Məlumat

Əks transkripsiya PCR optimallaşdırılması

Əks transkripsiya PCR optimallaşdırılması



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

RT üçün istifadə etmək üçün ideal RNT miqdarı nədir? və PCR üçün nə qədər cDNA istifadə edilməlidir?

0,36 ug/ul RNT məhlulu ilə RT etdim. Sonra PCR üçün mən əldə edilən cDNT-nin 1 ul-dan istifadə etdim və 25 dövr istifadə etdim, çünki endogen səviyyə ilə həddindən artıq ifadə arasında fərq görməyə ümid edirdim. Bununla belə, mən gözlənilən 500 bp hündürlüyündə heç bir band aşkar etmədim, lakin 100 bp-də diffuz bir zolaq aşkar etdim. Bu 100 bp nəyi təmsil edə bilər? primer dimer? Mən 35 dövrəyə keçdim və ya eyni miqdarda cDNA istifadə etdim, ya da 3 dəfə çox cDNA əlavə etdim. Hər iki halda mən gözlənilən hündürlükdə lentlər (lakin daha çox cDNA qoyanda daha güclü) və 100 bp-də hələ də böyük lentlər əldə etdim.


Mən də 100bp ətrafında böyük qeyri-səlis zolaqlar görürəm. Çox güman ki, onlar RNT çirklənməsi. Onlardan xilas olmaq üçün RT-PCR məhsullarınızı RNAse-H ilə həzm edin. Ancaq sadəcə maraq dairənizi vizuallaşdırmaq lazımdırsa və qeyri-səlis lentlər sizə mane olmursa, bu, problem olmamalıdır.

Mən adətən ümumi həcmi 20 ul olan Invitrogen Superscript III dəstindən istifadə edərək RT-PCR reaksiyama 1-2 mq RNT-dən istənilən yerə daxil edirəm. Reaksiyadan sonra onun həcminin 1/10-nu (2 ul) aşağı axın (PCR) tətbiqləri üçün istifadə edirəm. Bu adətən mənə gözəl nəticələr verir.

Müəyyən bir hədəfin aşkarlanması üçün RT-PCR-ni optimallaşdırmaq üçün RT-PZR-də oliqo-dT və ya təsadüfi heksamerlər əvəzinə genə xüsusi primerlərdən (yalnız antisens primerlərindən istifadə etməyinizə əmin olun) istifadə etməyi düşünün. Aşağı axın tətbiqləri üçün istifadə etdiyiniz zaman bu, hədəfinizi zənginləşdirir. Bununla belə, GSP-lərdən istifadə edərkən, RT-PCR reaksiyanızın işlədiyini sübut etmək üçün nəzarət (yəni beta aktin) primerləri ilə paralel reaksiya apardığınızdan əmin olun.


RNT-nin vahid "ideal miqdarı" yoxdur. Mən sizə xüsusi analiziniz üçün ən yaxşı məbləği müəyyən etmək üçün titrasiya əyrisi etməyi təklif edərdim. 100 bp-də band qeyri-spesifik gücləndirmə ola bilər. Aşağı bandı çıxarıb (və ya azaltdığını) görmək üçün yumşalma tempini bir qədər artırmağa cəhd edə bilərsiniz. Alternativ olaraq, fərqli bir primer dəsti və ya hətta yuvalanmış PCR-ni nəzərdən keçirə bilərsiniz. Bundan əlavə, hələ də həmin bandda birləşdirmə alternativinə baxa bilərsiniz. Astarlarınız birdən çox eksonu əhatə edirmi?


Dabaq xəstəliyi virusunun aşkarlanması üçün yeni tərs transkripsiya xətti-eksponensial PCR-nin dizaynı və optimallaşdırılması

Məqsədlər: Dabaq xəstəliyi virusunun (FMDV) aşkarlanması üçün yeni molekulyar analiz hazırlanıb.

Metodlar və nəticələr: Sintetik DNT hədəflərindən istifadə edən pilot təcrübələr LATE-PCR-nin son nöqtənin aşkarlanması vasitəsilə ilkin hədəf konsentrasiyasını kəmiyyətləndirmə qabiliyyətini nümayiş etdirdi. Daha sonra analizin FMDV RNT-ni aşkar etmək qabiliyyətini təsdiq etmək üçün əks transkripsiyanı (RT) və LATE-PCR-ni əhatə edən iki addımlı protokoldan istifadə edilmişdir. Nəhayət, RT və LATE-PCR, FMDV RNT seqmentinin və Zirehli RNT-dən ibarət daxili nəzarətin birgə gücləndirilməsi üçün bir addımlı dupleks analizdə birləşdirildi. Bu formada, reaksiya qarışığındakı artıq primerlərin hər biri qısa bir pre-inkubasiya zamanı müvafiq RNT hədəflərinə hibridləşir, sonra 60°C-də 3 dəqiqəlik RT addımı zamanı cDNA zəncirləri yaradır və nəticədə cDNT LATE ilə gücləndirilir. -Nümunələrin işlənməsinə müdaxilə etmədən PCR.

Nəticələr: RT-LATE-PCR analizi son nöqtədə RNT hədəflərinin başlanğıc sayına mütənasib olan flüoresan siqnallar yaradır və tək uyğunsuzluğa dözümlü zonddan istifadə edərək bir sıra ardıcıllıq variantlarını aşkar edə bilir.

Tədqiqatın əhəmiyyəti və təsiri: FMDV üçün mövcud laboratoriya əsaslı molekulyar diaqnostik analizlər üzərində təkmilləşdirmələr təklif etməklə yanaşı, bu yeni analiz sahədə şap xəstəliyinin sürətli diaqnostikası üçün nəzərdə tutulmuş yeni portativ (“qayğı nöqtəsi”) cihaz BioSeeq II ilə uyğun gəlir. .

© 2009 Müəlliflər. Jurnal tərtibi © 2009 Tətbiqi Mikrobiologiya Cəmiyyəti.


İçindəkilər

Birləşdirilmiş RT-PCR və qPCR texnikası kəmiyyət RT-PCR [3] və ya real vaxt RT-PCR [4] (bəzən hətta kəmiyyət real vaxt RT-PCR [5] adlanır) kimi təsvir edilmişdir, müxtəlif cür qısaldılmışdır: qRT-PCR, [6] RT-qPCR, [7] RRT-PCR, [8] və rRT-PCR. [9] Qarışıqlığın qarşısını almaq üçün bu məqalədə ardıcıl olaraq aşağıdakı abbreviaturalardan istifadə olunacaq:

Texnika İxtisar
Polimeraza zəncirvari reaksiya PCR
Əks transkripsiya polimeraza zəncirvari reaksiya RT-PCR
Real vaxtda polimeraza zəncirvari reaksiya qPCR
RT-PCR / qPCR kombinə edilmiş texnika qRT-PCR

Bütün müəlliflər, xüsusən də əvvəlkilər bu konvensiyadan istifadə etmirlər və oxucu linkləri izləyərkən ehtiyatlı olmalıdır. RT-PCR həm real vaxt PCR (qPCR) və həm də əks transkripsiya PCR (RT-PCR) göstərmək üçün istifadə edilmişdir.

1977-ci ildə təqdim olunduğu gündən, Northern blot çatışmazlıqlarına baxmayaraq, RNT-nin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün geniş şəkildə istifadə edilmişdir: (a) vaxt aparan texnika, (b) aşkarlanması üçün çoxlu RNT tələb edir və (c) aşağı bolluğunda kəmiyyətcə qeyri-dəqiqdir. RNT tərkibi. [10] [11] Bununla belə, 1983-cü ildə Kary Mullis tərəfindən ixtira olunduqdan sonra RT PCR o vaxtdan bəri RNT aşkarlanması və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün seçim üsulu kimi şimal ləkəsini dəyişdirdi. [12]

RT-PCR bir neçə səbəbə görə RNT səviyyələrinin aşkarlanması və/və ya müqayisəsi üçün etalon texnologiyaya çevrilmişdir: (a) PCR-dən sonrakı emal tələb etmir, (b) RNT bolluğunun geniş diapazonu (>10 7 qat) ölçülə bilər və (c) həm keyfiyyət, həm də kəmiyyət məlumatı haqqında təsəvvür yaradır. [5] Sadəliyi, spesifikliyi və həssaslığına görə, RT-PCR, şərabda maya hüceyrələrinin miqdarının təyini kimi sadə təcrübələrdən tutmuş quş qripi kimi yoluxucu agentləri aşkar etmək üçün diaqnostik vasitələr kimi daha mürəkkəb istifadələrə qədər geniş tətbiqlərdə istifadə olunur. virus və SARS-CoV-2. [13] [14] [15]

RT-PCR-də RNT şablonu əvvəlcə əks transkriptazadan (RT) istifadə edərək tamamlayıcı DNT-yə (cDNA) çevrilir. Daha sonra cDNA PCR istifadə edərək eksponensial gücləndirmə üçün şablon kimi istifadə olunur. RNT transkriptinin aşkarlanması üçün RT-PCR-nin istifadəsi aşağıdakı mühüm yollarla gen ifadəsinin öyrənilməsində inqilab etdi:

  • Praktiki olaraq hər hansı bir genin transkriptini aşkar etməyi nəzəri cəhətdən mümkün etdi [16]
  • Nümunə gücləndirilməsini aktivləşdirdi və şimal ləkə analizindən istifadə edərkən tələb olunan bol başlanğıc materialına ehtiyacı aradan qaldırdı [17][18]
  • Astarı əhatə edən RNT bütöv olduğu müddətcə RNT deqradasiyasına dözümlülük təmin edilir [17]

Bir addımlı RT-PCR və iki addımlı RT-PCR Redaktəsi

RT-PCR-dən istifadə edərək mRNT-nin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi ya bir addımlı, ya da iki addımlı reaksiya kimi əldə edilə bilər. İki yanaşma arasındakı fərq proseduru yerinə yetirərkən istifadə olunan boruların sayındadır. İki mərhələli reaksiya əks transkriptaza reaksiyasının və PCR gücləndirilməsinin ayrı-ayrı borularda aparılmasını tələb edir. İki addımlı yanaşmanın dezavantajı nümunənin daha tez-tez işlənməsinə görə çirklənməyə həssaslıqdır. [19] Digər tərəfdən, cDNT sintezindən PCR gücləndirilməsinə qədər bütün reaksiya bir addımlı yanaşmada tək boruda baş verir. Bir addımlı yanaşmanın bütün enzimatik reaksiyaları bir mühitdə ehtiva etməklə eksperimental dəyişkənliyi minimuma endirdiyi düşünülür. O, əmək tutumlu və çirklənməyə meyilli cDNA məhsulunun PCR reaksiyasına pipetləmə mərhələlərini aradan qaldırır. Optimallaşdırılmış bir addımlı RT-PCR vəziyyətinə malik polimeraza gücləndiriciləri olan inhibitorlara dözümlü polimerazaların sonrakı istifadəsi tam qan və serum kimi təmizlənməmiş və ya xam nümunələrdən RNT-nin tərs transkripsiyasını dəstəkləyir. [20] [21] Bununla belə, başlanğıc RNT şablonları bir addımlı yanaşmada deqradasiyaya meyllidir və eyni nümunədən təkrar analizlər tələb olunduqda bu yanaşmanın istifadəsi tövsiyə edilmir. Bundan əlavə, bir addımlı yanaşmanın iki addımlı yanaşma ilə müqayisədə daha az dəqiq olduğu bildirilir. O, həmçinin SYBR Green kimi DNT-ni birləşdirən boyalardan istifadə edərkən üstünlük verilən analiz üsuludur, çünki primer-dimerlərin aradan qaldırılması ərimə temperaturunda sadə dəyişikliklə əldə edilə bilər. Buna baxmayaraq, bir addımlı yanaşma birbaşa biosensasiyada hədəf RNT-nin sürətli aşkarlanması üçün nisbətən əlverişli həlldir. [ sitat lazımdır ]

Son nöqtə RT-PCR və real vaxt rejimində RT-PCR Redaktəsi

RT-PCR məhsullarının kəmiyyəti əsasən iki kateqoriyaya bölünə bilər: son nöqtə və real vaxt. [22] Az sayda nümunədə gen ifadə dəyişikliklərinin ölçülməsi üçün son nöqtə RT-PZR-dən istifadəyə üstünlük verilir, lakin real vaxt rejimində RT-PCR massiv analizlərindən və ya gen ifadəsindən əldə edilən kəmiyyət nəticələrini təsdiqləmək üçün qızıl standart metoda çevrilmişdir. qlobal miqyasda dəyişikliklər. [23]

Son nöqtə RT-PCR Edit

Son nöqtə RT-PZR-in ölçmə yanaşmaları, etidium bromid kimi flüoresan boyalardan istifadə etməklə, [24] [25] fosforimagerdən istifadə edərək PCR məhsullarının P32 etiketlənməsi, [26] və ya parıldama hesablanması ilə gen ifadə səviyyələrinin aşkarlanmasını tələb edir. [18] Son nöqtə RT-PCR adətən üç müxtəlif üsuldan istifadə etməklə əldə edilir: nisbi, rəqabətli və müqayisəli. [27] [28]

Nisbi RT-PCR RT-PCR-nin nisbi kəmiyyət göstəriciləri maraq doğuran genlə eyni vaxtda daxili nəzarətin birgə gücləndirilməsini nəzərdə tutur. Nümunələri normallaşdırmaq üçün daxili nəzarətdən istifadə olunur. Normallaşdırıldıqdan sonra mRNT-nin çoxsaylı nümunələri üzrə nisbi transkript bolluğunun birbaşa müqayisəsi edilə bilər. Qeyd edilməli ehtiyat tədbirləri ondan ibarətdir ki, daxili nəzarət eksperimental müalicədən təsirlənməməsi üçün seçilməlidir. Nəticələrin dəqiq və mənalı olması üçün ifadə səviyyəsi bütün nümunələrdə və maraq doğuran mRNA ilə sabit olmalıdır. Nəticələrin kəmiyyəti hədəfin xətti diapazonunun və nəzarət gücləndirilməsinin müqayisəsi ilə təhlil edildiyi üçün təhlilə başlamazdan əvvəl başlanğıc hədəf molekullarının konsentrasiyasını və onların gücləndirmə sürətini nəzərə almaq çox vacibdir. Təhlilin nəticələri gen siqnalının daxili nəzarət siqnalına nisbətləri kimi ifadə edilir və bu dəyərlər daha sonra nisbi hədəf RNT ifadəsinin qiymətləndirilməsində nümunələr arasında müqayisə üçün istifadə edilə bilər. [25] [28] [29] Rəqabətli RT-PCR Mütləq kəmiyyətin müəyyən edilməsi üçün rəqabətli RT-PCR texnikasından istifadə edilir. Hədəf RNT-dən kiçik ölçü və ya ardıcıllıqla fərqləndirilə bilən sintetik “rəqib” RNT-nin istifadəsini nəzərdə tutur. Dəqiq nəticələr əldə etmək üçün sintetik RNT-nin dizaynının ardıcıllıqla eyni, lakin hədəf RNT-dən bir qədər qısa olması vacibdir. Dizayn və sintez edildikdən sonra, rəqib RNT-nin məlum miqdarı eksperimental nümunələrə əlavə edilir və RT-PCR istifadə edərək hədəflə birlikdə gücləndirilir. Daha sonra rəqib RNT-nin konsentrasiya əyrisi hazırlanır və nümunədə mövcud olan hədəfin miqdarını müəyyən etmək üçün endogen transkriptlərdən alınan RT-PCR siqnallarını müqayisə etmək üçün istifadə olunur. [28] [30] Müqayisəli RT-PCR Müqayisəli RT-PCR rəqabətli RT-PZR-ə bənzəyir ki, hədəf RNT əlaqəli olmayan ardıcıllığın daxili standartı ilə tək reaksiya daxilində gücləndirici reagentlər üçün rəqabət aparır. Reaksiya başa çatdıqdan sonra, hədəf RNT konsentrasiyasını təyin etmək üçün nəticələr xarici standart əyri ilə müqayisə edilir. Nisbi və rəqabətli kəmiyyətləşdirmə üsulları ilə müqayisədə müqayisəli RT-PZR istifadə etmək üçün daha əlverişli üsul hesab olunur, çünki müstəntiqdən nisbi RT-PCR-də pilot təcrübə aparmağı tələb etmir, mRNT-nin eksponensial gücləndirmə diapazonu əvvəlcədən təyin olunmalı və rəqabətli RT-PCR-də sintetik rəqib RNT sintez edilməlidir. [28] [31] [32] [33] [34]

Real vaxt rejimində RT-PCR Edit

Son bir neçə ildə yeni flüoresan DNT etiketləmə üsullarının ortaya çıxması PCR məhsullarının real vaxt rejimində təhlili və aşkarlanmasına imkan yaratdı və nəticədə gen ifadəsinin təhlili üçün real vaxt rejimində RT-PCR-nin geniş yayılmasına səbəb oldu. Real vaxt rejimində RT-PCR indi gen ifadəsinin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün seçim üsulu olmaqla yanaşı, həm də qlobal miqyasda massiv analizləri və gen ifadələrindən nəticələr əldə etmək üçün üstünlük verilən üsuldur. Hazırda PCR məhsullarının real vaxt rejimində RT-PCR aşkarlanması üçün dörd müxtəlif flüoresan DNT zondları mövcuddur: SYBR Green, TaqMan, molekulyar mayaklar və əqrəb zondları. Bütün bu zondlar flüoresan siqnal yaradaraq PCR məhsullarını aşkar etməyə imkan verir. SYBR Green boyası sadəcə məhluldakı ikiqat zəncirli DNT-yə bağlanaraq öz flüoresan siqnalını yaydığı halda, TaqMan zondlarının, molekulyar mayakların və əqrəblərin flüoresans generasiyası boya molekulunun Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) birləşməsindən asılıdır. oliqonukleotid substratlarına söndürücü hissə. [35]

SYBR Yaşıl SYBR Yaşıl PCR məhsullarının ikiqat zəncirli DNT-sinə bağlandıqda, həyəcanlandıqda işıq saçacaq. Flüoresansın intensivliyi PCR məhsulları yığıldıqca artır. Bu texnikadan istifadə etmək asandır, çünki onun bağlanmasının spesifik olmaması səbəbindən zondların dizaynı lazım deyil. Bununla belə, boya ikiqat zəncirli DNT-ni PCR məhsullarından və primer-dimerlərdən fərqləndirmədiyi üçün hədəf konsentrasiyanın həddindən artıq qiymətləndirilməsi ümumi problemdir. Dəqiq kəmiyyətin müəyyənləşdirilməsi mütləq zərurət olduqda, nəticələrin təsdiqi üçün əlavə analiz aparılmalıdır. Buna baxmayaraq, real vaxt rejimində RT-PCR məhsul aşkarlama üsulları arasında SYBR Green ən qənaətcil və istifadəsi asan olanıdır. [22] [23]

Real vaxt rejimində RT-PCR, standart əyri metodu və müqayisəli hədd metodu ilə əldə edilən nəticələrin kəmiyyətini qiymətləndirmək üçün adətən iki strategiya istifadə olunur. [40]

Əks transkripsiya polimeraza zəncirvari reaksiya vasitəsilə eksponensial gücləndirmə çox az sayda RNT molekulunun aşkar oluna biləcəyi yüksək həssas bir texnika təmin edir. RT-PZR genetik xəstəliklərin diaqnostikasında və yarı kəmiyyətcə, gen ifadəsinin ölçüsü kimi hüceyrə və ya toxuma daxilində spesifik müxtəlif RNT molekullarının bolluğunun müəyyən edilməsində geniş istifadə olunur.

Tədqiqat üsulları Redaktə edin

RT-PCR, gen ifadəsini ölçmək üçün tədqiqat metodlarında geniş istifadə olunur. Məsələn, Lin et al. maya hüceyrələrində Gal genlərinin ifadəsini ölçmək üçün qRT-PCR istifadə etdi. Birincisi, Lin et al. Gal genlərinin tənzimlənməsində iştirak etməkdən şübhələnən bir zülalın mutasiyasını hazırladı. Bu mutasiya selektiv olaraq Gal ifadəsini ləğv etmək üçün fərz edildi. Bunu təsdiqləmək üçün bu mutasiyanı ehtiva edən maya hüceyrələrinin gen ifadə səviyyələri qRT-PCR istifadə edərək təhlil edilmişdir. Tədqiqatçılar bu tənzimləyici zülalın mutasiyasının Gal ifadəsini azaltdığını qəti şəkildə müəyyən edə bildilər. [41] Northern blot analizi RNT-nin gen ifadəsini daha da öyrənmək üçün istifadə olunur.

Gen daxil edilməsi Edit

RT-PCR eukaryotik genlərin prokaryotlara daxil edilməsində də çox faydalı ola bilər. Əksər eukaryotik genlər genomda olan, lakin yetkin mRNT-də olmayan intronlar ehtiva etdiyinə görə, RT-PCR reaksiyasından yaranan cDNT dəqiq (əks transkriptazaların xətaya meylli təbiəti nəzərə alınmadan) DNT ardıcıllığıdır. transkripsiyadan sonra birbaşa proteinə çevrilir. Bu genlər zülal istehsalı və ya təmizlənməsi üçün prokaryotik hüceyrələrdə ifadə olunduqda, transkriptdə yalnız ekzonlar olduğu üçün birbaşa transkripsiyadan əldə edilən RNT-nin birləşdirilməsinə ehtiyac yoxdur. (E. coli kimi prokariotlarda eukariotların mRNT-ni birləşdirmək mexanizmi yoxdur).

Genetik xəstəlik diaqnozu Redaktə edin

RT-PCR, Lesch-Nyhan sindromu kimi genetik xəstəliklərin diaqnozu üçün istifadə edilə bilər. Bu genetik xəstəlik, klinik olaraq ölümcül sidik turşusu sidik daşına və podaqraya bənzər simptomlara səbəb olan HPRT1 genindəki nasazlıqdan qaynaqlanır. [6] [ aydınlaşdırma tələb olunur ] Hamilə ana və dölün HPRT1-in mRNA ifadə səviyyələri üçün təhlili ananın daşıyıcı olub-olmadığını və dölün Lesch-Nyhan sindromunu inkişaf etdirmə ehtimalını aşkar edəcək. [42]

Xərçəngin aşkarlanması Edit

Alimlər proqnozu yaxşılaşdırmaq və terapiyaya cavabı izləmək üçün xərçəngin aşkarlanmasında RT-PCR-dən istifadə yolları üzərində işləyirlər. Sirkulyasiya edən şiş hüceyrələri xərçəng növündən asılı olaraq unikal mRNT transkriptləri istehsal edir. Məqsəd, hansı mRNA transkriptlərinin müəyyən bir xərçəng hüceyrəsi növü üçün ən yaxşı biomarkerlər kimi xidmət etdiyini müəyyən etmək və sonra onun ifadə səviyyələrini RT-PCR ilə təhlil etməkdir. [43]

RT-PCR adətən Qrip virusu A, HİV və SARS-CoV-2 kimi retroviruslar kimi genomları RNT-dən ibarət virusların genomlarının öyrənilməsində istifadə olunur. [44]

Əsas üstünlüklərinə baxmayaraq, RT-PCR-nin çatışmazlıqları yoxdur. Əks transkripsiya edilmiş tamamlayıcı DNT-nin (cDNT) çoxlu PCR dövrləri zamanı eksponensial artımı xəttin saxlanmasında çətinlik olduğu üçün qeyri-dəqiq son nöqtənin kəmiyyət göstəricisi yaradır. [45] Nümunədə RNT tərkibinin dəqiq aşkarlanmasını və kəmiyyətini təmin etmək üçün hər bir PCR dövrü ərzində gücləndirmə məhsullarını izləmək üçün flüoresan əsaslı modifikasiyadan istifadə edərək qRT-PCR hazırlanmışdır. Texnikanın həddindən artıq həssaslığı iki uclu qılınc ola bilər, çünki hətta ən kiçik DNT çirklənməsi də arzuolunmaz nəticələrə səbəb ola bilər. [46] Yanlış müsbət nəticələrin aradan qaldırılması üçün sadə üsul, genə xüsusi primerin 5' bölgəsinə lövbərlər və ya etiketlər daxil etməkdir. [47] Əlavə olaraq, şablon konsentrasiyası və gücləndirmə səmərəliliyi də daxil olmaqla çoxsaylı variasiya mənbələrinin mövcudluğu səbəbindən kəmiyyət tədqiqatlarının planlaşdırılması və dizaynı texniki cəhətdən çətin ola bilər. [31] Nümunəyə məlum miqdarda RNT-nin əlavə edilməsi, standart əyri yaradan bir sıra RNT seyreltmələrinin əlavə edilməsi və şablonsuz surət nümunəsinin (cDNA yoxdur) əlavə edilməsi nəzarət kimi istifadə edilə bilər.

RT-PCR bir addımlı RT-PCR protokolu və ya iki addımlı RT-PCR protokolu ilə həyata keçirilə bilər.

Bir addımlı RT-PCR Edit

Bir addımlı RT-PCR subyektləri mRNT hədəflərini (6 kb-a qədər) əks transkripsiyaya aparır, ardınca tək sınaq borusunda PCR gücləndirilməsi. Qeyd etmək vacibdir ki, bütöv, yüksək keyfiyyətli RNT və ardıcıllıqla xüsusi primerdən istifadə ən yaxşı nəticələr verəcəkdir.

Əks transkriptaza, Taq DNT polimeraza və korrektor polimerazın qarışığı olan bir addımlı RT-PCR dəsti seçildikdən və bütün lazımi material və avadanlıq əldə edildikdən sonra reaksiya qarışığı hazırlanmalıdır. Reaksiya qarışığına dNTP-lər, primerlər, şablon RNT, lazımi fermentlər və bufer məhlulu daxildir. Reaksiya qarışığı hər bir reaksiya üçün PCR borusuna əlavə edilir, sonra şablon RNT. PZR boruları daha sonra dövrəyə başlamaq üçün termal dövrəyə yerləşdirilir. Birinci dövrədə cDNT sintezi baş verir. İkinci dövr, əks transkriptazın təsirsiz hala gəldiyi ilkin denaturasiyadır. Qalan 40-50 dövr denatürasiya, yumşalma və uzanma daxil olan gücləndirmədir. Gücləndirmə tamamlandıqda, RT-PCR məhsulları gel elektroforezi ilə təhlil edilə bilər. [48] ​​[49]

(PCR Tətbiqləri Təlimatı və Biotools)

İki addımlı RT-PCR Edit

İki addımlı RT-PCR, adından da göründüyü kimi, iki mərhələdə baş verir. Əvvəlcə tərs transkripsiya, sonra isə PCR. Bu üsul bir addımlı metoddan daha həssasdır. Dəstlər iki addımlı RT-PZR üçün də faydalıdır. Bir addımlı PCR üçün olduğu kimi, ən yaxşı nəticələr üçün yalnız bütöv, yüksək keyfiyyətli RNT istifadə edin. İki mərhələli PCR üçün primerin ardıcıllıqla spesifik olması lazım deyil.

Birinci addım Redaktə edin

Əvvəlcə şablon RNT, primer, dNTP qarışığı və nukleazsız suyu PCR borusunda birləşdirin. Sonra PCR borusuna RNaz inhibitoru və əks transkriptaz əlavə edin. Sonra, PCR borusunu bir dövr üçün termal dövrəyə yerləşdirin

tərs transkriptazın tavlanması, uzanması və inaktivasiyası baş verir. Nəhayət, birbaşa PCR olan ikinci addıma keçin və ya PCR yerinə yetirilənə qədər məhsulu buzda saxlayın.

İkinci addım Redaktə edin

Bufer, dNTP mix, MgCl ehtiva edən master mix əlavə edin2, Hər bir PCR borusuna Taq polimeraza və nukleazsız su. Sonra borulara lazımi primeri əlavə edin. Daha sonra, gücləndirmə proqramının 30 dövrü üçün PCR borularını termal dövrəyə qoyun. Bura daxildir: denatürasiya, yumşalma və uzanma. RT-PZR məhsulları gel elektroforezi ilə təhlil edilə bilər. [50]

Kəmiyyət RT-PCR analizi nümunədə xüsusi cDNA hədəflərinin nüsxələrinin sayını ölçmək üçün qızıl standart hesab olunur, lakin o, zəif standartlaşdırılıb. [51] Nəticədə, texnikadan istifadə edən çoxsaylı nəşrlər olsa da, bir çoxları qeyri-adekvat eksperimental təfərrüat verir və uyğun olmayan nəticələr çıxarmaq üçün uyğun olmayan məlumat təhlilindən istifadə edir. İstənilən kəmiyyət PCR məlumatının keyfiyyətində xas dəyişkənliyə görə, nəinki rəyçilər bu əlyazmaları qiymətləndirməkdə çətinlik çəkirlər, həm də tədqiqatları təkrarlamaq mümkünsüz olur. [52] Eksperimental şəraitin hesabatının standartlaşdırılmasının zəruriliyini dərk edərək, akademik alimlərin beynəlxalq konsorsiumu tərəfindən Kəmiyyət Real Zamanlı PCR Təcrübələrinin Nəşri üçün Minimum Məlumat (MIQE, tələffüz mykee) təlimatları nəşr edilmişdir. MIQE təlimatları daha yaxşı eksperimental təcrübəni təşviq etmək və kəmiyyət PCR məlumatlarının uyğunluğunu, dəqiqliyini, düzgün şərhini və təkrarlanmasını təmin etmək üçün nəşr üçün tələb olunan kəmiyyət PCR təcrübələrini qiymətləndirmək üçün lazım olan minimum məlumatları təsvir edir. [53]

Hesabat qaydaları ilə yanaşı, MIQE qarışıqlığın qarşısını almaq üçün kəmiyyət PCR ilə əlaqəli nomenklaturanın standartlaşdırılmasının zəruriliyini vurğulayır, məsələn, qPCR abbreviaturası kəmiyyət real vaxt PCR üçün istifadə edilməlidir və RT-qPCR əks transkripsiya-qPCR üçün istifadə edilməlidir., və normallaşma üçün istifadə olunan genlər ev təsərrüfatı genləri əvəzinə istinad genləri adlandırılmalıdır. O, həmçinin TaqMan zondları kimi kommersiya baxımından əldə edilmiş terminlərin istifadə edilməməsini, əksinə hidroliz zondları adlandırılmasını təklif edir. Əlavə olaraq təklif edilir ki, kəmiyyətin müəyyən edilməsi üçün istifadə olunan PCR dövrü (Ct), kəsişmə nöqtəsi (Cp) və qalxma nöqtəsi (TOP) əvəzinə eyni dəyərə istinad edən, lakin real vaxt alətlərinin müxtəlif istehsalçıları tərəfindən hazırlanmışdır. [51]

Təlimat aşağıdakı elementlərdən ibarətdir: 1) eksperimental dizayn, 2) nümunə, 3) nuklein turşusunun çıxarılması, 4) əks transkripsiya, 5) qPCR hədəf məlumatı, 6) oliqonukleotidlər, 7) protokol, 8) yoxlama və 9) məlumat təhlil. Hər bir elementdəki xüsusi maddələr ya E (vacib) və ya D (arzu olunan) etiketini daşıyır. E ilə işarələnmişlər kritik və əvəzolunmaz, D ilə işarələnmişlər isə periferik, lakin ən yaxşı təcrübələr üçün vacib hesab olunur. [53]


CDNA mikroarray məlumatlarının yoxlanılması üçün kəmiyyət tərs transkripsiya PCR-nin optimallaşdırılması

cDNA mikroarray analizi bioloji proseslərdə baş verən gen ifadəsində genom miqyaslı dəyişiklikləri izləmək üçün çox faydalıdır. Mövcud standartlar mikroarray müşahidələrinin kəmiyyət (Q)-PCR və ya digər üsullarla yoxlanılmasını tələb edir. Bir neçə tədqiqat mikroarray tapıntılarının yoxlanılması üçün Q-PCR-ni optimallaşdırmışdır. Cari tədqiqatda Q-PCR sədaqətinə təsir edən bir neçə dəyişən, o cümlədən RNT çıxarılması üsulları, mRNT zənginləşdirilməsi, əks transkripsiya üçün primerlər və cDNA gücləndirilməsinin aşkarlanması üsulları qiymətləndirilmişdir. Digər gen ifadə dəyişikliklərinin əsaslandığı istinad geninin seçimi də qiymətləndirildi. Ribosomal zülal S28 üçün RNT-nin izogen dərmanlara davamlı hüceyrə xətləri arasında ifadədə minimal fərqlə bu məqsəd üçün ideal olduğu müəyyən edilmişdir. Biz həmçinin oliqo (dT) primerlərinin təsadüfi heksamerlərdən üstün olduğunu və RNeasy üsulu ilə çıxarılan RNT-nin mRNT zənginləşdirilməsinə ehtiyac olmadan, xüsusən də TaqMan zondlarından istifadə edildikdə ardıcıl S28 gen gücləndirilməsi verdiyini aşkar etdik. Buna baxmayaraq, SYBR Green I ilə həssaslıq kifayət qədər yüksək idi ki, o, hətta az bolluqlu transkriptlər üçün də gücləndirmə məhsulunun aşkarlanması üçün üstünlük verilən, ən az xərcli üsul idi. Optimal metoddan istifadə edərək, cDNA mikroarray analizi ilə hüceyrə xətləri arasında müəyyən edilmiş gen ifadəsindəki fərqlərin 91-95%-i əvvəllər təsvir edilmiş metodlardan əhəmiyyətli dərəcədə üstün olan Q-PCR ilə təsdiqlənə bilər.


PCR-nin optimallaşdırılması

PCR uğurlu nəticə əldə etmək üçün bəzən reaksiya şəraitinin optimallaşdırılmasını tələb edə bilər. Aşağıdakı tez-tez verilən suallardan istifadə edərək təcrübələriniz üçün PCR şərtlərini necə optimallaşdıracağınızı öyrənin.

PCR şərtlərini optimallaşdırarkən hansı şərtlər xüsusilə vacibdir?

İlkin denatürasiya mərhələsi

Mürəkkəb şablonları (məsələn, genomik DNT) denatürasiya etmək üçün bəzən əvvəlcədən isitmə tələb olunur, denaturasiya üçün 1 dəqiqə ərzində 94°C kifayətdir. Həddindən artıq istilik müalicəsi fermentin inaktivasiyasına səbəb ola bilər.

  • DNT ekstraktı və təmizlənmədən toxumadan birbaşa PCR gücləndirilməsi üçün istifadə edilən Terra PCR Direct Polimerase Mix üçün 2 dəqiqə ərzində 98°C-də əvvəlcədən qızdırma tələb olunur.
  • Takara üçün LA Taq DNT polimerazları və Advantage GC2 DNT polimerazları üçün ilkin denatürasiya mərhələsi tələb olunur.
  • PrimeSTAR fermentləri fermentin aktivləşdirilməsi üçün əvvəlcədən isitmə tələb etmir.

Denatürasiya şərtləri

İstifadə olunacaq termal dövran modeli nəzərə alınmaqla denatürasiya şərtləri seçilməlidir. Ümumi təlimat 30 saniyə üçün 94&ndash95°C və ya 10 saniyə üçün 98°C-dir.

PrimeSTAR polimerazalarından biri kimi istiliyədavamlı fermentdən istifadə edirsinizsə, biz qısa müddətli və yüksək temperaturlu denaturasiya mərhələsini tövsiyə edirik (yəni, 98°C-də 5&ndash10 san).

Həddindən artıq yüksək temperaturda və ya çox uzun müddət ərzində denatürasiya ferment aktivliyinin itirilməsi və/yaxud uzun şablonların zədələnməsi ilə nəticələnə bilər.

Qızartma şərtləri

Yuvlama addımı hər bir primer üçün tənzimlənməlidir, yumşalma temperaturu birbaşa T-dən asılıdırm primerlərdən ibarətdir. Həddindən artıq aşağı yumşalma temperaturlarından istifadə yanlış aspirasiya və qeyri-spesifik gücləndirmə ilə nəticələnə bilər ki, bu da arzu olunan məhsulun aşağı məhsuldarlığına səbəb ola bilər.

Gücləndirmənin effektivliyi və spesifikliyi tavlama temperaturunu primerin T-yə uyğun olaraq tənzimləməklə yaxşılaşdırıla bilərm və ya iki mərhələli PCR həyata keçirməklə.

  • üçün Taq fermentlər üçün tövsiyə olunan yumşalma müddəti 30 san.
  • PrimeSTAR seriyasındakı fermentlər əla astarlama effektivliyinə malikdir. Buna görə də, 5&ndash15 saniyəlik qısa tavlama müddətindən istifadə etmək vacibdir. Həddindən artıq uzun tavlama vaxtları səhv hopdurma nəticəsində qeyri-spesifik gücləndirməyə səbəb ola bilər.
  • 1 kb-dən kiçik qısa ardıcıllıqları gücləndirərkən üç addımlı PCR protokolu tövsiyə olunur. GC ilə zəngin hədəflər və ya uzun ardıcıllığın gücləndirilməsi (>10 kb) üçün iki addımlı PCR protokolu tövsiyə olunur.

Uzatma addımı

Ümumiyyətlə, 1 dəq/kb uzadılması tövsiyə olunur. SpeedSTAR HS DNA Polymerase və ya SapphireAmp Fast PCR Master Mix yüksək sürətli fermentlərdən istifadə edərkən, gücləndirilmiş məhsulun 10 san/kb reaksiya sürətindən istifadə edin (yəni, 1 kb məhsul üçün 10 saniyə, 2 kb məhsul üçün 20 saniyə) və s.).

PrimeSTAR Max DNT Polimerase və PrimeSTAR GXL DNT Polimerase özünəməxsus uzanma faktorunu ehtiva edir və 5&ndash20 san/kb-də yüksək sürətli reaksiyalara imkan verir. Bu fermentlərdən artıq şablon olan nümunələrlə istifadə edilərsə, 1 dəq/kb uzadılma müddətindən istifadə edilməlidir.

Üç addımlı və ya iki addımlı PCR protokolundan istifadə etməliyəm?

Üç mərhələli PCR denaturasiya, tavlama və uzatma mərhələlərini əhatə edir. Bu tip protokol Tm astarların uzadılma temperaturundan aşağıdır və ya 68°C-dən azdır.

Əgər primerin ərimə temperaturu (Tm) uzadılma temperaturuna yaxındır (72°C) və ya bir neçə dərəcə aşağıdır, denaturasiya mərhələsini və birləşmiş tavlama/uzatma addımını özündə birləşdirən iki addımlı PCR protokolundan istifadə etməyi düşünün. Bu protokolla tavlama temperaturu uzatma temperaturundan artıq olmamalıdır.

Hansı genişləndirici temperaturdan istifadə etməliyəm, 68°C və ya 72°C?

İki addımlı PCR üçün və daha uzun şablonları gücləndirərkən (>4 kb) 68°C uzatma temperaturuna üstünlük verilir. Bu aşağı uzatma temperaturu gücləndirməyə təsir edən depurinasiya sürətini azaltmaqla daha uzun gücləndirmə məhsullarının məhsuldarlığını əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırır.

Üç addımlı standart PCR həyata keçirərkən və qısa fraqmentlərin gücləndirilməsi üçün (<4 kb) uzatma temperaturu kimi 72°C istifadə edilməlidir.

PCR üçün istifadə edilməli olan DNT şablonunun optimal miqdarı nədir?

Tələb olunan şablonun optimal miqdarı şablonun mürəkkəbliyindən və hədəf ardıcıllığının surət nömrəsindən asılıdır. Hədəf DNT ardıcıllığının təxminən 10 4 nüsxəsi gücləndirmə məhsulunu 25&ndash30 PCR dövründə aşkar etmək üçün tələb olunur.

  • Tipik olaraq, 1 mikroq insan genomik DNT-si 3,04 x 105 DNT molekulunu ehtiva edir. Əksər PCR tətbiqləri üçün 30&ndash100 ng insan genomik DNT-si kifayətdir. Təmizlik genləri kimi yüksək surətli hədəflər yalnız 10 ng şablon tələb edir. Daha mürəkkəb şablonlar üçün şablon məbləğləri 10 ng ilə 500 ng arasında dəyişir.
  • Tipik olaraq, 1 & mikroq E. coli genomik DNT 2 x 108 DNT molekulunu ehtiva edir, buna görə də şablonun tövsiyə olunan miqdarı 100 pg ilə 1 ng arasındadır.
  • Tipik olaraq, 1 mikroq lambda DNT-də 1,9 x 10 10 DNT molekulu var, buna görə də şablon girişi 100 pg qədər az ola bilər.
  • cDNA şablonunun miqdarı hədəfin surət nömrəsindən asılıdır. cDNA girişi adətən ekvivalent RNT girişi baxımından təsvir edilir. PCR reaksiyasında cDNT-nin miqdarı 10 pg (RNT ekvivalenti) qədər az ola bilər.

Qeyd etmək vacibdir ki, bütün polimerazlar həddindən artıq miqdarda şablona dözə bilməz. Tərkibində artıq şablon olan nümunələr üçün (1 və mikroq-a qədər) PrimeSTAR GXL DNT Polimerase tövsiyə edirik.

Uzun genomik hədəflərin gücləndirilməsi üçün kritik amillər hansılardır?

Şablon keyfiyyəti

DNT bütövlüyü uzun hədəflərin gücləndirilməsi üçün vacibdir. DNT zədələnməsi və yüksək temperaturda və aşağı pH-da DNT izolyasiyası və ya DNT-nin depurinasiyası zamanı DNT qırılması və daha çox miqdarda qismən məhsullar və ümumi məhsuldarlığın azalması ilə nəticələnir. DNT zədələnməsi asidik şəraitdə də baş verə bilər, buna görə də DNT şablonlarını yenidən suspenziya etmək üçün sudan istifadə etməyin. DNT pH 7&ndash8 və ya tamponlu məhlullarda ən stabildir.

PCR şərtləri

  • Depurinasiya hadisələrini azaltmaq üçün denatürasiya müddəti minimuma endirilməlidir.
  • Daha yüksək yumşalma temperaturunda başlanğıc PCR-dən istifadə edin və bir neçə dövr üçün dövr başına iki dərəcə azaldın.
  • Ərimə temperaturu olan astarların dizaynı (Tm) 68°C-dən yuxarı.

PCR polimerazları

Biz uzunmüddətli PCR üçün optimallaşdırılmış bir neçə PCR polimeraza təklif edirik. Takara LA Taq DNT polimeraza, TaKaRa LA Taq GC Buferli Polimeraz və PrimeSTAR GXL DNT Polimerazı GC məzmunundan və hədəf(lərin) ölçüsündən asılı olaraq tövsiyə olunur.

Şablonun GC ilə zəngin olub olmadığını necə müəyyən edə bilərəm?

GC nisbəti genomda dəyişir. >65% GC məzmunu olan şablonlar GC ilə zəngin hesab olunur. Genomun GC ilə zəngin bölgələri əsasən promotorlar, gücləndiricilər və cis-tənzimləyici elementlər daxil olmaqla tənzimləyici bölgələrdə cəmləşmişdir. GC ilə zəngin traktlar, PCR-nin yumşalma mərhələsində əriməyə bilməyən tərs təkrarlar və ya saç tıxacları strukturları əmələ gətirir. Buna görə də, GC ilə zəngin şablonların gücləndirilməsi iki DNT zəncirinin səmərəsiz ayrılması ilə maneə törədir. Bu, polimeraza genişlənməsinin vaxtından əvvəl dayandırılması səbəbindən kəsilmiş amplikonlarla nəticələnir.

GC ilə zəngin şablonların gücləndirilməsi üçün kritik amillər hansılardır?

PCR şərtləri

  • Şablonun tam denaturasiyasına imkan vermək üçün daha yüksək denaturasiya temperaturlarından istifadə edin (məsələn, 94°C və ya 95°C-dən fərqli olaraq 98°C).
  • GC ilə zəngin şablonlar üçün yumşalma vaxtlarını mümkün qədər qısa tutun.
  • Use primers with a higher Tm (>68°C), because annealing can occur at a higher temperature.

PCR polymerases

Use a polymerase optimized for amplification of GC-rich sequences. To find an enzyme, visit our selection guide.

Can DMSO be added to improve amplification of GC-rich templates?

We have heard from customers that improved amplification of GC-rich templates was obtained by adding DMSO to reactions using PrimeSTAR MAX DNA Polymerase or CloneAmp HiFi PCR Premix. The recommended concentration of DMSO is between 2.5% and 5%.

How can I optimize PCR conditions for AT-rich templates?

Some templates may have long AT-rich stretches that are hard to amplify under standard reaction conditions. The Plasmodium falciparum genome is about 80% AT, and regions flanking genes are often AT rich.

Polymerases recommended for GC-rich templates, such as EmeraldAmp GT PCR Master Mix, EmeraldAmp Max PCR master mixes, and PrimeSTAR GXL DNA Polymerase, are also suitable for AT-rich templates.

The advantage of having AT-rich templates is that a lower extension temperature can be used. For certain templates with AT content >80&ndash85%, the extension temperature can be lowered from 72°C to 65&ndash60°C. DNA replication at this reduced temperature appears to be reliable (Su et al. 1996).

İstinadlar

Su, X. Z., və b. Reduced Extension Temperatures Required for PCR Amplification of Extremely A+T-rich DNA. Nucl Acids Res. 24, 1574&ndash1575 (1996).

What is the role of magnesium in PCR, and what is the optimal concentration?

Magnesium is a required cofactor for thermostable DNA polymerases and is important for successful amplification. Without adequate free Mg 2+ , PCR polymerases are not active. In contrast, excess free Mg 2+ reduces enzyme fidelity and may increase nonspecific amplification. A number of factors can affect the amount of free Mg 2+ in a reaction, including DNA template concentration, chelating agents in the sample (e.g., EDTA or citrate), dNTP concentration, and the presence of proteins.

  • Some polymerases (e.g., Takara Ex Taq DNA polymerases and Takara LA Taq DNA polymerases) are supplied with a magnesium-free reaction buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2. For these enzymes, you can optimize the Mg 2+ concentration for each reaction. and Advantage 2 DNA polymerases are magnesium-tolerant polymerases that are supplied with buffers containing 3.5 mM of MgCl2.
  • The final concentration of Mg 2+ for PrimeSTAR GXL DNA Polymerase and PrimeSTAR MAX DNA Polymerase reactions is 1 mM this concentration increases fidelity for these enzymes.

What is the role of salt in PCR reactions?

Successful PCR requires that the DNA duplex separates during the denaturation step and that primers anneal to the denatured DNA. Salt neutralizes the negative charges on the phosphate backbone of DNA, stabilizing double-stranded DNA by offsetting negative charges that would otherwise repel one another. Potassium chloride (KCl) is normally used in PCR amplifications at a final concentration of 50 mM. To improve amplification of DNA fragments, especially fragments between 100 and 1,000 bp, a KCl concentration of 70&ndash100 mM is recommended. For amplification of longer products, a lower salt concentration appears to be more effective, whereas amplification of shorter products occurs optimally with higher salt concentrations. This effect is likely because high salt concentration preferentially permits denaturation of short DNA molecules over long DNA molecules.

It is important to note that a salt concentration above 50 mM can inhibit Taq polimerazlar.

Takara Bio USA, Inc.
United States/Canada: +1.800.662.2566 &bull Asia Pacific: +1.650.919.7300 &bull Europe: +33.(0)1.3904.6880 &bull Japan: +81.(0)77.565.6999
FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES. © 2021 Takara Bio Inc. All Rights Reserved. All trademarks are the property of Takara Bio Inc. or its affiliate(s) in the U.S. and/or other countries or their respective owners. Certain trademarks may not be registered in all jurisdictions. Additional product, intellectual property, and restricted use information is available at takarabio.com.

Takara Bio Europe is a member of the Takara Bio Group, a leading life sciences company that is committed to improving the human condition through biotechnology. Through our Takara, Clontech, and Cellartis brands, our mission is to develop high-quality innovative tools and services to accelerate discovery.


Process:

  • Sample preparation
  • Selection of primers
  • Reaction preparation
  • RT-PCR cyclic condition
  • Strand synthesis

Sample preparation:

Instead of DNA, RNA is extracted for the RT-PCR. For extracting the RNA use ready to use RNA extraction kits, it performs better and the yield of the extraction is even good.

We have to extract RNA, not DNA. Care must be taken while extraction as RNase present on every possible surface in a lab. RNase is an enzyme cleaves RNA. Here we are extracting total RNA, not mRNA for gene expression study.

Use ready to use RNA extraction kit to avoid problems in extraction. So use total RNA instead of the only mRNA.

Selection of primers:

1. Random primers:

Random primers are short single-stranded sequences of hexamers or octamers. The random primer binds at the complementary random location on the RNA. It can bind to many types of RNA (tRNA, rRNA or mRNA) and synthesizes the cDNA.

It is used in the RT-PCR particularly for the templates having a huge secondary structure. Random hexamer provides high yield cDNA. However, it can produce truncated cDNA.

The randoms primers work finely for prokaryotic DNA, rRNA, rRNA, and other smaller RNAs. But as it can’t bind to poly-A tail, it is less preferred for eukaryotic RNA amplification.

Smaller fragments of RNA can be easily amplified using randoms primers. 2 to 5 μM concentration of random primers is enough for RT-PCR. Higher concentration can make the reaction ineffective. The hexamer bindings on RNA are shown into the figure below.

2.Oligo (dT) primers:

The oligo (dT) primers are specially designed to amplify the mRNA. As we know that the mRNA has a poly-A tail, the oligo (dT) primers only bind to the poly-A tail of mRNA. Hence it is used to amplify entire mDNA into cDNA. It can even amplify smaller mRNAs as well.

The oligo (dT) primers are 12 to 18 nucleotide long single-stranded DNA which contains one additional nucleotide at the 3′ end to anchor the binding. The anchored (dT) primers prevent the primer slippage and primer denaturation from the poly-A tail.

However, the oligo (dT) primers can not synthesize RNA other than mRNA because the tRNAs, rRNAs, and micro RNA do not have the poly-A tail. 2 to 4 μM concentration of oligo (dT) primers are enough for RT-PCR, usually.

oligo (dT) primer binding on the template mRNA is shown into the figure below,

3.Sequence-specific primers:

The sequence-specific primers are commonly utilized in one-step RT-PCR to amplify a gene of interest. The sequences in the sequence-specific primers are complementary to the sequence of our interest therefore, it can’t amplify other gene regions.

Furthermore, it can only amplify a specific region, a large amount of primary template is need to perform RT-PCR using this type of primers. Due to its high sequence specificity, it is preferred more in gene expression studies.

The sequence-specific primers synthesize only certain regions from the RNA, therefore less amount is recommended to achieve success in the reaction. 0.5 to 1.5 μM concentration is enough for the RT-qPCR.

Qeyd: If sequence-specific primers and oligo (dT) primers both are used in a single reaction, use the only 1μM each primer.

The figure above shows the specificity of the sequence-specific primers, as it can only bind to the mRNA and cannot binds to gDNA.


Chemical and Synthetic Biology Approaches To Understand Cellular Functions - Part A

Justin M. Thomas , . Jordan L. Meier , in Methods in Enzymology , 2019

2.3.2 Reverse transcription of borohydride-treated RNA

Reverse transcription of sodium borohydride-treated ac4c results in partial incorporation of adenosine in the cDNA strand opposite the reduced ac4C. It should also be noted that reduced ac4C results in partial termination of reverse transcription at or adjacent to its location, often referred to as RT-stops ( Fig. 4 A). Of the reverse transcriptase enzymes screened by our lab TGIRT-III RT (Ingex) produces the highest proportion of full-length to stop product, as well as the most robust C-to-T signature of the RT enzymes screened by our lab ( Fig. 4 B). The following protocol describes the use of TGIRT RT for sequence-defined cDNA generation, which we have used to profile ac4C in model substrates and human 18S rRNA ( Thomas et al., 2018 ).

Dilute RNA from Section 2.2.2 to 100 pg/μL in water for use as template.

Perform TGIRT RT reactions. We typically carry out RT in 20 μL volumes in PCR tubes. Exemplary protocol: combine 4 μL 5 × TGIRT reaction buffer with 200 pg (2 μL) of template, 4 pM DNA primer, 2 μL 50 mM MgCl2 and sufficient ultra-pure water to bring the mixture to 17 μL. Note 1: TGIRT reactions are incubated at 57 °C, higher than many other commercially available reverse transcription enzymes. Therefore, it is essential to design the reverse transcription primer to form a stable duplex with the target sequence at this temperature. Note 2: Fluorophore or radiolabeled primers can be substituted at this step to assess RT stop via primer extension assay ( Fig. 4 )

Heat to 75 °C for 3 min and placed on ice for 1 min to anneal the primer and RNA.

After cooling, add 0.5 μL TGIRT-III, 0.5 μL Rnasin Plus and 100 μL 100 mM DTT. Incubate 20 min at room temperature. Initiate the reverse transcription reaction by adding 1 μL of optimized dNTP mix. In optimization studies we have found that decreasing the dGTP concentration from 500 to 250 μM increases the sensitivity of C-to-T misincorporation. Incubate the reaction for one hour at 57 °C and proceed to PCR amplification step ( Section 2.3.3 ).

Note on additional controls: We recommend performing a reverse transcription reaction in the absence of template to ensure the reagents being used are free from contaminating RNA/DNA. It is also essential to include control reactions that lack RT enzyme for each biological replicate, which allows confirmation that the PCR reaction ( Section 2.3.3 ) is amplifying only cDNA generated through reverse transcription and not contaminating gDNA from other sources.


Materiallar və metodlar

Nümunə kolleksiyası

The study was approved by the Institutional Human Ethics Committee of All India Institute of Medical Sciences, Bhopal with the waiver of consent as per the “National Ethical Guidelines for Biomedical and Health Research” from Indian Council of Medical Research, a government body which makes and enforces policies of medical research in India. As per the guidelines, a waiver of consent may be granted by institutional ethics committee if the research is done on anonymized biological samples and/or the primary purpose of the research is refinement and improvement of the public health programs. As our study met both these criteria it the waiver of consent was granted. The study was conducted in 2 phases (a) pooled testing of simulated 5-sample pools, and (b) comparative evaluation of individualized and 4-sample pooled testing strategies. Nasopharyngeal and/or oropharyngeal swabs samples from COVID-19 suspects were collected by trained healthcare workers in Viral Transport Medium (VTM) and transported at 2–8°C to the Regional Virology Laboratory, All India Institute of Medical Sciences, Bhopal. All samples used in this study were anonymized before being accessed by the research team. For the first phase of the study archived samples were used as described below, while the second phase was undertaken on freshly collected samples.

Simulated pooling of retrospective samples

In order to find out the relative performance of 5-sample pools comprising of varying proportions of positive and negative samples, we randomly chose 50 anonymized positive and 415 negative samples from our departmental repository collected between first week of April and second week of May 2020. These samples were accessed on May 20–27, 2020 for the experiments. We used a web-based random number generator to create simulated pools of different constitutions with positive and negative samples as depicted in Table 1 by mixing 200 μl of each sample in a microfuge tube.

Prospective consecutive pooling

For this part of the study, aliquots of 1000 consecutive samples were anonymized and processed parallelly for individualized and pooled testing in a blinded manner. To evaluate the sensitivity of pooled analysis in two different prevalence settings, 500 samples were collected in June 2020 (scenario 1) and another 500 in August 2020 (scenario 2) from the same geographical region. A total of 250 pools of 4 anonymized consecutive samples each (125 each in June and August 2020) were thus created by mixing 200 μl of each sample and tested for SARS-CoV-2 along with individual samples as described earlier [15].

RRT-PCR for COVID-19 diagnosis

RNA from the simulated pools and the samples of scenario 1 were extracted using MGI kit (BGI Biotechnology, Wuhan, China) as per the manufacturer’s protocol and subjected to COVID-19 diagnosis using Lab Gun® fluorescent rRT-PCR diagnostic kit (Lab Genomics, Suwon-si, Republic of Korea). RNA from samples collected in scenario 2 were extracted using Hi-Media Viral RNA extraction kit (Hi-Media) and rRT-PCR assays were performed using Meril Diagnostic (Vapi, India) and 3B BlackBio Biotech (Bhopal, India) as per the kit protocol.

Calculation of reduction in cost and turnaround time for COVID-19 rRT-PCR test

For calculating the expenditure of rRT-PCR test, cost of nucleic acid extraction kits RT-PCR kits and other laboratory consumables were taken in the account. In a single 96 well PCR plate 93 samples and three controls were run and total time to taken for one run was 6.5 h which included time for sample aliquoting, RNA extraction and performing the PCR.

Statistika

The quantification of agreement and bias between the individual Ct value and pool Ct value was determined by Bland-Altman (BA) plot. X-axis of BA plot represented mean Ct value of individual sample and pool while Y-axis represented difference in individual and pool Ct value. We estimated the agreement interval at 95% confidence interval (CI) and each x-y paired observation was colored as per the number of rRT-PCR positive sample(s) in the pool. The ‘BlandAltmanLeh’ and ‘ggplot2’ package with base R software was used to draw the plot.

In the next step the Kendell’s tau coefficient between individual Ct value and pooled Ct value was determined. The reason for choosing Kendell’s tau over other correlation measure (Pearson or Spearman measure) was influenced by the construct of the study where the estimated probability of agreeability (concordance) between the paired individual and pooled Ct value is a major concern. Kendell’s tau, being a distribution-free (independent) non-parametric quantile base measure, seems more robust in this scenario. We used ‘ggpubr’ in R for this purpose. In order to visualize the effect of number of RT-PCR positive samples in 4- and 5-sample pools on Ct value separately, we created the best fit line for nested subgroup as per number of positive samples in both 4-sample and 5-sample pools.


3. Methods

3.1. Isolation of Total RNA

Obtaining high quality and intact RNA is the first and often the most critical step in performing RT-PCR and real-time PCR. RNA is easily degraded since RNase is very hard to inactivate. Several precautions need to be taken to prevent RNA from degradation. People should always wear a clean lab coat, disposable gloves, and change gloves frequently. The bench should be clean. Any aqueous solutions, tubes, and pipettes used for the procedure should be sterile and RNAse-free. To avoid contaminating your sample with RNases, do not talk while processing RNA extraction.

Currently, there are a number of RNA isolation kits commercially available. Although it is convenient, time-saving, and avoids contact with phenol/chloroform using commercially available kits, those kits using silica-membrane spin columns may not be ideal for studies of insoluble nanoparticle since the nanoparticles may clog the membrane pore of the spin column. Therefore, it is important to choose the right reagents or kits for total RNA isolation according to different experiments and specific characteristics of different nanoparticles. In our laboratory, we use TRI Reagent to isolate total RNA for nanoparticle studies. TRI Reagent is a mixture of guanidine thiocyanate and phenol in a monophase solution, which can effectively dissolve DNA, RNA, and protein after homogenization or lysis of tissue samples. It performs well with large or small amounts of tissue or cells. Here, we describe the procedures for isolating total RNA using TRI Reagent according to the manufacturer's instructions (1).

3.1.1. Sample Preparation

Lyse or homogenize the sample (see Notes 1𠄳).

Tissue (see Note 4): homogenize tissue samples in TRI Reagent (1 ml per 50� mg of tissue) in an appropriate homogenizer (see Notes 5 and 6). The volume of the tissue should not exceed 10% of the volume of the TRI Reagent.

Monolayer cells: lyse cells directly on the culture dish or plate (see Notes 7 and 8). Use 1 ml of the TRI Reagent per 10 cm 2 of glass culture plate surface area. After addition of the reagent, the cell lysate should be passed several times through a pipette to form a homogenous lysate (see Note 9).

Suspension cells: isolate cells by centrifugation at 1,000 rpm for 5 min and then lyse in TRI Reagent by repeated pipetting. One milliliter of the reagent is sufficient to lyse 5� × 10 6 animal, plant, or yeast cells, or 10 7 bacterial cells (see Notes 10 and 11).

In order to minimize the possibility of DNA contamination in the RNA extracted by TRI Reagent, after homogenization, centrifuge the homogenate at 12,000 × g for 10 min at 2𠄸ଌ to remove the insoluble material (extracellular membranes, polysaccharides, and high molecular mass DNA). The supernatant contains RNA and protein. If the sample had a high fat content, there will be a layer of fatty material on the surface of the aqueous phase that should be removed. Transfer the clear supernatant to a fresh tube.

To ensure complete dissociation of nucleoprotein complexes, allow samples to stand for 5 min at room temperature.

Add 0.2 ml of chloroform (see Note 12) per ml of TRI Reagent used. Cover the sample tightly, shake vigorously for 15 s, and allow to stand for 2� min at room temperature.

Centrifuge the resulting mixture at 12,000 × g for 15 min at 2𠄸ଌ.

3.1.2. RNA Isolation

Transfer the colorless upper aqueous phase to a fresh tube and add 0.5 ml of isopropanol per ml of TRI Reagent used in Subheading 3.1.1, step 1 and mix. Allow the sample to stand for 5� min at room temperature (see Note 13).

Centrifuge at 12,000 × g for 10 min at 2𠄸ଌ. The RNA precipitate will form a pellet on the side and bottom of the tube.

Remove the supernatant and wash the RNA pellet by adding a minimum of 1 ml of 75% ethanol per 1 ml of TRI Reagent used in sample preparation (see step 1 of Subheading 3.1.1). Vortex the sample and then centrifuge at 7,500 × g for 5 min at 2𠄸ଌ (see Notes 14 and 15).

Briefly dry the RNA pellet for 5� min by air-drying or under a vacuum (see Note 16). Add an appropriate volume of molecular grade water to the RNA pellet. To facilitate dissolution, mix by repeated pipetting with a micropipette at 55�ଌ for 10� min (see Note 17).

Measure the concentration of total RNA: in a sterile and RNase-free tube, add 48 μl of molecular grade and nuclease-free water and 2 μl of total RNA from step 3 to make a total volume of 50 μl. Mix well.

Measure the absorbance at 260 and 280 nm with a Spectrophotometer (DU 730 Spectrophotometer, Beckman Coulter, Fullerton, CA) (see Notes 18�). 1A260 unit/ml = 40 μg/ml.

3.2. Reverse Transcription

Reverse transcription involves the synthesis of DNA from RNA by using an RNA-dependent DNA polymerase, the tərs of normal transcription, which is from RNA to DNA. Although there are many kits commercially available for RT, the reverse transcriptase used in those kits usually is M-MLV reverse transcriptase from the Moloney murine leukemia virus or AMV reverse transcriptase from the avian myeloblastosis virus. M-MLV reverse transcriptase is the preferred reverse transcriptase in cDNA synthesis for long messenger RNA (mRNA) templates (ϥ kb) because the RNase H activity of M-MLV reverse transcriptase is weaker than the commonly used AMV reverse transcriptase (2). Since M-MLV reverse transcriptase is less processive than AMV reverse transcriptase, therefore, more units of the M-MLV enzyme are required to generate the same amount of cDNA as in the AMV reaction (2). The following are the basic procedures for RT using M-MLV reverse transcriptase according to the manufacturer's instruction (2).

Preheat a water bath to 70ଌ.

In a sterile RNase-free 0.2 ml PCR tube, add 2 μl of Oligo (dT)18 primer (0.5 μg/μl) and 2 μg of total RNA in a total volume of 15 μl with molecular grade and nuclease-free water (total volume is 17 μl).

Put the PCR tubes which contain the primer and total RNA in a plastic PCR rack (see Note 22), then put the rack in the 70ଌ water bath for 5 min to melt secondary structures within the template.

Cool the samples immediately by putting the tubes on ice to prevent secondary structures from reforming.

In a new sterile RNase-free 0.5 ml tube, mix the following reagents according to the number of samples. Each reaction should contain: 1 μl M-MLV reverse transcriptase, 1.25 μl of 10 mM dNTP, 0.75 μl Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor, and 5 μl of 5× M-MLV reaction buffer (see Notes 23 and 24). Mix gently by flicking the tube, then spin briefly.

Spin the PCR tubes from step 4 briefly to collect the solution at the bottom of the tube and put the tubes back onto the PCR rack.

Add 8 μl of the above mixture (step 5) into each PCR tube, mix gently by flicking the tube, then spin briefly. The total volume in the PCR tube should now be 25 μl.

Put the PCR tubes on to a thermal cycler and incubate at 42ଌ for 60 min (see Note 25), at 94ଌ for 5 min, then keep at 4ଌ (see Note 26).

When finished, the samples can be stored at �ଌ for later PCR experiments.

3.3. Polimeraza zəncirvari reaksiya

Almost all PCR applications employ a heat-stable DNA polymerase, such as Taq polymerase. There are many DNA polymerases commercially available. Although their efficiency may be different, they are suitable for regular RT-PCR to determine the expression level of mRNA. Some experiments which will use PCR products for cloning purposes, especially those for cloning of promoter region with high G-C content, need to use high fidelity DNA polymerase. The PCR is commonly carried out in a reaction volume of 10� μl in small reaction tubes (0.2𠄰.5 ml volumes) in a thermal cycler. The following is an example of a PCR performed in our laboratory.

In a sterile nuclease-free microcentrifuge tube, mix the following reagents on ice. Each reaction contains: 1 μl of 5 μM each primer, 0.5 μl of 10 mM dNTP, 5 μl of 5× Green GoTaq Buffer, 0.25 μl GoTaq DNA polymerase (5 U/μl), and 16.25 μl of nuclease-free water (total 24 μl) (see Notes 27�). Mix gently by flicking the tube, then spin briefly.

In each PCR tube, add 24 μl of the above mixture to the bottom of the tube.

Add 1 μl of cDNA sample in each PCR tube. Mix gently by flicking the tube, then spin briefly.

Put the PCR tube onto a thermal cycler.

According to the primers and the length of PCR product, set up parameters for PCR (see Notes 30�), then run.

Separate the PCR products by agarose gel electrophoresis and visualize with ethidium bromide (see Notes 35�).

After separation on an agarose gel, PCR products are visualized by Gel Doc XR ( Fig. 1 ) and analyzed by Quantity One.

mRNA expression level of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) by RT-PCR. Total RNA was extracted from human monocytes U937 by using TRI Reagent and reverse transcripted to cDNA by using M-MLV reverse transcriptase (Promega). PCR was performed on a thermal cycler (Mastercycler, Eppendorf) by using GoTaq DNA polymerase (Promega). The PCR products were separated on 1% agarose gel. Housekeeping gene GAPDH was used as internal control. M, 100 bp DNA Ladder (Fisher) (1) cells without any treatment were used as control (2) cells were treated with 5.0 μg/ml of cobalt nanoparticles for 24 h.

To semi-quantify the expression level of mRNA, intensities of target gene products are normalized to that of housekeeping gene to obtain the relative densities.

3.4. Real-Time PCR

Traditional PCR uses agarose gel for detection of PCR amplification at the final phase or endpoint of the PCR (plateau). However, real-time PCR allows for the detection of PCR amplification in the exponential growth phase of the reaction. Theoretically, there is a quantitative relationship between the amount of starting target sample and the amount of PCR product at any given cycle number. Real-time PCR detects the accumulation of amplicon during the reaction. The data is then measured at the exponential phase of the PCR, which makes quantitation of DNA and RNA easier and more precise than traditional methods. There are two methods, which are often used in the laboratory. One is the 5′ nuclease assay in which an oligonucleotide called a TaqMan® Probe is added to the PCR reagent master mix. This probe is designed to anneal to a specific sequence of template between the forward and reverse primers and is also designed with a high-energy dye termed a Reporter at the 5′ end, and a low-energy molecule termed a Quencher at the 3′ end. When this probe is intact and excited by a light source, the Reporter dye's emission is suppressed by the Quencher dye as a result of the close proximity of the dyes. When the probe is cleaved by the 5′ nuclease activity of the enzyme, the distance between the Reporter and the Quencher increases causing the transfer of energy to stop. The fluorescent emissions of the reporter increase and the quencher decrease. An increase in Reporter fluorescent signal is directly proportional to the number of amplicons generated. Another real-time PCR method is by using SYBR Green Dye, which can bind the minor groove of any double-stranded DNA molecule. When SYBR Green dye binds to double-stranded DNA, the intensity of the fluorescent emissions increases. As more double-stranded amplicons are produced, SYBR Green dye signal will increase. The following is an example of real-time PCR by using iQ™ SYBR Green Supermix and performed on an iQ5 multicolor real-time PCR detection system.

Thaw all components used in step 2 at room temperature. Mix vigorously, and centrifuge to collect contents to the bottom of the tubes, then put the tubes on ice.

In a sterile nuclease-free microcentrifuge tube, mix the following reagents on ice. Each reaction contains: 1 μl of 5 μM of each primer, 10 μl of 2× iQ™ SYBR Green Supermix, and 7 μl of nuclease-free water (total 19 μl) (see Notes 38 and 39). Mix gently by flicking the tube, then spin briefly.

In each well of 96-well PCR plate, add 19 μl of the above mixture to the bottom of the tube.

Add 1 μl of cDNA sample in each well (see Note 40). Cover the plate with Microseal® 𠇋” Film (see Note 41).

Mix gently by flicking the tube, then spin the plate briefly.

Put the PCR plate in an iQ5 multicolor real-time PCR detection system.

According to the primers and the length of PCR product, set up parameters for real-time PCR, then run (see Notes 42�).

Analyze the data. If using SYBR Green, there should be only one peak in the melting curve ( Fig. 2 ) (see Note 45).

Real-time PCR for rabbit IL-1β. Rabbit ear skin wound tissues were used for total RNA isolation by TRI Reagent (Sigma) and reverse transcripted to cDNA by using M-MLV reverse transcriptase (Promega). Real-time PCR was performed on an iQ5 multicolor real-time PCR detection system (Bio-Rad) by using 2× iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). (a) The amplification curves (b) the melting curves. Single peak in the melting curve represents that only the real target gene is amplified (c) the PCR standard curve (Color figure online).

In our laboratory, the relative expression level of each gene is calculated as fold dilution (see Note 46) by using a standard curve for each gene. Standard curves are obtained by real-time PCR using 3, 1, and 1 μl of 10-, 100-, and 1,000-fold dilution, respectively, of cDNA obtained from sample without any treatments (see Note 47). The expression level of each gene is then normalized to the relative expression level of housekeeping gene in the same sample.


Applications and Advantages RT-PCR

Applications: The reverse transcriptase PCR analysis is used in many bio-molecular analyses.

RT-PCR is the Golden Standard test for detecting viral infections, including HIV, HPV, SARS, COVID-19 coronavirus, etc.

Diagnosis and identification of microbial diseases

RT-PCR measures viral load and expression in infections

It determines tissue-specific gene expression and measures tissue-specific mutant alleles.

Applied in cancer therapy to monitor response and prognosis to therapy

Gene therapy and gene insertion studies apply RT-PCR techniques

A simple, rapid, cost-effective, and easy to use analysis

Quantitative and qualitative analysis can be done

Requires a smaller amount of sample

Complex electrophoresis after PCR processing is not necessary

Greater specificity and sensitivity


Videoya baxın: ПЦР-диагностика. Мифы и реальность. Polymerase Chain Reaction PCR (Avqust 2022).