NSP2 + hüceyrələri arasında statistik fərq aşkar edilməmişdir.P = 0.09, Mann-Whitney testi), IBC-də daha yüksək səviyyələrdə infeksiyaya meyl görüldü (Şəkil ​ (Şəkil 1A). 1A ). Bu nəticələri təsdiqləmək üçün eyni könüllüdən alınan CBC və IBC RRV ilə yoluxmuşdur (Şəkil ​ (Şəkil 1B). 1B). 10 saatdan sonra qeyri-struktur protein NSP2 və viral struktur protein VP6-nın hüceyrədaxili birgə ifadəsi araşdırıldı. Nəticələrimizlə razılaşaraq, əksər NSP2 + hüceyrələri də VP6-nı ifadə etdi və İBC-də CBC-yə nisbətən təxminən 3 qat daha yüksək səviyyəli ikiqat müsbət yoluxmuş hüceyrələr var idi (Şəkil ​ (Şəkil 1B 1B).

CBC və IBC-nin RRV və Wa infeksiyası. Fərqli xəstələrdən olan mikro muncuqla təmizlənmiş CBC (boş dairələr) və IBC (doldurulmuş kvadrat) psoralenlə inaktivləşdirilmiş RRV (iRRV), RRV və ya Wa RV (hamısı 5 MOI ilə) ilə saxta müalicə edildi və ya müalicə edildi. 10 saatdan sonra hüceyrələr səth markerləri üçün boyandı və sonra hüceyrədaxili viral zülalları aşkar etmək üçün permeabilizasiya edildi. (A) B hüceyrələrində NSP2 ifadəsinin xülasəsi. Xətlər medianı təmsil edir. Ulduz işarəsi RRV ilə yoluxmuş CBC və IBC faizləri arasında statistik əhəmiyyətli fərqləri göstərir (P < 0,0001, Mann-Whitney testi). (B) Eyni xəstədən təmizlənmiş qoşalaşmış CBC və IBC-də struktur olmayan (NSP2) və struktur (VP6) zülalların birgə ifadəsi. (C) RRV insan CBC və IBC-ni məhsuldar şəkildə yoluxdurur. Muncuqla təmizlənmiş CBC və IBC 45 dəqiqə ərzində saxta müalicə edildi və ya iRRV və ya RRV (MOI, 5) ilə müalicə edildi. İnfeksiyadan sonra hüceyrələr üç dəfə yuyulur. İlk yuma üçün neytrallaşdırıcı MAb (159 anti-VP7) 1/1000 nisbətində seyreltmə istifadə edilmişdir. 2 və 24 saatda supernatantlar toplandı və virus replikasiyası MA104 hüceyrələrində yoluxucu virusun titrlənməsi ilə müəyyən edildi. RV ilə yoluxmuş MA104 hüceyrələrinin supernatantı müsbət nəzarət kimi istifadə edilmişdir. Fərdi təcrübələrin nəticələri göstərilir və üfüqi xətlər medianı təmsil edir. Ulduz işarəsi statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqləri göstərir (P < 0.05, Wilcoxon testi).

Daha sonra RV-nin yoluxmuş B hüceyrələrində tam bir viral replikasiya dövrü keçirib-keçmədiyini araşdırdıq. Yoluxmuş CBC və IBC supernatantlarında mövcud olan yoluxucu virusun (Şəkil ​ (Şəkil 1C) 1C) və VP6 (məlumatlar göstərilmir) nisbi miqdarları MA104 hüceyrələrində və ELISA-da müvafiq olaraq 2 və 24 hpi-də titrləmə yolu ilə qiymətləndirilmişdir. 24 at gücündə canlı RRV ilə müalicə olunan CBC və IBC-nin supernatantlarında yoluxucu virus və həll olunan VP6-nın əhəmiyyətli dərəcədə artması müşahidə edilmişdir (Şəkil ​ (Şəkil 1C 1C və məlumatlar göstərilmir). Qeyd etmək lazımdır ki, insanın əsas CBC infeksiyası. və RRV ilə IBC MA104 hüceyrələrinin müqayisə olunan infeksiyasından əhəmiyyətli dərəcədə az məhsuldardır (Şəkil ​ (Şəkil 1C). 1C).

RV əsasən mBC alt qruplarını yoluxdurur.

B-hüceyrə alt dəstlərinin paylanması onların ev sahibi və bağırsaqda lokalizasiyasına görə dəyişir, qandan fərqli olaraq, B hüceyrələrindən daha çox antigen təcrübəsi var (21, 22). B-hüceyrə alt dəstlərinin RV infeksiyasına həssaslığını müəyyən etmək üçün CBC təcrid olundu və RRV ilə ələ salındı ​​və ya yoluxdu və infeksiyadan dərhal sonra hüceyrələr anti-CD19, anti-CD27 və anti-IgD ilə boyandı və FACS ilə sıralandı. B hüceyrələrinin dörd alt dəstəsi təcrid olundu: CD27 − IgD + (naïve), CD27 + IgD − (keçid yaddaşı), CD27 + IgD (x0002b) (IgD (IgD) 45) , və CD27 − IgD − (bu yaxınlarda CD27-mBC kimi təsvir edilmişdir [23, 71]). Bütün populyasiyalar çeşidləndikdən sonra 94-dən çox təmiz olmuşdur (Şəkil ​ (Şəkil 2A). 2A). Çeşidləmə infeksiyadan sonra həyata keçirildiyi üçün virusa məruz qalma bütün alt qruplar üçün müqayisə edilə bilər. 10 hpi-də hüceyrələr yuyuldu və yenidən anti-CD19, anti-CD27 və anti-IgD MAb ilə boyandı və hüceyrədaxili NSP2-ni aşkar etmək üçün keçiriciləşdirildi. Şəkildə göstərildiyi kimi Şəkil 2A, 2A, naïve B hüceyrələri RV infeksiyasına nisbətən davamlı idi və keçiddə, IgM və CD27-mBC-də yoluxmuş hüceyrələrin 3-6 dəfə yüksək tezlikləri müşahidə edildi. alt qrup populyasiyaları (n = 3) (Şəkil ​ (Şəkil 2A 2A).

Bu müşahidələri təsdiqləmək və genişləndirmək üçün təmizlənmiş CBC və IBC yoluxdu və 10 hpi hüceyrələr anti-CD19, anti-CD20, anti-CD27, anti-IgD, anti-CD38 və anti-NSP2 MAb ilə boyandı. Şəkil ​ Fig.2B, 2B-də göstərildiyi kimi, RV replikasiyası yüksək dərəcədə IgD − CD27 + mBC ilə məhdudlaşdırılmışdır. Qeyd edək ki, bağırsaq ASC-nin 20-dən 90-dək (CD19 + CD20 aşağı CD38 yüksək CD27 +) RRV replikasiyasını dəstəkləyir (məlumatlar göstərilmir). RRV infeksiyasından sonra CBC və IBC-nin yaddaş (IgD −) bölməsində müvafiq olaraq 52-86 və 54-92 (orta hesabla 80-ə bərabər) yoluxmuş hüceyrələr olmuşdur (Şəkil 2B və C). ). İnsan Wa RV də üstünlük olaraq CBC və IBC-nin mBC alt dəstələrində təkrarlanır (Şəkil ​ (Şəkil 2C). 2C). Beləliklə, dövran edən və bağırsaq mBC alt dəstələri həm heteroloji, həm də homolog RV infeksiyasının əsas hədəfləridir və bağırsaqda əhəmiyyətli infeksiya CD38 yüksək ASC-də də baş verir (məlumatlar göstərilmir).

RV infeksiyası CBC-nin canlılığını azaldır, lakin IBC-nin yox.

RV infeksiyası tez-tez hüceyrə mədəniyyətində sitolitikdir və yoluxmuş B hüceyrələrinin ölümünə səbəb ola bilər. RV-nin yoluxmuş CBC və IBC-də canlılıq dəyişikliklərinə səbəb olub-olmadığını müəyyən etmək üçün saxta, iRRV-, RRV- və ya Wa ilə yoluxmuş hüceyrələr 10 hpi olan bir neçə canlılıq markerləri ilə boyandı. CBC-nin tripan mavisi ilə boyanması saxta yoluxmuş hüceyrələrə nisbətən RRV ilə yoluxmuş hüceyrələrdə ölü hüceyrələrin əhəmiyyətli dərəcədə yüksək tezliyini göstərdi, median 11,5 (aralıq, 4,2 ilə 29 arasında) və 4,3 ilə (0 ilə 14 arasında arasında) #x00025), müvafiq olaraq (P = 0.004, Man-Whitney testi n = 13) (məlumat göstərilmir). IBC-də tripan mavisi analizi aparılmadı, çünki preparatların ölü epitel hüceyrələri ilə çirklənməsi analizi çaşdırdı. Bundan əlavə, flüoresan amin-müsbət (ölü hüceyrələr) B hüceyrələrinin faizi əhəmiyyətli dərəcədə yüksək idi (P = 0.001, Man-Whitney testi n = 10) RRV-ə yoluxmuş CBC-də (median, 8' diapazon, 3 ilə 20' arasında) saxta (median, 2' diapazon, 1 ilə 5' arasında) ilə müqayisədə, iRRV (median 30 25' diapazon, 1-dən 5-ə qədər)- və ya Wa (median, 4' diapazon, 1 ilə 7' arasında) yoluxmuş B hüceyrələri (Şəkil 'x200B (Şəkil 3A). 3A). Bununla belə, saxta, iRRV-, RRV- və Wa ilə yoluxmuş hüceyrələr arasında ölü İBC-nin tezliyində heç bir fərq tapılmadı (Şəkil ​ (Şəkil 3A). 3A). Etoposid (burada istifadə olunan yüksək dozalarda nekroza səbəb ola bilər [53]) həm CBC, həm də IBC-də ölü hüceyrələrin müqayisəli tezliyinə səbəb olur (Şəkil ​ (Şəkil 3A 3A).

CBC və IBC-də RV səbəb olan ölüm. Muncuqla təmizlənmiş CBC və IBC saxta yolla yoluxmuş və ya müsbət nəzarət kimi iRRV, RRV və ya Wa RV (MOI, 5) və ya 80 º003bcM etoposid ilə yoluxmuşdur. B hüceyrələrinin canlılığı 10 saatdan sonra axın sitometriyası ilə qiymətləndirildi. (A) Amin + CBC və IBC tezliyi. CBC və IBC üçün ən azı 12 təcrübədən medianlar və diapazonlar göstərilir. Wa RV üçün altı təcrübə daxildir. Qoşa ulduz işarəsi saxta və RRV ilə yoluxmuş B hüceyrələri üçün nəticələr arasında statistik əhəmiyyətli fərqləri göstərir (P = 0,005, Wilcoxon testi). Ulduz işarəsi iRRV və RRV ilə yoluxmuş B hüceyrələri və ya RRV və Wa ilə yoluxmuş hüceyrələr arasında statistik əhəmiyyətli fərqləri göstərir (P = 0.01, Wilcoxon testi). ns, əhəmiyyətsiz fərqlər. (B) CBC saxta yolla yoluxmuşdur və ya iRRV, RRV (MOI, 5) və ya 80 º003bcM etoposidlə yoluxmuşdur. 10 saatdan sonra PI, anneksin V və NSP2 ifadəsi B hüceyrələrində axın sitometriyası ilə qiymətləndirildi. RRV ilə yoluxmuş hüceyrələr üçün NSP2 + və NSP2 − hüceyrələrindəki qapılar göstərilir. Görülən üç eksperimentdən biri təqdim olunur.

CBC-də RRV tərəfindən yaradılan ölüm mexanizmini daha da öyrənmək üçün yoluxmuş CBC annexin V (apoptoz markeri) və propidium iyodid (PI) (nekroz markeri) ilə boyandı. Şəkil ​ Fig.3B, 3B-də göründüyü kimi, flüoresan amin üçün yuxarıda təsvir edilənlərlə müqayisə edilə bilən boyanma səviyyələri bu markerlərlə aşkar edilmişdir. Yoluxmuş hüceyrələrin təhlili (Şəkil ​ (Şəkil 3B) 3B ) apoptozdan daha çox ehtimal olunan nekrozun (15, 19) əsas mexanizm olduğunu irəli sürərək, anneksin V və PI ikiqat müsbət hüceyrələrin üstünlük təşkil etdiyini göstərdi. RV-nin səbəb olduğu B-hüceyrəsinin ölümü üçün. Bu nəticələr göstərir ki, RRV CBC-nin əhəmiyyətli bir hissəsində canlılıq dəyişikliklərinə səbəb olur, daha asan yoluxmuş İBC isə infeksiyadan sonra erkən (10 saat) RV-nin səbəb olduğu ölümə nisbətən davamlıdır. Saxta və Wa ilə yoluxmuş B hüceyrələri arasında heç bir fərq görülmədi, yəqin ki, virus infeksiyasını dəstəkləyən hüceyrələrin daha az tezliyi səbəbindən (Şəkil ​ (Şəkil 3A 3A).

RV dolayı mexanizmlə B-hüceyrəsinin aktivləşməsinə və ASC-yə diferensiasiyaya səbəb olur.

RV infeksiyasından sonra T-müstəqil kütləvi B hüceyrə aktivasiyası bildirilmişdir in vivoin vitro siçan modelində (6, 10). RV-nin insan CBC və IBC-nin aktivləşməsinə səbəb olub olmadığını müəyyən etmək in vitro, CD69, CD40, CD86 və HLA-DR ifadə səviyyələri mənfi təmizlənmiş CBC, IBC və ya B hüceyrələrinin təmizləndiyi müvafiq PBMC və IMC preparatlarının saxta, iRRV və ya RRV infeksiyasından sonra axın sitometriyası ilə araşdırıldı. LPS, CpG 2006 və ya bəzi hallarda anti-BCR ilə hüceyrə stimullaşdırılması B-hüceyrəsinin aktivləşdirilməsi üçün müsbət nəzarət kimi istifadə edilmişdir. LPS və CpG 2006 təmizlənmiş CBC və PBMC-də mövcud olan CD69 + B hüceyrələrinin faizini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı (Şəkil ​ (Şəkil 4A, 4A, yuxarı). Lakin RV infeksiyasından sonra B-hüceyrəsinin aktivləşməsi müşahidə edilmədi. təmizlənmiş dövran edən və ya bağırsaq B hüceyrələrində (Şəkil ​ (Şəkil 4A, 4A , yuxarı və aşağı, açıq çubuqlar). Maraqlıdır ki, aktivləşdirilmiş B hüceyrələrinin tezliyi PBMC-nin RV infeksiyasından sonra təmizlənmiş CBC ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə yüksək idi. PBMC-dən əldə edilmişdir (Şəkil ​ (Şəkil. ​ (Şəkil. 4A, 4A , yuxarı, çubuqlar). iRRV PBMC-də CD69 ifadəsini, eləcə də canlı RRV-ni artırdığından, RV replikasiyası aktivləşdirmə üçün kritik bir tələb deyildi (Şəkil ​). x200B (Şəkil 4A, 4A , yuxarı) Əksinə, RV və CpG 2006 IBC və IMC-ni aktivləşdirmədi və yalnız aşağı, lakin əhəmiyyətli aktivasiya (Şəkil ​ (Şəkil 5A, 5A, alt) aşkar edildi. təmizlənmiş IBC və bütün IMC-nin LPS müalicəsi (P < 0.03, Mann-Whitney testi). Müsbət nəzarət kimi istifadə edilən təmizlənmiş CBC və IBC-nin anti-BCR müalicəsi CD69-un inkişaf etmiş ifadəsi ilə nəticələndi (CBC üçün median, 26° diapazon, IBC üçün median 15-77, 13-3-20 diapazonu). x00025 n = 4 məlumat göstərilmir). RV ilə yoluxmuş CBC-də CD86 ifadəsində əhəmiyyətli olmayan, lakin ardıcıl artım qeyd edildi, lakin HLA-DR və ya CD40 təhlil edildikdə heç bir dəyişiklik müşahidə edilmədi (məlumatlar göstərilmir). Birlikdə götürdükdə, bu tapıntılar göstərir ki, RV B hüceyrələrinin aktivləşməsinə onlar PBMC-nin tərkib hissəsi kimi daxil olduqda, onlar təmizləndikdə deyil, dövriyyədə səbəb olmuşdur. Digər tərəfdən, IBC RV müalicəsi ilə aktivləşdirilmədi (LPS ilə aşağı səviyyəli aktivləşdirmə istisna olmaqla), hətta IMC-nin bir komponenti kimi məruz qaldıqda.

RV PBMC-də B-hüceyrə aktivləşməsinə səbəb olduğundan, biz RV-nin ASC-yə BC diferensiasiyasına səbəb ola biləcəyini müəyyən etmək istədik. Bu məqsədlə, PBMC və CBC saxta yoluxmuş və ya iRRV və ya RRV ilə yoluxmuşdur və ümumi IgA və IgG ASC tezliyi 5 günlük mədəniyyətdən sonra iki rəngli ELISPOT analizi ilə ölçüldü. CD69 ifadə analizi ilə razılaşaraq (Şəkil ​ (Şəkil 4A), 4A), PBMC-nin RRV infeksiyası mədəniyyətdə IgA/IgG ASC tezliyini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı (Şəkil ​ (Şəkil ​, 4B) , yuxarı). #x200B (Şəkil 4B, 4B , yuxarı və müvafiq olaraq məlumatlar göstərilmir) Virusun PBMC-yə təsirindən fərqli olaraq, təmizlənmiş CBC-nin RV infeksiyası nəzərəçarpacaq ASC differensasiyası ilə nəticələnməmişdir (Şəkil ​ (Şək. ​) Fig.4B, 4B, alt), PBMC populyasiyasında mövcud olan başqa hüceyrə(lər)dən olan faktor(lar)ın RV-vasitəçiliyi ilə dövran edən B-hüceyrəsinin aktivləşməsi və ASC-yə diferensiallaşması üçün lazım olduğunu göstərir.

Daha sonra RV-nin B hüceyrələrinin müxtəlif poliklonal stimullaşdırmalar tərəfindən törədilən ASC-yə diferensiasiyasını modullaşdıra biləcəyini araşdırdıq. CBC və PBMC Toll-bənzər reseptor (TLR) agonistləri LPS və CpG 2006, eləcə də anti-BCR ilə müalicə olundu və eyni zamanda RRV ilə yoluxdular. Materiallar və Metodlarda təsvir olunduğu kimi, bütün stimullar eksperimentin vaxtı ərzində saxlanılıb. ASC-nin yüksək tezlikləri LPS müalicəsindən sonra və hətta daha çox saxta yoluxmuş PBMC və ya CBC-nin CpG 2006 müalicəsindən sonra müşahidə edilmişdir (Şəkil ​ (Şəkil 4C, 4C, açıq dairələr). ASC tezliyində əhəmiyyətli azalma CpG ilə stimullaşdırılmış PBMC və CBC və LPS ilə müalicə olunan CBC-də eyni vaxtda RV infeksiyası ilə nəsil müşahidə edilmişdir (Şəkil ​ (Şəkil 4C, 4C, doldurulmuş dairələr)). CBC-ni ASC-yə stimullaşdırdı.

RV insan CBC-də IL-6 sekresiyasını induksiya edir, lakin İBC-də deyil.

Son tədqiqatlar göstərdi ki, B hüceyrələri tərəfindən buraxılan sitokinlər immun cavabın modulyasiyasında mühüm rol oynaya bilər (36, 47, 48, 73). Biz CBA ilə RV infeksiyasından 72 saat sonra CBC və IBC tərəfindən istehsal olunan sitokinlərin (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70 və TNF-α) nümunəsini təhlil etdik. . Ümumiyyətlə, IL-6 və IL-8-in daha yüksək səviyyələri CBC-nin supernatantlarında IBC-yə nisbətən daha yüksək olmuşdur (Şəkil ​ (Şəkil 5). 5). RRV və iRRV CBC-dən IL-6 sekresiyasını əhəmiyyətli dərəcədə artırdı, lakin IBC-dən deyil (P < 0.01 və P > 0.2, müvafiq olaraq, Wilcoxon testi) (Şəkil ​ (Şəkil 5, 5, yuxarı və aşağı). Müqayisə edilə bilən IL-6 ifrazı CBC-nin sezium-təmizlənmiş RRV ilə infeksiyasından sonra əldə edilmişdir ki, ehtimalı istisna olmaqla, bu sitokin supernatantlarda mövcud olan hüceyrə komponentləri tərəfindən induksiya edilmişdir (n = 3) (məlumat göstərilmir). Bu təcrübələrdə IL-8 RRV və ya iRRV tərəfindən induksiya edilməmişdir. IL-10 və TNF-α qeyri-müntəzəm olaraq CBC-də induksiya edilmişdir, lakin IBC-də deyil (Şəkil ​ (Şəkil 5 5).

Daha sonra RV-nin poliklonal stimullaşdırılmış B hüceyrələri tərəfindən induksiya edilən sitokinlərin sekresiyasını modulyasiya edə biləcəyini araşdırdıq. Saxta yoluxmuş hüceyrələrin anti-BCR (və ya LPS və CpG 2006 məlumatları göstərilməyib) ilə poliklonal stimullaşdırmadan sonra CBC və IBC-də IL-6 və IL-8 sekresiyasında əhəmiyyətli artım və yalnız TNF-α CBC, müşahidə edilmişdir (Şəkil ​ (Şəkil 5). 5). Maraqlıdır ki, RV ilə yoluxmuş anti-BCR ilə müalicə olunan CBC-də yoluxmamış anti-BCR ilə müalicə olunan nəzarət hüceyrələri ilə müqayisədə IL-6 və IL-8 sekresiyasında əhəmiyyətli azalma müşahidə edilmişdir (P = 0.02 və P = 0,03, müvafiq olaraq, Wilcoxon testi n = 13) və bu bastırıcı cavab anti-BCR ilə müalicə olunan yoluxmuş İBC-də mövcud deyildi (Şəkil ​ (Şəkil 5). 5). TNF-α istehsalının aşağı səviyyəsi (median, 9 pg/ml diapazon, 1,8-30 n = 12 Şəkil ​ Şəkil.5) 5 ) və IL-10 (median, 20 pg/ml diapazon, 5-dən 183-ə qədər) n = 10 məlumat göstərilməyib) müvafiq olaraq CBC-nin anti-BCR və CpG 2006 stimullaşdırılması ilə təhrik edilmişdir. Qeyd edək ki, anti-BCR-stimullaşdırılmış CBC-də TNF-α-də aşkar edilə bilən, lakin əhəmiyyətli olmayan azalma RV infeksiyasından sonra da əldə edilmişdir (Şəkil ​ (Şəkil 5, 5, yuxarı). Bunun əksinə olaraq, IL-12p70 və IL-1β heç bir stimullaşdırma ilə CBC və ya IBC mədəniyyətlərində aşkar edilməmişdir (məlumatlar göstərilmir) Xülasə, CBC və IBC RV infeksiyasından sonra sitokinləri diferensial şəkildə ifraz edir, CBC daha həssasdır və RV azalır. anti-BCR-stimullaşdırılmış CBC-dən IL-6 və IL-8-in ifrazı, lakin IBC-dən deyil (Şəkil ​ (Şəkil 5 5).

Poliklonal stimullaşdırma CBC-də RRV infeksiyası və hüceyrə ölümünün əhəmiyyətli dərəcədə artmasına səbəb olur, lakin IBC-də deyil.

RV poliklonal stimullaşdırılmış B hüceyrələrində ASC tezliyini və IL-6 və IL-8 sekresiyasını modulyasiya edə bildiyindən (şək. ​ (müvafiq olaraq, Şəkil 4 4 və ​ və 5, 5), biz təsiri araşdırdıq. B-hüceyrəsinin aktivləşməsinin virus replikasiyası və hüceyrənin həyat qabiliyyətinə təsiri. CBC və IBC müalicə olunmadan buraxıldı və ya anti-BCR, LPS və ya CpG 2006 ilə müalicə olundu və sonra iRRV, RRV və ya Wa ilə ələ salındı ​​və ya yoluxdu. Anti-BCR, LPS , və ya CpG 2006 müalicəsi inkubasiya zamanı davam etdirildi. İRRV ilə saxta yoluxmuş və ya yoluxmuş poliklonal stimullaşdırılmış hüceyrələrdə heç bir NSP2 + B hüceyrələri aşkar edilmədi. Şəkil ​ Şəkil 6A, 6A, poliklonal stimullaşdırmada göründüyü kimi anti-BCR ilə RRV replikasiyasını dəstəkləyən CBC faizini 3 dəfə artırdı. LPS müalicəsi RRV infeksiyasına da əhəmiyyətli stimullaşdırıcı təsir göstərdi (Şəkil ​ (Şəkil 6B). 6B). Əksinə, artım yoxdur. Bu eyni stimullarla müalicə olunan IBC-də NSP2 + hüceyrələrinin tezliyində aşkar edilmişdir (Şəkil 6A və B).Müqayisəli artım Wa ilə yoluxmuş hüceyrə sayında ase, poliklonal stimullaşdırılmış CBC-də müşahidə edilmişdir (n = 5) (Şəkil ​ (Şəkil 6B). 6B). Maraqlıdır ki, virus infeksiyası və hüceyrə ölümü birlikdə təhlil edildikdə, əhəmiyyətli müsbət əlaqə (n = 6, P = 0.02, Mann-Whitney testi) RV-ə yoluxmuş hüceyrə sayının artması ilə CBC ölümü arasında LPS ilə müalicə olunan hüceyrələrdə tapıldı (Şəkil ​ (Şəkil 6C). 6C). Anti-BCR-stimullaşdırılmış CBC-də hüceyrə ölümü ilə RV replikasiyası arasında heç bir əhəmiyyətli əlaqənin olmamasına baxmayaraq, oxşar tendensiya qeyd edildi (Şəkil 6A və C). CBC-dən fərqli olaraq, RV ilə yoluxmuş anti-BCR və LPS ilə stimullaşdırılmış IBC-də viral replikasiyada və RV-nin səbəb olduğu hüceyrə ölümündə artım müşahidə edilməmişdir (Şəkil ​ (Şəkil 6 6).

Poliklonal stimullaşdırma CBC-də RRV infeksiyası və hüceyrə ölümünün artmasına səbəb olur, lakin IBC-də deyil. (A) Təmizlənmiş CBC və IBC RRV infeksiyasından əvvəl 10 μg/ml anti-BCR antikoru ilə müalicə edilmişdir (MOI, 5). Canlılıq və CD19 və NSP2 ifadəsi 10 hpi-də axın sitometriyası ilə qiymətləndirildi. 14 təcrübənin nümayəndəsi göstərilir. (B) Poliklonal stimullaşdırmadan sonra viral replikasiyanın gücləndirilməsi qat artımı kimi təqdim olunur. Çubuqlar medianları göstərir və CBC üçün 8-dən 12-ə qədər təcrübə və IBC üçün 6-dan 12-ə qədər təcrübələr arasında dəyişir. Wa RV üçün beş təcrübə təqdim olunur. * və **, RRV və anti-BCR plus RRV arasında statistik əhəmiyyətli fərqlər (P = 0,0009) və RRV və LPS plus RRV və ya Wa və anti-BCR plus Wa arasında (P = 0.03, Mann-Whitney testi) müvafiq olaraq. (C) Təmizlənmiş CBC və IBC RRV və ya RRV plus poliklonal stimullaşdırma ilə yoluxmuş və sonra 10 saat ərzində becərilmişdir.Amin canlılıq markerinin və NSP2-nin birgə ifadəsini qiymətləndirmək üçün hüceyrələr boyandı. Çubuqlar ikiqat müsbət (NSP2 + və amin + ) CBC (boş çubuqlar) və IBC (dişli çubuqlar) median tezliyini təmsil edir. P dəyərlər (Mann-Whitney testi) göstərilir (n = 6-12 təcrübə).

B hüceyrələri RV-yə xas yaddaş dövran edən və bağırsaqda CD4 və CD8 T hüceyrələrinin stimullaşdırılmasında rol oynamır.

B hüceyrələrinin antigen təqdim edən hüceyrələr kimi rolunu xarakterizə etmək üçün, an in vitro T-hüceyrə stimullaşdırılması təhlili tükənməmiş və ya mikro muncuqlarla B hüceyrələri tükənmiş PBMCs və IMCs istifadə edərək həyata keçirilmişdir. IFN-γ, IL-2, TNF-α və ya IL-10 istehsal edən RV-spesifik T hüceyrələrinin tezlikləri hüceyrədaxili sitokin aşkarlanması ilə qiymətləndirilmişdir. Əvvəlki nəticələrimizlə (39) razılaşaraq, RRV ilə stimullaşdırılan PBMC-lərdə RV-xüsusi IFN-3- istehsal edən CD4 + T-hüceyrələrinin tezliyində aşağı, lakin əhəmiyyətli fərq səviyyəsi tapıldı (median, 0.04+). x00025 diapazonu, 0,02-dən 0,11-ə qədər) saxta yoluxmuş hüceyrələrlə müqayisədə (median, 0,01-ci diapazon, 0,00-0,02-x00025) P = 0.04, Wilcoxon testi n = 5) (Şəkil ​ (Şəkil 7). 7). Maraqlıdır ki, bağırsaq CD8 + T-hüceyrələrində də əhəmiyyətli bir fərq tapıldı və ya istehza edildi (median, 0,04' diapazon, 0,0-dan 0,08'ə qədər) P = 0,04, Wilcoxon testi) və ya RRV-nin stimullaşdırılması (median, 0,58% diapazon, 0,04-3,08%) (Şəkil ​ (Şəkil 7). 7). PBMC-lərdən və ya İMC-lərdən B hüceyrələrinin tükənməsindən sonra, tükənməyən bütöv PBMC-lər və ya İMC-lər ilə müqayisədə IFN-x003b3 istehsal edən RV-xüsusi CD4 və ya CD8 hüceyrələrinin tezliyində heç bir fərq tapılmadı. B hüceyrələri bu qısa müddətdə antigen təqdim edən hüceyrələr kimi əhəmiyyətli dərəcədə iştirak etmir in vitro yaddaş təhlili (Şəkil ​ (Şəkil 7). 7). Bununla belə, B-hüceyrələrinin tükənməsindən sonra IFN- γ istehsal edən SEB ilə stimullaşdırılan bağırsaq CD8 + T-hüceyrələrinin tezliyində əhəmiyyətli bir azalma müşahidə edilmişdir ki, bu da HLA I ifadə edən hüceyrələrin (HLA molekulları var) azalması ilə əlaqədar ola bilər. adekvat superantigen stimullaşdırılması üçün lazımdır). PBMC və ya IMC-də müşahidə edilən IL-10, TNF-α və ya IL-2 istehsal edən RV-yə xas T hüceyrələrində heç bir mühüm fərq tapılmadı, ya B hüceyrələri tükənməmiş, ya da tükənmişdir (məlumatlar göstərilmir).

Qan dövran edən və bağırsaq B hüceyrələri RV spesifik T hüceyrələri üçün kritik antigen təqdim edən hüceyrələr deyil. Bütün (açıq dairələr) və ya B hüceyrəsi tükənmiş (doldurulmuş dairələr) PBMC və ya IMC, Materiallar və Metodlarda təsvir olunduğu kimi, RRV və ya SEB ilə istehza ilə stimullaşdırılıb və ya stimullaşdırılıb. 10 saatlıq kulturadan sonra (son 5 saat ərzində brefeldin A əlavə edildi) hüceyrələr CD3, CD4, CD8, CD69 və IFN-#x003b3-ə qarşı canlılıq markeri, MAb ilə boyandı. RV-xüsusi IFN-#x003b3 istehsal edən T hüceyrələrinin tezliyi axın sitometriyası ilə təhlil edilmişdir. Ölü hüceyrələr canlılıq boyanması ilə analizdən çıxarıldı. Fərdi təcrübələr göstərilir. Xətlər medianı təmsil edir. Ulduz işarəsi saxta və RV və ya SEB ilə stimullaşdırılmış hüceyrələr arasında əhəmiyyətli fərqləri göstərir (P ≤ 0.04, Wilcoxon testi).


Metodlar

Xəstələr

Xəstələr Almaniyanın Münhen şəhərindəki Dr von Hauner Uşaq Xəstəxanasına, Ludwig-Maximilians-Universität və Minas Gerais Federal Universitetinin Uşaq Qastroenterologiyası Departamentinə, Belo Horizonte, Braziliyaya göndərildi. Mövcud etik və hüquqi qaydalara uyğun olaraq məlumatlandırılmış razılıq alınmışdır. Tədqiqat protokolu Münhen, Almaniya (Layihə Nömrəsi 381-11) Ludwig-Maximilians-Universität, Universitet Xəstəxanasında İnstitusional Nəzarət Şurası tərəfindən təsdiq edilmişdir. Araşdırma Helsinki Bəyannaməsinə uyğun olaraq aparılıb.

LCL cavab verən T-hüceyrə xətləri

T-hüceyrə xətlərini (keçid 1) başlatmaq üçün P2.1 və P2.2 xəstələrindən və iki EBV-seropozitiv sağlam donordan (HD1 və HD2) 1 × 10 6 periferik qan mononükleer hüceyrəsi (PBMC) birgə kulturasiya edilmişdir. 10:1 nisbətində (PBMC:LCL) qamma-şüalanmış (80ºGy) otolog EBV + lenfoblastoid hüceyrə xətləri (LCL) ilə, ümumi həcmi 2 ml T-hüceyrə V-dən ibarət 10's birləşdirilmiş insan serumu, 2'x02009mM'L-qlutamin, 10'mM HEPES və 1'amfoterisin B ilə əlavə edilmiş mühit. FCS-reaktiv T hüceyrələrinin genişlənməsinin qarşısını almaq üçün, davamlı olaraq stimulyator LRP4 CL1-də kultura əlavə edildi. 10 insan serumu, 2'x02009mM L-qlutamin, 1'vacib olmayan amin turşuları, 1'mM natrium piruvat, 2'x02009mM'x02009 L-qlutamin' və 'qlutamin' və 'x02009mM' ilə 48 saatdan sonra kultur mühitinə 50 º2121 IL-2 (Novartis) əlavə edildi. T-hüceyrə xətləri eyni şəkildə hər iki həftədən bir yenidən stimullaşdırıldı və lazım olduqda bölündü. On keçiddən sonra sətirlər əsasən (㺕%) CD3 + CD8 + hüceyrələri və bir neçə (υ%) CD3 + CD4 + hüceyrələrindən ibarət idi. T hüceyrələrinin spesifikliyi 5 x000d7 10 4 hədəf hüceyrənin (otoloq və ya allogen HLA-uyğunsuz LCL) 5 x000d7 10 4 T hüceyrəsi ilə 200ºC T-hüceyrəsinin son həcmində inkubasiya edilməsi ilə sınaqdan keçirilmişdir. 24 saat birgə kulturadan sonra supernatant sitokinlərin ölçülməsi üçün ELISA (Rɭ Systems) həyata keçirildi.

Genetik analiz

1-ci ailə subyektlərinin genomik DNT-si F1, M1, P1.1, P1.2 və S1.1 (Şəkil 2a) GEO Platformada <"type":"entrez-geo-da Genom-geniş İnsan SNP massivi 6.0 istifadə edərək genotiplənmişdir. ","attrs":<"text":"GPL6801","term_id":"6801">> GPL6801 (Affymetrix) və SureSelect XT Human All Exon V4+UTRs dəstindən (Agilent Technologies) istifadə edərək ekzome kitabxanaları hazırlamaq üçün istifadə olunur. Ştrix kodlu kitabxanalar Dr von Hauner Uşaq Xəstəxanasının sekvensləmə müəssisəsində SOLiD 5500 XL yeni nəsil ardıcıllıq platformasında (Life Technologies) orta əhatə dairəsi 80 oxunuş dərinliyinə qədər ardıcıllıqla sıralanıb. Bioinformatik məlumatların işlənməsi daxili boru kəməri ilə aparıldı: Oxumalar standart parametrlərdən istifadə edərək LifeScope Analysis Suite 2.5.1 (Life Technologies, Carlsbad, CA, ABŞ) istifadə edərək insan istinad genomuna uyğunlaşdırıldı (versiya hg19). Hər bir nümunə üçün zolaq məlumatları birləşdirildi və PCR dublikatları SAMtools versiyası 1.18 (istinad 36) istifadə edilərək silindi. SAMtools həmçinin SNP-lərə zəng etmək üçün istifadə olunurdu: ‘mpileup –M 300 –I –g 𠄽 -C50 –S'. Kiçik daxiletmələr və silinmələr (indels) DinDel versiyası 1.01 (istinad 37) istifadə edərək, əvvəlcə hər bir nümunə üçün fərdi olaraq ehtimal göstəriciləri müəyyən etməklə, sonra isə əvvəllər müəyyən edilmiş indellərlə birlikdə A ailəsindən yığılmış nümunələr dəstində DinDel-i yenidən işə salmaqla müəyyən edilmişdir. təklif olunan variantlar kimi. Variantlara şərh verilmiş və onların mRNT və zülal səviyyəsində təzahürü Ensembl Database (versiya 68) əsasında müəyyən edilmişdir. Bundan əlavə, variant tezlikləri haqqında məlumat HapMap (HM) 38 , 1000 genom (TG) 39 , NHLBI Grand Opportunity Exome Sequencing Project (NH) və ExAC 40-dan toplanmışdır. 2 ailə subyektinin genomik DNT-si üçün WES yanaşması F2, M2, P2.1 və P2.2 20-dən əvvəl nəşr edilmişdir. c.489insG və c.871ʱG>T CARMIL2 mutasiyalar Sanger ardıcıllığı ilə təsdiq edilmişdir (primer məlumat üçün Əlavə Cədvəl 5-ə baxın). CARMIL2 cDNA P2.1 T lenfoblast total mRNA-dan (RevertAid H Minus Reverse trascriptase ThermoFisher Scientific) tərs transkripsiya edildi və 11-ci ekzonun atlanması Sanger ardıcıllığı ilə təsdiqləndi (əsas məlumat üçün Əlavə Cədvəl 5-ə baxın).

Hüceyrə mədəniyyəti və stimullaşdırılması

PBMC sağlam donorlardan və xəstələrdən Ficoll-Hypaque (Pharmacia) sıxlıq gradient sentrifuqasiyası ilə təcrid edilmişdir. PBMC RPMI 1640-da saxlanılıb, 2 mM glutamin, 100  U ml 𢄡 penisilin, 100 μgμgμgμgμgμgμgμgμgμgμgμgμgμgμgstreamȂm∂mM glutamin mM qlutamin ml ml ml mM ilə əlavə edilmişdir2 37ºC-də inkubator. Hüceyrə xətləri VenorGeM Mycoplasma Detection Kit (MP0025, Sigma-Aldrich) istifadə edərək PCR vasitəsilə mikoplazma üçün mənfi test edilmişdir. Stimulyasiya titrləmə əyriləri quruldu (Əlavə Şəkil 4b). T-hüceyrəsinin aktivləşdirilməsi, yayılması və sitokin ifrazı təcrübələri üçün PBMC anti-CD3-birləşdirilmiş muncuqlarla (Bio-anti-CD3, eBioscience-dən OKT3 və Miltenyi Biotec-dən anti-Biotin MACSiBeads ilə birləşdirilmiş) və 10:1 nisbətində stimullaşdırıldı. 1 & # x02009 olmadan & # x003bcg & # x02009ml & # x022121 həll anti-CD28 (CD28.2, eBioscience) və ya 0,5 ilə & # x02009ng & # x02009ml & # x022121 phorbol 12 miristat 13 asetat (PMA) və 1 & # x02009 & # x003bcM ionomycin (Siqma-Aldrich). İmmunoblotinq və (fosfo-) axın sitometriyası ilə T-hüceyrə siqnalının təhlili üçün T limfoblastları PBMC-dən 5 ml PMA, 1 M ionomisin və   μM ” 2 (Novartis) iki gün ərzində və 100 ½ ½ IL-2 ilə əvəz edilmiş tam RPMI 1640-da əlavə 8 gün əkilir. T-hüceyrə miqrasiya analizləri və sitoskeletal zülalların təhlili üçün PBMC-lər dörd gün ərzində 1'fytohemagglutinin (Remel, Dartford) ilə aktivləşdirildi. Sonra hüceyrələr 20 ml rekombinant IL-2 (Proleukin, Novartis) olan mühitdə saxlanıldı. Aktivləşdirilmiş insan T limfoblastları stimullaşdırmadan sonra 10-cu gündə istifadə edilmişdir.

Axın sitometriyası

Treg hüceyrələr APC-H7-anti-CD3 (SK7, 1:50), APC-anti-CD4 (SK3, 1:100), PE-anti-CD25 (M-A251, 1:50) (bütün BD Biosciences) ilə boyandı. ) və FITC-anti-CD127 (eBioRDR5, 1:50, eBioscience). PerCP-Cy5.5-anti-FOXP3 (PCH101, 1:25) ilə hüceyrədaxili boyanma FOXP3 boyama dəsti (eBioscience) istifadə edərək həyata keçirildi. Yaddaş T hüceyrələri səthi APC-H7-anti-CD3 (SK7, 1:50), PerCP-anti-CD4 (SK3, 1:10), PacB-anti-CD8 (RPA-T8, 1:100), APC-anti-CD28 (CD28.2, 1:200), PE-Cy7-anti-CD45R0 (HI100, 1:100), PE-anti-CCR7 (3D12, 1:5) (hamısı BD) və FITC-anti -CD27 (O323, 1:50, eBioscience). Proliferativ reaksiya və AICD, PBMC-ni 2,5 ºM karboksifluoressein diasetat suksinimidil esteri (CFSE, ThermoFisher), 7-aminoaktinomisin D (7-AAD, 2,5 Ȃ,’) ilə etiketləməklə ölçüldü. APC-H7-anti-CD3 (SK7, 1:50), PE-anti-CD25 (M-A251, 1:50), APC-anti-CD8 (SK1, 1:200) (hamısı BD) və PC5-anti -CD4 (13B8.2, 1:100, Beckman Coulter) stimulyasiyadan 5 gün sonra. NK hüceyrələrinin və CTL-lərin (sitotoksik T-limfositlər) deqranulyasiyası PerCP-anti-CD3 (SK7, 1:100), FITC-anti-CD8 (SK1, 1:100), APC-anti-CD56 (NCAM16) ilə səthi boyanma yolu ilə müəyyən edilmişdir. .2, 1:100), PE-anti-CD107a (H4A3, 1:50) və PE-Cy7-anti-NKG2D (1D11, 1:20) (hamısı BD). Ümumi və yüksək yaxınlıqlı LFA1-in ifadə analizi konformasiyaya xas anti-LFA1 monoklonal anticisimlər klonu 38 (AbD Serotec) və klon 24 (N. Hoggdan növ hədiyyə) və Biozoldan (Eching) siçan IgG1 (MOPC-21) ilə aparılmışdır. 37 ଌ, 7% CO-da izotip nəzarəti kimi2, sonra buz üzərində keçi anti-siçan IgG-APC (BioLegend), hamısı 10 μl ml 𢄡 konsentrasiyasında istifadə olunur. CXCR4 PE-anti-CXCR4 (klon 44717, 10 6 hüceyrəyə 10  μl, Rɭ Systems) ilə aşkar edilmişdir. (Fosfo-) axın analizi üçün 2,5 × 10 6 T limfoblastlar 1 μg ml  μg ml (anti-HT1C3UC) 𢄡 çarpaz əlaqə ilə titrlənmiş antikor konsentrasiyaları (Əlavə Şəkil 6a) ilə stimullaşdırıldı. /və ya 10 μg ml 𢄡 anti-CD28 (CD28.2) ilə 10 μg ml 𢄡 keçi anti-siçan BD IgG-dən bütün vaxtları göstərir. Hüceyrələr 90° metanolda Molekulyar Problardan fiksasiya və keçiricilik dəsti ilə sabitləndi və keçiriciləşdirildi. Səth antigenlərinin boyanmasından əvvəl, bağlanmamış keçi anti-siçan IgG normal siçan IgG (Invitrogen) ilə bloklandı. Keçirilmiş hüceyrələr aşağıdakı titrlənmiş hüceyrədaxili antikorları aşkar edərək boyandı: T202 və Y204-də fosforilləşdirilmiş ERK1/2 (�, 197G2, 1:200), Y319-da (�, 197G2, 1:200), Y319-da fosforilləşdirilmiş ZAP70 (𣐂), T538-də fosforilləşdirilmiş #x003b8 (�, 1:200), dovşan AlexaFluor488-birləşmiş ikincili antikor (�, 1:1000) hamısı Cell Signaling və AlexaF-lax501K-da (AlexaF-N601K) alınmışdır. 895.12.50, 1:10) və AlexaFluorA647-anti-I㮫α (25/IkBa/MAD-3, 1:10) hər ikisi BD-dən alınıb. Ləkələnmiş hüceyrələr BD LSRII Fortessa və ya BD CANTOII axını sitometrindən istifadə edərək təhlil edildi. Gating strategiyaları Əlavə Şəkil 11-də göstərilmişdir. Məlumatların təhlili FlowJo proqramı (TreeStar) ilə həyata keçirilmişdir.

Sitokin analizi

Kultura supernatantları stimullaşdırıldıqdan 48 saat sonra toplanmış, dörd texniki təkrardan birləşdirilmiş və IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17A, TNF- üçün təhlil edilmişdir. x003b1, GM-CSF və IFN-γ istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq Bio-Plex 200 Sistemində (BioRad) 10-pleks sitokin analiz dəsti (L500000CA5) istifadə edərək.

NK və CD8 T hüceyrələrinin deqranulyasiyası və NKG2D ifadəsi

İstirahətdə olan və aktivləşdirilmiş NK hüceyrələrinin deqranulyasiyası CD107a-nın səthi boyanması ilə (orta kultivasiya olunmuş hüceyrələr) və 1:1 nisbətində K562 hüceyrələri ilə stimullaşdırıldıqdan 3 saat sonra ölçüldü (ref. 41). Eritroleykemik hüceyrə xətti K562 (ATCC, CCL-243) hədəf hüceyrə xətti kimi istifadə edilmişdir. Aktivləşdirilmiş NK hüceyrələrinin deqranulyasiyasını qiymətləndirmək üçün NK hüceyrələri 48 saat ərzində 600ºUºº2009ml IL-2 (Novartis) olan mühitdə becərildi. T qiymətləndirdi CTL (cytotoxic T lymphoblasts) degranulation 1.25 & # x02009 & # x003bcg & # x02009ml & # x022121 phytohemagglutinin-L (PHA-L, Sigma) və 200 & # x02009U & # x02009ml & # x022121 Il- ilə stimullaşdırılması sonra 48 & # x02009h lymphoblasts 2 (Novartis). CTL deqranulyasiyası CD3/CD28 örtülmüş mikromuncuqlarla (ThermoFisher Scientific) stimullaşdırılan CTL-lərin CD107a-nın median flüoresans intensivliyindəki fərqlə hesablanıb.

İmmunoblotinq və CD28 birgə siqnalı

CARMIL2 ifadəsi üçün CD28 birgə siqnal və sitoskeletal analiz hüceyrələri yuxarıda qeyd olunduğu kimi müvafiq olaraq stimullaşdırılmamış və ya stimullaşdırılmışdır. Zülal təcrid, SDS-PAGE və immunoblotting başqa yerdə dərc edildiyi kimi həyata keçirilmişdir 42 . Aşağıdakı əsas və ikincili antikorlar istifadə edilmişdir: CARMIL2 (HPA041402, 1:400, Sigma-Aldrich və ab122717, 1:400, Abcam), aktin (sc-8432, 1:500, Santa Cruz), detirozinləşdirilmiş α-tu (Glu-tubulin, AB3201, 1:500, Millipore), asetilləşdirilmiş α-tubulin (6-11-B-1, ab24610, 1:1,000, Abcam), α-tubulin (DM1A, CP06,1: 2,000, Calbiochem), vinkulin (V9131, 1:10,000, Sigma-Aldrich), p38 (� 1:1,000, Cell Signalling) və keçi-anti-siçan-HRP (1:4,000) və keçi-dovşan- HRP (1:5,000) hər ikisi Jackson ImmunoResearch-dən alınıb. (Fosfo)-protein analizi üçün yuxarıda təsvir olunduğu kimi T limfoblastlarının yaranması və stimullaşdırılması həyata keçirildi və aşağıdakı antikorlar istifadə edildi: T202 və Y204-də fosforilləşdirilmiş ERK1/2 (�, 197G2, 1:1,000), ZAP70 ilə Y319-da (�, 65E4, 1:1,000), PKCθ T538-də fosforilləşdirilmiş (�, 1:1,000), NF-㮫 (H30, 0, 0, və ̃-də fosforilləşdirilmiş) -birləşdirilmiş ikincili antikor (�, 1:3,000) hamısı Cell Signalling-dən alınmışdır. Kəsilməmiş immunoblotlar Əlavə Şəkil 8-də göstərilmişdir.

F-aktinin miqdarının təyini

F-aktinin miqdarını ölçmək üçün T limfoblastları müalicə olunmadan buraxıldı və ya 100 ½ forbol-miristat-asetat (PMA, Sigma-Aldrich) ilə 5 dəqiqə və ya 0,5 M Buncual-Büncül (Buncul-Bunculin) ilə inkubasiya edildi. 37°C-də 10 dəqiqə, sonra 4 paraformaldehid ilə fiksasiya. Sabit hüceyrələr 0,01' Triton X-100 (Sigma-Aldrich) ilə keçiriciləşdirildi, phalloidin-Alexa594 (1:500, Invitrogen) ilə boyandı və F-aktinin miqdarı BD FACSCalibur ( və Flow) proqram təminatından istifadə edərək axın sitometriyası analizi ilə ölçüldü. Ağac Ulduzu).

Miqrasiya analizləri

ICAM1-də T limfoblastlarının iki ölçülü miqrasiyası gecə 40°C-də gecə 0.15°C rekombinant insan ICAM1/Fc (Rɭ Systems) ilə örtülmüş μ-slaydlarda (Ibidi) təhlil edilmişdir. Slaydlar istifadə etməzdən əvvəl 1 saat BSA/PBS ilə bloklandı. Hər kanal üçün cəmi 5 × 10 4 T limfoblastın buxarla doymuş inkubasiya kamerasında 37°C, 7°C-də miqrasiyasına icazə verildi.2, və şəkillər Axiovert 200 mikroskopundan (bütün Zeiss Mikroskopundan) istifadə edərək Plan-Apochromat 40 º7 /1.3 NA neft obyektivi ilə 1 saat ərzində hər 8 saniyədən bir çəkilib. Miqrasiya sürəti, yığılmış və Evklid məsafəsi və birbaşalıq ImageJ proqramı (Milli Sağlamlıq İnstitutu) və Ibidi-dən kimyotaksis və miqrasiya aləti V2.0 istifadə edilməklə ölçüldü. 30 dəqiqə ərzində 㲀 μm miqrasiya edən hüceyrələr əsasən stasionar olduqları üçün daxil edilməyib. T limfoblastlarının üçölçülü miqrasiyasını təhlil etmək üçün istehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq siçovul quyruğundan 1 mq  ml 𢄡 tip I kollagen istifadə edərək kollagen matrisi hazırlanmışdır (Ibidi). Aktivləşdirilmiş T limfoblastlar bir μ-slayd daxilində 1 × 105 hüceyrə konsentrasiyasında kollagen matrisinə daxil edilmişdir. Hüceyrə miqrasiyasının təhlili və kəmiyyəti yuxarıda təsvir olunduğu kimi, EC Plan-Neofluar 20 × /0,50 NA istifadə edərək 30 dəqiqə ərzində hər 8 saniyədən bir şəkil çəkməklə həyata keçirilmişdir. CXCL12-yə cavab olaraq miqrasiya analizləri 5 sm məsamə ölçüsü olan 6,5 mm transwelllərdən istifadə etməklə həyata keçirilib (Corning). Hər filtrin üstünə 5 × 10 5 T limfoblast əlavə edildi. Tərkibində 2,5'lik serum və 25'mM Hepes olan vasitə aşağıya yerləşdirildi və göstərildiyi zaman 100'nq CXCL12 (R'Sistemləri) ilə əlavə edildi. Təhlillər 2 saat 37 ° C və 7 ° C CO-da aparıldı.2. Köçürülmüş limfositlər CountBright Mütləq Sayma Muncuqları (Molekulyar Zondlar) və BD FACSCalibur istifadə edərək toplanmış və kəmiyyəti müəyyən edilmişdir.

İmmunofluoresan görüntüləmə

Miqrasiya edilmiş hüceyrələrin immunofluoressensiya ilə boyanması 0,7𠂜g rekombinant insan ICAM1/Fc (Rɭ Systems) ilə örtülmüş 15 mm şüşə örtüklər üzərində aparılmışdır. 1 × 10 5 T limfoblastın miqrasiyasına 37 ଌ, 7% CO-da 1 saat ərzində icazə verildi.2 HBSS/25 mM HEPES-də. Yapışqan hüceyrələr 3 paraformaldehid ilə fiksasiya edilmiş, 0,1 Triton X-100 ilə keçiriciləşdirilmiş və örtüklər anti-LFA1 antikoru ilə inkubasiya edilmişdir (klon 38, 10 μgμgȂ, ardınca Abd‥) keçi-anti-siçan-Alexa 488 (Molekulyar Problar 1:150) və ya Phalloidin-Alexa 546 (1:100, Invitrogen). Tubulinin lokalizasiyası üçün qütbləşmiş T hüceyrələri yarım konsentratlı PHEM tamponunda (30'M PIPES, 12.5'mM HEPES, 5'M EGTA, 1'MgCl) sabitlənmişdir.2 pH 6,9) 5 dəqiqə ərzində 0,25 qlutaraldehid və 0,25 Triton X-100 ilə təzə əlavə edilmişdir. Reaksiyaya girməyən qlutaraldehid 10 dəqiqə ərzində 1 mq təzə həll edilmiş natrium borhidridlə söndürüldü və T hüceyrələri antitubulin antikoruna (YL12, ab62160, ardınca) məruz qaldı. -Cy3 (1:200, Jackson ImmunoResearch). Quraşdırma vasitəsi kimi ProLong Gold Antifade Reagent (Life Technologies) istifadə edilmişdir. Sabit nümunələr otaq temperaturunda ApoTome-a qoşulmuş Observer Z1 və Plan-Apochromat 100 × /1.4 NA yağ obyektivi (Zeiss Mikroskopiyası) ilə təsvir edilmişdir. Parlaq sahəli təsvirlər diferensial müdaxilə kontrastından (DIC) istifadə etməklə həyata keçirilmişdir. Təsvirin əldə edilməsi və təsvirin təhlili üçün AxioCam MRm kamerası və AxioVision Proqramı (Zeiss Mikroskopiyası) istifadə edilmişdir.

İmmunohistokimya və yerində hibridləşmə

İmmunohistokimya üçün ultraView Universal DAB aşkarlama dəstləri (Ventana Medical Systems) ilə Ventana Benchmark XT avtostainerində aşağıdakı antikorlar və seyreltmələrdən istifadə edilmişdir: əzələ spesifik aktin (DAKO HHF35 1:200), kalponin (DAKO CALP 1:300), pan- sitokeratin (Beckman Coulter KL-10 1:150), desmin (DAKO D33 1:300), CD34 (Cell Marque QBEnd/10 1:800), CD117 (DAKO A4502 1:400), S100 (DAKO Z031000) , Ki67 (DAKO MIB-1 1:150), CD80 (Abcam EPR1157(2) 1:300), p53 (Leica Microsystems DO-7 1:25), C-MYC (Abcam Y69 1:100), LMP1 (Diaqnostik BioSystems CS1/CS2/CS3/CS4 1:100), LMP2A (Acris antikorları 15F9 1:100), EBNA2 (Merck Millipore R3 1:25) və virus transkripsiya faktoru ZEBRA (Santa Cruz Biotechnology BZ1 1:10). CD86 (BIOZOL Diagnostica 1B3 1:100) əl ilə boyanmışdır. Xromogen yerində EBV ilə kodlanmış RNT (EBER) üçün hibridləşmə flüoresan etiketli oliqonukleotid zondlarından istifadə etməklə həyata keçirilmişdir (INFORM EBER Probe, Ventana). Floresensiya yerində C-MYC (Zyto Vision) üçün hibridləşmə 43-dən əvvəl təsvir edildiyi kimi həyata keçirilmişdir.

Statistik təhlil

Məlumatlar statistik hesablama və qrafika üçün R (versiya 3.2.3) və ya Prism 5 (GraphPad) proqram mühiti ilə təhlil edilmişdir. Məlumat dəstlərinin Normal Qauss paylanması Şapiro-Wilk normallıq testindən istifadə etməklə sınaqdan keçirilmişdir. İki qrup arasındakı əhəmiyyətlər Welch-in ikitərəfli qeyri-bərabər dispersiyaları ilə hesablanmışdır. t-test və ya ikitərəfli cütləşməmiş Tələbə t-test. İki tərəfli ANOVA ikidən çox qrupun müqayisəsi üçün istifadə edilmişdir. P π.05 dəyərləri əhəmiyyətli hesab edilmişdir.

Məlumatın mövcudluğu

Bu tədqiqatın nəticələrini dəstəkləyən CARMIL2 variant məlumatları SCV000322745 və SCV000322755 əsas qoşulma kodları ilə ClinVar-da saxlanılmışdır. Bu tədqiqatın nəticələrini dəstəkləyən digər məlumatlar sorğu əsasında müvafiq müəllifdən əldə edilə bilər.



Şərhlər:

  1. Ferris

    Hesab edirəm ki, səhv edirsiniz. Bunu sübut edə bilərəm. PM-də mənə e-poçt göndərin, danışacağıq.

  2. Douzshura

    Məncə səhv edirsən. Bunu sübut edə bilərəm. PM-də mənə yazın, ünsiyyət quracağıq.

  3. Mimuro

    This - is healthy!

  4. Ptah

    Məndən sonra çox maraqlı mövzudur. Bunu burada və ya PM-də müzakirə etməyi təklif edirəm.



Mesaj yazmaq