Məlumat

Antisens transkriptlərinin məna strand transkriptlərindən fərqli adları varmı?

Antisens transkriptlərinin məna strand transkriptlərindən fərqli adları varmı?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən tapmaq istəyirəm ki, insan genomunda hansı genlər antisens transkript inhibasiyası kimi çıxış edə biləcək transkriptə potensial olaraq tamamlayıcı ola bilər? cis-NAT-lar (təbii olaraq meydana gələn antisens transkriptləri) fərqli transkriptlər hesab olunur və fərqli adlandırılır, yoxsa onların məna transkripti ilə eyni adı var?


Əgər anti-sense transkript düzgün şərh edilmişdir və verilənlər bazası (çox böyük əgər), onda onun fərqli bir adı olacaq. Məsələn, siçan Msx1 antisens transkriptində RefSeq qoşulması NR_027920, eyni genin sensasiya transkripti isə NM_010835-dir.

Ümumiyyətlə, müəyyən bir lokusdan köçürülən hər bir transkript fərqli bir birləşməyə malikdir. Eyni şey alternativ olaraq birləşdirilmiş transkriptlərə də aiddir. Əgər müəyyən bir genin 4 AS transkripti varsa, bu transkriptlərin hər biri fərqli, unikal birləşməyə malik olacaq. Məsələn, insan insulin reseptor geni iki protein kodlaşdırma transkriptinə malikdir, hər birinin öz qoşulması var: NM_000208 və NM_001079817.

Sizi 10 növdə cis-NAT-ların son təhlili maraqlandıra bilər[1] və həmçinin NATsDB-də: Təbii Antisens Transkriptləri DataBase[2].

  1. Osato N, Suzuki Y, Ikeo K, Gojobori T. 2007. Transkripsiya müdaxilələri cis İnsanların və Siçanların Təbii Antisens Transkriptləri. Genetika, 176(2): 1299-1306, doi:10.1534/genetics.106.069484.
  2. Li JT, Zhang Y, Kong L, Liu QR, Wei L. 2008. Trans-təbii antisens transkriptləri, o cümlədən 10 növdə kodlaşdırılmayan RNT: ifadənin tənzimlənməsi üçün təsirlər. Nuklein turşularının tədqiqatı, 36(15):4833-44, doi:10.1093/nar/gkn470.

Məməlilərdə təbii antisens transkriptlərinin qorunmuş ifadəsi

Son tədqiqatlar zülal kodlayan genlərin eyni genomik lokuslarından, lakin əks zəncirdən yaranan minlərlə təbii antisens transkript tapdı. Antisens transkriptlərinin əksəriyyətinin funksional və ya sadəcə transkripsiya səs-küyü olduğu aydın deyil.

Nəticələr

Antisens transkripsiyasının genom miqyasında aşkarlanmasına imkan verən dəyişdirilmiş cDNA sintez protokolu ilə Affymetrix Exon massivindən istifadə edərək, insan, siçan və siçovulların doqquz müvafiq toxumasında antisens transkriptlərinin geniş miqyaslı ifadə analizini apardıq. Biz minlərlə antisens transkript aşkar etdik, onlardan bəziləri müvafiq toxumalarda/orqanlarda potensial funksiyaları üçün əlavə tədqiqata məruz qala bilən toxumaya xas ifadəni göstərir. Bir çox antisens transkriptlərinin ifadə nümunələri növlər arasında qorunur və bu transkriptlərə seçici təzyiq göstərir. Zülal kodlayan genlərlə müqayisədə, antisens transkriptləri ifadənin qorunmasının daha az dərəcəsini göstərir. Biz həmçinin toxumalar arasında məna və antisens ifadəsi arasında müsbət korrelyasiya tapdıq.

Nəticə

Nəticələrimiz göstərir ki, təbii antisens transkriptləri selektiv təzyiqə məruz qalır, lakin məməlilərdə hiss transkriptləri ilə müqayisədə daha az dərəcədə.


Təbii antisens transkriptlərinin tənzimləyici rolları

Təsnifat və nomenklatura hələ ilkin mərhələdə olsa da, funksional olaraq qeyd edilmiş lncRNA-ların sayı sürətlə genişlənməkdə davam edir. Həqiqətən də bir neçə alt sinif artıq geniş şəkildə xarakterizə edilmişdir ki, bunlara NAT-lar [8], böyük intergenik ncRNA (lincRNA-lar) [9] və tam və qismən intronik kodlaşdırılmayan transkriptlər (VÖEN və PİN-lər) [10] daxildir. Baxmayaraq ki, lincRNA-lar da son illərdə, xüsusən də müxtəlif xərçəng növləri ilə əlaqəsi sayəsində (cədvəl 1), bu və digər lncRNA növlərinin genişlənən sahələrinin hərtərəfli təsviri bu qısa icmalın əhatə dairəsindən kənardadır. Bunun əvəzinə biz lncRNA-lar üçün ən yaxşı səciyyələnən NAT-ların terapevtik potensialına diqqət yetirəcəyik. Burada təqdim olunan məlumatlara əlavə olaraq, biz oxucunu lncRNA-ların müxtəlif dünyasında müxtəlif mövzuları daha ətraflı təsvir edən aşağıdakı əla məqalələrə müraciət etməyi tövsiyə edirik [11-14].

Cədvəllər 1

Xəstəlikdə potensial rolu olan tənzimləyici lncRNA-ların son nümunələri

Gen Xəstəlik İstinad
NAT-larMALAT1Xərçəng[61]
ATXN80SSpinocerebellar ataksiya[62]
ASFMR1Kövrək × sindromu[63]
NAT-RAD18Alzheimer xəstəliyi[42]
PINK1-ASParkinson xəstəliyi, diabet[34]
ANRILXərçəng, ürək-damar xəstəlikləri, diabet[39]
BACE1-ASAlzheimer xəstəliyi[18]
NPPA-ASÜrək-damar xəstəliyi[35]
HTTASHuntington xəstəliyi[33]
p15ASXərçəng[41]
LincRNAİSTİ HAVAXərçəng[64]
LincRNA-p21Xərçəng[65]
LincRNA-EPSAnemiya[66]
LSINCT5Xərçəng[67]
CUDRXərçəng[68]

NAT-lar əks DNT zəncirindən sensasiya (zülal kodlaşdırma) transkriptlərinə transkripsiya edilən və qismən hiss RNT, hiss promotoru və ya digər tənzimləyici bölgələrlə üst-üstə düşən lncRNA-lardır[2]. Onlar genik, intergenik və ya intronik ardıcıllıqlar da daxil olmaqla kodlaşdıran və ya kodlaşdırılmayan DNT-dən yarana bilər və mRNT ilə 5º qapaq, 3º poliadenilasiya və alternativ birləşmə kimi bir sıra oxşarlıqlar göstərə bilər [8]. NAT-lar üçün görülən ən çox görülən tənzimləmə forması bu kodlaşdırılmayan antisens RNT-lərdən birinin partnyor hissi transkripti ilə cütləşməsidir [2]. FANTOM3 layihəsinin nəticələri siçan və insan arasında yaxşı qorunmuş ən azı 1000 sens-antisens transkript cütünü, eləcə də minlərlə qorunmayan hesab edilən [15]. 2010-cu ildə Faqihi və həmkarları 797 təkamüllə qorunmuş NAT-ın məqsədyönlü şəkildə məhv edilməsini araşdırdılar və bir sıra sens-antisens cütləri üçün tənzimləyici rolların sübutunu tapdılar [16]. Həqiqətən, NAT-lar hüceyrə böyüməsi və differensiasiyası, inkişafı, metabolizmi, ürək-damar funksiyası və sinaptik plastiklik kimi müxtəlif müxtəlif proseslərdə iştirak edən geniş diapazonlu məməli genləri üçün müəyyən edilmişdir (cədvəl 1 və ​ və 2). 2). mRNA-larla eyni şəkildə işlənməsinə baxmayaraq, NAT-ların hamısı eyni xüsusiyyətləri göstərmir. Məsələn, onlar qeyri-poliadenilləşməmiş üzərində poliadenilləşə bilər və ya nüvədə və ya sitoplazmada lokallaşdırıla bilər. Onların ümumiyyətlə hiss transkriptlərindən daha az bol olduğu göstərilsə də[17], verilmiş antisens transkriptinin ifadə səviyyəsi də hüceyrə növünə görə dəyişə bilər [18, 19]. Xüsusi bir ncRNA massivindən istifadə edərək, Klark və həmkarları bu yaxınlarda nümayiş etdirdilər ki, cis-təsirli antisens transkriptlərinin yarı ömrü üç ilə on saat arasında dəyişə bilər, baxmayaraq ki, araşdırılanların əksəriyyəti təxminən beş-altı saat arasında qruplaşdırılıb [20]. NAT-ların sabitliyinə onların hüceyrə lokalizasiyası da təsir göstərir, nüvə transkriptləri daha qeyri-sabitdir[20].

Cədvəl 2

Təbii antisens tənzimlənməsinin funksional təsdiqi in vitro.

Hiss Təyin olunmuş Antisens Növlər İstinad
Uyğun nizamnaməÇƏHRİ 1PINK1-ASSiçan, insan[34]
BACE1BACE1-ASSiçan, insan[18]
iNOSiNOS-ASSiçovul[28]
səh53Sarma 53İnsan[57]
HAS2HAS2-ASİnsan[69]
WDR83DHPSİnsan[70]
Uyğunsuz TənzimləməMsx-1Msx-1 AsSiçan[71]
HIF1-aaHIF1İnsan[31]
CrxCrxOSSiçan[72]
D5DTers D5Dİnsan[73]
Rad18Nat-Rad18Siçovul[42]
səh15p15ASİnsan[41]
BOKBOK-ASİnsan[74]
NPPANPPA-ASİnsan[35]
SLC39A5ANKRD52İnsan[16]
CCPG1CCPG1-ASİnsan[16]
RAPGEF3RAPGEF3-ASİnsan[16]
Qalstuk-1HAS-2İnsan[75]
BDNFBDNF-ASSiçan, insan[19]
GDNFGDNF-ASİnsan[19]
EPHB2EPHB2-ASİnsan[19]
Tbca13Tbca16İnsan[76]
TspoTspo-NatSiçan[77]

İndiyə qədər lncRNA-ların müxtəlif formalarının tənzimləyici rolları ümumiyyətlə geniş miqyaslı molekulyar ekranlar vasitəsilə nümayiş etdirilib və bu ekranlarda RNT müdaxilə texnologiyasından istifadə etməklə onların fəaliyyəti pozulub. Bu tədqiqatlar göstərdi ki, endogen lncRNA-lar hədəf genlərinin ifadəsini repressiya edərək və ya təşviq etməklə fəaliyyət göstərə bilər. Bu tənzimləmənin ya meydana gəldiyi görüldü cis-, bunun sayəsində lncRNA hiss transkriptini hədəflədiyi eyni genetik lokusda yaranır və ya trans-, bunun sayəsində lncRNA hərəkət etdiyi gendən uzaq bir xromosom yerində əldə edilir [16, 21]. Onlar yüksək dərəcədə hədəf spesifikliyi nümayiş etdirsələr də, NAT-ların onların uyğun qoşalaşmış məna transkriptlərini tənzimləmə tərzinin, təklif olunan müxtəlif transkripsiya və post-transkripsiya mexanizmlərini əhatə edən olduqca müxtəlif olduğu düşünülür (nəzarət üçün bax [8]). Məsələn, indi onların bir çoxunun müvafiq hiss zəncirinin promotor bölgələri ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğu göstərilmişdir. cis- və DNT metilasiyasına təsir edir və ya onun xromatin vəziyyətini diktə edən histonu dəyişdirən komplekslərin məqsədyönlü şəkildə cəlb edilməsi üçün bir çərçivə rolunu oynayır [22]. Həqiqətən də bir çox xromatini dəyişdirən fermentlərdə RNT-ni bağlayan motivlərin olması onu göstərir ki, nüvədə az miqdarda olan bəzi NAT-lar histon modifikasiyalarını təşkil etmək və beləliklə də gen susdurulmasına vasitəçilik etmək üçün yerli olaraq fəaliyyət göstərə bilər [23]. İndiyə qədər bunun ən yaxşı səciyyələndirilmiş nümunəsi, transkripsiya baxımından səssiz xromatinin işarəsi olan histon H3 (H3K27me3) üzərində lizin 27 qalığının trimetilasiyasına səbəb olduğu bilinən gen susdurucu polikomb resessiv kompleks 2-nin (PRC2) cəlb edilməsidir. . RNT immunoprecipitation (RIP) istiqamətli RNT ardıcıllığı ilə birlikdə PRC2 kompleksinin siçan embrion kök hüceyrələrində 9000-dən çox RNT ilə əlaqəli olduğunu və bu RNT-lərin təxminən 3000-nin NAT olduğunu ortaya qoydu. Əslində, belə bir NAT, X (qeyri-aktiv) spesifik transkript (Xist) tərəfindən PRC2 işə götürülməsi, heterokromatinləşmə [24] vasitəsilə insanlarda bütün X-xromosomunun inaktivasiyasına səbəb ola bilər ki, bu da müxtəlif X üçün mühüm təsir göstərə bilər. - bağlı xəstəliklər [25].

Alternativ olaraq, sis-fəaliyyət göstərən NAT-ların ardıcıl tamamlayıcılığı o deməkdir ki, onlar həm nüvədə, həm də sitoplazmada RNT duplekslərinin əmələ gəlməsi yolu ilə qoşalaşmış hiss RNT-lərinin ifadəsini tənzimləyə bilirlər. NAT-lar və onların nüvədə partnyor sensiyası transkripti arasında RNT-RNT duplekslərinin əmələ gəlməsi diferensial RNT-nin birləşdirilməsinə və ya nüvə saxlanması vasitəsilə sens RNT-nin hüceyrə əlçatanlığının azalmasına səbəb ola bilər [26, 27]. Bundan əlavə, sitoplazmada RNT dupleks formalaşmasının ikincil strukturda dəyişikliklər və ya digər tənzimləyici bağlanma yerlərini maskalamaq yolu ilə hissin transkript sabitliyinə təsir göstərdiyi göstərilmişdir [18, 28]. Sitoplazma daxilindəki RNT duplekslərinin başlanğıc və uzanma mərhələləri arasında hiss RNT tərcüməsini maneə törətdiyi də göstərilmişdir [29].

Bu mürəkkəb tənzimləmə səviyyəsini nəzərə alaraq, çox güman ki, dəyişdirilmiş hüceyrə NAT ifadəsi də bir sıra patoloji vəziyyətlərə kömək edə bilər. Bu, BACE1-AS, HSR və HIF1-AS kimi bəzi antisens transkriptlərin müxtəlif hüceyrə stressorlarından təsirlənə biləcəyinə dair müşahidələrlə təsdiqlənir [18, 30-32]. Bundan əlavə, indi Alzheimer [18], Huntington [33] və Parkinson xəstəliyi [34], həmçinin ürək-damar [35] və metabolik pozğunluqlar [34] kimi müxtəlif nevroloji vəziyyətlərdə iştirak edən genlər üçün NAT-lar müəyyən edilmişdir. Hal-hazırda bu transkriptlərin bəzilərinin həqiqətən xəstə populyasiyalarında differensial şəkildə ifadə edilib-edilməməsi hələ də görünməsə də, daha sonra müzakirə edəcəyimiz kimi, bu və digər oxşar NAT-ların funksional təsdiqi xəstəliyin irəliləməsi ilə mübarizə üçün yeni dərman hədəflərinin müəyyən edilməsinə səbəb ola bilər (cədvəl 1). ).

Müxtəlif ncRNA lokuslarında bir sıra mutasiyalar bildirilsə də [3, 36, 37], insan genetik tədqiqatlarından NAT-ları kodlayan genlər daxilində mutasiyaların və ya tək nukleotid polimorfizmlərinin (SNP) onların ifadəsinə təsir edə biləcəyini göstərən çox məhdud sübutlar var. səviyyələrdə və ya xəstəlik fenotiplərinə səbəb olur. Bununla belə, genom miqyaslı assosiasiya tədqiqatları göstərmişdir ki, INK4a lokusunda [38] şiş bastırıcı genlərin INK4b/ARF/INK4a transkripsiya tənzimlənməsinə vasitəçilik edən böyük antisens transkripti olan ANRIL-i kodlayan intergenik bölgə xərçəngə qarşı həssaslığın artması ilə əlaqələndirilir. , tip 2 diabet və koronar xəstəlik [39]. Həqiqətən də, ateroskleroza qarşı artan həssaslıqla əlaqəli olan ANRIL-kodlaşdırma bölgəsindəki SNP-lər təmizlənmiş periferik qan T hüceyrələrində azalmış ANRIL ifadə səviyyələri ilə əlaqələndirilir. Digər tərəfdən, ANRIL-in prostat xərçəngi hüceyrələrində həddən artıq ifadə olunduğu, PRC1 [38] işə götürülməsi yolu ilə INK4b/ARF/INK4a şiş bastırıcı genlərin susdurulmasına səbəb olduğu görülür. Əlavə bir hesabat göstərdi ki, ANRIL P15/INK4B şiş bastırıcı geninin PRC2 vasitəçiliyi ilə susdurulması üçün də tələb olunur və onun PRC2 kompleksi ilə qarşılıqlı əlaqəsinin pozulması hüceyrə proliferasiyasını maneə törədə bilər [40]. Lösemili xəstələrdə başqa bir şiş supressor geni p15 (p15AS) üçün NAT-ın artan ifadəsi də müşahidə edilmişdir ki, bu da p15 hissi səviyyələrində nəzərəçarpacaq dərəcədə azalma ilə əlaqələndirilir [41]. Burada tədqiqatçılar göstərdilər ki, p15AS ifadəsi p15 promotorunda histon 3 lizin 4 (H3K4) və histon 3 lizin 9-un (H3K9) dimetilləşməsini azaldır, nəticədə davamlı transkripsiya susdurulur. Bu p15AS tənzimləməsinin səbəbi bilinməsə də, bu, diferensial şəkildə ifadə edilmiş NAT-ın xəstəlik üçün potensial molekulyar marker, eləcə də yeni bir terapevtik hədəf kimi necə fəaliyyət göstərə biləcəyinin bariz nümunəsidir.


Nəticələr

Proqnozu Ərəbidopsis trans-NAT cütləri

Müəyyənləşdirmək trans- NAT Ərəbidopsis, biz əvvəlcə bütün ardıcıllıqları topladıq Ərəbidopsis genləri və tam uzunluqlu cDNT transkriptlərini şərh etdi və onları genomik yerlərə görə qruplara qruplaşdırdı. Burada bir transkript çoxluğu eyni gen və ya genomik lokusdan əldə edilən bütün transkriptlərin bir qrupunu təmsil edirdi. Geniş genom trans-NAT ekranı NCBI BLAST proqramından istifadə edərək bir-biri ilə ardıcıl tamamlayıcılığı paylaşan transkript klaster cütlərinin axtarışı ilə həyata keçirilmişdir. İki transkript a kimi qəbul edildi trans-NAT cütü, əgər: onların RNT-RNT duplekslərini yarada bilən qismən və ya mükəmməl ardıcıl tamamlayıcı bölgələri varsa, iki transkriptin bütün ehtimal olunan dupleks bölgələrinin ümumi uzunluğu cütün daha qısa transkriptinin uzunluğunun 50%-dən çox olduqda (yüksək- əhatə kateqoriyası) və ya iki transkriptin ən uzun ehtimal olunan dupleks bölgəsinin uzunluğu 100 nukleotiddən çoxdur (nt 100 nt kateqoriya). Daha əvvəl bildirildikdən sonra silindi cis-Annotasiya edilmiş transpozonlardan və psevdogenlərdən əldə edilən transkriptlərdən əmələ gələn NAT-lar və cütlər, cəmi 1320 trans-NAT cütləri daxilində təsbit edildi Ərəbidopsis genom (Əlavə məlumat faylı 1). Onların arasında 368 trans-NAT cütləri “yüksək əhatə dairəsi” kateqoriyasına aid idi, qalan 952 cüt isə “100 nt” sinfindən idi (Cədvəl 1). 'Yüksək əhatə dairəsi' sinfinin iki telli cütləşmə bölgəsinin orta uzunluğu trans-NAT cütləri 571 nt, diapazon 75 ilə 2.628 nt arasındadır. '100-nt' sinfi üçün trans-NAT cütləri, orta cütləşmə uzunluğu 258 nt, diapazon 100 ilə 1.621 nt arasındadır.

RNT molekullarının bioloji funksiyalarını yerinə yetirmək və ya digər molekullarla qarşılıqlı əlaqədə olmaq üçün müxtəlif üçölçülü strukturları qəbul etdikləri məlumdur. Bir ehtimalın iki transkriptinin olub olmadığını araşdırmaq trans-NAT cütü həqiqətən də ikiqat zəncirli RNT dupleksi yarada bilərdi, biz hər birinin ərimə strukturunu yoxlamaq üçün hibrid proqramdan [23, 24] istifadə etdik. trans-NAT cütü silisiumda. Nəticələr göstərir ki, bütün iki transkript proqnozlaşdırılır trans-Yüksək əhatə dairəsi kateqoriyasındakı NAT cütləri və 100 nt kateqoriyasındakı cütlərin təxminən 90%-i bir-biri ilə hibridləşə bilər və ən azı, ən aşağı enerji ərimə formalarında genişləndirilmiş dupleks bölgələrə malikdir. silisiumda RNT hibridizasiya modeli (bax: Materiallar və üsullar). Bəziləri trans-NAT cütləri hətta BLAST nəticələrinə əsasən proqnozlaşdırılan ərazidən kənara çıxan iki telli cütləşmə bölgəsinə malik idi (Şəkil 1).

tavlanmış quruluşu a trans-NAT cütü (At4g19270::At1g56530). İki transkriptin tavlanmış quruluşu hibrid proqram tərəfindən proqnozlaşdırıldı. Transkript At4g19270 5'-dən 3'-ə qədər yuxarı tel kimi göstərilir, At1g56530 transkripti isə 3'-dən 5'-ə qədər aşağı tel kimi göstərilir. Partlayış axtarışı nəticəsində əldə edilən qoşalaşmış bölgə qırmızı rənglə göstərilir.

Ifadə təhlili trans-NATs

1320 nəfər arasında trans-NAT cütləri, 658 cüt, hər ikisi tam uzunluqlu cDNA-lara uyğun gələn iki transkript klasteri tərəfindən yaradılmışdır, 444 cüt bir transkript üçün tam uzunluqlu cDNA dəstəyinə malik idi və qalan 218 cüt yalnız şərh edilmiş gen ardıcıllıqlarını müqayisə etməklə müəyyən edilmişdir (Cədvəl 1) ).

RNT molekulunun funksiyasını yerinə yetirməsi üçün trans-NAT, iki zəncirli RNT dupleksini meydana gətirmək üçün eyni hüceyrədə hiss transkripti ilə birlikdə mövcud olmalıdır. Ehtimal olunanın birgə ifadəsinin mümkünlüyünü yoxlamaq trans-NAT cütlərindən istifadə etdik Ərəbidopsis müxtəlif toxumalarda və ya müxtəlif böyümə şəraitində transkriptlərin ifadə profillərini araşdırmaq üçün ictimai MPSS verilənlər bazası. The Ərəbidopsis ictimai MPSS verilənlər bazası 17 nt və 20 nt uzunluğunda ifadə edilmiş ardıcıllıq teqlərini ehtiva edir Ərəbidopsis müxtəlif şəraitdə yetişdirilən 17 müxtəlif toxuma və ya bitkilərin transkriptləri. Bu araşdırmada biz ilk olaraq bütün 17 nt və 20 nt MPSS teqlərini Ərəbidopsis genom və sonrakı təhlil üçün yalnız transkriptlərin əmələ gəlməsi ilə unikal şəkildə əlaqələndirilə bilən teqlər seçilir trans-NAT cütləri. Təxminən 16% trans-NAT cütləri 'yüksək əhatə dairəsi' kateqoriyasında və 28% trans- '100 nt' kateqoriyasındakı NAT cütləri hər iki transkript üçün müvafiq MPSS teqlərinə malik idi və digər 32% və 45% trans- "Yüksək əhatə dairəsi" və "100 nt" kateqoriyalarındakı NAT cütləri, müvafiq olaraq, bir transkript üçün MPSS teqlərinə malik idi (Cədvəl 2). Onlar üçün trans-Hər iki transkriptin uyğun MPSS məlumatlarına malik olduğu NAT cütləri, 85%-dən çoxu ən azı bir toxumada birgə ifadə edilmişdir (Cədvəl 2), bu, onların iki transkriptinin trans-NAT cütləri cüt zəncirli RNT dupleksləri əmələ gətirmək imkanı əldə etdilər in vivo. İki ifadə nümunələri trans-MPSS məlumatlarından əldə edilən NAT cütləri nümunə kimi Cədvəl 3-də göstərilmişdir. Qeyd edək ki, əksər hallarda a-nın məna və antisens transkriptləri trans-NAT cütü eyni toxumada ifadə edildikdə müqayisə edilə bilən ifadə səviyyələrinə malikdir. ifadəsində əhəmiyyətli toxuma meyli müşahidə edilməmişdir trans17 müxtəlif kitabxanadan MPSS məlumatlarını müqayisə edərkən -NAT cütləri.

Ehtimal olunan potensialı daha çox araşdırmaq trans-NAT cütləri tək hüceyrə səviyyəsində ikiqat zəncirli RNT dupleksləri yaratmaq üçün hər birinin ifadə modelini yoxladıq. trans-NAT cütü Ərəbidopsis ictimaiyyətə açıq istifadə edərək kök hüceyrələri yerində hibridləşmə məlumatları (AREX verilənlər bazası) [25]. Çünki AREX verilənlər bazası yalnız şərh üçün məlumat ehtiva edir Ərəbidopsis genlər, yalnız 658 ehtimal trans-Annotasiya edilmiş genlərdən alınan hər iki transkriptin bu analizlə müqayisə oluna biləcəyi NAT cütləri. 355 arasında trans-NAT ilə cütləşir yerində hər iki transkript üçün hibridləşmə məlumatları, 237 cüt (67%) hər iki transkriptin mRNA-ları müqayisə edilə bilən ifadə səviyyələri ilə eyni hüceyrədə tapıldı (Cədvəl 4), bu cütlərin məna və antisens transkriptlərinin bir-biri ilə qarşılıqlı əlaqədə olmaq imkanına malik olduğunu göstərir. in Ərəbidopsis kök hüceyrələri. Eyni hüceyrədəki məna və antisens transkriptlərinin müxtəlif hüceyrə bölmələrində mövcud olub-olmaması gələcək eksperimental araşdırmaları gözləyir. 355-in tam siyahısı trans-NAT cütləri mövcuddur yerində hibridləşdirmə məlumatları Əlavə məlumat faylında təqdim olunur 2.

Funksiyaları trans-NAT cütləri

istifadə etdik Ərəbidopsis bioloji funksiyalarını təhlil etmək üçün Gene Ontology (GO) konsorsiumundan funksiya təyinatı trans-NAT və təvazökar bir funksional kateqoriya meylini müşahidə etdi. Katalitik aktivliyi, siqnal çeviricisi aktivliyi və daşıyıcı fəaliyyəti olan funksiya siniflərindən olan transkriptlər bir qədər çox təmsil olunub (Şəkil 2). Ki-kvadrat testi nəticələri transkriptlər arasındakı fərqi göstərdi trans-NAT cütləri bütün genomdan olanlar yuxarıda göstərilən bütün kateqoriyalarda p dəyəri < 0,01 idi, bu fərqin statistik cəhətdən əhəmiyyətli olduğunu göstərir. FuncAssociate [26] istifadə edərək ətraflı gen funksiyası analizi bir neçə gen ailəsinin və ya funksional qrupların transkriptlərinin həddindən artıq şəkildə təmsil olunduğunu ortaya qoydu. trans-NAT cütləri, o cümlədən UDP-qlikosiltransferaza genlərinin transkriptləri və hüceyrə divarının biosintezində iştirak edən gen transkriptləri, zülalların ubiquitinasiyası və auksin stimuluna cavablar (Cədvəl 5). Bunun əksinə olaraq, transkriptlər arasında heç bir xüsusi gen ailəsində zənginləşmə tapılmadı cis-NAT cütləri (məlumatlar göstərilmir).

Funksional analiz trans- GO-dan istifadə edən NAT-lar. -nin faizi Ərəbidopsis iştirak edən şərhli genlər və genlər trans-Hər bir funksional kateqoriyada NAT cütləri göstərilir.

Təkamüllə mühafizəsi trans-NAT cütləri

Mümkün filogenetik qorunmasını öyrənmək trans-Yüksək bitkilərdə NAT'ları reallaşdırdıq silisiumda axtarmaq trans-NAT qovaq və düyüdə cütləşdi və onları olanlarla müqayisə etdi Ərəbidopsis. Təxminən 60% üçün Ərəbidopsis trans-NAT cütlərində ən az bir cütün homologları da var trans-NAT ya qovaqda, ya da düyüdə tərəfdaşdır (Cədvəl 6). Bunların əksəriyyəti üçün Ərəbidopsis trans-NAT cütləri, yalnız bir transkript saxladı transQovaqda və ya düyüdə NAT əlaqələri, lakin yeni tərəfdaşlarla. Hətta kiçik bir hissəsi üçün Ərəbidopsis trans-Hər iki transkriptin saxlandığı NAT cütləri transQovaq və ya düyüdə NAT əlaqələri, eyni məna və antisens transkriptləri trans-NAT cütlüyündə yalnız bir yeni cütləşmə tərəfdaşı var idi trans-NAT cütü qovaqda və düyüdə olduğu kimi eyni qaldı Ərəbidopsis.

Tərəfindən yaradılmış şəbəkələr cis- və trans-NAT cütləri

Fərqli cis-NAT cütləri, hansı ki, bir hiss transkripti adətən yalnız bir antisens partnyora malikdir, birdən çox əlaqəyə adətən rast gəlinir. trans-NATs. Alternativ birləşdirmə nəticəsində bir transkriptin eyni gendən əldə edilən müxtəlif transkriptlərlə müxtəlif ikiqat zəncirli RNT dupleksləri əmələ gətirdiyi hallar da olmuşdur. İştirak edən bütün transkript qrupları arasında trans-NAT cütləri, həm yüksək əhatə dairəsi kateqoriyasından, həm də 100 nt kateqoriyasından 425 çox sayda yarada bilər trans-NAT digər transkriptlərlə cütləşir (Şəkil 3).

Transkript çoxluqlarının cütləşmə əlaqəsi trans-NAT cütləri.

Əvvəlki məlumatla müqayisə Arabidopsis cis-NAT məlumatları üzərində 430 transkript olduğunu ortaya qoydu trans-NAT siyahısı da var idi cis-NATs [7], antisens transkriptlərinin mürəkkəb tənzimləyici şəbəkələr yarada biləcəyini göstərir. Ərəbidopsis. UDP-qlükozil transferaza ailəsi zülalları şəkərlərin daşınmasını kataliz edən mühüm fermentlərdir [27]. The Ərəbidopsis genom UDP-qlükozil transferaz ailəsi zülallarını kodlayan təxminən 115 gen ehtiva edir. 44 UDP-qlükozil transferaz geninin transkriptində bir və ya daha çox cütləşmə var trans-NAT-lar, bunlardan 5-i də ehtimal olunur cis-NATs. Digər 13 UDP qlükozil transferaz gen üzvü transkriptində cütləşmə var cis-Yalnız NAT. Antisens transkriptləri ilə əmələ gələn mümkün tənzimləyici şəbəkələri aşkar etmək üçün yEd proqramından [28] istifadə edərək UDP-qlükozil transferaz gen ailəsi üzvlərinin transkriptləri ilə yaradılmış NAT cütlərini ətraflı təhlil etdik (Şəkil 4). Nəticələrimiz göstərdi ki, antisens transkriptləri potensial olaraq UDP-qlükozil transferaz ailəsinin transkriptlərini müxtəlif yollarla tənzimləyə bilər. Bəzi transkriptlər UDP-qlükozil transferaz ailə üzvlərinin transkriptləri ilə antisens cütləri yarada bilər. cis- və trans- tərzdə. UDP-qlükozil transferaza gen üzvünün transkriptlərinin filogenetik təhlili göstərdi ki, yaxından əlaqəli transkriptlər (filogenetik ağacın eyni təbəqəsindən) eyni şəkildə tənzimlənməyə meyllidirlər. trans-antisens transkripti (Şəkil 4, Əlavə məlumat faylı 3). Belə bir mürəkkəb cütləşmə şəbəkəsi bir neçə digər gen ailəsinin transkriptləri arasında da müşahidə edilmişdir (məlumatlar göstərilmir).

şəbəkələri cis- və trans-UDP-qlükozil transferaza ailəsi zülallarını kodlayan transkriptlərdən əmələ gələn NAT cütləri A. thaliana. Yaşıl ellipslər iştirak edən UDP-qlükozil transferaz transkriptlərini təmsil edir trans-NAT cütləri yalnız qırmızı ellipslərdə iştirak edən UDP-qlükozil transferaz transkriptlərini təmsil edir. cis-NAT cütləri yalnız sarı ellipslər hər ikisində iştirak edən UDP-qlükozil transferaz transkriptlərini təmsil edir. cis- və trans-NAT cütləri. Digər zülal ailələrindən olan transkriptlər mavi ellips kimi göstərilir. İstiqamətləndirilmiş xətlər UDP-qlükozil transferaz transkriptlərinə işarə edən oxlarla iki transkriptin qoşalaşma əlaqəsini təqdim edir.

Potensial rolları trans-Gen susdurulmasında NAT-lar

Göstərilmişdir ki, ikiqat zəncirli RNT dupleksləri kiçik müdaxilə edən RNT-lər yaratmaq üçün Dicer tərəfindən həzm oluna bilər ([29]-da nəzərdən keçirilir). ildən trans-NAT cütlərinin də uzun müddət uzanmış ikiqat zəncirli bölgələri var, onlardan bəzilərinin, hətta hamısının RNT müdaxilə yolu ilə bir-birinin ifadəsini tənzimləyə biləcəyini soruşduq. Bu fərziyyəni yoxlamaq üçün əvvəlcə mövcud olanların hamısını xəritələşdirdik Ərəbidopsis ictimaiyyətdən kiçik RNT-lər Ərəbidopsis MPSS verilənlər bazasına Ərəbidopsis genom [30] və ehtimal ki, tərəfindən yaradıla bilən siRNA-ları axtardı trans-NAT cütləri. Biz 171 RNT-RNT dupleks bölgəsindən ehtimal edilən cəmi 148 siRNA-nı müəyyən edə bildik. trans-NAT cütləri (Cədvəl 7). Onların arasında 110 siRNA birdən çox tərəfindən yaradıla bilər trans-NAT cütü. 171-in qoşalaşan və qoşalaşmayan bölgələri arasında siRNA sıxlığının (uyğun siRNA nömrəsi ilə ardıcıllıq uzunluğu) müqayisəsi trans-NAT cütləri dupleks bölgələrdə siRNA sıxlığının tək zəncirli bölgələrdəkindən 1,75 dəfə yüksək olduğunu ortaya qoydu (1000 nt üçün 14 siRNA və 1000 nt üçün 8 siRNA). a-nın dupleks bölgəsindən yaranan SiRNA-lar trans-NAT cütü antisens transkriptini birləşdirə və RNT-dən asılı RNT polimeraza (RDRP) vasitəsilə ikiqat zəncirli RNT-lərin sintezini gücləndirə bilər və bununla da 5' ardıcıllığından orijinal dupleks bölgəyə daha çox siRNA yarada bilər. Bu səbəbdən, siRNA sıxlığı analizində yalnız dupleks bölgənin 3' ucundan transkriptin 3' ucuna qədər olan və RDRP tərəfindən yaradılan siRNA-ları istehsal edə bilməyən ardıcıllıqlar nəzərə alındı.

İfadə profilinin müqayisəsi trans-NAT spesifik siRNA-lar arasında Ərəbidopsis vəhşi tipli və RNT-dən asılı RNT polimeraza 2 (rdr2) funksiyasını itirən mutant [31] göstərdi ki, 148 siRNA-dan yalnız 1-i rdr2 mutant. Bu nəticə ən azı bəzi siRNA-ların yaratdığını göstərir trans-NAT-lər RDR2-dən asılıdır.

Çünki böyük bir hissəsi 171 siRNA ilə əlaqəlidir trans-NAT cütləri, hipotetik zülalları kodlayan kimi qeyd edilən genlərdən ehtimal edilən transkriptlərlə əmələ gəldi, biz bu genlərin bəzilərinin xarakterik olmayan transpozisiya elementləri olub olmadığını soruşduq. Bu sualı həll etmək üçün biz 171-də iştirak edən genlərin müvafiq genomik bölgələrini çıxardıq trans-NAT cütləri və bu ardıcıllıqların məlum transpozisiya elementləri ilə homologiyasını yoxlamaq üçün RepeatMasker istifadə etdi. Nəticələr göstərdi ki, 101 trans-NAT cütlərinin uyğun genomik bölgəsi Repbase-də sadalanan transpozisiya elementlərinə yüksək homologiya göstərən ən azı bir transkript var idi ki, bu da bu genlərin transpozonlardan əldə oluna biləcəyini göstərir.

Trans-NAT və alternativ birləşdirmə

Digər bildirilmiş funksiyası trans-NAT-lər əsas cütləşmə yolu ilə onların müvafiq hiss transkriptlərinin splicing modelini dəyişdirmək və bununla da müəyyən birləşmə yerlərini maskalamaqdır [10, 11]. Potensial rolları araşdırmaq Ərəbidopsis trans-Alternativ splaysinqi tənzimləməkdə NAT-lar, biz proqnozlaşdırılan genlərin alternativ splicing ilə nisbətini müqayisə etdik. trans-NAT bütün genlərlə cütləşir Ərəbidopsis genom. Tam uzunluqlu cDNA-lardan istifadə edən əvvəlki bir araşdırma göstərdi ki, təxminən 11,59% Ərəbidopsis transkripsiya vahidlərində alternativ birləşmə hadisələri var idi [32]. 658 proqnozlaşdırılan üçün trans-Hər iki transkript üçün müvafiq annotasiya edilmiş genlərə malik olan NAT cütləri, 127 cütdə məlum alternativ olaraq birləşdirilmiş gen məhsulları olan bir transkript, digər 3 cütdə isə hər iki transkript üçün alternativ olaraq birləşdirilmiş formalar var idi (Cədvəl 8). Bu məlumatlar bunu göstərir Ərəbidopsis trans-NAT cütləri, genomdakı bütün transkripsiya vahidləri (11,59%) ilə müqayisədə alternativ birləşmə hadisələrinin (19,76%) daha yüksək nisbətinə malikdir və bu, bəzilərinin trans-NAT-lar alternativ birləşməni tənzimləməkdə fəaliyyət göstərə bilər Ərəbidopsis. Bundan əlavə, bunlar arasında 130 trans-NAT cütlərinin təxminən 60%-də alternativ olaraq birləşdirilmiş eksonlarla üst-üstə düşən antisens cütləşmə bölgələri var idi ki, bu da antisens transkriptlərinin onların hiss partnyorlarının pre-mRNT-yə bağlanmasının qoşalaşma bölgəsinin yaranan yetkin hiss mRNA-larından xaric olmasına səbəb ola biləcəyini göstərir.


(OLAR). RNT transkriptində AUUUA kimi tez-tez A və U nukleotidləri olan, deqradasiya üçün RNT-ni hədəf alan bölgə.

dsRNA və pre-miRNA-ları müvafiq olaraq siRNA və miRNA-lara emal edən RNase III ailə endonükleazı.

(DNT Elementlərinin Ensiklopediyası). İnsan genomunda funksional elementləri tapmaq məqsədi daşıyan dövlət tərəfindən maliyyələşdirilən layihə.

(miRNA). Kiçik (20-25 nukleotid) ssRNT-nin digər genlərin ifadəsini tənzimlədiyi güman edilir, ya protein tərcüməsini maneə törətməklə, ya da hədəf mRNT transkriptini deqradasiya etməklə, RNT-yə bənzər bir proseslə.

Dicerdən asılı olmayaraq, prekursor ssRNA-dan işlənən və Piwi zülalı ilə kompleks əmələ gətirən kiçik (25-35 nukleotid) RNT növü. piRNA-lar, ehtimal ki, transpozonun susdurulmasında və kök hüceyrə funksiyasında iştirak edirlər.

(RNT-nin səbəb olduğu susdurucu kompleks). Bir siRNA zəncirini özündə birləşdirən və onu deqradasiya üçün tamamlayıcı hədəf mRNT-ni tanımaq üçün istifadə edən çoxproteinli kompleks.

(RNT-nin səbəb olduğu transkripsiya susdurucu kompleks). siRNA kimi qısa RNT molekullarını özündə birləşdirən və müəyyən bir genin və ya genomik bölgənin transkripsiyasının aşağı tənzimlənməsinə səbəb olan çox proteinli kompleks - məsələn, parçalanma mayasında. Bu, adətən, heterokromatin formalaşması üçün genomik bölgəni hədəf alan histon quyruqlarının modifikasiyası ilə həyata keçirilir.

(siRNA). Uzun dsRNT-dən işlənən qısa (21-23 nukleotid) RNT molekulu. siRNA-lar RISC-nin funksional komponentləridir və onlar adətən mRNT-də mükəmməl tamamlayıcı ardıcıllıqları bağlayaraq və onların deqradasiyasına səbəb olmaqla mRNT-ləri hədəfləyirlər.

Ən azı 1 nukleotidin ekzonik üst-üstə düşməsini paylaşan və eyni xromosom oriyentasiyasında olan, adətən alternativ birləşmə nümunələri olan ifadə edilmiş ardıcıllıq etiketləri və ya mRNA-lar qrupu.


NƏTİCƏLƏR

Antisens transkripsiyasına məruz qalan promotorlar xromatini yenidən modelləşdirən fermentlərin və histon şaperonlarının yüksək səviyyələrini göstərir.

Antisens transkripsiyasının sens promotorunun ətrafındakı kanonik xüsusiyyətlərə necə təsir etdiyini həll etmək üçün biz bütün genləri səviyyəsinə əsaslanaraq müəyyən etdik. yaranan hər hansı üst-üstə düşən, konvergent genlər istisna olmaqla, sens promotorunun dərhal aşağı axınında 300 bp pəncərəsində antisens transkripsiyası (Şəkil 1A). Bu, yüksək səviyyəli antisens transkripsiyasına məruz qalan sens promotorlarının aşağı səviyyəlilərdən necə fərqləndiyini araşdırmağa imkan verdi.

5183-ü böldük S. cerevisiae genləri 300 bp pəncərəsində NET-seq oxunuşlarının sayına əsasən beş sinifə ayırın. Bu, bizə yüksək səviyyəli antisens transkripsiyası (≥28 oxunuş, median 70 oxunması) olan 1024 gen sinfi (20%), antisens transkripsiyası az və ya heç olmayan (0 və ya 1 oxunuş) olan 1240 gen sinfi (24%) verdi. və üç ara sinif (Şəkil 1A). Daha sonra 202 promotor faktorun səviyyələrinin genom miqyasında müəyyən edildiyi geniş təhlildən istifadə edərək, ən aşağı səviyyədə olanlarla müqayisədə ən yüksək antisens transkripsiyası olan sinifdəki genlərin spesifik faktorlar üçün zənginləşib-zənginləşdirilmədiyini qiymətləndirdik (10). Maraqlıdır ki, yüksək səviyyəli antisens transkripsiyaya məruz qalan genlərin təşviqatçılarının xromatin mühitinin modulyasiyasında iştirak edən amillər üçün əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdiyini gördük (Cədvəl 1 Əlavə Cədvəl S1). Bu zənginləşdirilmiş amillərin antisens transkripsiyasına məruz qalan genlərin unikal xüsusiyyəti olub-olmadığını, yoxsa ümumilikdə sadəcə transkripsiya edilmiş genlərin olub-olmadığını qiymətləndirmək üçün biz ən yüksək antisens transkripsiyaya malik qrupu müqayisə etdik (median 70 antisens oxu, 578 məna oxu, n = 1024) antisens transkripsiyası olmayan və ya aşağı səviyyədə olan (0 və ya 1 oxunuş), lakin daha yüksək sensasiya transkripsiyasına malik olan başqa bir qrupla (median 948 oxunuş, n = 1240) eyni 300 bp pəncərəsində (Əlavə Cədvəl S2). ISW1, ISW2 və INO80 remodeling komplekslərinin komponentləri və FACT histon şaperonu (28) yüksək sensasiya transkripsiyasına malik gen promotorları ilə müqayisədə yüksək antisens transkripsiyaya məruz qalan genlərin sensasiya promotorları ilə xüsusi olaraq zənginləşdirilmişdir (Cədvəl 1). Beləliklə, antisens transkripsiyası çox güman ki, spesifik xromatini yenidən modelləşdirən fermentlər və promotor xromatinin strukturunda dəyişikliklərlə əlaqələndirilir.

Antisens transkripsiya edilmiş genlər fərqli promotorla əlaqəli transkripsiya ilə əlaqəli zülallar üçün zənginləşdirilmişdir.

Zənginləşdirilmiş amil. Kompleks. Funksiya. P- dəyəri a.
Isw1 Isw1a, Isw1b Xromatinin yenidən qurulması fermenti 4.2 × 10 −9
Ino80 INO80 Xromatin remodeling fermenti 4.9 × 10 −9
Pob3 FAKT Histon şaperon 2.5 × 10 −7
Rsc9 RSC1, RSC2, RSCa Xromatinin yenidən qurulması fermenti 3.2 × 10 −7
Swi3 SWI-SNF Xromatin remodeling fermenti 4.9 × 10 −7
Rpd3 RPD3 Histon şaperon və lizin deasetilaz 2.9 × 10 −6
Rpb7 Pol II 3′-sonlu emal faktorlarının işə götürülməsi 3.8 × 10 −6
Itc1 Isw2 Xromatin remodeling kompleksinin komponenti 1.2 × 10 −5
Spt3 SAGA, SLİK SAGA və SAGA kimi transkripsiya tənzimləmə komplekslərinin mənfi fəaliyyət göstərən alt bölməsi 1.9 × 10 −5
Ctk1 CTK CTD fosforilasiyası, mRNA 3′ son emalını tənzimləyir 2.1 × 10 −5
Spn1 (Iws1) SPT6 interaktoru RNAP II, TBP və xromatin remodeling amilləri ilə qarşılıqlı təsir göstərir 2.2 × 10 −5
Mərhələ 6 SPT6 Histon şaperon 2.9 × 10 −5
Rpo21 Pol II Ən böyük Pol II alt bölməsi 3.8 ×10 −5
Htb2 nukleosom Əsas histon 6.7 × 10 −5
Rpb2 Pol II İkinci ən böyük Pol II alt bölməsi 8.8 × 10 −5
Zənginləşdirilmiş amil. Kompleks. Funksiya. P- dəyəri a.
Isw1 Isw1a, Isw1b Xromatinin yenidən qurulması fermenti 4.2 × 10 −9
Ino80 INO80 Xromatin remodeling fermenti 4.9 × 10 −9
Pob3 FAKT Histon şaperon 2.5 × 10 −7
Rsc9 RSC1, RSC2, RSCa Xromatinin yenidən qurulması fermenti 3.2 × 10 −7
Swi3 SWI-SNF Xromatinin yenidən qurulması fermenti 4.9 × 10 −7
Rpd3 RPD3 Histon şaperon və lizin deasetilaz 2.9 × 10 −6
Rpb7 Pol II 3′-sonlu emal faktorlarının işə götürülməsi 3.8 × 10 −6
Itc1 Isw2 Xromatin remodeling kompleksinin komponenti 1.2 × 10 −5
Spt3 SAGA, SLİK SAGA və SAGA kimi transkripsiya tənzimləmə komplekslərinin mənfi fəaliyyət göstərən alt bölməsi 1.9 × 10 −5
Ctk1 CTK CTD fosforilasiyası, mRNA 3′ son emalını tənzimləyir 2.1 × 10 −5
Spn1 (Iws1) SPT6 interaktoru RNAP II, TBP və xromatin remodeling amilləri ilə qarşılıqlı təsir göstərir 2.2 × 10 −5
Mərhələ 6 SPT6 Histon şaperon 2.9 × 10 −5
Rpo21 Pol II Ən böyük Pol II alt bölməsi 3.8 ×10 −5
Htb2 nukleosom Əsas histon 6.7 × 10 −5
Rpb2 Pol II İkinci ən böyük Pol II alt bölməsi 8.8 × 10 −5

a Faktorlar sıra ilə sıralanır P- dəyərlər Wilcoxon rank sum testindən istifadə edilməklə müəyyən edilir və onların səviyyələri aşağı antisenslə müqayisədə yüksək antisensli genlərdə daha yüksəkdirsə və zənginləşdirilmiş hesab olunurdu. P-qiymət 0,0001-dən azdır. Mavi rəngdəki faktorlar, məna transkripsiyası olan, lakin antisens transkripsiyası olmayanlarla müqayisədə antisens transkripsiyası olan genlərdə əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirilmişdir (Əlavə Cədvəl S2-ə baxın).

Zənginləşdirilmiş amil. Kompleks. Funksiya. P- dəyər a.
Isw1 Isw1a, Isw1b Xromatinin yenidən qurulması fermenti 4.2 × 10 −9
Ino80 INO80 Xromatin remodeling fermenti 4.9 × 10 −9
Pob3 FAKT Histon şaperon 2.5 × 10 −7
Rsc9 RSC1, RSC2, RSCa Xromatinin yenidən qurulması fermenti 3.2 × 10 −7
Swi3 SWI-SNF Xromatinin yenidən qurulması fermenti 4.9 × 10 −7
Rpd3 RPD3 Histon şaperon və lizin deasetilaz 2.9 × 10 −6
Rpb7 Pol II 3′-sonlu emal faktorlarının işə götürülməsi 3.8 × 10 −6
Itc1 Isw2 Xromatin remodeling kompleksinin komponenti 1.2 × 10 −5
Spt3 SAGA, SLİK SAGA və SAGA kimi transkripsiya tənzimləmə komplekslərinin mənfi fəaliyyət göstərən alt bölməsi 1.9 × 10 −5
Ctk1 CTK CTD fosforilasiyası, mRNA 3′ son emalını tənzimləyir 2.1 × 10 −5
Spn1 (Iws1) SPT6 interaktoru RNAP II, TBP və xromatin remodeling amilləri ilə qarşılıqlı təsir göstərir 2.2 × 10 −5
Mərhələ 6 SPT6 Histon şaperon 2.9 × 10 −5
Rpo21 Pol II Ən böyük Pol II alt bölməsi 3.8 ×10 −5
Htb2 nukleosom Əsas histon 6.7 × 10 −5
Rpb2 Pol II İkinci ən böyük Pol II alt bölməsi 8.8 × 10 −5
Zənginləşdirilmiş amil. Kompleks. Funksiya. P- dəyər a.
Isw1 Isw1a, Isw1b Xromatin remodeling fermenti 4.2 × 10 −9
Ino80 INO80 Xromatin remodeling fermenti 4.9 × 10 −9
Pob3 FAKT Histon şaperon 2.5 × 10 −7
Rsc9 RSC1, RSC2, RSCa Xromatinin yenidən qurulması fermenti 3.2 × 10 −7
Swi3 SWI-SNF Xromatin remodeling fermenti 4.9 × 10 −7
Rpd3 RPD3 Histon şaperon və lizin deasetilaz 2.9 × 10 −6
Rpb7 Pol II 3′-sonlu emal faktorlarının işə götürülməsi 3.8 × 10 −6
Itc1 Isw2 Xromatin remodeling kompleksinin komponenti 1.2 × 10 −5
Spt3 SAGA, SLİK SAGA və SAGA kimi transkripsiya tənzimləmə komplekslərinin mənfi fəaliyyət göstərən alt bölməsi 1.9 × 10 −5
Ctk1 CTK CTD fosforilasiyası, mRNA 3′ son işlənməsini tənzimləyir 2.1 × 10 −5
Spn1 (Iws1) SPT6 interaktoru RNAP II, TBP və xromatinin yenidən qurulması faktorları ilə qarşılıqlı təsir göstərir 2.2 × 10 −5
Mərhələ 6 SPT6 Histon şaperon 2.9 × 10 −5
Rpo21 Pol II Ən böyük Pol II alt bölməsi 3.8 ×10 −5
Htb2 nukleosom Əsas histon 6.7 × 10 −5
Rpb2 Pol II İkinci ən böyük Pol II alt bölməsi 8.8 × 10 −5

a Faktorlar sıra ilə sıralanır P- dəyərlər Wilcoxon rank sum testindən istifadə edilməklə müəyyən edilir və onların səviyyələri aşağı antisenslə müqayisədə yüksək antisensli genlərdə daha yüksəkdirsə və zənginləşdirilmiş hesab olunurdu. P-qiymət 0,0001-dən azdır. Mavi rəngdəki faktorlar, məna transkripsiyası olan, lakin antisens transkripsiyası olmayanlarla müqayisədə antisens transkripsiyası olan genlərdə əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirilmişdir (Əlavə Cədvəl S2-ə baxın).

Antisens transkripsiyası, hiss promotorunda xromatin arxitekturasında dəyişiklik ilə əlaqələndirilir

Genlərin promotorla bağlı nukleosomlarının yerləşməsi, dinamikası və yerləşməsi baxımından necə fərqlənə biləcəyini soruşduq. Nukleosomların genişlənməsinin genom xəritəsindən (29) istifadə edərək, yüksək səviyyəli antisens transkripsiyaya məruz qalan genlərin promotorları arasında yüksək nukleosom tutulması göstərdiyini aşkar etdik (29).səh = 2,3 × 10 −27 Şəkil 1B). −1 və +1 nukleosomları arasındakı NDR yüksək antisens transkripsiyası olan genlərdə də daha qısa idi (Şəkil 1B, ən yüksək və ən aşağı siniflər üçün müvafiq olaraq 114 bp-ə qarşı orta uzunluq 75 bp). səh = 1 × 10 −16 ). Nukleosomların tutulmasında artım beş gen sinfi arasında mərhələli şəkildə baş verdi və bu, antisens transkripsiyanın hətta aşağı səviyyələrdə və genlərin ≈75% -ində xromatində dəyişikliklər edə biləcəyini göstərir. Tənqidi olaraq, 300 bp pəncərəsində məna və antisens transkripsiyası arasında yalnız çox zəif korrelyasiya olduğunu aşkar etdik (Şəkil 1C, Spearmanın korrelyasiya əmsalı = -0.07). Bundan əlavə, hiss transkripsiyasında dəyişikliklərin qlükoza-qalaktoza tərkibli mühitə köçürülmüş hüceyrələrdə aparılmış NET-seq təcrübələrindən istifadə etməklə genom boyu antisens transkripsiyasında dəyişikliklərlə tərs korrelyasiya olduğu aşkar edilməmişdir, baxmayaraq ki, hiss transkripsiyasında >3 qat dəyişikliyi olmuşdur. 1078 gen üçün (genomun 20%-i) ( 8) (Şəkil 1D, rs = +0,06). Beləliklə, artan antisens transkripsiyası ilə əlaqəli nukleosomların tutulmasında artım ola bilər müstəqil hissi transkripsiyasından.

Hiss və antisens transkripsiyası, hiss promotorunda nukleosomların yerləşməsinin fərqli nümunələri ilə əlaqələndirilir.

Daha sonra, eyni 300 bp pəncərəsində yaranan sensasiya transkripsiyasının müxtəlif səviyyələrdə antisens transkripsiyasının mövcudluğunda nukleosomların tutulmasına və NDR ölçüsünə necə təsir etdiyini qiymətləndirdik (Şəkil 2A-D). Birincisi, 300 bp pəncərəsindəki məna və ya antisens transkripsiya səviyyələrinin TSS-yə nisbətən müxtəlif mövqelərdə nukleosomların tutulması ilə necə əlaqəli olduğunu soruşduq (Şəkil 2A). Hiss transkripsiyasının TSS-dən dərhal yuxarıdakı nukleosomların tutulması ilə mənfi əlaqədə olduğunu və +1 nukleosoma uyğun gələn bölgədə dərhal aşağı axınında müsbət korrelyasiya olduğunu, transkripsiyanın +1 nukleosomunu yerləşdirdiyi modeli dəstəklədiyini aşkar etdik (30). Bunun əksinə olaraq, antisens transkripsiyası promotor üzərində, TSS-dən birbaşa yuxarıda və transkripsiya edilmiş bölgənin ilk 1 kb-də nukleosomların tutulması ilə müsbət əlaqələndirildi. Sens transkripsiyası olan, lakin antisens transkripsiyası olmayan genlər aşağı nukleosom tutulması və böyük NDR (126 bp) ilə açıq promotor xromatin strukturuna meyl edirdilər, yüksək antisens transkripsiyası və aşağı sens transkripsiyası olan genlər isə yüksək nukleosom doluluğu ilə qapalı promotor xromatin strukturuna malikdirlər. promotor və kiçik NDR (39 bp) (Şəkil 2B və C). Biz antisens transkripsiyası ilə əlaqəli artan nukleosom doluluğunun oxşar səviyyəli sensasiya transkripsiyasına malik genləri, lakin müxtəlif səviyyələrdə antisens transkripsiyası ilə müqayisə edərək hiss transkripsiyasından müstəqil olduğunu təsdiqlədik və nukleosomların tutulmasının hələ də ciddi şəkildə fərqləndiyini aşkar etdik (Şəkil 2B və C). Bu, əsasən sensasiya transkripsiyası (Şəkil 2D sol panel), ilk növbədə antisens transkripsiyası (orta panel) üçün zənginləşdirilmiş genlər və ya həm məna, həm də antisens transkripsiyası (sağ panel) üçün müxtəlif səviyyələrə malik genlər ilə müəyyən edilmiş üç fərqli promotor xromatin arxitekturasını təklif edir. Bu arxitekturalar gen ifadə səs-küyünün müxtəlif dərəcələri ilə əlaqəli vəziyyətə xas promotor xromatin konfiqurasiyalarının fərqli siniflərini çox xatırladır (26). Beləliklə, məna və antisens transkripsiyası hissi TSS-ni əhatə edən xromatin təşkilatının fərqli xüsusiyyətləri ilə əlaqələndirilir. Hiss və antisens transkripsiyası nukleosomların tutulması ilə tərs əlaqəli olsa da, genom miqyasında sens və antisens transkripsiyası arasında çox zəif korrelyasiya göstərir ki, onlar əsasən müstəqil proseslərdir, burada biri digərinin səviyyələrini tənzimləmir.

(A) Nukleosomların tutulması və iki növ transkripsiya arasında korrelyasiya. TSS ətrafında müxtəlif mövqelərdə nukleosomların yerləşməsi ilə 300 bp pəncərəsində hiss transkripsiyası (qırmızı) və ayrıca antisens transkripsiyası (mavi) üçün hesablanmış Spearman korrelyasiya əmsalı göstərilir. Boz düzbucaqlılar -1 (sol) və +1 (sağ) nukleosomların təxmini mövqelərini təmsil edir. (B) Paneldə (C) göstərilən gen qruplarında median NDR ölçüsü ilə birlikdə məna və antisens oxunuşlarının median sayı. (C) Paneldə (B) təsvir edilən gen qruplarına istinad edən rənglər eyni pəncərədə fərqli median sayları olan sens və antisens oxunan genlərdə orta nukleosom tutulması. (D) Promotorlar hər biri fərqli xromatin xüsusiyyətlərinə malik olan verilmiş şərtlər toplusunda üç müxtəlif sinifdən birinə aid edilə bilər. Üçbucaqlar transkripsiya faktorlarını, ovallar isə xromatini yenidən modelləşdirən fermentləri təmsil edir. Əlavə S1 və S2 Şəkillərinə baxın.

(A) Nukleosomların tutulması və iki növ transkripsiya arasında korrelyasiya. TSS ətrafında müxtəlif mövqelərdə nukleosom yerləşməsi ilə 300 bp pəncərəsində hiss transkripsiyası (qırmızı) və ayrıca antisens transkripsiyası (mavi) üçün hesablanmış Spearman korrelyasiya əmsalı göstərilir. Boz düzbucaqlılar -1 (sol) və +1 (sağ) nukleosomların təxmini mövqelərini təmsil edir. (B) Paneldə (C) göstərilən gen qruplarında median NDR ölçüsü ilə birlikdə məna və antisens oxunuşlarının median sayı. (C) Paneldə (B) təsvir edilən gen qruplarına istinad edən rənglər eyni pəncərədə fərqli median sayları olan sens və antisens oxunan genlərdə orta nukleosom tutulması. (D) Promotorlar hər biri fərqli xromatin xüsusiyyətlərinə malik olan müəyyən şərtlər toplusunda üç müxtəlif sinifdən birinə aid hesab edilə bilər. Üçbucaqlar transkripsiya faktorlarını, ovallar isə xromatini yenidən modelləşdirən fermentləri təmsil edir. Əlavə S1 və S2 Şəkillərinə baxın.

Yeni yaranan hiss və antisens transkripsiyası histon modifikasiyasının fərqli nümunələri ilə əlaqələndirilir

300 bp pəncərəsində müxtəlif səviyyələrdə antisens transkripsiyası olan genlərdə histon modifikasiyalarının nümunələrini araşdırdıq və aşağı səviyyələrə malik olanlarla müqayisədə yüksək antisens transkripsiyaya məruz qalan genlərdə əhəmiyyətli fərqlər göstərən çoxsaylı modifikasiyaları müəyyən etdik (Şəkil 3A). Bu modifikasiyaları geniş şəkildə üç qrupa bölmək olar: yüksək antisens transkripsiyası olan gen orqanında daha yüksək olanlar, aşağı olanlar və daha bərabər yayılmış olanlar. Biz həmçinin xromatin modifikasiyaları və antisens transkripsiyası arasındakı korrelyasiyanın modifikasiyalar və hiss transkripsiyası arasındakı korrelyasiya ilə müqayisədə necə olduğunu qiymətləndirdik (Şəkil 3B və C). Ən yüksək antisens transkripsiyası olan gen sinfi üç alt qrupa bölündükdə (Əlavə Şəkil S1) və ya kontinuumu göstərən genləri ehtiva edən tənzimlənən TATA qutusu (25) analizdən çıxarıldıqda (Əlavə Şəkil S2) genom miqyasında birləşmələr eyni qaldı. antisens transkripsiya səviyyəsi ilə əlaqəli bütün gen növlərinə təsirləri. Bu təhlil 300 bp pəncərəsində məna və antisens transkripsiyasına əsaslansa da, biz hiss və antisens transkripsiyası arasında korrelyasiyanın olmamasının gen bədəninə yaxşı yayıldığını göstəririk (Şəkil 3D). 3′ bölgəsinə qarşı kiçik mənfi korrelyasiya onu göstərir ki, antisens transkripsiyasının başlanması sensasiya transkripsiyasının vaxtından əvvəl dayandırılmasına səbəb ola bilər və beləliklə, stabil vəziyyət transkript səviyyələrinə təsir göstərir.

Sense və antisens transkripsiyası müxtəlif histon modifikasiyaları ilə fərqli assosiasiyalara malikdir. (A) Şəkil 1A-da təsvir edilən beş gen sinifində TSS ətrafında yeddi müxtəlif histon modifikasiyasının orta səviyyələri (0) müxtəlif antisens transkripsiyaya məruz qalır. (B) TSS ətrafında 10 bp pəncərələrində yeddi müxtəlif histon modifikasiyasının səviyyələri arasında korrelyasiya əmsalı (0) və ayrıca, Şəkil 1A-da təsvir olunan 300 bp pəncərəsində məna və antisens NET-seq oxunuşlarının sayı. (C) Şəkil 1A-da təsvir edilmiş beş gen sinifində TSS ətrafında yeddi müxtəlif histon modifikasiyasının (0) orta səviyyələri, 300 bp pəncərəsində yüksək antisens transkripsiyaya (mavi) və yüksək mənalı transkripsiyaya (qırmızı) məruz qalır. (D) Genlər arasında məna və antisens transkripsiyası arasında Spearman korrelyasiya əmsalı. (E) TBP, TFIIB, H2A.Z və hissi transkripsiya edən RNAPII-nin orta səviyyələri. TBP və TFIIB, H2A.Z kimi artan antisens transkripsiyası ilə genin bədəninə yayılmır. (F) RNAPII CTD Ser2ph səviyyəsi ilə məna və antisens transkripsiya arasında korrelyasiya əmsalı. Göstərilən yerdə, P-dəyərlər ən yüksək sinifdə olan genləri TSS yaxınlığında ən aşağı siniflə müqayisə edərək, Wilcoxon rank sum testindən istifadə edərək müəyyən edilmişdir. Əlavə Şəkil S3-ə baxın.

Sense və antisens transkripsiyası müxtəlif histon modifikasiyaları ilə fərqli assosiasiyalara malikdir. (A) Şəkil 1A-da təsvir edilən beş gen sinifində TSS ətrafında yeddi müxtəlif histon modifikasiyasının orta səviyyələri (0) müxtəlif antisens transkripsiyaya məruz qalır. (B) TSS ətrafında 10 bp pəncərələrində yeddi müxtəlif histon modifikasiyasının səviyyələri arasında korrelyasiya əmsalı (0) və ayrıca, Şəkil 1A-da təsvir olunan 300 bp pəncərəsində məna və antisens NET-seq oxunuşlarının sayı. (C) Şəkil 1A-da təsvir edilən beş gen sinifində TSS ətrafında yeddi müxtəlif histon modifikasiyasının (0) orta səviyyələri, 300 bp pəncərəsində yüksək antisens transkripsiyaya (mavi) və yüksək mənalı transkripsiyaya (qırmızı) məruz qalır. (D) Genlər arasında məna və antisens transkripsiyası arasında Spearman korrelyasiya əmsalı. (E) TBP, TFIIB, H2A.Z və hissi transkripsiya edən RNAPII-nin orta səviyyələri. TBP və TFIIB, H2A.Z kimi artan antisens transkripsiyası ilə genin bədəninə yayılmır. (F) RNAPII CTD Ser2ph səviyyəsi ilə məna və antisens transkripsiyası arasında korrelyasiya əmsalı. Göstərilən yerdə, P-dəyərlər ən yüksək sinifdə olan genləri TSS yaxınlığında ən aşağı siniflə müqayisə edərək, Wilcoxon rank sum testindən istifadə edərək müəyyən edilmişdir. Əlavə Şəkil S3-ə baxın.

Histon H3-də asetilasiya yüksək antisens transkripsiyaya məruz qalan genlərdə yüksəldi (Şəkil 3A-C Əlavə Şəkil S3A-C). H3 asetilasiyası yüksək sensiyalı transkripsiyaya malik genlərdə daha yüksək olsa da, bu fərqlər ilk növbədə promotorda idi, halbuki antisens transkripsiya ilə əlaqəli dəyişikliklər həm promotorda, həm də gen bədənində baş verdi.

H3K4me3 səviyyələri antisens transkripsiyasına məruz qalan genlərin promotorunda və erkən transkripsiya edilmiş bölgəsində əhəmiyyətli dərəcədə azaldı (Şəkil 3A-C), lakin daha aşağı axınla artırıldı, bu işarənin antisens transkripsiyası ilə yenidən paylandığını göstərir (31) (Əlavə Şəkil S3D). Htz1 (H2A.Z) variantının səviyyələri promotordan yüksək antisens transkripsiyaya məruz qalan genlərin bədəninə oxşar yenidən bölüşdürülmə göstərdi (Şəkil 3E), yəni onlar daha bərabər şəkildə yayıldı. Bununla belə, TFIIB və TBP promotorda əlaqəli olaraq qalır və müşahidə etdiyimiz yenidən bölüşdürmənin transkripsiya edilmiş bölgədəki sirli promotorların nəticəsi olmadığını nümayiş etdirir (Şəkil 3E).

H2BK123ub, H3K36me3 və H3K79me3 genom boyu, əsasən gen orqanında yüksək antisens transkripsiyaya məruz qalan genlərdə daha aşağıdır (Şəkil 3A–C Əlavə Şəkil S3E və F). Bu, H3K36me3-ün əsasən genlərin 3′ ucunda tapıldığını nəzərə alsaq, iki üst-üstə düşən, konvergent transkripsiya vahidinə malik genlər üçün gözlənilən şeyə ziddir (16, 19), bu, antisens transkripsiyasının hiss transkripsiyasından mahiyyətcə fərqli ola biləcəyini nəzərdə tutur. Həqiqətən, biz antisens transkripsiyası ilə H3K36me3-ün Set2 tərəfindən çökdürülməsi üçün tələb olunan RNAPII CTD serin 2 fosforilasiyası (32) (Şəkil 3F) arasında az korrelyasiya müşahidə etdik ki, bu, məna və antisens transkripsiya edən RNAPII komplekslərinin özlərinin fərqli ola biləcəyini göstərir. Maraqlıdır ki, H2BK123ub, H3K36me3 və H3K79me3 nukleosom strukturlarının sabitləşməsi ilə əlaqələndirilir (16, 20-21, 33-34). Üstəlik, H3K36me3 histon dövriyyəsi ilə səbəb əlaqəsi göstərməməsinə baxmayaraq (13), antisens transkripsiyası ilə ən güclü şəkildə əlaqəli olan histon modifikasiyaları da histon H3 dövriyyəsi genomu ilə ən güclü şəkildə əlaqəli olanlardır, yəni H3K79me3 və H3K36me3 (hər ikisi ilə mənfi və H34K ilə əlaqəli) , H3K56ac və H3K79me2 (hər ikisi ilə müsbət korrelyasiya) (Şəkil 4A), bizi antisens transkripsiyasının histon dövriyyəsi ilə əlaqəli olub olmadığını soruşmağa aparır.

Antisens transkripsiyası histon dövriyyəsinin artması ilə əlaqələndirilir. (A) Spearman korrelyasiya əmsalları, genom boyu histon dövriyyəsini və ya antisens transkripsiyasını eyni araşdırılan bölgələr daxilində on üç müxtəlif histon modifikasiyasının səviyyələri ilə əlaqələndirməklə əldə edilir. (BC) Şəkil 1A-da olduğu kimi rənglənmiş, antisens transkripsiyasının müxtəlif səviyyələrinə malik genlərin −1-dən +4-ə qədər nukleosomlarında histon dövriyyəsi sürətlərinin paylanmasını göstərən qutular, üç aralıq sinif bir qrupda birləşdirilmiş və ya (C) 300 bp pəncərəsində transkripsiyanı hiss edin. Hər qrupda məna və antisens transkripsiyasının median səviyyələri müvafiq olaraq qırmızı və mavi rənglərlə verilmişdir. Boz qutunun yuxarı və aşağı hissəsi müvafiq olaraq genom üzrə -1 nukleosom və ya histon dövriyyəsi ilə üst-üstə düşən bütün zondların median dəyərini göstərir. (D) (12) və NET-seq məlumatlarından (8) G1-də seçilmiş bölgələr üçün histon dövriyyəsi məlumatları TUB2 (Qrup HMS2 (C). Yaşıl aşağı histon dövriyyəsi olan bölgələri, qırmızı isə yüksək histon dövriyyəsi olan bölgələri təmsil edir. TUB2HMS2 oxşar səviyyəli sensasiya transkripsiyasına məruz qalırlar, lakin çox fərqli antisens transkripsiya səviyyələrini göstərirlər. Əlavə Şəkil S4-ə baxın.

Antisens transkripsiyası histon dövriyyəsinin artması ilə əlaqələndirilir. (A) Spearmanın korrelyasiya əmsalları, genom boyu histon dövriyyəsi və ya antisens transkripsiyasını eyni araşdırılan bölgələrdə on üç müxtəlif histon modifikasiyasının səviyyələri ilə əlaqələndirməklə əldə edilir. (BC) Şəkil 1A-da olduğu kimi rənglənmiş, antisens transkripsiyasının müxtəlif səviyyələrinə malik genlərin −1-dən +4-ə qədər nukleosomlarında histon dövriyyəsi sürətlərinin paylanmasını göstərən qutular, üç aralıq sinif bir qrupda birləşdirilmiş və ya (C) 300 bp pəncərəsində transkripsiyanı hiss edin. Hər qrupda məna və antisens transkripsiyasının median səviyyələri müvafiq olaraq qırmızı və mavi rənglərlə verilmişdir. Boz qutunun yuxarı və aşağı hissəsi müvafiq olaraq genom üzrə −1 nukleosom və ya histon dövriyyəsi ilə üst-üstə düşən bütün zondların median dəyərini göstərir. (D) (12) və NET-seq məlumatlarından (8) G1-də seçilmiş bölgələr üçün histon dövriyyəsi məlumatları TUB2 (Qrup HMS2 (C). Yaşıl aşağı histon dövriyyəsi olan bölgələri, qırmızı isə yüksək histon dövriyyəsi olan bölgələri təmsil edir. TUB2HMS2 oxşar səviyyəli sensasiya transkripsiyasına məruz qalırlar, lakin çox fərqli antisens transkripsiya səviyyələrini göstərirlər. Əlavə Şəkil S4-ə baxın.

Antisens transkripsiyasına məruz qalan promotorlar və gen cisimləri artan histon dövriyyəsi nisbətlərini nümayiş etdirir

Histon dövriyyəsini qiymətləndirmək üçün biz genom miqyaslı xəritədən istifadə etdik ki, burada Bayraq-H3 ifadəsinin induksiyasından sonra Myc etiketli H3-ün Bayraq etiketli H3 ilə yerdəyişmə sürəti ölçüldü (12). Histon dövriyyəsi 300 bp pəncərəsində yüksək antisens transkripsiyası olan genlərin −1 və +4 nukleosomları arasında 300 bp pəncərəsində antisens transkripsiyası olmayan/aşağı olanlarla müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə yüksək olmuşdur (Şəkil 4B səh = 9,6 × 10 −7 , 1,7 × 10 −22 , 1,9 × 10 −24 , 5,4 × 10 −21 və 4,9 × 10 −25). Bu tendensiyalar H3K36 metiltransferaz olduqda qaldı SET2 silindi (16) (Əlavə Şəkil S4), antisens transkripsiyası və histon dövriyyəsi arasındakı əlaqədə H3K36 metilasiyası üçün əsas səbəb roluna uyğun gəlmir.

Artan histon dövriyyəsinin daha çox transkripsiyanın deyil, antisens transkripsiyasının xüsusiyyəti olduğunu təsdiqləmək üçün histon dövriyyəsinin müxtəlif səviyyələrdə sensasiya transkripsiyasına malik genlər üçün necə fərqləndiyini qiymətləndirdik (Şəkil 4C). Qruplar arasında məna transkripsiyasında böyük dəyişikliklərə baxmayaraq, histon dövriyyəsi promotorda əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmədi, baxmayaraq ki, dövriyyə nisbətləri yüksək idi. Promotorda hiss transkripsiyası və histon dövriyyəsi səviyyələri arasında əlaqənin olmaması əvvəlki tapıntılarla razılaşır (12). Hiss transkripsiyası, daha yüksək səviyyəli transkripsiya ilə əlaqəli daha yüksək dövriyyə ilə +3 və +4 nukleosomlarında gözlənilən əlaqəni göstərdi.

Antisens transkripsiyasının histon dövriyyəsinə dramatik təsirini burada görmək olar HMS2TUB2, sensasiya transkripsiyasının oxşar səviyyələrinə malik genlər, lakin çox fərqli antisens transkripsiyası (Şəkil 4D). Birlikdə götürdükdə, əldə etdiyimiz nəticələr göstərir ki, histon dövriyyəsi kanonik eukaryotik promotorun xüsusiyyəti olsa da, bu, hissin transkripsiya səviyyəsi ilə deyil, antisens transkripsiya səviyyəsi ilə əlaqələndirilir. Bu dövriyyənin artması histon şaperonlarının və/yaxud xromatini yenidən modelləşdirən fermentlərin səviyyəsinin artmasının nəticəsi ola bilər ki, bu da birbaşa dövriyyəyə səbəb olur (35, 36).

Antisens transkripsiyasının azalması GAL1 H3 və H3 asetilasiya səviyyəsini artırır, lakin H3K36me3 səviyyəsini azaldır

Biz antisens transkripsiyasının histon səviyyələrini və histon səviyyələrini dəyişdirməkdən və gen orqanında dəyişikliklərdən məsul ola biləcəyini fərz etdik və bunu eksperimental olaraq təsdiqləməyə çalışdıq. GAL1 gen. Həm qlükoza, həm də qalaktoza GAL1 məna və antisens var (CUT445) transkriptlər, baxmayaraq ki, qlükozada məna transkripti (SUT013) bir promouterdən yaranır GAL10 ( 22) (Şəkil 5 və Əlavə Şəkil S5). Əvvəllər terminator ardıcıllığının daxil edildiyini göstərmişdik ADH1 (ADH1T) ORF-ə GAL1 ilə nəticələndi yenidən müəyyən edilməsi transkripsiya vahidinin GAL1 hiss transkriptləri (GAL1SUT013) saatında dayandırıldı ADH1T antisens transkripti ondan başlamışdır (9) (Şəkil 5A və B). Qalaktoza induksiyası zamanı antisens transkriptlərinin qısaldılması fərqli transkript izoformalarının istehsalı ilə nəticələnir (Şəkil 5B) (8, 37). Bu transkriptlərin qlükozada xəritələşdirilməsi aşkar etdi ki, əsas antisens transkript son sahəsi sens TSS-dən 128 bp yuxarı, QAL1-10 promotor, onun hiss promotor strukturunu modulyasiya edə biləcəyini təklif edir (Şəkil 5C). NET-seq istifadə edərək yeni yaranan transkriptlərin xəritələşdirilməsi, tam şəkildə uzanan antisens transkripsiyanın mövcudluğunu təsdiqlədi. QAL1-10 promotor induksiyanın başlanğıcında (qalaktozada 60 dəq) və hiss transkripsiyası yüksək dərəcədə induksiya edildikdə (qalaktozada 180 dəq) (Şəkil 5D).

Eksperimental olaraq dəyişən antisens transkripsiyası GAL1 xromatin modifikasiyalarını dəyişdirir (A) Qlükoza mühitində (yuxarıda) və ya daxil edildikdən sonra yerli GAL lokusunda transkriptləri göstərən sxemlər ADH1 terminator (T) +757 bp daxil GAL1 qlükozada (ortada) və ya qalaktozada (aşağıda). (B) üçün Northern blot probing GAL1 induksiya vaxtı kursu zamanı sens və antisens transkriptləri (dəq. dəfə). Etidium bromidlə boyanmış geldəki rRNT yükləmə nəzarəti kimi göstərilir. Nəzarət edir GAL1: ADH1T və TATA mutantında 4 bp TATA-ya bənzər ardıcıllıqla şifrələnmişdir (C panelinə baxın). Antisens transkripsiyası GAL1 daxil olan promotor daxilində TATA bənzər ardıcıllığın mutasiyası ilə pozula bilər ADH1T. (C) GAL1: ADH1 konstruksiyanın 3' bölgəsində RL-PCR (qapağın açılması və defosforilasiyası ilə) ilə sens/antisens RNT xəritəsi ADH1T daxil edilir GAL1. Həmçinin TATA-ya bənzər ardıcıllığın mövqeyi, eləcə də mutasiyadan sonrakı ardıcıllığı (qırmızı ilə işarələnmiş dəyişikliklər) göstərilir. 3' son saytlar 3' RACE istifadə edərək təsdiqləndi. İstək əsasında astarların ardıcıllığı mövcuddur. (D) DNT-nin Watson (W) və Crick (C) zəncirində yaranan transkriptləri göstərən NET-seq məlumatları GAL1: ADH1T qalaktoza mühitində 60 və ya 180 dəqiqədən sonra süzün. (EF) histon H3 səviyyələrini və ya müxtəlif histon modifikasiyalarını göstərən ChIP təcrübələri GAL1 içində GAL1-ADH1T TATA-ya bənzər ardıcıllığın həm mutasiyası olan, həm də mutasiyası olmayan gərginlik. Xromatin əvvəllər təsvir edildiyi kimi qlükozada yetişdirilən suşlardan hazırlanmışdır (27). (E) TATA-ya bənzər ardıcıllığı pozulmamış gərginlikdə antisens transkriptinin başladığı yerə təxminən uyğun gələn H3K4me3 zirvəsi müşahidə olunur. TATA kimi ardıcıllığın mutasiyasından sonra bu zirvə itirilir, antisens transkripsiyasının müşahidə edilən ləğvi ilə uyğundur, n = 2, xəta çubuqları SEM-dir. (F) H3 səviyyələri, H3K9, K14, K18 və K23 üçün histon lizin asetilasiyası və K36 üçün histon H3 lizin trimetilasiyası H3 səviyyələrinə normallaşdırılır.

Eksperimental olaraq dəyişən antisens transkripsiyası GAL1 xromatin modifikasiyalarını dəyişdirir (A) Qlükoza mühitində (yuxarıda) və ya daxil edildikdən sonra yerli GAL lokusunda transkriptləri göstərən sxemlər ADH1 terminator (T) +757 bp daxil GAL1 qlükozada (ortada) və ya qalaktozada (aşağıda). (B) üçün Northern blot probing GAL1 induksiya vaxtı kursu zamanı sens və antisens transkriptləri (dəq. dəfə). Etidium bromidlə boyanmış geldəki rRNT yükləmə nəzarəti kimi göstərilir. Nəzarət edir GAL1: ADH1T və TATA mutantında 4 bp TATA-ya bənzər ardıcıllıq şifrələnmişdir (C panelinə bax). Antisens transkripsiyası GAL1 daxil olan promotor daxilində TATA bənzər ardıcıllığın mutasiyası ilə pozula bilər ADH1T. (C) GAL1: ADH1 konstruksiyanın 3' bölgəsində RL-PCR (qapağın açılması və defosforilasiyası ilə) ilə sens/antisens RNT xəritəsi ADH1T daxil edilir GAL1. Həmçinin TATA-ya bənzər ardıcıllığın mövqeyi, həmçinin mutasiyadan sonrakı ardıcıllığı (qırmızı ilə işarələnmiş dəyişikliklər) göstərilir. 3' son saytlar 3' RACE istifadə edərək təsdiqləndi. İstək əsasında astarların ardıcıllığı mövcuddur. (D) DNT-nin Watson (W) və Crick (C) zəncirində yaranan transkriptləri göstərən NET-seq məlumatları GAL1: ADH1T qalaktoza mühitində 60 və ya 180 dəqiqədən sonra süzün. (EF) histon H3 səviyyələrini və ya müxtəlif histon modifikasiyalarını göstərən ChIP təcrübələri GAL1 içində GAL1-ADH1T TATA-ya bənzər ardıcıllığın həm mutasiyası olan, həm də mutasiyası olmayan gərginlik. Xromatin əvvəllər təsvir edildiyi kimi qlükozada yetişdirilən suşlardan hazırlanmışdır (27). (E) TATA-ya bənzər ardıcıllığı pozulmamış gərginlikdə antisens transkriptinin başladığı yerə təxminən uyğun gələn H3K4me3 zirvəsi müşahidə olunur. TATA kimi ardıcıllığın mutasiyasından sonra bu zirvə itirilir, antisens transkripsiyasının müşahidə edilən ləğvi ilə uyğundur, n = 2, xəta çubuqları SEM-dir. (F) H3 səviyyələri, H3K9, K14, K18 və K23 üçün histon lizin asetilasiyası və K36 üçün histon H3 lizin trimetilasiyası H3 səviyyələrinə normallaşdırılır.

Biz daxilində ardıcıllığı müəyyən etdik ADH1T TATA qutusuna (TATAAAAA) bənzəyir (Şəkil 5C) və bunun antisens transkriptinin başlaması üçün lazım ola biləcəyini fərz etdi. Maraqlıdır ki, antisens TSS-nin aşağı axınında olsa da, TATA qutusunun mutasiyası (AAATAAAT) sens və antisens transkripsiyası arasında korrelyasiya olmamasına uyğun olaraq antisens transkript səviyyəsini azaldarkən, sens transkript səviyyələri təsirsiz qaldı (Şəkil 5B) (Şəkil 1C). ). Transkripsiya vahidinin azaldılmış istifadəsini təsdiqləyən TATA qutusu mutant ştammında (Şəkil 5E) antisens transkript üçün TSS ətrafında H3K4me3-ün azalmış səviyyələrini göstərmək üçün xromatin immunoprecipitation (ChIP) istifadə etdik. Antisens transkripsiyasını azaltmaq qabiliyyəti GAL1 antisens transkripsiyasının xromatinə təsirlərinin müşahidə oluna biləcəyi eksperimental sistem təqdim etdi.

Histon və histon modifikasiyalarının səviyyələri qlükoza tərkibli mühitdə, xüsusilə H3, H3 asetilasiya işarələri seriyası (K9,14,18,23ac) və H3K36me3-də ChIP istifadə edərək ölçüldü. GAL1 konstruksiyalar (Şəkil 5F). iştirakı ilə ChIP təcrübələri həyata keçirilmişdir SUT013qlükoza oxşar səviyyələrdə transkripsiya olunur GAL1 antisens transkripti (Şəkil 5D). Geniş genom analizinə əsasən, H3 və H3 asetilləşmə səviyyələrinin antisens transkripsiyasının ablasyonundan sonra aşağı düşəcəyi və H3K36me3-ün yüksələcəyi proqnozlaşdırıldı. Proqnozlarımıza uyğun olaraq, TATA kimi ardıcıllığın mutasiyası və antisens transkriptinin itirilməsindən sonra H3 və H3 asetilasiya səviyyələri (H3 səviyyələrinə normallaşdırılıb) aşağı düşmüş, H3 ilə normallaşdırılmış H3K36me3 səviyyələri artmışdır (Şəkil 5F). Bu dəyişikliklər antisens transkripsiyası olmadıqda azalmış histon dövriyyəsi/çökmə ilə uyğun gəlir və antisens transkripsiyasının xromatində geniş dəyişikliklərlə əlaqəli olduğunu göstərir.

Silindikdən sonra antisens transkripsiyasında dəyişikliklər SET2, RCO1, EAF3 və ya SET1 nukleosomların tutulmasında və histon modifikasiyalarında müvafiq dəyişikliklə əlaqələndirilir

İndiyə qədər biz vəhşi tipli fonda müxtəlif genlər arasında antisens transkripsiyası və xromatin xüsusiyyətləri arasında əlaqəni göstərmişik. Müqayisə edərkən oxşar birləşmələrin müşahidə olunacağını fərz etdik eyni arasında genlər fərqli maya suşları. yəni mutasiya zamanı antisens transkripsiyasının necə dəyişdiyini və bu dəyişikliklərin yuxarıda müzakirə olunan xromatin xüsusiyyətlərindəki dəyişikliklərlə əks olunub-olunmadığını araşdırmaq yolu ilə.

Bu məqsədlə biz antisens transkripsiya səviyyələrini dəyişdirdiyi bilinən maya mutantlarında əldə edilmiş mövcud NET-seq məlumatlarından istifadə etdik, yəni. SET2, RCO1, EAF3SET1 silmə suşları (7) və qruplaşdırılmış genlər 300 bp pəncərəsi üzərində antisens transkripsiyası artıb, azalıb və ya dəyişməyib. Şəkil 1A-da təqdim olunan beş sinfi təşkil edən 5183 gen arasından vəhşi tiplə müqayisədə mutant ştammda təsnifatı necə dəyişdikləri əsasında üç yeni gen qrupu seçdik. Genlərin ən azı iki sinifə yüksəldiyi “artırılmış” gen qrupu seçildi (məsələn, ikinci sinifdən dördüncü sinifə, Şəkil 1A-da). Genlərin ən azı iki sinif aşağı düşdüyü ikinci qrup seçildi (“azalmış” qrup). Üçüncü qrupda təsnifatı dəyişdirməyən genlər ("dəyişməmiş" qrup) var idi. Hər bir mutant ştamm üçün hər qrupdakı genlərin sayı Şəkil 6-da sol tərəfdəki panellərdə göstərilmişdir. Xüsusilə nəzərə alın ki, üç qrup dörd mutantın hər birində fərqlidir (bax: müvafiq n dəyərləri sol panellər), çünki antisens transkripsiyası onlar arasında diferensial şəkildə dəyişdirildi, yəni. bir mutantda "artan" kimi təsnif edilən bir gen digərində "azalmış" və ya "dəyişməmiş" kimi təsnif edilə bilər. Genom miqyasında hiss ifadəsinin səviyyələri ümumiyyətlə dörd mutant və yabanı tip arasında oxşar idi. eaf3Δ, burada bir gendə hiss transkripsiyasının orta səviyyəsi vəhşi tipin dörddə üçü idi. Ən əsası və əvvəlki təhlillərimizi dəstəkləmək üçün, silmə mutantlarının vəhşi tipə nisbətən 300 bp pəncərəsində məna və antisens transkripsiyasının dəyişməsi arasındakı korrelyasiya bütün dörd suş üçün eyni dərəcədə kiçik idi (Şəkil 6) - yəni. antisens transkripsiyasında dəyişikliklər hiss transkripsiyasının artması və ya azalması ilə əlaqəli deyildi.

Mutasyondan sonra antisens transkripsiya səviyyələrində dəyişikliklər nukleosomların tutulmasında və xromatin modifikasiyasında gözlənilən dəyişikliklərlə eyni vaxtda baş verir. (AD) Nükleosomların tutulması səviyyələrində orta dəyişiklik, H3K14ac, H3K36me3 və H4ac (A) set2Δ (B) rco1Δ (C) eaf3Δ və (D) set1Δ, vəhşi tiplə müqayisədə. Üç gen qrupu təhlil edildi, bunlar mutasiyadan sonra 300 bp pəncərəsində antisens transkripsiyası səviyyəsinin necə dəyişməsi baxımından fərqlənirdi. Müsbət dəyər vəhşi tipə nisbətən mutant ştammda xüsusi səviyyənin yüksəldiyini göstərir. Qara şaquli xətlər göstərir P- Wilcoxon rank sum testindən istifadə etməklə müəyyən edilmiş göstərilən nöqtələrdə gen qrupları arasındakı dəyərlər (* göstərir P < 0,05, **P < 0.01, ***P < 0,001). Boz şaquli qutu tipik olaraq +1 nukleosomunun tutduğu bölgəni təmsil edir. H3K14ac və H3K36me3 səviyyələri Materiallar və Metodlarda müzakirə edildiyi kimi nukleosomların tutulması səviyyələrinə normallaşdırıldı. Ən sağ tərəfdəki panellər 300 bp pəncərəsində sensasiya transkripsiyasındakı dəyişiklikləri vəhşi tipə nisbətən dörd mutantın hər biri üçün antisens transkripsiyasında dəyişiklikləri müqayisə edən səpələnmə qrafiklərini göstərir. Mətndə müzakirə edildiyi kimi bütün 5183 gen daxildir. Spearman rütbəsi korrelyasiya əmsalları göstərilir (r). NET-seq məlumatları (7), nukleosomların tutulması, H3K14ac və H3K36me3 məlumatları (38) və H4ac məlumatları (39)-dan əldə edilmişdir.

Mutasyondan sonra antisens transkripsiya səviyyələrində dəyişikliklər nukleosomların tutulmasında və xromatin modifikasiyasında gözlənilən dəyişikliklərlə eyni vaxtda baş verir. (AD) Nükleosomların tutulması səviyyələrində orta dəyişiklik, H3K14ac, H3K36me3 və H4ac (A) set2Δ (B) rco1Δ (C) eaf3Δ və (D) set1Δ, vəhşi tiplə müqayisədə. Üç gen qrupu təhlil edildi, bunlar mutasiyadan sonra 300 bp pəncərəsində antisens transkripsiyası səviyyəsinin necə dəyişməsi baxımından fərqlənirdi. Müsbət dəyər vəhşi növə nisbətən mutant ştammda xüsusi səviyyənin yüksəldiyini göstərir. Qara şaquli xətlər göstərir P- Wilcoxon rank sum testindən istifadə etməklə müəyyən edilmiş göstərilən nöqtələrdə gen qrupları arasındakı dəyərlər (* göstərir P < 0,05, **P < 0.01, ***P < 0,001). Boz şaquli qutu tipik olaraq +1 nukleosomunun tutduğu bölgəni təmsil edir. H3K14ac və H3K36me3 səviyyələri Materiallar və Metodlarda müzakirə edildiyi kimi nukleosomların tutulması səviyyələrinə normallaşdırıldı. Ən sağ tərəfdəki panellər 300 bp pəncərəsində sensasiya transkripsiyasındakı dəyişiklikləri vəhşi tipə nisbətən dörd mutantın hər biri üçün antisens transkripsiyasındakı dəyişiklikləri müqayisə edən səpələnmə qrafiklərini göstərir. Mətndə müzakirə edildiyi kimi bütün 5183 gen daxildir. Spearman rütbəsi korrelyasiya əmsalları göstərilir (r). NET-seq məlumatları (7), nukleosomların tutulması, H3K14ac və H3K36me3 məlumatları (38) və H4ac məlumatları (39)-dan əldə edilmişdir.

Nükleosomların tutulması və histon modifikasiyalarının bu üç fərqli qrup arasında necə müqayisə edildiyini nəzərdən keçirdik. ChIP-seq məlumatlarından (H3K36me3 üçün göstərilmir) nukleosomların tutulması səviyyələri, H3K14ac və H3K36me3 əldə etdik. set2Δ bu modifikasiyadan məhrum olan və ya rco1Δ) ( 38). H4ac səviyyələri ChIP-çip məlumatlarından idi (mövcuddur set2Δrco1Δ yalnız suşlar) ( 39). Təxmin etdik ki, mutasiyadan sonra antisens transkripsiyası artan genlər, antisens transkripsiyasının azaldığı genlərlə müqayisədə nukleosomların tutulması və H3K14ac-da daha çox artıma, H3K36me3 isə daha çox azalmaya meylli olacaq. Vəhşi tip ştammlarla müqayisədə mutantdakı dəyişikliklər fərq planları kimi göstərilir (Şəkil 6A-D). Dəyişməmiş gen qrupu üçün fərq süjetləri üzərində antisens transkripsiyası artmış və ya azalmış gen qrupları üçün fərq süjetləri üst-üstə düşür. Maraqlıdır ki, müşahidə edilən dəyişikliklər bizim əvvəlki təhlilimizlə uyğun gəlirdi (Şəkil 1-4). Məsələn, ildə set2Δ gərginlik, antisens transkripsiyasının artması və ya azalması proqnozlaşdırıldığı kimi promotorda və gen bədənində nukleosomların yerləşməsini dəyişdi. Antisens transkripsiyası səviyyələrindəki dəyişikliklərin mutant suşlarda asetilləşmə və H3K36me3 üzərində qarşılıqlı təsiri olduğu aşkar edilmişdir (Şəkil 6D). Bununla belə, qeyd edirik ki, xromatində dəyişikliklər müxtəlif mutant suşlarda genlərin müxtəlif bölgələrində olur. Üçün set1 silmə gərginliyi, məsələn, biz promotorda nukleosomların tutulmasında və H3K36me3-də dəyişiklikləri müşahidə etdik, lakin gen bədəni üzərində deyil. Bunun əksinə olaraq, nukleosomların tutulmasında dəyişikliklər hər iki sens promotorunda müşahidə edilmişdir gen bədənində set2Δ, rco1Δeaf3Δ, H3K36me3 isə hər iki bölgədə dəyişdi eaf3Δ. Bu, Set1-in digər mutant suşlarda gen bədənində müşahidə olunan bəzi antisens-transkripsiya ilə əlaqəli dəyişikliklərə vasitəçilik etmək üçün tələb oluna biləcəyini göstərir. Bu təhlil, antisens transkripsiyasının hiss transkripsiyası ilə müqayisədə unikal xromatin mühiti ilə əlaqəli olduğu fərziyyəmizi dəstəkləyir. Əvvəlki bioinformatika və eksperimental yoxlama ilə birlikdə götürdükdə məlumatlarımız artan antisens transkripsiya səviyyələrinin H3K36me3 səviyyələrini azaltmaqla yanaşı, nukleosomların tutulmasının və histon asetilləşməsinin artmasına səbəb olduğu modeli dəstəkləyir.


İstinadlar

Bir JJ et al (2008) Uzun 3′ UTR BDNF mRNA-nın onurğa morfologiyasında və hipokampal neyronlarda sinaptik plastisiyada fərqli rolu. Hüceyrə 134(1):175–187

Beltran M et al (2008) Təbii antisens transkripti, Snail1-in yaratdığı epiteliya-mezenximal keçid zamanı Zeb2/Sip1 gen ifadəsini tənzimləyir. Genes Dev 22(6):756-769

Berkovits BD, Mayr C (2015) Alternativ 3′ UTR-lər membran zülalının lokalizasiyasını tənzimləmək üçün iskele rolunu oynayır. Təbiət 522(7556):363–367

Carrieri C et al (2012) Uzun kodlaşdırmayan antisens RNT, daxil edilmiş SINEB2 təkrarı vasitəsilə Uchl1 tərcüməsini idarə edir. Təbiət 491(7424):454–457

Chen JJ et al (2005) İnsan cis-kodlanmış məna-antisense transkriptlərinin koordinat ifadəsinin və təkamülünün genom miqyasında təhlili. Trendlər Genet 21(6):326–329

Colgan DF, Manley JL (1997) mRNA poliadenilasiyasının mexanizmi və tənzimlənməsi. Genes Dev 11(21):2755–2766

David L et al (2006) Maya genomunda yüksək keyfiyyətli transkripsiya xəritəsi. Proc Natl Acad Sci USA 103(14):5320–5325

de la Mata M, Kornblihtt AR (2006) RNT polimeraza IIC-terminal domeni SRp20 ilə alternativ birləşmənin tənzimlənməsinə vasitəçilik edir. Nat Struct Mol Biol 13(11):973–980

Derti A et al (2012) Beş məməlidə poliadenilləşmənin kəmiyyət atlası. Genom Res 22(6):1173-1183

Di Giammartino DC, Nishida K, Manley JL (2011a) Alternativ poliadenilləşmənin mexanizmləri və nəticələri. Mol Cell 43(6):853-866

Di Giammartino DC, Nishida K, Manley JL (2011b) Alternativ poliadenilasiyanın mexanizmləri və nəticələri. Mol Cell 43(6):853-866

Elkon R, Ugalde AP, Agami R (2013) Alternativ parçalanma və poliadenilləşmə: ölçü, tənzimləmə və funksiya. Nat Rev Genet 14(7):496–506

Faghihi MA və digərləri (2010) MikroRNT funksiyasının təbii antisens transkript vasitəçiliyi ilə inhibə edilməsi üçün sübut. Genom Biol 11(5):R56

Fu YG və digərləri (2011) Yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığı ilə insan döş xərçəngi və normal hüceyrələr arasında tandem 3' UTR-lərin genom geniş profilinin diferensiallaşdırılması. Genom Res 21(5):741–747

Grinchuk OV, Motakis E, Kuznetsov VA (2010) 17q11.2-də TNFAIP1/POLDIP2-nin kompleks məna-antisense arxitekturası döş xərçənginin inkişafında iştirak edən yeni transkripsiya struktur-funksional gen modulunu təmsil edir. BMC Genomics 11:S9

Gunderson SI, Polycarpou-Schwarz M, Mattaj IW (1998) U1 snRNP, U1 70 K və poli(A) polimeraza arasında birbaşa qarşılıqlı təsir vasitəsilə pre-mRNA poliadenilasiyasını maneə törədir. Mol Hüceyrə 1(2):255-264

Hsin JP, Manley JL (2012a) RNT polimeraza II CTD transkripsiya və RNT emalını əlaqələndirir. Genes Dev 26(19):2119–2137

Hsin JP, Manley JL (2012b) RNT polimeraza II CTD transkripsiya və RNT emalını əlaqələndirir. Genes Dev 26(19):2119–2137

Hu X et al (2009) Döş xərçəngi alt tipləri ilə əlaqəli genetik dəyişikliklər və onkogen yollar. Mol Xərçəng Res 7(4):511-522

Hu S, Wang X, Shan G (2016) Alu elementinin lncRNA-ya daxil edilməsi alternativ splicingin primata xüsusi modulyasiyasına gətirib çıxarır. Nat Struct Mol Biol 23(11):1011–1019

Ikura T et al (2000) TIP60 histon asetilaza kompleksinin DNT təmirində və apoptozda iştirakı.Hüceyrə 102(4):463–473

Jao CY, Salic A (2008) Klik kimyasından istifadə edərək in vivo RNT transkripsiyasını və dövriyyəsini araşdırmaq. Proc Natl Acad Sci USA 105(41):15779–15784

Ji Z, Tian B (2009) Müxtəlif hüceyrə növlərindən pluripotent kök hüceyrələrin yaradılmasında alternativ poliadenilləşmə yolu ilə mRNA-ların 3′ tərcümə olunmamış bölgələrinin yenidən proqramlaşdırılması. PLoS ONE 4(12):e8419

Ji Z et al (2009) Siçan embrion inkişafı zamanı alternativ poliadenilasiya yolu ilə mRNA-nın 3 'tərcümə edilməmiş bölgəsinin proqressiv uzanması (cild 106, səh 7028, 2009). Proc Natl Acad Sci USA 106(23):9535

Ji Z et al (2011) Transkripsiya fəaliyyəti alternativ parçalanma və poliadenilasiyanı tənzimləyir. Mol Syst Biol 7:534

Kaida D et al (2010) U1 snRNP pre-mRNA-ları vaxtından əvvəl parçalanma və poliadenilləşmədən qoruyur. Təbiət 468(7324):664–668

Katayama S və digərləri (2005) Məməli transkriptomunda antisens transkripsiyası. Elm 309(5740):1564–1566

Li H, Durbin R (2009) Burrows-Wheeler çevrilməsi ilə sürətli və dəqiq qısa oxunuş. Bioinformatika 25(14):1754–1760

Licatalosi DD, Darnell RB (2010) Yeni nəsil ardıcıllıq RNT emalının tətbiqləri və onun tənzimlənməsi: bioloji şəbəkələrə qlobal anlayışlar. Nat Rev Genet 11(1):75–87

Loeb LA (2011) İnsan xərçəngləri mutator fenotipləri ifadə edir: mənşəyi, nəticələri və hədəflənməsi. Nat Rev Xərçəng 11(6):450–457

Lopez-Otin C et al (2013) Yaşlanma əlamətləri. Hüceyrə 153(6):1194–1217

Mayr C, Bartel DP (2009) Alternativ parçalanma və poliadenilləşmə ilə 3′ UTR-lərin geniş şəkildə qısaldılması xərçəng hüceyrələrində onkogenləri aktivləşdirir. Hüceyrə 138(4):673–684

Millevoi S, Vagner S (2010) Eukaryotik pre-mRNA 3′ son emal tənzimlənməsinin molekulyar mexanizmləri. Nuklein turşuları Res 38(9):2757–2774

Moskalev AA et al (2013) Koch kimi meyarlar prizmasından qocalmada DNT zədələnməsinin və təmirinin rolu. Yaşlanma Res Rev 12(2):661–684

Ni T et al (2013) Dəyişdirilmiş PA-seq strategiyası ilə aşkar edilən müxtəlif insan toxumalarının fərqli poliadenilasiya mənzərələri. BMC Genomics 14:615

Onodera CS et al (2012) Gücləndirici ilə əlaqəli antisens transkripsiyası vasitəsilə gen izoformunun spesifikliyi. PLoS ONE 7(8):e43511

Ozsolak F et al (2010) Maya və insanda hərtərəfli poliadenilasiya sahəsinin xəritələri geniş yayılmış alternativ poliadenilasiyanı aşkar edir. Hüceyrə 143(6):1018–1029

Park JY et al (2011) Ürək hipertrofiyası və inkişafında mRNA izoform ifadəsinin müqayisəli təhlili çoxlu post-transkripsiya tənzimləyici modulları aşkar edir. PLoS ONE 6(7):e22391

Paulsen MT et al (2014) Bru-Seq və BruChase-Seq-in RNT sintezinin və sabitliyinin genom miqyasında qiymətləndirilməsi üçün istifadəsi. Metodlar 67(1):45–54

Pelechano V, Steinmetz LM (2013) Antisens transkripsiyası ilə KODLAMAYAN RNT Gen tənzimlənməsi. Nat Rev Genet 14(12):880–893

Pinto PAB et al (2011) polo poliadenilasiya siqnal seçimində RNT polimeraza II kinetikası. EMBO J 30(12):2431–2444

Quinlan AR, Hall IM (2010) BEDTools: genomik xüsusiyyətləri müqayisə etmək üçün çevik kommunal dəst. Bioinformatika 26(6):841–842

Reijns MA et al (2012) DNT-dən ribonukleotidlərin enzimatik çıxarılması məməlilərin genomunun bütövlüyü və inkişafı üçün vacibdir. Hüceyrə 149(5):1008–1022

Sandberg R et al (2008) Proliferasiya edən hüceyrələr qısaldılmış 3 'tərcümə edilməmiş bölgə və daha az mikroRNT hədəf sahələri ilə mRNA-ları ifadə edir. Elm 320(5883):1643–1647

Spies N et al (2009) Poliadenilasiya yerləri və ekzonlar ətrafında qərəzli xromatin imzaları. Mol Hüceyrə 36(2):245-254

Squatrito M, Gorrini C, Amati B (2006) Tip60 DNT zədələnməsinə reaksiya və böyüməyə nəzarət: bir HAT-da çoxlu fəndlər. Trends Cell Biol 16(9):433–442

Thorvaldsdottir H, Robinson JT, Mesirov JP (2013) İnteqrativ genomika izləyicisi (IGV): yüksək performanslı genomik məlumatların vizuallaşdırılması və kəşfiyyatı. Qısa Bioinform 14(2):178–192

Vanden Bempt I, Drijkoningen M, De Wolf-Peeters C (2007) HER2-müsbət döş xərçənginin altında yatan genotipik dəyişikliklərin mürəkkəbliyi: onun klinik heterojenliyinin izahı. Curr Opin Oncol 19(6):552–557

Wallace SS, Murphy DL, Sweasy JB (2012) Əsas eksizyon təmiri və xərçəngi. Xərçəng Lett 327(1-2):73-89

Xie Y et al (2017) İnsan pluripotent kök hüceyrələrində yüksək effektiv gen nokaut üçün epizomal vektor əsaslı CRISPR/Cas9 sistemi. Sci Rep 7(1):2320

Yelin R et al (2003) İnsan genomunda antisens transkripsiyasının geniş yayılması. Nat Biotechnol 21(4):379–386

Yu M et al (2015) RNT polimeraza II ilə əlaqəli faktor 1, dayandırılmış RNT polimeraz II-nin sərbəst buraxılmasını və fosforlaşmasını tənzimləyir. Elm 350(6266):1383–1386


Eksperimental prosedurlar

Antisens transkript xarakteristikası

Ustilago maydis antisens transkriptləri Ho tərəfindən müəyyən edilmişdir və b. (2007) və Morrison və b. (2012) təmsil olunan 5' EST-nin təhlili vasitəsilə U.maydis Cücərən (T11) və hərəkətsiz (TDO) teliosporlardan yaradılmış cDNT kitabxanaları (Sacadura və Saville, 2003 Ho və b., 2007), tam mühitdə (HCM), karbon aclığı mühitində (MMC) və ya azot açlığı mühitində (MMN Ho) yetişdirilmiş haploid hüceyrələr və b., 2007), iplə böyüdülmüş məcburi diploidlər (D12 Nugent) və b., 2004) və ya filamentli dikaryotik miseliya (DIK Morrison və b., 2012 ).

Antisens transkriptlərini təmsil edən klonlar 3' ardıcıllığı üçün seçildi. Plazmid DNT-nin təcrid edilməsi Nugent-də göstərilən prosedura əməl etdi və b. (2004). Antisens transkriptinin 3' ucundan ardıcıllıq M13_R və ya dT primerlərindən istifadə edilməklə həyata keçirilmişdir.19V (Cədvəl S5). Nukleotid ardıcıllığı Big Dye Terminator v3.1 kimyası (Tətbiqi Biosistemlər) istifadə edilməklə müəyyən edilib və reaksiya məhsulları ABI PRISM 3730 DNT Analizatoru (Tətbiqi Biosistemlər) istifadə edilməklə təhlil edilib.

Morrisonda göstərildiyi kimi çirkləndirici vektor ardıcıllıqlarını aradan qaldırmaq üçün yeni EST-lər redaktə edilmişdir və b. (2012), istisna olmaqla, bütün ardıcıllıqlar poli(A) quyruğunun olması üçün əl ilə yoxlanılıb. Antisens transkriptlərini təmsil edən 5' və 3' EST-lər blastn istifadə edərək U.maydis "Umaydis_contigs.fas" xromosom yığım faylı (sonuncu dəfə 8 sentyabr 2011-ci ildə dəyişdirilib) və ya U.maydis açıq oxu çərçivəsi (ORF) faylı ‘Umaydis_valid_orf.fas’ (sonuncu dəfə 24 may 2011-ci ildə dəyişdirilib). Bu FASTA (.fas) faylları Münhen Protein Ardıcıllığı Məlumat Mərkəzindən (MIPS) endirilib. U.maydis verilənlər bazası (MUMDB Mewes və b., 2008). Antisens transkriptlərini təmsil edən klonlardan alınan bütün 5' və 3' EST-lərin MUMDB geninin antisens zəncirinin olduğu təsdiqləndi. Bundan əlavə, antisens transkriptinin 5' və 3' uclarını təmsil edən EST cütlərini uyğunlaşdırmaqda U.maydis genom və ya U.maydis ORF-lər, antisens transkriptlərinin xüsusiyyətləri müəyyən edilmişdir, o cümlədən: antisens transkriptinin uzunluğu, üst-üstə düşmənin növü və uzunluğu (ORF ilə bağlı) və tərkibində intron olan antisens transkriptlər. Tərkibində intron olan antisens transkriptləri əl ilə təsdiqləndi və birləşmə yerinin nukleotidləri qeydə alındı. Tam uzunluqlu NAT-lar daxilində ehtimal olunan ORF-lər aşkar edilmiş və Geneious Pro v5.6.5 (Biomatters) istifadə edərək onların müvafiq amin turşusu ardıcıllığını proqnozlaşdırmaq üçün istifadə edilmişdir. Nəticədə ehtimal olunan zülallar E< 1e-5 gözləmə həddi ilə NCBI-nin lazımsız protein verilənlər bazasına qarşı blastp axtarışlarında (2012-ci ilin oktyabrında keçirilmiş) istifadə edilmişdir. Hər bir zülal üçün yalnız ən yaxşı blastp vuruşu bildirildi. Bundan əlavə, ehtimal olunan zülallar SignalP v4.0 (Petersen) istifadə edərək N-terminal sekresiya siqnalları üçün yoxlanılıb. və b., 2011), TargetP v1.1 (Emanuelsson və b., 2000) və ProtComp v9.0 (Softberry). Yalnız hər üç proqram tərəfindən hüceyrədənkənar yerləşdiyi proqnozlaşdırılan zülallar qeydə alınıb.

Plazmid və deformasiya konstruksiyaları

Bütün prosedurlar, başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə, istehsalçılar tərəfindən təklif edildiyi kimi həyata keçirildi. Bu tədqiqatda istifadə olunan plazmidlər Cədvəl S6-da verilmişdir. The U.maydis ifadə vektoru pCM768 inteqrasiya etməyən vektordur, tərkibində a U.maydis avtonom replikasiya ardıcıllığı (ARS), higromisin B müqaviməti (Hyg R) kaseti və U.maydis qliseraldehid-3-fosfat dehidrogenaz promotoru (Pumgapd) çoxlu klonlama sahəsinə daxil edilmiş genlərin ifadəsini asanlaşdırır (Kojic və Holloman, 2000). Avtonom replikasiya edən vektordan antisens transkriptlərini ifadə etmək üçün genomun antisens transkriptinə uyğun olan bölgəsi (tam uzunluqlu cDNT analizi ilə müəyyən edilir) 5' uclarında məhdudlaşdırıcı endonükleaz tanınma ardıcıllığını təqdim edən primerlərdən istifadə etməklə PCR ilə gücləndirildi (Cədvəl S5) . PCR fraqmenti və pCM768 məhdudlaşdırıcı endonükleazlarla həzm olundu və təmizləndi. Xəttiləşdirilmiş pCM768 Antarktik Fosfataz (New England BioLabs) ilə müalicə olundu və təmizlənmiş həzm edilmiş PCR fraqmentinə bağlandı. Nəticədə U.maydis antisens transkript ifadə vektoru Subklonlaşdırma Efficiency DH5α Səlahiyyətli Hüceyrələrə (Invitrogen) çevrildi. altı U.maydis antisens transkript ifadə vektorları bu yanaşmadan istifadə etməklə qurulmuşdur (Cədvəl S6). Antisens transkriptini kodlayan genom bölgəsi üçün düzgün nukleotid ardıcıllığı və oriyentasiya ardıcıllıqla təsdiqləndi. Bütün ardıcıllıq reaksiyaları pgapd_79_F primerindən istifadə etməklə həyata keçirilmişdir (Cədvəl S5). FB1 və ya FB2 protoplastları əvvəllər Morrisonda təsvir edilən Yee (1998) protokolunun modifikasiyasından istifadə edərək antisens ifadə vektoru ilə transformasiya edilmişdir. və b. (2012). Genomik DNT Hoffman və Winston (1987) tərəfindən göstərilən protokoldan istifadə edərək ehtimal olunan transformantlardan təcrid edilmişdir. Uğurlu U.maydis transformantlar PCR istifadə edərək təsdiq edilmişdir. PCR-lər pCM768_Hyg_F və pCM768_Hyg_R və ya P primerlərindən istifadə edərək Hyg R kasetinin bir bölgəsini gücləndirmək üçün yerinə yetirildi.umgapd-pgapd_79_F primerindən və antisens transkriptinə uyğun genomik bölgəni klonlaşdırmaq üçün istifadə edilən əks primerdən istifadə edərək idarə olunan antisens transkript (Cədvəl S5). Bundan əlavə, antisens transkript ifadəsi strand-spesifik yarı kəmiyyətli RT-PCR vasitəsilə təsdiq edilmişdir (aşağıdakı transkript ifadə analizinə baxın). The U.maydis Antisens transkript ifadə analizləri üçün yaradılmış FB1- və FB2-dən alınmış ştamlar Cədvəl 4-də verilmişdir. Hər bir halda bir neçə ştam müəyyən edilmişdir.

Gərginləşdirmək Müvafiq genotip Mənbə
Ustilago maydis
518 a2 b2 Holliday (1961)
521a a Genom ardıcıllığı üçün istifadə olunan istinad ştammı.
a1 b1 Holliday (1961)
d132 a1/a2 b1/b2 Kronstad və Leonq (1989)
FB1 a1 b1 Banuett və Herskowitz (1989)
FB2 a2 b2 Banuett və Herskowitz (1989)
FBD12 a1/a2 b1/b2 Banuett və Herskowitz (1989)
SG200 a1 mfa2 bE1bW2 Kämper və b. ( 2006 )
FB1 [pCM768] a1 b1 [pCM768] Bu iş
FB2 [pCM768] a2 b2 [pCM768] Bu iş
FB2 [pCMas-um02114] a2 b2 [pCMas-um02114] Bu iş
FB1 [pCMas-um02125] a1 b1 [pCMas-um02125] Bu iş
FB1 [pCMas-um02150] a1 b1 [pCMas-um02150] Bu iş
FB1 [pCMas-um02151] a1 b1 [pCMas-um02151] Bu iş
FB2 [pCMas-um10002] a2 b2 [pCMas-um10002] Bu iş
FB2 [pCMas-um12232] a2 b2 [pCMas-um12232] Bu iş
SG200Δum02151 a1 mfa2 bE1bW2 Δum02151 Bu iş
SG200ΔPas-um02151 a1 mfa2 bE1bW2 ΔPas-um02151 Bu iş
SG200ΔncRNA1 a1 mfa2 bE1bW2 ΔncRNA1 Morrison və b. ( 2012 )
Ustilago hordei
Uh 4857-4 (ləqəb Uh364)a a Genom ardıcıllığı üçün istifadə olunan istinad ştammı.
MAT-1 Astar və b. ( 2004 )
Uh 4857-5 (ləqəb Uh365) MAT-2 Astar və b. ( 2004 )

Ustilago maydis delesiya ştammları PCR-əsaslı yanaşmadan sonra maraq odağının Hyg R kaseti ilə əvəz edilməsi ilə yaradılmışdır (Kämper, 2004). Silmək üçün um02151, 1,1 kb fraqmentlər yan um02151 sol cinahı gücləndirmək üçün um02151_Left_F və um02151_Left_R_SfiI primerlərindən, sağ cinahı gücləndirmək üçün isə um02151_Right_F_SfiI və um02151_Right_R primerlərindən istifadə etməklə PCR ilə gücləndirilmişdir (Cədvəl S5). Üçün ehtimal olunan tənzimləyici elementləri silmək as-um02151, yuxarıda 0,5 kb bölgə as-um02151 (Sas-um02151) silinmək üçün hədəflənmişdi. pA_Left_F və pA_Left_R_SfiI və pA_Right_F_SfiI və pA_Right_R primerləri 1.1 kb cinah bölgələrini P-yə gücləndirmək üçün istifadə edilmişdir.as-um02151 (Cədvəl S5). PCR fraqmentləri SfiI ilə həzm olundu və Morrisonda təsvir edildiyi kimi Hyg R kasetinə bağlandı. və b. (2012). 4,8 kb liqasiya məhsulları um02151_Nested_F və um02151_Nested_R və ya pA_Nested_F və pA_Nested_R (Cədvəl S5) primerlərindən istifadə edilərək gücləndirilib və pCR-XL-TOPO (Invitrogen)-ə klonlaşdırılaraq pCR-XL-XL-TO2 və pCR-1XL-TO2 verir.as-um02151 (Cədvəl S6). Silinmə konstruksiyalarını daşıyan bu vektorlar One Shot Chemically Competent TOP10-a çevrildi. Escherichia coli hüceyrələr (invitrogen). Nukleotid ardıcıllığı pMF1_HygOUT_F və pMF1_HygOUT_R primerlərindən istifadə etməklə ardıcıllıqla yoxlanılıb. The um02151 və ya Pas-um02151 silinmə konstruksiyaları um02151_Nested_F və um02151_Nested_R və ya pA_Nested_F və pA_Nested_R primerlərindən istifadə etməklə PCR ilə gücləndirilmiş və sonra QIAquick Gel Təmizləmə dəsti (Qiagen) ilə təmizlənmişdir. U.maydis transformasiya. U.maydis SG200 protoplastları çevrildi. Ehtimal olunan transformantları müəyyən etmək üçün, Hyg R kasetinin bir hissəsini və yan tərəfin sahəsini ehtiva edən bölgəni gücləndirmək üçün PCR-lər aparıldı. um02151 və ya Pas-um02151 lokus, inteqrasiya sahəsindən kənarda. Bu ekranlar üçün PCR um02151_Left_F və pMF1_HygOUT_F və pMF1_HygOUT_R və um02151_Right_R primer cütləri və ya pA_Left_F və pMF1_HygOUT_F və pAMFORT_Hy (pAMFOR_Hy) primer cütlərindən istifadə etməklə aparılıb. Silinmələri daşıyan bir neçə suşlar um02151 və ya Pas-um02151 PCR ilə müəyyən edilmişdir.

Göbələk suşları, böyümə şəraiti və istehsalı U.maydis hüceyrə növləri

Ustilago maydisU. hordei Bu işdə istifadə edilən suşlar Cədvəl 4-də verilmişdir. EST məlumatlarını dəstəkləmək üçün aparılan RT-PCR-lər üçün, U.maydis haploid suşları FB1 və FB2 Ho-da təsvir olunduğu kimi tam (CM) və ya mənfi azot (MN) mühitində yetişdirilmişdir. və b. (2010), FBD12 diploidlərinin və ya FB1 × FB2 dikaryonlarının filamentli böyüməsi Morrisonda təsvir edildiyi kimi induksiya edilmişdir. və b., (2012) və teliosporlar qarğıdalının yetkin şişlərindən yığılmışdır (Z. mays L. ‘Golden Bantam’) 518×521 ilə yoluxmuşdur. Kob infeksiyası, teliosporun yığılması və teliosporun saxlanması Morrisonda təsvir edildiyi kimi həyata keçirilmişdir və b., (2012). Bütün digər təcrübələr üçün: U.maydis haploid hüceyrələr gecə ərzində YEPS mühitində yetişdirildi (1% maya ekstraktı, 2% w/v pepton, 2% w/v saxaroza 250 rpm, 28°C). U.maydis teliosporlar Zahiridə təsvir edilən protokolu dəyişdirərək cücərməyə vadar edildi və b. (2005). Fərqlərə aşağıdakılar daxildir: cücərmə 10 ml YEPS mühiti olan, 160 μg ml -1 streptomisin sulfat (90 rpm, 28°C) ilə əlavə edilmiş 250 ml Erlenmeyer şüşələrində silkələməklə induksiya edilmişdir. Cücərən teliosporlar cücərmə induksiyasından (PIG) ​​16, 18, 24 və ya 40 saat sonra sentrifuqalama (400 g, 5 dəq, RT).

Ustilago hordei haploid suşları Uh364 və Uh365 və arpa (Hordeum vulgare Uh364×Uh365 ilə yoluxmuş L. ‘Odessa’) başları Guus Bakkerendən (Agriculture & Agri-Food Canada, Pacific Agri-Food Research Centre, BC, Kanada) əldə edilmişdir. Haploid hüceyrələr YEPS mühitində (250 rpm, 22°C) ~ 40 saat yetişdirildi. Qarışıqları U. hordei 2007 və ya 2009-cu illərdə Manitoba və şərq Saskaçevanda tarla nümunələrindən toplanmış teliosporlar James Menzies (Agriculture & Agri-Food Canada, Taxıl Araşdırma Mərkəzi, MB, Kanada) tərəfindən təmin edilmişdir. Bitki böyüməsi şərtləri və patogenez təhlilləri Morrisonda təsvir olunan protokollara əsasən aparılmışdır və b. ( 2012 ).

RNT hasilatı, S1 nukleazasının kəsilməsi və əks transkripsiya

EST məlumatlarını dəstəkləmək üçün aparılan RT-PCR-lər üçün RNT ekstraksiyaları CM və ya MN-də böyüdülmüş qranullaşmış haploid hüceyrələr və ya plitələrdən yığılmış filamentli diploidlər və ya dikaryonlar üzərində aparılmışdır. Haploid və ya miselial hüceyrə növlərindən olan toxuma maye azotda dondurulmuş və havan və pestle istifadə edərək homogenləşdirilmişdir. Vakuumda qurudulmuş teliosporlar Zahiridə təsvir olunan protokola uyğun olaraq pozuldu və b. (2005). Bütün digər təcrübələr üçün U.maydis haploid hüceyrələr, U.maydis cücərən teliosporlar və ya U. hordei haploid hüceyrələr sentrifuqa üsulu ilə qranullara çevrildi. Bu hüceyrələr və ya U. hordei teliosporlar (tarla nümunələrindən toplanmış), TRIzol reagentində (Invitrogen) yenidən dayandırılıb və tərkibində Lysing Matrix C (MP Biomedicals) olan 2 ml vintli qapaqlı borulara köçürülüb. Hüceyrələr Zahiridə təsvir olunduğu kimi pozulub və b. (2005). Alternativ olaraq, U. hordei-yoluxmuş arpa başları RNT ekstraksiyasından dərhal əvvəl maye azotda üyüdülmüş və TRIzol reagentində (Invitrogen) yenidən dayandırılmışdır. Hüceyrə pozulduqdan sonra RNT istehsalçının protokoluna uyğun olaraq TRIzol reagentindən (Invitrogen) istifadə edilərək təcrid olundu. RNT nümunələri çökdürülmüş, DNase I ilə müalicə edilmiş, genomik DNT ilə çirklənmə üçün yoxlanılmış və Morrisonda təsvir olunduğu kimi keyfiyyət qiymətləndirilmişdir. və b. ( 2012 ).

Birinci zəncirli sintez reaksiyaları üçün şablon kimi 200 ng DNase I ilə işlənmiş ümumi RNT istifadə edilmişdir. Bu reaksiyalar oliqo-d(T) ilə hazırlanmışdır.16, sensasiyaya xas primer, antisens spesifik primer, etiketli strand spesifik primer və ya su (yanlış astarlanmanı nəzərə almaq üçün). Primerlər, Ho-da göstərilən protokola uyğun olaraq Primer3 (Rozen və Skaletsky, 2000) istifadə edərək, məna və ya antisens spesifik birinci zəncir sintez reaksiyaları üçün nəzərdə tutulmuşdur. və b. (2010). Strand-spesifik primer ardıcıllıqları Cədvəl S5-də verilmişdir. Bütün birinci zəncirli sintez reaksiyaları Ho-da göstərilən şərtlərlə TaqMan Gold RT-PCR dəsti (Applied Biosystems) istifadə edilməklə həyata keçirilmişdir. və b. (2010). Birinci zəncir sintezindən sonra cDNA DEPC ilə işlənmiş su ilə dörd qat (1:3) seyreltildi.

DsRNA-nı aşkar etmək üçün 2,5 μg DNase I ilə müalicə olunmuş ümumi RNT 30 dəqiqə ərzində 37°C-də S1 nukleaz həzm reaksiyalarında inkubasiya edilmişdir. Ayrı-ayrı reaksiyalarda S1 Nukleazının (Invitrogen) son konsentrasiyasına aşağıdakılar daxildir: 0, 0,01, 0,1 və ya 1 U μl -1 . Sonra, dsRNA fenol/xloroform ekstraktı edildi, NH ilə çökdürüldü4Ac/Ethanol/GlycoBlue Coprecipitant (Invitrogen) -20°C-də 60 dəqiqə ərzində və 15 µl DEPC ilə işlənmiş H-də yenidən dayandırılıb2O. Birinci zəncirli sintez reaksiyalarında şablon kimi iki mikrolitr S1 kəsilmiş RNT istifadə edilmişdir.

Transkript ifadə analizi

Transkript ifadəsini təhlil etmək üçün RT-PCR-lərdə istifadə olunan bütün primerlər Primer3 (Rozen və Skaletsky, 2000) istifadə edərək tərtib edilmişdir və Cədvəl S5-də verilmişdir.Hər RT-PZR üçün şablon kimi iki mikrolitr seyreltilmiş cDNT istifadə edilmişdir. Bütün RT-PCR-lər Amplitaq Gold DNT polimerazadan (Applied Biosystems) və 30 və ya 35 dövrədən istifadə etməklə həyata keçirilib. 30 dövrəli RT-PCR-lər yarı kəmiyyətli hesab olunurdu, çünki hər bir birinci zəncirli sintez reaksiyası üçün şablon kimi bərabər miqdarda ümumi RNT, hər bir RT-PZR üçün şablon kimi isə bərabər həcmdə cDNT istifadə edilmişdir. Son məhsul qarışığının dörddə biri agaroz geldə (1 × TAE) elektroforetik yolla ayrıldı və etidium bromidlə boyanma ilə vizuallaşdırıldı.

TaqMan kiçik yivli bağlayıcı (MGB) zondları Primer Express v2.0 (Tətbiqi Biosistemlər) istifadə edilməklə dizayn edilmişdir və Cədvəl S5-də verilmişdir. Hər kəmiyyət PCR (RT-qPCR) üçün şablon kimi iki mikrolitr seyreltilmiş cDNT istifadə edilmişdir. Bütün RT-qPCR-lər TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) istifadə edilərək yerinə yetirilmişdir. Məlumatlar Sequence Detection System Version 2.1 (Applied Biosystems) istifadə edərək ABI PRISM 7900HT-də toplanmış və təhlil edilmişdir. üçün nisbi transkript səviyyələri um02151 ΔΔCT metodundan istifadə edərək orta hesabla dörd müstəqil FB1 [pCM768] ştammı ilə müqayisədə səkkiz müstəqil FB1 [pCMas-um02151] ştammı üçün ölçüldü. Hər bir nümunə üçün üç texniki təkrarlama aparıldı və umgapd daxili standart kimi istifadə olunurdu.

CDNA uclarının RNT ligaza vasitəçiliyi ilə sürətli gücləndirilməsi (RLM-RACE)

RLM-RACE 5' və 3' uclarını müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir as-um02150, as-um02151as-uhor_03676. On mikroqram DNaz I ilə müalicə olunan ümumi RNT U.maydis (518×521) və ya U. hordei (Uh364×Uh365) teliosporlar FirstChoice RLM-RACE dəsti (Ambion) istifadə edərək işlənmiş və tərs transkripsiya edilmişdir. 5' və ya 3' adaptorları olan nəticədə cDNA-lar RACE üçün şablon kimi istifadə edilmişdir. 5' və ya 3' RACE məhsullarını əldə etmək üçün gen-spesifik xarici primerlərdən istifadə edən ardıcıl PCR-lər, ardınca gen-spesifik daxili primerlər (Cədvəl S5) yerinə yetirildi. Bütün PCR-lər HotStar HiFidelity DNT Polimerase (Qiagen) istifadə edərək aparılmışdır. Gücləndirilmiş fraqmentlər pDrive Klonlama Vektoruna (Qiagen) klonlaşdırıldı və çevrildi. E. coli (Qiagen EZ Səlahiyyətli Hüceyrələr). Transformantlar 100 μg ml -1 ampisilin, 50 μM izopropil β-d -tioqalaktopiranosid (IPTG) və 80 μg ml -1 5-bromo-4-xloro-3-indolil β-d -qalaktopirano (ks-d-qalaktopiranosi) olan LB agar plitələrinə örtülmüşdür. -gal), bu, rekombinant koloniyaların mavi/ağ skrininqini təmin etdi. 37°C-də gecə böyüməsindən sonra 24 nəfər E. coli hər transformasiyadan əldə edilən koloniyalar 100 μg ml -1 ampisilin ilə əlavə edilmiş LB mühiti olan 96 quyu mikrotitr plitələrinə əkilmiş və bir gecədə 250 rpm, 37 ° C-də böyüdülmüşdür. Hər bir bakteriya mədəniyyətinin hissələri ayrıca 96 quyuluq mikrotitr boşqabına bölündü və 15% qliserin içində -80°C-də dondurulmuş halda saxlandı. Qalan bakterial hüceyrələr sentrifuqalama yolu ilə toplandı və plazmid DNT Nugentdə göstərilən protokoldan istifadə edilərək təcrid olundu. və b., (2004). Nukleotid ardıcıllığı M13_ F primerindən istifadə etməklə müəyyən edilmişdir (Cədvəl S5).

Protein çıxarılması və analizi

Zülallar 15 ml YEPS mühitində və ya 250 μg ml -1 hygromycin B (Bioshop Canada) ilə əlavə edilmiş YEPS mühitində yetişdirilmiş haploid hüceyrələrdən çıxarılmışdır. Hüceyrələr sentrifuqa üsulu ilə qranullandı (5250 g, 5 dəq, 4°C) və bir dəfə 1 ml buz kimi soyuq zülal ekstraksiya tamponunda yuyulur [10 mM KCl, 5 mM MgCl2·6H2O, 400 mM saxaroza, 100 mM Tris-HCl pH 8.1, 10% v/v qliserin, 0.007% v/v β-merkaptoetanol, 1% v/v Proteaz inhibitor kokteyli (Sigma-Aldrich)]. Hüceyrələr 300 μl buz kimi soyuq zülal ekstraksiya tamponunda yenidən dayandırıldı, turşu ilə yuyulmuş şüşə muncuqları (425-600 μm, Sigma-Aldrich) olan 2 ml vidalı qapaqlı borulara köçürüldü və Zahiridə təsvir edildiyi kimi pozuldu. və b. (2005). Hüceyrə zibilləri sentrifuqa üsulu ilə peletlənmişdir (20 800 g, 5 dəq, 4°C), supernatant 1,5 ml mikrosentrifuqa borusuna köçürüldü və ümumi protein ekstraktı -20°C-də saxlanıldı.

Protein konsentrasiyaları Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad) istifadə edərək təxmin edilmişdir. Standart mikroplat protokoluna əməl edilmişdir. Standart əyri iribuynuzlu γ-globulin seyreltmə seriyasından istifadə edərək yaradılmışdır. Hər bir nümunə üçün 595 nm-də absorbans NanoDrop 8000 Spektrofotometrindən (Thermo Scientific) istifadə edərək üç nüsxədə ölçüldü. Ümumi zülal ekstraktları ~ 1000 μg ml -1 qədər seyreltildi və bu konsentrasiyalar Bradford analizi ilə təsdiq edildi.

Ümumi zülal ekstraktı görüntüləmək üçün SDS-PAGE yerinə yetirildi, sonra Coomassie boyandı. Qısaca olaraq, seyreltilmiş ümumi protein ekstraktının bərabər hissələri Laemmli Nümunə Tamponu ilə birləşdirildi (5% h/v β-merkaptoetanol ilə əlavə edildi) və bu qarışıq 5 dəqiqə qaynadıldı. Təxminən 10 μg ümumi protein ekstraktı 12% Mini-PROTEAN TGX prefabrik poliakrilamid gelin (Bio-Rad) quyularına yüklənmişdir. Gellər Coomassie Boyama Məhlulu (Sambrook və Russell, 2001) ilə boyandı, bu da ~ 1000 μg ml -1 seyreltmələrdə ümumi proteinin ekvivalent miqdarının olduğunu təsdiqləyir.

Um02151-in aşkarlanması üçün Western blot aparıldı. SDS-PAGE-dən sonra zülallar elektroforetik olaraq 0,2 μm PVDF membranına (Bio-Rad) köçürüldü. Sonradan hər quyuda bərabər protein yüklənməsini yoxlamaq üçün membran Ponceau S (Sigma-Aldrich) ilə boyandı. Bloklamadan əvvəl Ponceau S ləkəsi distillə edilmiş su istifadə edərək membrandan yuyuldu. Membranı yoxlamaq üçün istifadə edilən əsas antikor (1:1000 qatılma) Um02151 peptid APGKTKEDTLESLRC (GenScript) əleyhinə dovşan yaxınlığı ilə təmizlənmiş poliklonal antikor idi. Birincil antikorun membrana bağlanması İmmun-Blot Təhlil dəsti (Bio) ilə birlikdə qələvi fosfatazaya (Bio-Rad) konyuqasiya olunmuş keçi anti-dovşan immunoqlobulini G-dən ibarət ikincili antikordan (1:3000 qatılma) istifadə edilməklə aşkar edilmişdir. -Rad). Qərb ləkəsinin şəkli Geliance 600 Imaging System (Perkin Elmer) vasitəsilə çəkilib. Um02151 səviyyələrini qiymətləndirmək üçün hər bir nümunə üçün piksel həcmi GeneTools proqramından (Perkin Elmer) istifadə edilməklə müəyyən edilmişdir. Boş vektor transformantının FB1[pCM768] üç bioloji təkrarı üçün orta piksel həcmi hesablanmışdır. Bu ortadan istinad kimi istifadə edərək, hər bir nümunə üçün nisbi piksel həcmi müəyyən edilmişdir. Western blot təkrarlandı və nisbi piksel həcmləri ayrıca hesablandı. Şəkil 7B-də hər bir nümunə üçün bildirilmiş “nəzarət vasitələrinə nisbətən qat dəyişikliyi” iki texniki təkrardan əldə edilən dəyərlərin ortasıdır.


NƏTİCƏ

Nəticələrimiz indiyə qədər bitkilərdə cis-NATS-in qlobal tənzimlənməsinin ən ətraflı mənzərəsini yaradır. Biz cis-NAT cütlərinin üst-üstə düşməyən qonşu transkriptlərə nisbətən daha çox antikorrelyasiyalı ifadə nümunələrinə malik olduğunu göstərə bilsək də, biz aşkar etdik ki, bir çox nümunələr arasında açıq-aşkar antikorrelyasiya yalnız cis-NAT-ların kiçik bir hissəsində tapıla bilər. Bu sətirlər boyunca, fərqli təcrübələrdə diskret cis-NAT cütlərinin antikorrelyasiya ifadəsi göstərdiyini aşkar etdik ki, bu da bir cütün hər iki üzvünün müstəqil transkripsiya tənzimlənməsinin cis-NAT ifadəsinə güclü təsir göstərdiyini göstərir. Cis-NAT-lərin mənfi korrelyasiyası hüceyrə tipinə aid olan məlumat dəstində də müşahidə edilmişdir ki, bu da cis-NAT-lərin ayrı-ayrı hüceyrələrdə bir-birinin ifadəsinə təsir etdiyini göstərir. Əsasən siRNA-ları təmsil edən kiçik RNT lokuslarının cis-NAT-larda kifayət qədər təmsil olunmaması ilə yanaşı, RNT susdurma mexanizmindəki mutasiyaların cis-NAT ifadəsinə əhəmiyyətli təsir göstərməməsi ilə bağlı müşahidə bu anlayışı təsdiq edir və kiçik RNT və RNT müdaxiləsi yalnız cis-NAT-lərin bir hissəsi üçün vacibdir (Lu və digərləri, 2005).

Bununla birlikdə, cis-NAT-lərdən əldə edilən kiçik RNT-lərin qarşılıqlı antaqonist ifadədə əhəmiyyətli olduğu göstərildiyi ən azı bir məlum nümunə var, yəni. SRO5P5CDH Arabidopsis duzuna dözümlülüyündə iştirak edən cüt cis-NAT (Borsani et al., 2005). Duz stresinə məruz qaldıqda, SRO5 mesaj induksiya olunur, bu da kiçik RNT-lərin əmələ gəlməsinə və RNT-nin susdurucu yolunun aktivləşməsinə gətirib çıxarır ki, bu da nəticədə RNT-nin tənzimlənməsinin aşağı düşməsinə gətirib çıxarır. P5CDH transkript. Daha əvvəl qeyd edildiyi kimi, vəhşi tipli toxuma xəritələrindən iki transkriptin üst-üstə düşən bölgəsinə qədər heç bir kiçik RNT MPSS etiketi, bu xüsusi siRNA-nın induksiya edilə bilən təbiətinə uyğundur. Borsani və b. (2005) mikroarrayların, əgər 3′ məhsullar əsasən sabitdirsə, qarşılıqlı antaqonist təsirləri qiymətləndirmək üçün qeyri-mükəmməl olduğunu irəli sürmüşlər. Həqiqətən, SRO5P5CDH məlumat dəstlərimizdə yalnız zəif antikorrelyasiyaya malikdir və üst-üstə düşməyən transkriptlərdən əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənmir. Buna baxmayaraq, üst-üstə düşməyən transkriptlərlə müqayisədə cis-NAT-lərin korrelyasiya əmsallarının mənfi dəyərlərə doğru əhəmiyyətli yerdəyişməsi göstərir ki, cis-NAT-ın koordinasiya olunmuş ifadəsi, hətta buna nail olmaq mexanizmi hələ də aydın olmasa da, mikroarraylar tərəfindən aşkar edilə bilər. Bu güclü antikorrelyasiyalı cis-NAT-lər gələcək mexaniki tədqiqatlar üçün cəlbedici hədəflər olacaqdır.


Veqada genlərin və transkriptlərin annotasiyası üçün üç fərqli mənbə dəsti var. Bunlar müxtəlif treklər kimi göstərilir və müxtəlif rəng sxemlərinə malikdir.

  • Havana Əsas Genləri alternativ transkriptləri müəyyən etmək üçün dərindən şərh edilmişdir və bütün növlər üçün mövcuddur. Onlar WTSI-də Havana qrupu tərəfindən şərh edilmişdir.
  • LoF genləri insan transkriptlərinin funksional xassələri üzrə ardıcıllıqdakı dəyişikliklərin nəticələrini göstərmək.

Bu dəstlərin hər biri üçün genlər və transkriptlər aşağıda göstərildiyi kimi təsnif edilir.


Videoya baxın: ADLAR #8 (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Adwin

    Əla cavab

  2. Hsmilton

    ağlınıza nə gəldi

  3. Eleazar

    Məncə, səhvlər olur. Mənə PM yazın, danışın.

  4. Dariel

    Siz sadəcə parlaq bir fikirlə ziyarət edildiniz

  5. Tezuru

    Sizə heç nə ilə kömək edə bilməyəcəyim üçün çox üzr istəyirəm. Amma əminəm ki, siz düzgün həll yolu tapacaqsınız. Ümidsiz olmayın.



Mesaj yazmaq