Məlumat

Fermentlərin kinetikası

Fermentlərin kinetikası


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Fermentlərin kinetikasını necə öyrənməyi başa düşə bilmirəm. Deyin ki, məndə lipaz var və flüorogen substratdan istifadə edərək bu lipazanın kinetikasını öyrənmək istəyirəm, bunu necə edə bilərəm? Anladığım qədər 96 və ya daha çox quyu boşqabından istifadə edərdim və hər birində substratın miqdarını artırardım və ya fermentin miqdarını artırardım və flüoresan mikroskop və ya spektrofotometrdən istifadə edərdim?


Mən burada tapa bildiyim qədər sadə dildə bəzi əsas tərifləri verməyə çalışacağam.

Fərqli kontekstlərdə tamamilə fərqli davrana biləcəyi hüceyrədən kənarda olan fermentləri öyrənmək çətindir. Verilmiş fermenti öz sinfinə görə təsnif edirik kcat, Km və mexanizmlə (kataliz etdikləri reaksiya növü).

kcat bir növ fermentin maksimum sürətidir - ətrafda çoxlu substrat olduqda - kataliz sürəti nə qədərdir. İdeal olaraq sıfır məhsul olacaq.

Km bir növ fermentin onun substratına tərs yaxınlığıdır, lakin reaksiyanın maksimum sürətinin yarısıdır.

Bir neçə tərifi olan mexanizm, əsasən, neçə substratın bağlandığını və hansı ardıcıllıqla, hansı məhsulların buraxıldığını və hansı qaydada olduğunu və reaksiyada görünə biləcək hər hansı bir ara məhsulun hansı ardıcıllıqla olduğunu soruşur.

məs.: A -> A* -> B* -> B A + B -> C + D

Mən "bir növ" deyirəm, çünki siz heç vaxt fermentin canlı hüceyrələrdə maksimum sürətlə işlədiyini görə bilməzsiniz. Substratlar adətən orada dərəcəyə nəzarət edilir - onlar lazım olan qədər hər hansı bir tərkibə malikdirlər.

Bütün bu nömrələrin və təyinatların istifadə edildiyi kontekst çox vaxt taksonomik olur - yəni siz kateqoriyalara ayıra, çeşidləyə və fermentin nə etdiyini təsvir edə bilərsiniz. Təcrübədə rəqəmlərdəki böyük fərqlər bir fermentin digərinə nisbətən nə qədər faydalı olduğunu təsvir edə bilər, lakin bu, bir fermentin mütləq necə davranacağını sizə izah etmir. in vivo və ya sənaye tətbiqində tamamilə necə işləyəcəyi. Bu sadəcə başlanğıcdır.


Ferment Kinetikası

Xülasə:

Fermentlərin kinetikasına dair bu fəsildə fermentlərin kataliz etdiyi reaksiyaların sürətlərinə təsir edən amillər Michaelis-Menten tənliyindən istifadə edərək riyazi olaraq təsvir edilmişdir. Michaelis-Menten tənliyinin komponentləri təsvir edilmiş və təsvir edilmişdir. Tətbiqlər və komponentlər daxil olmaqla, substratın doyma əyriləri və ikiqat qarşılıqlı (Lineweaver-Burk) qrafikləri göstərilir və müzakirə edilir. Enzim inhibitorları geri dönməz, geri dönən və rəqabətli, rəqabətsiz və rəqabətsiz olanlara diqqət yetirməklə əhatə olunur. Terapevtik inhibitorların nümunələri verilmiş, diaqnostik məqsədlər üçün istifadə olunan serum fermentlərinin nümunələri verilmişdir. İzozimlər, həmçinin kofaktorlar və kofermentlər müzakirə olunur. Diaqnostik agent kimi izozimlər müzakirə olunur. Miokard hüceyrələrinin zədələnməsi və nekrozunun markerləri kimi istifadə edilən troponin-I-in ürək izoziminin qan səviyyələri müzakirə olunur. Konjestif ürək çatışmazlığı olan heyvanlarda ürək hipertrofiyası və ya dilatasiya markerləri kimi istifadə edilən N-terminal-pro-Brain Natriuretik Peptidinin (NT-proBNP) qan səviyyələri əhatə olunur.


Fermentlərin Kinetikası və Sistem Biologiyası

Mən nəhayət ki, Fermentlərin Kinetikası və Sistem Biologiyası adlı ilk dərsliyimi nəşr etməyə çatdım.

Bazarda bir çox ferment kinetikası dərslikləri var, baxmayaraq ki, bəziləri artıq köhnəlib. Bu kitabların əksəriyyəti fermentlərin kinetik mexanizmlərinin aydınlaşdırılmasına yönəlib. “Ferment Kinetikası və Sistem Biologiyası” daha çox model qurucuları üçün fermentlərin kinetikasına yönəlib. Bu, modellərin necə qurulacağına dair kitab deyil, istifadə edə biləcəyiniz kinetik qanunlara və qarşılaşa biləcəyi problemlərə ümumi baxışdır. Kitabda həmçinin gen tənzimləyici şəbəkə modellərini qurarkən istifadə edilə bilən elastikliklər, ümumiləşdirilmiş dərəcə qanunları və dərəcə qanunları haqqında unikal fəsillər var. Kitab sistem biologiyası kursu üçün bakalavr dərsliyi və ya əlavə kitab (sinif almaq üçün endirimlər mövcuddur) və ya sistem biologiyası və ya sintetik biologiya sahələrində məzunlar və digər tədqiqatlar üçün istinad bələdçisi kimi uyğundur.

Sistem Biologiyası üçün Ferment Kinetikası

Kitabın qiyməti e-kitab üçün 9,95 dollar, kağız üzlü çap üçün isə 29,95 dollardır. Elektron kitab versiyası üçün ikinci nəşr çıxana qədər pulsuz yeniləmələr var. Sinif istifadəsinə endirimlər mövcuddur. Elektron kitab həmçinin beynəlxalq oxucular üçün xüsusi 50% endirimlə təqdim olunur, lakin bunlar daxil deyil: ABŞ, Kanada, Qərbi Avropa (keçmiş şərq bloku daxil deyil), Avstraliya, Yeni Zelandiya, Yaponiya, Səudiyyə Ərəbistanı, Birləşmiş Ərəb Əmirlikləri, İsrail, Oman, Küveyt, Qutar və Bəhreyn.


Fermentlərin tənzimlənməsi

Rəqabətli və rəqabətsiz inhibə

Fermentlər digər birləşmələrin müdaxiləsi ilə inhibə edilə və ya aktivləşdirilə bilər. Bunlar (K_m) və ya (V_) dəyişdirərək reaksiyaya təsir edəcək.) reaksiya. Əksər ferment inhibitorları tərs təsir göstərir və fermentdə qalıcı dəyişikliklərə səbəb olmur. Bununla belə, hədəf fermenti kovalent və daimi olaraq dəyişdirən geri dönməz inhibitorlar da var. Bunlara intihar inhibitorları deyilir.

İnhibitorlar kimi təsnif edilə bilər rəqabətli və ya rəqabətsiz və bunu normal və inhibe edilmiş reaksiyaların kinetikasını müqayisə etməklə müəyyən etmək olar.

Şəkil 1.6: Rəqabətli və rəqabətsiz inhibə. (Kindred Grey 2020 LibreText CC BY 4.0 vasitəsilə Marks Medical Biochemistry-dən uyğunlaşdırılıb)

Rəqabətli inhibitorlar fermenti aktiv yerdə bağlayır və bağlanmaq üçün substratla rəqabət aparır. Çoxları substratın analoqu kimi fəaliyyət göstərir. Buna görə inhibitorun iştirakı ilə daha yüksək substrat konsentrasiyası Michaelis sabitinin (K_m) artmasının yarı maksimum sürətinə nail olmaq üçün lazımdır. Substrat konsentrasiyaları yüksəldikdə, bu, son nəticədə inhibitoru sıxışdıracaq və (V_) çatacaq. Maksimum dərəcə, (V_), buna görə də rəqabətli inhibitorlardan təsirlənmir. Bu halda, yoxdur dəyişdirin (V_) çünki rəqabət substratın konsentrasiyasının artması ilə aradan qaldırıla bilər, lakin bir var görünən artım 5-dən (K_m) Şəkil 1.5 (K_m) və (V_) təsvir etmək üçün Lineweaver-Burk planı). (Marks rsquo Medical Biochemistry-dən uyğunlaşdırılmışdır) Şəkil 1.6 Rəqabətli və rəqabətsiz inhibə. (Marks Medical Biochemistry-dən uyğunlaşdırılmışdır) (V_) çatmaq üçün daha böyük substrat konsentrasiyası kimi reaksiya lazımdır.) (Şəkil 1.6A).

Əksinə, rəqabətsiz inhibitorlar fermenti substratın bağlanma yerinə alternativ yerdə bağlayır və buna görə də onun təsirini substratı artırmaqla aradan qaldırmaq mümkün deyil. Bu halda, (K_m) dəyişməz qalır, lakin (k_) (məhsulun əmələ gəlmə sürəti) və beləliklə (V_), azalır. Geri dönməz inhibitorlar adətən qeyri-rəqabətli inhibe növü ilə nəticələnir, çünki aktiv ferment [E] konsentrasiyası azalır (Şəkil 1.6B).

İnhibitorların fəaliyyəti Lineweaver‒Burk süjetində aydın şəkildə göstərilə bilər. Bu tip süjetdə y oxu ilə yaxınlaşma xətlərinin kəsişməsi 1/(V_) uyğun gəlir.) x oxunun kəsilməsi isə -1/(K_m) dəyərini verir. Məhz buna görə də rəqabətli inhibitor (A, qırmızı) olmadıqda (mavi) və mövcud olduqda alınan düz xətlər y oxunda (1/ (V_) kəsişir.), dəyişməz), qeyri-rəqabətli inhibitorlar (B, qırmızı) isə daha yüksək y-kəsici, lakin dəyişməmiş x-kəsici (1/(V_) ilə düz xətt ilə nəticələnir.) artıb, (K_m) dəyişməyib) (Şəkil 1.6).


Fermentlər bioloji katalizatorlardır

Hüceyrələrdə demək olar ki, bütün reaksiyalar ümumiyyətlə zülal olan fermentlər tərəfindən kataliz edilir. Fermentlər reaktivlərə bağlanır, bunlara deyilir substratlar, və məhsulların formalaşmasına vasitəçilik edir. Fermentlər bioloji katalizatorlardır və kimyəvi katalizatorlarla eyni xüsusiyyətlərə malikdirlər. Bundan əlavə, zülallar bağlandıqları substratlar və katalizlədikləri reaksiyalar üçün böyük spesifikliyə malikdirlər. Bundan əlavə, onların fəaliyyəti fəaliyyəti artırmaq və ya azaltmaq üçün tənzimlənə bilər. Çox vaxt fermentlər kimyəvi katalizatorlardan daha təsirli katalizatorlardır. H-nin parçalanmasını yenidən nəzərdən keçirin2O2, bu, dəmir ionlarının iştirakı ilə 3 x 10 4 dəfə, katalaza fermentinin iştirakı ilə isə 1 x 10 8 dəfə sürətlənir. Fermentlər adətən reaksiya sürətini 10 7 - 10 14 dəfə artırır.


Ferment Kinetikasını Təsvir etməyin Yeni Yolu

Michaelis-Menten tənliyi fermentin sərbəst buraxılmasından əvvəl hansısa məhsul yaratmaq üçün substratla qarşılıqlı əlaqədə olduğu fermentativ reaksiyanın dinamikasını təsvir etmək üçün istifadə olunur. Bununla belə, hüceyrələr müxtəlif məqsədlər üçün, o cümlədən məhsulların parçalandığı və ya yığıldığı maddələr mübadiləsi və ya hüceyrələrin və ya zülalların bir-biri ilə əlaqə saxlamasına imkan verən siqnallar daxil olmaqla, bir çox fərqli fermentdən asılıdır. Son işlərin hesabatında Milli Elmlər Akademiyasının Materialları klassik tənliyin bütün ferment dinamikasını xarakterizə etmək üçün kifayət etmədiyini irəli sürdü.

"Hazırda biz siqnal fermentlərini metabolik fermentlər üçün hazırlanmış tənliklərlə təsvir edirik", - tədqiqatın müəllifi Magnus Kjægaard izah etdi. "Məsələn, bədənimiz üçün enerji yaradan metabolik fermentlər dəqiqədə bir çox substratı emal etməlidir. Bunun əksinə olaraq, siqnal fermentləri açar rolunu oynayır və çox vaxt təsir göstərmək üçün yalnız bir substratı çevirmək lazımdır. Buna görə də, metabolik fermentləri təsvir etmək üçün hazırlanmış tənliklər siqnal verən fermentlər üçün daha az aktualdır."

Michaelis-Menten tənliyi biyokimyaçılar tərəfindən bir fermentin substratının səviyyəsi artdıqda onun aktivliyinin necə artdığını göstərmək üçün yüz ildən çoxdur istifadə olunur. Ancaq bir ferment onun substratına birləşdirilərsə, nə qədər mövcud olduğu əhəmiyyətsiz olur və reaksiyanın sürəti bunun əvəzinə bir əlaqədən asılıdır. Enzimatik reaksiyaların sürəti öyrənilərkən molekulyar strukturun dəyişməsi adətən nəzərə alınmır.

"Adətən, cavab verməyə çalışdığınız sual, fermentin fəaliyyətini hansı qrafik formasının təsvir etdiyidir. Bizim daha fundamental problemimiz var idi” dedi tədqiqatın ilk müəllifi Mateusz Dyla. "Biz konsentrasiya əvəzinə X oxuna nə qoymalıyıq?"

Tədqiqatçılar ferment və onun substratı arasındakı əlaqənin dəyişdirilə biləcəyi bir model yaratdılar. Çevik birləşdiricinin uzunluğu fermentin katalizinin birinci mərhələsinə təsir etdi. Tədqiqatçılar ferment-substrat əlaqəsindən asılı olaraq fermentin sürətinin necə dəyişdiyini təsvir edə biləcək bir tənlik hazırladılar. İş bu əlaqələrin lazımi səviyyədə qiymətləndirilmədiyini göstərir.

Bir ferment və onun substratı arasındakı bağlayıcı reaksiyalara təsir göstərə bilər. Ferment bir anda yalnız birinə qoşulduqda iki substratın hər biri çox fərqli sürətlər istehsal edə bilər.

"Bu, mənim bir hotdoq yeməyin nə qədər vaxt apardığı ilə bütün həftə ərzində nə qədər hotdoq yeyə biləcəyim arasındakı fərq kimidir" Maqnus izah etdi. "Bir həftə ərzində mən hot-doqları nə qədər tez həzm edə biləcəyimlə məhdudlaşacağam. Bu, ilk hotdoq yemək üçün lazım olan vaxta aid deyil. Buna görə də iki növ ölçmə fərqli nəticələr verir. Əgər siz kinaz açarlarını başa düşmək istəyirsinizsə, diqqətinizi katalizin birinci raunduna yönəltməlisiniz."

Bu iş kinazlar adlanan fermentləri hədəf alan dərmanların inkişafına təsir göstərə bilər. "Biz ümid edirik ki, bir gün yalnız fermenti deyil, həm də onun substratına necə bağlandığını hədəfləyən dərmanlar hazırlamaq mümkün olacaq", Mateusz əlavə edib.


Fermentlərin kinetikası - Biologiya

Keçici Dövlət Fermentinin Kinetikası

Kenneth A. Johnson, Kimya və Biokimya Departamenti, Hüceyrəvi və Molekulyar Biologiya İnstitutu, Ostindəki Texas Universiteti, Ostin, Texas

Keçici vəziyyətin kinetik analizi ferment katalizli reaksiyanın yolu boyunca elementar addımları müəyyən edir. Metodlar bir ferment dövrü ərzində aktiv sahədə əmələ gələn ara məhsulların və məhsulların birbaşa müşahidəsinə imkan vermək üçün kifayət qədər ferment konsentrasiyası ilə substratın sürətlə qarışdırılmasına əsaslanır. Dayandırılmış axın metodları qarışıqdan sonra vaxt funksiyası olaraq optik siqnallarda dəyişiklikləri (yəni, absorbans, flüoresan və işığın səpilməsi) izləməklə reaksiyaların müşahidəsini təmin edir. Substratın konsentrasiyadan asılılığının təhlili substratın bağlanmasından sonra baş verən hadisələrin ardıcıllığını müəyyən edə bilər. Sürətli-kimyəvi söndürmə axını üsulları iki ardıcıl qarışdırma hadisəsini tələb edir: biri reaksiyanı başlatmaq, ikincisi söndürmə agentinin əlavə edilməsi ilə reaksiyanı dayandırmaq. Daha sonra məhsuldan radio ilə işarələnmiş substratı həll etmək üçün çox vaxt xromatoqrafiya yolu ilə əmələ gələn məhsulun miqdarını ölçür. Substratın məhsula çevrilməsini birbaşa məlum konsentrasiya miqyasında müşahidə etmək mümkün olduğundan, sürətli söndürmə təcrübələri birbaşa şərh edilə bilər. Yekun təhlildə, ən ciddi şərh, reaksiya yolunu və kinetik əhəmiyyətli ara məhsulların qarşılıqlı çevrilmə sürətlərini yaratmaq üçün eyni vaxtda həm dayandırılmış axın, həm də sürətli söndürmə axını məlumatlarına uyğun qlobal təhlilə əsaslanır. Müvafiq olaraq, keçici vəziyyətin kinetik üsulları fermentlərin spesifikliyi və effektivliyi üçün kinetik və termodinamik əsasları yaratmaq üçün hər bir addımın birbaşa ölçülməsi yolu ilə reaksiya ardıcıllığını təyin etməyə imkan verir.

Struktur və kinetik üsullar, fermentlərin diqqətəlayiq effektivliyini və spesifikliyini araşdırmaq üçün əlaqəli məlumatların güclü birləşməsini təmin edir. Hər bir üsul digərindən kənarda qalan detalları doldurur. Struktur tədqiqatlar statik bir mənzərə təqdim edir, kinetik isə katalizin əsasını təşkil edən dinamikanı müəyyən etmək üçün məlumatları təmin etməklə strukturu canlandırır. Kinetik tədqiqatları strukturla birbaşa əlaqələndirmək üçün fermentin aktiv yerində, yəni substrat bağlandıqdan sonra və məhsul buraxılmazdan əvvəl baş verən reaksiyaları araşdırmaq çox vacibdir. Təəssüf ki, sabit vəziyyətli kinetik üsullar fermentin aktiv yerində substratın məhsula çevrilməsi ilə bağlı təfərrüatları aşkar edə bilmir. Buna görə də, biz fermenti iz katalizatoru kimi deyil, stokiometrik reaktiv kimi yoxladığımız sürətli keçid kinetik üsullarına müraciət edirik. Beləliklə, tək bir ferment dövriyyəsinin zaman miqyasını araşdıraraq kataliz zamanı əmələ gələn fermentlə əlaqəli növləri müşahidə edə bilərik. Fermentin spesifikliyini və səmərəliliyini tənzimləyən reaksiyalar daha sonra substratın bağlanması, ferment izomerləşməsi, substratın məhsula kimyəvi çevrilməsi və məhsulun sərbəst buraxılması sürətlərinin kəmiyyətini müəyyən etməklə müəyyən edilə bilər.

Ölçülə bilən Kinetik Parametrlər

Ənənəvi sabit vəziyyətli kinetik tədqiqatlar katalizator izi ilə bir çox reaksiya dövrlərinin nəticəsi olaraq məhsulun yığılmasına və ya substratın istehlakına nəzarət etməklə katalizin dolayı müşahidəsinə əsaslanır. Nəticələr çoxsaylı substratların əlavə edilməsi və məhsulların buraxılması və iki kütləvi kinetik parametrin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün mümkün yolların çıxarılması ilə məhdudlaşır, k.pişik və kpişik/Km. Parametr k pişik fermentlə bağlı substratın məhlula buraxılan məhsula çevrilməsinin maksimum sürətini müəyyən edir, lakin reaksiyanın maksimum sürətinin fermentin konformasiya dəyişiklikləri, kimyəvi reaksiya sürətləri və ya məhsulun sərbəst buraxılma sürəti ilə məhdudlaşdığını müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilməz. bununla belə, həmin ardıcıllıqda istənilən sürət sabitinin böyüklüyünə aşağı həddi təyin edir. K terminipişik/Km spesifiklik sabiti kimi tanınır, çünki rəqabətdə hansı fermentin və ya substratın qalib gəldiyini kəmiyyətcə müəyyən edir. Üstəlik, kpişik/Km substratın bağlanma sürətini bir dəfə bağlandıqdan sonra substratın məhsula çevrilməsi və sərbəst buraxılması ehtimalı ilə vurulan müəyyən edir. Belə ki, kpişik/kpişik/Km substratın bağlanması üçün ikinci dərəcəli sürət sabiti üçün aşağı həddi təyin edir və o, həmçinin diffuziya ilə məhdudlaşan substratın bağlanma sürətinə nisbətən fermentin səmərəliliyinin ölçüsünü təmin edir. Termin Km ən yaxşı iki əsas parametr arasındakı nisbət kimi başa düşülür, kpişik, və kpişik/Km, və ümumiyyətlə substratın bağlanması üçün dissosiasiya sabitinə bərabər deyil. Bu sabit vəziyyətli kinetik parametrlər, reaksiya yolu boyunca fərdi addımların ardıcıllığını müəyyən etməkdən daha çox təcrübələrin dizaynı üçün minimal fon təşkil edir.

Keçici vəziyyətin kinetik analizi fermentin aktiv yerində substratın məhsula çevrilməsinə cavabdeh olan kinetik əhəmiyyətli aralıq maddələrin minimal reaksiya ardıcıllığını təyin etməyə imkan verir (1). Fərdi dərəcə sabitlərinin k üçün verilmiş dəyərə necə gətirib çıxarmasının həllipişik/Km fermentlərin spesifikliyini və effektivliyini idarə edən reaksiyalar haqqında anlayışı təmin edir. Fermentin aktiv yerində baş verən hadisələrin birbaşa ölçülməsi, sabit vəziyyətin kinetik tədqiqatlarının buraxdığı məlumat boşluğunu doldurur, yəni substratın bağlanmasından sonra məhsulun buraxılması nöqtəsinə qədər baş verən addımlar. Keçici kinetik üsullardan istifadə edərək, tək reaksiya dövrünün sürətləri müşahidə edilə bilən reaktiv kimi fermentdən istifadə etməklə, çox vaxt substrata təxminən bərabər konsentrasiyalarda ölçülür. Məsələn, Sxem 1-də göstərilən yolu nəzərə alaraq, bütün səkkiz sürət sabiti tarazlıq, sabit vəziyyət və keçici vəziyyət kinetik təcrübələrinin kombinasiyası ilə ölçülə bilər. Bundan əlavə, bu kinetik tədqiqatlar fermentlə əlaqəli ara məhsulların (EI) identifikasiyası üçün əsas yaradır.

Kompleks kinetik analiz ferment strukturu ilə bilavasitə əlaqəli ola biləcək yollarla fermentin spesifikliyi və səmərəliliyinin mexaniki əsasını müəyyən edir. Bu məqalədə keçid kinetik üsullardan istifadə edərək fermentlə katalizlənmiş reaksiyaların yolunu müəyyən etmək üçün təcrübələrin dizaynı və təfsiri üçün əsaslar təsvir ediləcəkdir. Bu prinsiplər bioloji əhəmiyyətli reaksiyaların üç nümunəsi ilə təsvir olunacaq, bunların heç biri tək sabit vəziyyət kinetikası ilə həll edilə bilməzdi. Bu məqalə heç bir halda bu geniş sahənin hərtərəfli tədqiqi deyil, əksinə, mümkün olanı bir ləzzətlə təmin etmək üsullarını göstərmək üçün müəllifin laboratoriyasından seçilmiş nümunələrdən istifadə olunacaq.

Bioloji reaksiyaların keçici kinetikası

Fermentlərin katalizi həyatın əsasını təşkil edir. Fermentlər arzu olunan reaksiyaları sürətləndirir ki, onlar canlı orqanizmlər üçün lazım olan zaman miqyasında baş verir. Bundan əlavə, fermentlər arzu olunan sintetik reaksiyaları termodinamik cəhətdən əlverişli katabolik reaksiyalara birləşdirərək həyatı təmin etmək üçün kifayət qədər uzun müddət mövcud olan mürəkkəb bioloji makromolekulları sintez edə bilirlər. Kinetik analiz, fermentlərin bu bioloji əhəmiyyətli reaksiyaları inanılmaz sürət, səmərəlilik və spesifikliklə həyata keçirmə yolunu deşifrə etməyə imkan verir. Ənənəvi sabit vəziyyət kinetik üsulları kinetik sabitlər üçün təxminləri təmin edir, kpişikvə kpişik/Km, metabolik yollar vasitəsilə axını idarə edən. Keçici vəziyyətin kinetik üsulları kinetik cəhətdən əhəmiyyətli reaksiya ardıcıllığını təyin etməyə imkan verir və fermentlə əlaqəli ara məhsulların əmələ gəlməsi və parçalanma sürətləri daxil olmaqla, yol boyunca hər bir daxili sürət sabiti üçün təxminlər təmin edə bilər. Beləliklə, keçici vəziyyətin kinetik analizi fermentlərin katalizə necə səbəb olduğunu başa düşmək üçün vacibdir. Burada bioloji əhəmiyyətli reaksiyaların üç nümunəsi verilmişdir.

DNT polimeraz sədaqəti

Nümunə kimi, DNT-ni saniyədə 300 baza cütü sürətlə təkrarlaya bilən DNT polimerazlarının inanılmaz sürəti və dəqiqliyi bizi çoxdan valeh edir, eyni zamanda milyard dəfədən yalnız 1-də səhvlər verir (2). Kinetik analiz, bu fermentlərin hər hansı DNT şablon mövqeyində üç mümkün uyğunsuzluqdan düzgün əsas cütlərini ayırd etmək üçün həm hidrogen bağından, həm də əsas cütün formasından məlumatdan necə istifadə etdiyini ortaya qoydu (3-6). Spesifikliyin təyin olunduğu ən vacib addım nukleotid bağlandıqdan sonra ferment strukturunun dəyişməsi zamanıdır ki, burada substratın bağlanma enerjisi ferment konformasiyasını dəyişdirmək üçün istifadə olunur. Konformasiya dəyişikliyindən sonra düzgün substrat (deoksinukleotid) bağlı substratın sərbəst buraxılmasını yavaşlatan və katalizi təşviq etmək üçün aktiv sahə qalıqlarını təşkil edən bir vəziyyətdə sıx bağlanır. Bunun əksinə olaraq, yanlış substrat (uyğun olmayan deoksinukleotid) substratın sərbəst buraxılmasını təşviq edən və kimyəvi reaksiyanı yavaşlatan vəziyyətə gətirib çıxaran aktiv sahə qalıqlarını nizamsız edir. Beləliklə, substratın spesifikliyini təyin edən substratın bağlanmasından sonra əmələ gələn konformasiya izomerinin kinetik bölünməsidir. Keçici vəziyyətin kinetik təhlili bu struktur dinamikanın polimeraza canlı orqanizmi saxlamaq üçün kifayət qədər dəqiqlik və sürətlə DNT-ni təkrarlamaq qabiliyyətini necə bəxş etdiyini ortaya qoydu.

Aralıq fermentlərin aşkarlanması

Fermentlər tez-tez aralıq vəziyyətlərin ardıcıllığı ilə substratın məhsula çevrilməsini katalizləyir. Bir çox hallarda ara məhsullar nəticə çıxarılmalıdır, çünki onlar kinetik və ya termodinamik cəhətdən birbaşa müşahidə olunmaq üçün kifayət qədər sabit deyillər. Bununla belə, bir sıra hallarda keçici vəziyyətin kinetik analizi fermentlə əlaqəli ara məhsulların müəyyən edilməsinə imkan vermişdir. Aralıq məhsulları reaksiyanın yan məhsullarından ayırmaq üçün ciddi kinetik analiz vacibdir. Nümunə kimi, herbisid qlifosatın hədəfi olan həyəcanlandırıcı postsinaptik potensial (EPSP) sintaza, EPSP məhsulunu yaratmaq üçün tetraedral ara məhsul vasitəsilə şikimat-3-fosfatın (S3P) fosfoenolpiruvat (PEP) ilə reaksiyasını katalizləyir (7). , 8). Reaksiya mexanizmi qlifosatın inhibə rejimini başa düşmək və daha effektiv herbisidlərin axtarışında çox vacibdir. Keçici vəziyyətin kinetik tədqiqatları 100 millisaniyədən az müddətdə ara məhsulun sürətli əmələ gəlməsini və parçalanmasını aşkar etdi. Bunun əksinə olaraq, nüvə maqnit rezonansı ilə aparılan struktur tədqiqatları aralıq məhsul kimi başqa bir növün (EPSP ketal) olduğunu irəli sürdü, lakin sonrakı kinetik təhlillər göstərdi ki, onun aktiv sahədə əmələ gəlmə sürəti kataliz üçün hesablama aparmaq üçün milyon dəfə çox yavaşdır (9, 10). . Beləliklə, kinetik səriştə, fermentin aktiv yerində substratın məhsula xalis çevrilməsini nəzərə almaq üçün kifayət qədər sürətlə formalaşmalı və parçalanmalı olan ara məhsulların müəyyən edilməsi üçün kritik bir meyardır (11). Tək dövriyyəli keçici vəziyyətin kinetik tədqiqatları ferment aralıq məhsullarını müəyyən etmək üçün vacib məlumatları təmin edir.

Motor zülalları tərəfindən güc istehsalı

Miyozin, dinein və kinesin kimi motor zülalları, ATP-nin hidrolizini motorun bir filament (aktin və ya mikrotubullar) ilə tsiklik qarşılıqlı əlaqəsi ilə əlaqəli olan zülal strukturunda konformasiya dəyişikliklərinə birləşdirərək hərəkət üçün güc yaradır. Stabil vəziyyət metodlarından istifadə edərək aktinlə stimullaşdırılan miozin ATPase kinetikasının ilkin səciyyələndirilməsi, aktinin miozinin yalnız kiçik bir hissəsi ilə əlaqə qurarkən ATP dövriyyəsini tam olaraq təqlid etdiyi təəccüblü müşahidəyə səbəb oldu (12). Keçici kinetikadan istifadə edərək sadə və birbaşa təcrübələr toplusunda, Lymn və Taylor (13) aktinin miyozinlə çox qısa müddətə əlaqə saxladığını və sonra miyozin çarpaz körpü dövrünün bir hissəsi kimi sürətlə dissosiasiya etdiyini göstərdi. ATP-nin aktomiozin kompleksinə bağlanması miozinin aktindən sürətli sərbəst buraxılmasını stimullaşdırır, aktinin miyozin-ADP-P kompleksinə bağlanması isə məhsulların (ADP və P) buraxılmasını simulyasiya edir. Nukleotidlərin bağlanması və sərbəst buraxılması ilə baş verən konformasiya dəyişiklikləri daha sonra istehsalı məcbur etmək üçün birləşdirilir. Kinesin adlanan başqa bir motor zülalı, alternativ ATPaz yoluna görə mikrotubullar boyunca əl-ələ tərzdə gəzir (14, 15). Bu dimerik zülalın iki motor sahəsi arasındakı əlaqədəki gərginlik, hər ikisi mikrotubulun səthinə bağlandıqda geridə qalan ATPase saytlarından aparıcını fərqləndirir. Bu gərginlik ADP-nin aparıcı motor sahəsindən sürətli dissosiasiyasına səbəb olur, eyni zamanda geridə qalan motor sahəsində ATP hidrolizini stimullaşdırır. Üstəlik, ATP-nin geridə qalan başlığa bağlanması ADP-nin aparıcı başdan sərbəst buraxılmasını stimullaşdırır. Keçidli kinetik analiz, birbaşa ATP-nin bir yerə bağlanmasının digər sahədən ADP-nin buraxılma sürətini təqlid etdiyini göstərməklə bu alternativ sayt ATPaz dövrünü təyin etdi (14).

Kataliz üçün kinetik və struktur əsaslar

Struktur analiz tez-tez fermentlərin spesifikliyi və mexanizminin müzakirəsi üçün əsasdır. Bununla belə, struktur tədqiqatlar tək başına mexanizm qura və ya ferment spesifikliyinin mənşəyini müəyyən edə bilməz. Yuxarıda göstərilən üç nümunədə struktur tədqiqatlar aktiv sahə qalıqlarını göstərmək üçün çox vacib idi, lakin ən aktual sualları öz-özünə həll edə bilmədi. Xüsusilə, ferment spesifikliyi k ilə ölçülən kinetik bir hadisədirpişik/Km, lakin spesifikliyin əsas mənşəyi k-nin böyüklüyünü düşünməklə aşkar olunmurpişik/Km və ya amin turşularının üçölçülü düzülüşünü təftiş etməklə. Əksinə, keçici vəziyyətin kinetik tədqiqatları ilə birlikdə strukturlar və sabit vəziyyət kinetik parametrləri yeni məna kəsb edir və ferment dinamikası və spesifikliyinin maraqlı detallarını aşkar etmək üçün şərh edilə bilər.

DNT polimerləşməsinin kimyası

Bağlanmış DNT və daxil olan substrat olan dCTP ilə DNT polimerazının aktiv sahəsinin strukturu Şəkil 1a-da göstərilmişdir (16). Bu quruluşda DNT 3'OH-dan məhrum olan dideoksinukleotidlə sonlanır, beləliklə kataliz qarşısını alır və buna görə də bu strukturun katalizdən dərhal əvvəlki qapalı ferment vəziyyətinə yaxın bir yaxınlaşma olduğu düşünülür. Reaksiya kimyası yaxşı qurulmuşdur ki, reaksiya iki metal ion mexanizmi ilə katalizlənir, burada bir Mg +2 3'OH-nin nukleofil reaktivliyini artırır, digəri Mg +2 a-da inkişaf edən mənfi yükü sabitləşdirir. -keçid vəziyyəti zamanı fosfat (17). Lakin bu model reaksiyanın qeyri-adi effektivliyini və spesifikliyini izah etmir. Bu polimeraza saniyədə 300 baza cütü sürətlə DNT-ni kopyalayır və təxminən milyonda bir səhv edir. Səhv etdikdən sonra polimeraza dayanır ki, bu da DNT primer zəncirinin şablon zəncirindən əriməsi və uyğun olmayan bazanı çıxarmaq üçün 25 Aaway ekzonukleaza sahəsinə köçməsi üçün vaxt verir. Bundan sonra primer sürətlə yenidən əriyir və polimerləşmə davam edir ki, ümumi xəta tezliyi milyardda bir olsun (5). Effektivlik və spesifiklik reaksiya ardıcıllığında kinetik əhəmiyyətli ara məhsulları müəyyən etmək və bununla da nukleotid seçiciliyi üçün kinetik və termodinamik əsasları yaratmaq üçün keçici kinetik analizlə birbaşa həll edilə bilən fermentin kinetik xüsusiyyətləridir. Ətraflı kinetik tədqiqatlar göstərdi ki, metal ionları mexanizmi katalizinin əsas səviyyəsini təşkil etsə də, müsbət yüklü amin turşularının O-heliksdə düzülməsi (Şəkil 1a) onların düzgün konturun tanınmasında iştirakı ilə spesifiklikdə mühüm rol oynayır. baza cütü.

Şəkil 1. DNT polimerləşməsinin mexanizmi. (a) DNT və daxil olan nukleotidlə kompleksdə T7 DNT polimerazının strukturu C514-ə əlavə edilmiş flüoresan etiketlə göstərilmişdir. Flüoresansdakı dəyişikliklər strukturda nukleotidlərin yaratdığı dəyişikliyin və onun seçicilikdəki rolunun kəmiyyətini müəyyən etməyə imkan verir. Aktiv sahəni aşkar etmək üçün 233-411 və 436-454 qalıqları çıxarıldı. PDB 1 T7P-dən (17) O-heliks və əsas katalitik qalıqlar da göstərilir. (b) Nukleotidlərin bağlanması nəticəsində yaranan flüoresan dəyişikliyinin zamandan asılılığı dCTP-nin üç konsentrasiyasında göstərilir. Daxil E.DNT-dən dCTP dissosiasiya sürətinin ölçülməsini göstərirgg.dNTP kompleksi. Bu məlumatların təhlili nukleotidlərin seçiciliyində ferment konformasiya dəyişikliklərinin rolunu müəyyən etdi. Hər iki rəqəm İstinad 6-nın icazəsi ilə çoxaldılır.

EPSP sintazasının kimyası

EPSP sintaza Şəkil 2a-da göstərilən tetraedral ara məhsul vasitəsilə əlavə-eliminasiya reaksiyası ilə EPSP-nin sintezini katalizləyir. Bu ferment aromatik amin turşularının sintezi üçün şikimat yolundadır və Roundup-da (The Scotts Company LLC, Marysville, OH) aktiv tərkib hissəsi olan mühüm herbisid, qlifosatın hədəfidir. Keçici vəziyyətin kinetik tədqiqatları tetraedral ara məhsulun müşahidəsi və təcrid olunması ilə bu reaksiya mexanizminin sübutuna gətirib çıxardı. Üstəlik, tetraedral ara məhsulun əmələ gəlmə və çürümə sürətlərinin kəmiyyəti müəyyən etdi ki, o, həqiqətən də reaksiyanın substratları (S3P və PEP) və məhsulları (EPSP və Pi) arasındakı yolda aralıq növdür. Bu reaksiyanın kimyası maraqlıdır ki, ferment əvvəlcə ara məhsulun əmələ gəlməsini kataliz etməli və sonra kataliz üçün fərqli tələblərlə onun parçalanmasını katalizləməlidir. İrəli və əks istiqamətdə bu reaksiyanın hər bir addımının sürətlərinin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi reaksiya üçün sərbəst enerji profilinin tam təsvirini verdi və fermentin hər bir addımı nə dərəcədə katalizlədiyini qiymətləndirməyə imkan verdi (8).

Şəkil 2. EPSP sintaza yolunda aralıq. (a) EPSP sintazasının kataliz etdiyi reaksiyanın mexanizmi göstərilmişdir. Reaksiya sabit tetraedral ara məhsul vasitəsilə əlavə-eliminasiya mexanizmi ilə davam edir. (b) 10 μM fermentin 100 μM S3P və 3,5 μM radio ilə işarələnmiş PEP ilə qarışdırıldığı tək dövriyyə reaksiyası göstərilir. Sürətli söndürmə kinetik üsulları ilə aparılan təhlil, PEP-nin aralıq məhsulu yaratmaq üçün reaksiyasını göstərdi, daha sonra tək dövriyyədə EPSP yaratmaq üçün parçalandı. Hamar xətlər bütün mövcud məlumatlara qlobal uyğunluğa əsaslanan tənliklərin ədədi inteqrasiyası ilə tam modeldən hesablanmışdır. İstinad 7-nin icazəsi ilə çoxaldılıb.

Motor zülalları ilə enerji ötürülməsinin kimyası

Məhlulda ADP və Pi meydana gətirmək üçün ATP-nin hidrolizindən əldə edilən sərbəst enerji, əlbəttə ki, ATP, ADP və Pi-nin hüceyrədaxili konsentrasiyalarından asılı olaraq, ümumiyyətlə 15 kkal/mol yaxınlığında olur. Bir fermentin bu sərbəst enerjini birləşdirərək hərəkət üçün bir qüvvə meydana gətirə biləcəyi vasitələr yarım əsrdən çox araşdırma mövzusudur. İşıq mikroskopunda aparılan tədqiqatlar əzələ daralması üçün sürüşən filament modelini qurdu, sonradan bunun miyozin AT-Pase ilə aktin filamentlərinin tsiklik qarşılıqlı təsirindən qaynaqlandığı göstərildi. Sərbəst enerjidəki ən böyük dəyişikliklərin ATP-nin bağlanması və ADP və Pi-nin sərbəst buraxılması ilə əlaqəli olduğunun fərqinə varılması ilə böyük bir kəşf gəldi, halbuki hidrolizlə əlaqəli faktiki kimyəvi addım fermentin aktiv yerində yalnız 4 tarazlıq sabitinə sahib idi. (13). Çox sıx bağlanma yaxınlığı (Kd

10-11 M) ATP-nin miozinə qədər ferment strukturunda dəyişikliyə səbəb olmaq üçün dövrədə istifadə olunur ki, bu da rigor kompleksi adlanan kompleksdə miozinin aktinlə sıx qarşılıqlı təsirini pozur. Miyozin-ATP kompleksinin aktindən dissosiasiyasından sonra ATP-nin hidrolizi miozini aktinlə zəif əlaqə saxlaya bilən miozin-ADP-Pi vəziyyətinə çevirir. Pi və sonra ADP-nin ardıcıl buraxılması ilə birləşən sonrakı konformasiya dəyişiklikləri, güc istehsalı zamanı qolun yellənməsini idarə edir (18, 19). Birləşməni başa düşməyin açarı, miyozin motorunun sıx və zəif nükleotid bağlayan vəziyyətlər arasında ziddiyyət təşkil edən reaksiyalarda dövr etdiyini və buna görə də sıx və zəif filament bağlayan vəziyyətlər arasında dövrə vurduğunu qəbul etməkdir. The details of this energy transduction cycle are derived from a combination of structural, spectroscopic, equilibrium, and kinetic measurements transient-state kinetic analysis has played a central role in defining the pathway.

The coupling of ATP hydrolysis to force production by kinesin is different, but it relies on similar principles in that the binding of substrate and release of products are coupled to conformational switching between tight- and weak-filament-binding states (14, 15, 20). Like myosin, cycling between two nucleotide-binding states is coupled to cyclical changes in the affinity of the kinesin motor domain for binding to the microtubule surface. However, the pathway is complicated by the negative cooperativity between the two ATPase domains of the dimeric motor. It is believed that strain induced when simultaneously binding both motor domains to the microtubule surface causes the leading head into a weak-nucleotide-binding state stimulating the release of product, ADP. In contrast, the trailing head binds ATP tightly, and the tight association with the microtubule surface also stimulates ATP hydrolysis. The subsequent release of Pi is then coupled to the dissociation of this trailing head from the microtubule that allows it to leapfrog forward, thereby being converted from the trailing to a leading motor. As this motor domain then binds to the microtubule surface in its new role as leading motor, it reaches a weak-nucleotide-binding state and rapidly releases the bound ADP. Unlike myosin in which one step of the cycle can be attributable to the force-producing step, net displacement of kinesin along the microtubule surface occurs with a complete cycle of the ATPase shown in Fig. 3a, which is rate limited by the release of Pi from the trailing head. This complex pathway was derived by a relatively small set of simple and direct experiments using transient kinetic methods to measure the rate of each reaction and to provide definitive evidence for this alternating site ATPase pathway. For example, Fig. 3b shows the effect of increasing ATP concentrations in stimulating the release of ADP from kinesin bound to a microtubule.

Figure 3. Pathway of the kinesin ATPase. (a) The pathway is shown for the cyclical interaction of kinesin ''heads'' with the microtubule surface driven by the binding and hydrolysis of ATP and release of products. When both heads are bound to the microtubule, then strain leads weak nucleotide binding in the leading head (right-most image). In a key step that leads to an alternative site pathway, ATP binding to the trailing head caused the leading head to bind to the microtubule, which stimulates the release of ADP (steps 1 and 2). The cycle is completed by the hydrolysis of ATP (step 3) and the release of the trailing head from the microtubule coupled to the dissociation of Pi (step 4). (b) Kinetic data to support this model is shown, in which a fluorescent analog of ADP (mant-ADP) was bound to the kinesin, and the kinesin-mantADP complex was mixed with microtubules at various concentrations of ATP. One ADP was released rapidly from only one of the two kinesin heads in the absence of ATP. The binding of ATP to the first head simulates the release of ADP from the second head. These data directly demonstrate the alternating site pathway in which the binding of substrate to one site stimulates product release from the neighboring site. Fitting of this data by simulation of the complete pathway allows definition of the rates of ATP binding and of ADP release. Reproduced with permission from Reference 20.

Transient-kinetic techniques most often rely on the rapid mixing of reactants with enzyme to initiate the reaction. This mixing is essential so that all enzyme molecules start reaction in synchrony with one another therefore, the time dependence of the observable reactions defines the kinetics of interconversion of enzyme intermediate states. Because mixing requires a finite amount of time, conventional methods are limited in their ability to measure very fast reactions. For example, a typical value for the “dead time” of a stopped-flow instrument is approximately 1 ms, which is because of the time it takes to fill the observation cell. Thus, reactions with a half-life of less than 1 ms (rate > 700 s -1 ) are difficult to observe depending on the signal to noise ratio. With a favorable signal to noise ratio, rates on the order of 2000 s -1 can be measured, but it is rare. Other transient kinetic techniques have been devised to break this time barrier. Both temperature-jump and pressure-jump experiments can approach the 1-μs limit, but both only allow observation of relaxation of a system of reactants from one equilibrium position to another and therefore have less widespread use. Modern microfluidic methods have also achieved mixing times in the microsecond range and offer the promise of more widespread use. In addition, recent efforts have succeeded in combing rapid mixing followed by mass spectrometry analysis to detect enzyme intermediates.

The two prominent transient-kinetic mixing methods are stopped flow and rapid chemical quench flow. In the stopped flow, the instrument mixes and then forces reactants through a flow cell. After an abrupt stop of the flow, the observation cell contains reactants that were just mixed within the previous millisecond. One can then trigger a computer to collect data to measure changes in optical signals such as absorbance, fluorescence, or light scattering as a function of time after mixing. Other spectroscopic methods such as electron paramagnetic resonance have been employed, but many traces must be collected and averaged to improve the signal to noise ratio. Stopped-flow methods have a distinct advantage in that one can often obtain data of high quality (high signal-to-noise ratio) over a series of concentrations of substrate with a modest investment of time and materials. These data can then accurately define the concentration dependence of observable rates of reaction this information is critical in developing a model for the enzyme pathway. However, stopped-flow signals are sometimes difficult to interpret uniquely, especially when fluorescence data Scheme multiple exponentials, as described below. An important solution to the problem can be achieved by correlating stopped-flow data with measurements of the chemical conversion of substrate to product using rapid quench-flow methods.

Figure 1b illustrates the analysis of substrate binding and dissociation using stopped-flow fluorescence methods. The concentration dependence of the binding rate defines a two-step sequence that involves a weak rapid-equilibrium binding followed by isomerization to tighter binding. The inset to Fig. 1b shows an experiment to measure the substrate dissociation rate. Combined, the two experiments accurately define the kinetic parameters that govern the two-step binding sequence.

Rapid quench-flow methods

Rapid chemical-quench-flow methods are employed to measure the chemical conversion of substrate to product without necessarily relying on an optical signal. Often, radiolabeled substrates are used, and the substrate and product are resolved chromatographically to allow quantification of the conversion of substrate to product. The reaction is started by mixing the enzyme with substrate and then stopped by mixing with a quenching agent, such as 2N acid or base. In a quench-flow apparatus, reactants are driven through loops of tubing at defined speeds to control the timing and to achieve reaction times as short as 2 ms. Longer reaction times, up to approximately 100 ms, are achieved by using longer loops of tubing. Even longer reaction times, greater than 100 ms, require a push-pause-push mode in which the first push forces the reactants into a reaction loop and after a pause of known duration, a second push forces the reactants to mix with a quenching agent and then out into a collection tube. The method can be time consuming and tedious compared with stopped-flow, but rapid quench flow methods have two distinct advantages. First, they provide a direct measurement for the rate of conversion of substrate to product at the active site second, they provide a measurement of reaction amplitude in units of concentration that can be directly related to the concentration of enzyme active sites. Accordingly, rapid quench-flow data can be interpreted more easily in evaluating to a given model. In addition, they allow one to assess the extent to which dead enzyme or microheterogeneity in the enzyme and/or substrate might influence interpretation of the data.

Figure 2b shows the results of a rapid-quench single-turnover experiment performed with EPSP synthase with enzyme in excess over the radiolabeled substrate, PEP. The data show the transient formation and decay of the tetrahedral intermediate, which led to its subsequent isolation and structure determination.

When transient kinetic methods fail

Conventional transient-kinetic methods are not always applicable to every enzyme system. In particular, enzymes that have very fast turnover rates such as carbonic anhydrase are not amenable to single-turnover kinetic methods and may require the use of stopped-flow methods just to observe reactions in the steady state. In addition, enzymes with very high Km values are sometimes difficult to study because the high substrate concentrations needed to saturate the rate of reaction increase the background in attempts to observe product formed at a concentration equal to only one per enzyme site. However, these limitations are being challenged constantly by the development of better instrumentation, new methods, and better signals. If one is lucky or wise enough to choose an enzyme with Km values in the micromolar range and kcat less than several hundred per second, then a large range of experiments is possible.

Experimental Design and Interpretation of Data

The overall goal of a comprehensive kinetic study is to provide estimates for each step in the pathway and to identify enzyme-bound intermediates. The time dependence of an enzyme-catalyzed reaction can be rather complex for even a simple reaction sequence that contains only one substrate, one product, and one enzyme-bound intermediate such as the reaction illustrated in Scheme 1. Nonetheless, careful design and rigorous interpretation of a combination of equilibrium and kinetic data can define all eight rate constants under favorable circumstances in particular, definition of the reverse rate constants usually requires that the reaction be measurable in the reverse direction. In those cases in which rates cannot be defined with certainty, the degree of uncertainty must be stated. For example, in some cases the data may only indicate that k-2 and k3, for example, must be greater than 1000 s -1 , but no data define an upper limit. In either case, the data could show that the formation of the intermediate is the kinetically significant step and that the intermediate breaks down at a fast rate. Given the very nature of the reaction, this method may be the best possible and perhaps all that is important mechanistically.

Equilibrium measurements

Steady-state and equilibrium measurements are extremely important to place constraints on the interpretation of more complex kinetic experiments. For example, measurement of the overall equilibrium constant for the reaction defines the product of equilibrium constants for all four steps, Kxalis = K1K2K3K4. In addition, it is often possible to measure the two internal equilibria, K2 and K3 if concentrations of enzyme can be attained that are higher than the dissociation constants for substrate and product. Finally, dissociation constants for substrates and products can be measured in some instances, particularly with multiple substrate reactions when one of the reactants can be left out to allow the binding but not reaction of the other substrate. Whatever information can be obtained will facilitate the design of subsequent experiments (i.e., what concentrations of substrate are needed to saturate the enzyme) and in their interpretation (i.e., knowing that k2/k-2 = K2 provides an important constraint in globally fitting data).

It is useful to approach the solution of an enzyme pathway from both ends and work inward. Measurement of the substrate-binding kinetics is a good first start, but it will depend on a useful signal. Often, changes in protein fluorescence occur that reflect changes in protein structure induced by substrate binding these signals can be monitored to measure the kinetics of binding and isomerization. In other cases, a fluorescent analog of a substrate or a fluorescently labeled protein can provide a useful signal. In either case, definition of rate constants that govern binding assist in the design and interpretation of subsequent experiments to measure rates of substrate to product conversion at the active site. Figure 1b illustrates the measurement of substrate binding kinetics.

Pre-steady-state burst kinetics

Important results are obtained in an experiment where enzyme is mixed with an excess of substrate and then the formation of product is monitored over the time period of a few enzyme turnovers and with an enzyme concentration high enough to allow quantification of one product per enzyme site. Under conditions in which substrate binding and chemical conversion to product are faster than the release of product, one observes a “burst” of product formation equal to one product per enzyme site, followed by steady-state turnover.

The mere observation of a burst implies that a step after chemistry is at least partially rate limiting for steady-state turnover. In addition, if no observable burst occurs, then the data imply that chemistry is largely rate limiting. When a burst can be observed, quantitative fitting of the amplitude and rate of the burst phase relative to the steady-state phase affords estimates for three rate constants: k2, k-2 and k3 in the pathway shown above (Scheme 2).

Single turnover kinetics

If enzyme can be obtained at concentrations approaching the Kd və ya Km for substrate, then experiments can be performed with enzyme in excess of substrate. In these experiments, one can observe the net conversion of substrate to intermediate and form product in a single enzyme cycle. The real advantage of the method is in the signal-to-noise (or background) ratio of the data. While in a pre-steady state burst experiment, one might be looking for the appearance of an intermediate in the background of 100-fold higher concentration of substrate in a single turnover experiment, that same intermediate might appear as 30% of the total substrate. This finding was the case in studies on EPSP synthase, in which single-turnover experiments revealed the presence of the tetrahedral intermediate, which led to its isolation and structure determination (Fig. 2b).

Interpretation of transient kinetic data

Unlike the standard protocols for steady-state kinetic analysis, transient kinetic analysis is dependent on the availability of signals to measure individual steps of the reaction. Moreover, the observable kinetics change and can be complex or deceivingly simple depending on the relative magnitudes of sequential steps in a pathway. The rule of thumb is that one exponential phase exists in the time dependence of a reaction for each step in the pathway. For example, the kinetics of signals observable according to Scheme 2 will follow a triple exponential function: Moreover, it is important to note that the observed rates (λ values) do not translate directly to rate constants for individual steps except in the rare case where each step is irreversible. Rather, the observable rates are a function of all rate constants that are reversibly linked (1, 21, 22). In general, the observed rate approaches the sum of the rate constants for all steps that contribute to the observable transient. A complete discussion of this is beyond the scope of this review, but some simplifying concepts are important to note. For example, if the binding of substrate is a rapid equilibrium or the experiment is conducted at sufficiently high substrate concentration, then the exponential term that governs the formation of ES is so fast that it is dropped from the equation. In addition, in a pre-steady-state burst experiment, the last exponential term is lost because the release of products regenerates free enzyme, which blends the time dependence of the reaction into the steady-state phase. Thus, it is common that for this three-step pathway, the observed rate of formation of product during a pre-steady-state burst experiment follows a single exponential with a rate given by the sum, kmüşahidə olunur = k2 + k-2 + k3 (followed by linear steady-state turnover).

Under some conditions, the kinetics of the reactions simplify, but the validity of such simplifying assumptions is limited. Moreover, as a reaction becomes more complex, the mathematical modeling of the data becomes intractable. For these reasons, methods have been developed for modeling and fitting kinetic data by computer simulation based on numerical integration of the full rate equations without simplification. The data shown in Fig. 3b, for example, can only be analyzed by simulation to obtain meaningful information because of complexities in the experiment. However, in fitting the data by simulation, the rate constant for ATP binding is defined accurately by the observed increase in rate of the slow reaction phase as a function of ATP concentration.

Computer simulation and global data fitting

Kinetic data can be fitted directly to a given model without invoking simplifying assumptions needed to solve mathematical equations. Rather, by numerical integration of the rate equations, complex models can be examined in fitting data over a wide range of concentrations and differing starting conditions. When fitting data by computer simulation, one bypasses mathematical modeling entirely and fits data directly to the model. Moreover, many experiments can be fitted simultaneously to a single unifying model. Several computer programs are currently available including, DynaFit (BioKin, Ltd., Watertown, MA), Copasi (EML Research, Heidelberg, Germany), and KinTek Global Kinetic Explorer (KinTek Corporation, Austin, TX), and all are available on the internet. The major difficulty in using these programs occurs because of the ease with which one can propose overly complex models in attempting to explain kinetic data. Understanding which kinetic constants are actually constrained by the data becomes extremely difficult when fitting multiple parameters to several data sets. KinTek Explorer addresses this problem by allowing the user to scroll a given rate constant, starting concentration, or output factor and watch the curves change in shape. This dynamic simulation immediately reveals whether a given constant has a significant effect on the fit to the data and shows when a model is overly complex.

The future of kinetic analysis lies in the use of these powerful computer simulation methods to design experiments and to fit data rigorously to extract mechanistic information. Ongoing work is directed toward the development of more robust algorithms to address the confidence intervals with which individual parameters can be obtained from modeling a given set of data. With these tools, one can accurately establish a given reaction mechanism and provide estimates for the rates and free-energy changes for each kinetically significant step in the pathway.

1. Johnson KA. Transient-state kinetic analysis of enzyme reaction pathways. The Enzymes. 1992 XX:1-61.

2. Johnson KA. Conformational coupling in DNA polymerase fidelity. Annu. Rev. Biochem. 1993 62:685-713.

3. Patel SS, Wong I, Johnson KA. Pre-steady-state kinetic analysis of processive DNA replication including complete characterization of an exonuclease-deficient mutant. Biochemistry 1991 30:511-525.

4. Wong I, Patel SS, Johnson KA. An induced-fit kinetic mechanism for DNA replication fidelity: direct measurement by single-turnover kinetics. Biochemistry 1991 30:526-537.

5. Donlin MJ, Patel SS, Johnson KA. Kinetic partitioning between the exonuclease and polymerase sites in DNA error correction. Biochemistry 1991 30:538-546.

6. Tsai YC, Johnson KA. A new paradigm for DNA polymerase specificity. Biochemistry 2006 45:9675-9687.

7. Anderson KS, Sikorski JA, Johnson KA. A tetrahedral intermediate in the EPSP synthase reaction observed by rapid quench kinetics. Biochemistry 1988 27:7395-7406.

8. Anderson KS, Johnson KA. Kinetic and Structural Analysis of Enzyme Intermediates: Lessons from EPSP Synthase. Kimya. Rev. 1990 90:1131-1149.

9. Anderson KS, Sammons RD, Leo GC, Sikorski JA, Benesi AJ, Johnson KA. Observation by 13C NMR of the EPSP synthase tetrahedral intermediate bound to the enzyme active site. Biochemistry 1990 29:1460-1465.

10. Lewis J, Johnson KA, Anderson KS. The catalytic mechanism of EPSP synthase revisited. Biochemistry 1999 38:7372-7379

11. Anderson KS, Johnson KA. “Kinetic competence” of the 5-enolpyruvoylshikimate-3-phosphate synthase tetrahedral intermediate. J. Biol. Kimya. 1990 265:5567-5572.

12. Eisenberg E, Moos C. Actin activation of heavy meromyosin adenosine triphosphatase. Dependence on adenosine triphosphate and actin concentrations. J. Biol. Kimya. 1970 245:2451-2456.

13. Lymn RW, Taylor EW. Mechanism of adenosine triphosphate hydrolysis by actomyosin. Biochemistry. 1971 10:4617-4624.

14. Gilbert SP, Moyer ML, Johnson KA. Alternating site mechanism of the kinesin ATPase. Biochemistry 1998 37:792-799.

15. Gilbert SP, Webb MR, Brune M, Johnson KA. Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin. Nature 1995 373:671-676.

16. Steitz TA. DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms. J. Biol. Kimya. 1999 274:17395-17398.

17. Geeves MA, Holmes KC. Structural mechanism of muscle contraction. Annu. Rev. Biochem. 1999 68:687-728.

18. Geeves MA, Holmes KC. The molecular mechanism of muscle contraction. Adv. Protein Chem. 2005 71:161-193.

19. Auerbach SD, Johnson KA. Alternating site ATPase pathway of rat conventional kinesin. J. Biol. Kimya. 2005 280:37048-37060.

20. Johnson KA. Rapid kinetic analysis of mechanochemical adeno-sinetriphosphatases. Metodlar Enzimol. 1986 134:677-705.

21. Johnson KA. Rapid quench kinetic analysis of polymerases, adenosinetriphosphatases, and enzyme intermediates. Metodlar Enzimol. 1995 249:38-61.

22. Doublie S, Tabor S, Long AM, Richardson CC, Ellenberger T. Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2.2 A resolution. Nature 1998 391:251-258.

Johnson KA, ed. Kinetic Analysis of Macromolecules. 2003. Oxford University Press, Oxford, UK.

Gutfreund H. Kinetics for the Life Sciences: Receptors, Transmitters and Catalysts. 2002. Cambridge University Press, Cambridge, UK.


İçindəkilər

In 1901, French physical chemist Victor Henri found that enzyme reactions were initiated by a bond (more generally, a binding interaction) between the enzyme and the substrate. [4] His work was taken up by German biochemist Leonor Michaelis and Canadian physician Maud Menten, who investigated the kinetics of an enzymatic reaction mechanism, invertase, that catalyzes the hydrolysis of sucrose into glucose and fructose. [5] In 1913, they proposed a mathematical model of the reaction. [6] It involves an enzyme, E, binding to a substrate, S, to form a complex, ES, which in turn releases a product, P, regenerating the original enzyme. This may be represented schematically as

where k f > (forward rate constant), k r > (reverse rate constant), and k c a t >> (catalytic rate constant) denote the rate constants, [7] the double arrows between S (substrate) and ES (enzyme-substrate complex) represent the fact that enzyme-substrate binding is a reversible process, and the single forward arrow represents the formation of P (product).

Under certain assumptions – such as the enzyme concentration being much less than the substrate concentration – the rate of product formation is given by

The model is used in a variety of biochemical situations other than enzyme-substrate interaction, including antigen–antibody binding, DNA–DNA hybridization, and protein–protein interaction. [9] [12] It can be used to characterise a generic biochemical reaction, in the same way that the Langmuir equation can be used to model generic adsorption of biomolecular species. [12] When an empirical equation of this form is applied to microbial growth, it is sometimes called a Monod equation.

Parameter values vary widely between enzymes: [13]

Ferment K M >> (M) k cat >> (s −1 ) k cat / K M >/K_ >> (M −1 s −1 )
Chymotrypsin 1.5 × 10 −2 0.14 9.3
Pepsin 3.0 × 10 −4 0.50 1.7 × 10 3
T-RNA synthetase 9.0 × 10 −4 7.6 8.4 × 10 3
Ribonuclease 7.9 × 10 −3 7.9 × 10 2 1.0 × 10 5
Carbonic anhydrase 2.6 × 10 −2 4.0 × 10 5 1.5 × 10 7
Fumarase 5.0 × 10 −6 8.0 × 10 2 1.6 × 10 8

The constant k cat / K M >/K_ >> (catalytic efficiency) is a measure of how efficiently an enzyme converts a substrate into product. Diffusion limited enzymes, such as fumarase, work at the theoretical upper limit of 10 8 – 10 10 M −1 s −1 , limited by diffusion of substrate into the active site. [14]

Michaelis–Menten kinetics have also been applied to a variety of spheres outside of biochemical reactions, [7] including alveolar clearance of dusts, [15] the richness of species pools, [16] clearance of blood alcohol, [17] the photosynthesis-irradiance relationship, and bacterial phage infection. [18]

The equation can also be used to describe the relationship between ion channel conductivity and ligand concentration. [19]

Applying the law of mass action, which states that the rate of a reaction is proportional to the product of the concentrations of the reactants (i.e. [ E ] [ S ] ), gives a system of four non-linear ordinary differential equations that define the rate of change of reactants with time t [20]

Equilibrium approximation Edit

In their original analysis, Michaelis and Menten assumed that the substrate is in instantaneous chemical equilibrium with the complex, which implies [6] [21]

From the enzyme conservation law, we obtain [21]

Combining the two expressions above, gives us

Upon simplification, we get

Quasi-steady-state approximation Edit

An alternative analysis of the system was undertaken by British botanist G. E. Briggs and British geneticist J. B. S. Haldane in 1925. [22] [23] They assumed that the concentration of the intermediate complex does not change on the time-scale of product formation – known as the quasi-steady-state assumption or pseudo-steady-state-hypothesis. Mathematically, this assumption means k f [ E ] [ S ] = k r [ ES ] + k c a t [ ES ] = ( k r + k c a t ) [ ES ] [>][>]=k_[>]+k_ >[>]=(k_+k_ >)[>]> . This is mathematically the same as the previous equation, with k r > replaced by k r + k c a t +k_ >> . Hence, following the same steps as above, the velocity v of the reaction is [21] [23]

is known as the Michaelis constant.

Assumptions and limitations Edit

The first step in the derivation applies the law of mass action, which is reliant on free diffusion. However, in the environment of a living cell where there is a high concentration of proteins, the cytoplasm often behaves more like a viscous gel than a free-flowing liquid, limiting molecular movements by diffusion and altering reaction rates. [24] Although the law of mass action can be valid in heterogeneous environments, [25] it is more appropriate to model the cytoplasm as a fractal, in order to capture its limited-mobility kinetics. [26]

By contrast, the Briggs–Haldane quasi-steady-state analysis is valid if [20] [27]

Thus it holds if the enzyme concentration is much less than the substrate concentration or K M >> or both.

It is also important to remember that, while irreversibility is a necessary simplification in order to yield a tractable analytic solution, in the general case product formation is not in fact irreversible. The enzyme reaction is more correctly described as

In general, the assumption of irreversibility is a good one in situations where one of the below is true:

1. The concentration of substrate(s) is very much larger than the concentration of products: [ S ] ≫ [ P ] ⋅ >>

This is true under standard in vitro assay conditions, and is true for many in vivo biological reactions, particularly where the product is continually removed by a subsequent reaction.

2. The energy released in the reaction is very large, that is Δ G ≪ 0. ll 0.>

In situations where neither of these two conditions hold (that is, the reaction is low energy and a substantial pool of product(s) exists), the Michaelis–Menten equation breaks down, and more complex modelling approaches explicitly taking the forward and reverse reactions into account must be taken to understand the enzyme biology.

Before computing facilities to perform nonlinear regression became available, graphical methods involving linearisation of the equation were used. A number of these were proposed, including the Eadie–Hofstee diagram, Hanes–Woolf plot and Lineweaver–Burk plot of these, the Hanes–Woolf plot is the most accurate. [28] However, while useful for visualization, all three methods distort the error structure of the data and are inferior to nonlinear regression. [29] Assuming a similar error d v 0 > on v 0 > , an inverse representation leads to an error of d v 0 / v 0 2 /v_<0>^<2>> on 1 / v 0 > (Propagation of uncertainty). Without proper estimation of d v 0 > values, linearisation should be avoided. In addition, regression analysis using Least squares assumes that errors are normally distributed, which is not valid after a transformation of v 0 > values. Nonetheless, their use can still be found in modern literature. [30]

In 1997 Santiago Schnell and Claudio Mendoza suggested a closed form solution for the time course kinetics analysis of the Michaelis–Menten kinetics based on the solution of the Lambert W function. [31] Namely,

harada V is the Lambert W function and

The Michaelis-Menten equation has been used to predict the rate of product formation in enzymatic reactions for more than a century. Specifically, it states that the rate of an enzymatic reaction will increase as substrate concentration increases, and that increased unbinding of enzyme-substrate complexes will decrease the reaction rate. While the first prediction is well established, the second is more elusive. Mathematical analysis of the effect of enzyme-substrate unbinding on enzymatic reactions at the single-molecule level has shown that unbinding of an enzyme from a substrate can reduce the rate of product formation under some conditions, but may also have the opposite effect. As substrate concentrations increase, a tipping point can be reached where an increase in the unbinding rate results in an increase, rather than a decrease, of the reaction rate. The results indicate that enzymatic reactions can behave in ways that violate the classical Michaelis-Menten equation, and that the role of unbinding in enzymatic catalysis still remains to be determined experimentally. [34]


Enzyme kinetics - Biology

One of the ways biochemists characterize enzymes is to study the rates of enzyme-catalyzed reactions, a field known as enzyme kinetics. The study of enzyme kinetics provides researchers with clues as to how enzymes work. In 1913, Leonor Michaelis and Maud Menten derived a rate law that governs enzyme kinetics.

Michaelis-Menten enzyme kinetics can be modeled by the following equation,

harada V represents the reaction velocity, Vmaks represents the maximum reaction velocity, Kmrepresents the Michaelis-Menten constant, and [S] represents the substrate concentration.

Note of caution

This equation assumes that during the reaction the concentration of the enzyme-substrate complex remains constant and is lower than the concentrations of unbound substrate. These conditions are known as steady-state.

Looking at the equation, one can readily see that the velocity of the reaction, V , is dependent on the substrate concentration, [S]. In fact, the Michaelis-Menten equation is a rational function. As rational functions can be difficult to work with graphically, the Michaelis-Menten equation can be transformed into a linear equation by taking the reciprocal of both sides as,

This new equation is called the Lineweaver-Burk equation after the researchers who derived it in 1934. The Lineweaver-Burk equation is a linear equation, where 1/V is a linear function of 1/[S] instead of V being a rational function of [S]. The Lineweaver-Burk equation can be readily represented graphically to determine the values of KmVmaks.


Enzyme Kinetics (activity)


Amylase is an enzyme that breaks down amylose (starch) into glucose molecules.

      1. What test can be used to indicate the presence of Starch?
      2. What test can be used to indicate the presence of glucose?
      3. What is the role of an enzyme in a chemical reaction and what is it made of?
      4. What parameters would influence the ability of the enzyme to facilitate the rate of the reaction?

      Salivary amylase is produced in the mouth, where digestion begins.

      Pancreatic amylase is produced in the pancreas and is supplied to the duodenum of the small intestines.

      Overlay of salivary ( yaşıl ) and pancreatic ( teal ) amylase molecules.


      Videoya baxın: Spektrofotometriya. Kinetika. Kimyo (BiləR 2022).