Məlumat

Elektron Nəqliyyat Sistemi - Biologiya

Elektron Nəqliyyat Sistemi - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mitoxondriya

Mitoxondriyada iki membran var, daxili membran və xarici membran. Daxili membran xarici membrandan çox böyükdür, lakin cristae adlanan daxili qıvrımlara bağlıdır. Daxili və xarici membran arasında membranlararası boşluq var və daxili membranın içərisindəki boşluq fermentləri və digər reagentləri ehtiva edən matris adlanır. Xarici membran digər molekullar üçün keçiricidir, çünki onun tərkibində məsamə əmələ gətirən zülal olan mitoxondrial porin var. Daxili membran əksər ionlar və qütb molekulları üçün keçirməyən bir membrana malikdir və metabolit daşıyıcıları səbəbindən yalnız ATP, piruvat və sitrat üçün keçiricidir.

Elektron Nəqliyyat Sistemi

Bu diaqramdan göründüyü kimi, NADH-dən O2-ə elektron axını bir neçə aralıq elektron daşıyıcısı tərəfindən asanlaşdırılır, məsələn, elektronlar azalmış donordan, məsələn, malatdan OAA kimi oksidləşmiş donora keçir. Elektronlar daşıyıcıdan daşıyıcıya, əlverişli enerji qradiyenti ilə son elektron qəbuledici O-ya doğru hərəkət edir.2. Əlverişli enerji qradiyenti elektronların daha müsbət reduksiya potensialı və beləliklə, oksigenə daha yüksək yaxınlığı olan komponentlərə doğru hərəkət etməsi ilə bağlıdır. Elektron axını meydana gəldikdə, protonlar daxili membrandan membranlararası boşluğa axır.

Elektron nəqli zəncirinin komponentləri

Elektronlar enerji qradiyenti ilə NADH-dən O2-ə axdıqda, redoks reaksiyasını kataliz edən dörd protein kompleksi bunlardır:

  • Kompleks I = NADH-Q reduktaza kompleksi
  • Kompleks III = Sitokrom c reduktaza kompleksi
  • Cyt C = Sitokrom c
  • Kompleks IV = Sitokrom c oksidaz kompleksi

Elektronlar enerji qradiyenti ilə FADH2-dən O2-ə doğru axdıqda, redoks reaksiyasını kataliz edən dörd protein kompleksi bunlardır:

  • Kompleks II = süksinat dehidrogenaz
  • Kompleks III = Sitokrom c reduktaza kompleksi
  • Cyt C = Sitokrom c
  • Kompleks IV = Sitokrom c oksidaz kompleksi

Qeyd: FADH-dən elektronlar2 dördüncü zülal kompleksində, suksinat-Q reduktazında elektron daşıma zəncirinə daxil olur. Bu zülal kompleksi süksinatın fumarat çevrilməsi reaksiyasından FADH2 əmələ gətirməkdən məsul olan suksinat dehidrogenazı ehtiva edir. FADH2 elektronları elektron nəqli zəncirinə daha gec dövrə daxil olduğundan, membranlararası boşluğa daha az H+ ionları vururlar (protein kompleksi II H+ ionlarını pompalamır), bu da daha az ATP əmələ gəlməsi deməkdir.

Koenzim Q:

Niyə elektronlar bu istiqamətdə axır?

E-yaxınlıq və redoks gərginliklərindən enerji münasibətlərini hesablayaraq elektron axını təyin edirik

E-də dəyişikliko’ : “standart” reduksiya potensialı @ 1 M azaldılmış formada (donor), 1 M oksidləşmiş formada (akseptor), 25 dərəcə C, pH 7 (Fosforil ötürmə potensialının ΔG ilə ölçüldüyü kimi, elektron ötürmə potensialı da ΔE ilə ölçülür.o)

Redoks potensialının ölçülməsi: Biz ΔE ölçə biləriko' 1M H ilə müqayisədə+/ doymuş H2 qaz Aşağıdakı təcrübəni qurmaqla elektronun elektron ötürmə potensialını ölçə bilərik. İki elektrik terminalı var, birində 1M azaldılmış forma (1M NADH) və 1M oksidləşdirilmiş forma (1M NAD) olan nümunə hüceyrə məhlulu var.+) və digərində standart istinad xanası var, 1M H+ və 1M doymuş H2 qaz. İki məhluldakı elektrodlar voltmetrlə birləşdirilir. Voltmetr iki terminal arasındakı gərginliyi ölçür. Elektronlar bir hüceyrədən digərinə axır. Elektronlar nümunə hüceyrəsindən standart istinad hüceyrəsinə axsa və mənfi gərginliyə sahib olarsa, standart istinad hüceyrəsindəki başqa bir elektroda qoşulmuş məhluldakı elektrodumuz olacaq. Klemenslər arasında gərginliyi ölçməklə, .

Standart sərbəst enerji dəyişikliyi standart delta G ilə azalma potensialı standart delta E arasında əlaqə:

Bəzi reaksiyalar üçün standart reduksiya potensialı:

Reaksiyaları və standart reduksiya potensialını birləşdirin: Donorun yarım reaksiyasını tərsinə çevirin və onun reduksiya potensialını -1-ə vurun; reaksiyaları və reduksiya potensialını əlavə edin

Reaksiyaları və standart reduksiya potensialını birləşdirin: Donorun yarım reaksiyasını tərsinə çevirin və onun reduksiya potensialını -1-ə vurun; reaksiyaları və reduksiya potensialını əlavə edin

Bu reaksiyada O-nun azaldılması ilə əhəmiyyətli miqdarda enerji ayrılır2 NADH ilə. Bu reaksiya zamanı sərbəst buraxılan enerji ATP sintezini və digər metabolitlərin daşınmasını təmin edən proton qradiyenti yaradır.


OKSİDİV FOSFORİLƏŞMƏ, ELEKTRON NƏQLİM ZƏNCİRİ

Oksidləşdirici fosforlaşma, NADH və ya FADH2-nin oksidləşməsinin tənəffüs zənciri ilə ATP sintezi ilə daxili mitoxondrial membran boyunca protonların gradienti vasitəsilə birləşməsini əhatə edir.

ELEKTRON NƏQLİYYAT ZƏNCİRİ

Elektron nəqli zənciri elektronları müəyyən ardıcıllıqla azaldılmış nikotinamid koenzimindən (NADH) və ya azaldılmış flavin protez qrupundan (FADH2) molekulyar O2-yə daşıyan düzgün təşkil edilmiş və yönümlü elektron daşıyıcılarından ibarətdir.

Daxili mitoxondrial membran, toxuma substratlarından molekulyar O2-ə elektron axınının son yolunu təşkil edən mitoxondrial tənəffüs zənciri adlanan elektron daşıma zəncirini daşıyır.

Hər addımda elektronlar daha aşağı redoks potensialına malik olan redoks cütlüyünün istəksizindən daha yüksək redoks potensialına malik olan digər redoks cütünün oksidantına axır.

Zəncir boyu elektronların ötürülməsi zamanı sərbəst buraxılan sərbəst enerji ATP-nin yüksək enerjili bağlarının formalaşmasında istifadə olunur.

TƏrif

Koenzimlərin azaldılmış formalarının elektron daşıma zənciri kimi tanınan molekulyar O2 tərəfindən yenidən oksidləşdiyi reaksiyaların ardıcıllığı

Zəncirin əsas elektron daşıyıcıları var

  • NADH dehidrogenaz.
  • Süksinat dehidrogenaz.
  • Koenzim Q.
  • Sitokromlar b2, bH, b560, c1, c, a, & a3 və dəmir kükürd zülalları.

Onların hər biri protez qrupu və ya metal ionları elektron daşınması zamanı reduktant və oksidləşdirici formalara alternativ olaraq dəyişən redoks sistemi kimi fəaliyyət göstərir.

REAKSİYALARIN ADDIMLARI

Mitoxondriyanın daxili membranında elektron daşıma zəncirini idarə etmək üçün dörd kompleks ayrıca təqdim olunur.

Kompleks I və ya NADH-CoQ reduktaza

O, FMN və dəmir-kükürd klasterləri vasitəsilə azaldıcı ekvivalentləri (yəni H+ və e) NADH-dən CoQ-ya köçürür, NADH-ni oksidləşdirir və CoQ-nu azaldır.

Kompleks II və ya suksinat-CoQ reduktaza

O, FAD, sitoxrom v560 və dəmir-kükürd klasterləri vasitəsilə klasterləri birbaşa suksinatdan CoQ-ya nəql edir.

Kompleks III və ya QH2 sitokrom C reduktaza

  • Kompleks III elektronları QH2-dən sitoxrom C-yə köçürür.
  • QH2 iki elektrondan birini Fe2S2-yə köçürür
  • İkinci elektron ardıcıl olaraq sitoxrom b2, sitoxrom pH və yenidən CoQ tərəfindən daşınır.
  • Daha sonra daha az qəbul edilən elektron birbaşa C1 sitoxromuna keçir.
  • Sitokrom C1 daha sonra elektronu sitoxrom C-yə verir

Kompleks IV və ya sitoxrom C oksidaz

  • Ardıcıl dörd elektronun hər birindən bir elektron ötürür.
  • Ferrositokrom C molekulları dörd ferrisitoxrom C molekulu və iki su molekulu istehsal edən O2 molekullarına çevrilir.

/>

Siz həmçinin bəyənə bilərsiniz

BİOTEXNOLOGİYA

Fermentlər


Konspekt

Anoksigen kükürdsüz fotosintetik bakteriyaların (Rhodospirillaceae) hüceyrə redoks hadisələrinə cavab olaraq gen tənzimlənməsini öyrənmək üçün cəlbediciliyi onların müxtəlif ətraf mühit şəraitində böyüməsini təmin edən enerjili çevikliyinə əsaslanır. Oksigenin iştirakı ilə elektronlar NADH (və ya FADH), ubiquinone (Q), sitoxromdan ibarət tənəffüs zənciri vasitəsilə ötürülür. e.ə1, sitokrom c2 və nəhayət, sitoxrom oksidazlar və ya ubiquinol oksidazlar tərəfindən oksigenə çevrilir, bununla da ATPase kompleksləri vasitəsilə ADP-nin fosforlaşmasına imkan verir. Mitoxondrial tənəffüs zəncirinin funksional homologiyasına diqqət yetirin. Aşağı oksigen gərginliyində intrasitoplazmik membranların (ICM) biosintezi induksiya olunur. Bu membranların spesifik polipeptid-bakterioklorofil (BChl) komponentləri – fotosintetik işıq yığan komplekslər (LHC) və reaksiya mərkəzləri (RC) – RC-Q-cyt vasitəsilə siklik fotofosforlaşma sistemini idarə edən işıq enerjisini tutur. e.ə1-cyt c2 RC səhifəsinə qayıt. Hələ 1957-ci ildə bildirilmişdir ki, tənəffüs və fotosintetik elektron daşıma zəncirinin (ETC) komponentlərinin redoks vəziyyəti LHC və RC kodlaşdıran genlərin ifadəsini idarə edən metabolik siqnalları təşkil edə bilər və buna görə də hüceyrələrin fizikaya uyğunlaşmasını təyin edə bilər. verilmiş ekoloji vəziyyət (Cohen-Bazire və b, 1957). İCM sintezinin yüksək oksigen gərginliyi altında və həmçinin yüksək işıq intensivliyi ilə anaerobik şəkildə repressiyası son illərdə ətraflı öyrənilmiş və iki komponentli RegA/RegB (PrrA/PrrB), PpsR sistemi daxil olmaqla, bəzi tənzimləyici sistemlər müəyyən edilmişdir. (CrtJ) repressor və Fnr kimi transkripsiya tənzimləyicisi FnrL ( Oh və Kaplan, 2000 Bauer və b, 2003). Bununla belə, xüsusilə ICM sintezinin işıq tənzimlənməsi üçün, fotosintetik gen ifadəsini idarə edən siqnal ötürülməsi yollarının başlanmasında iştirak edən molekulyar siqnallar və mexanizmlər hələ də zəif xarakterizə olunur və ya hətta naməlumdur. Yüksək işıqlı repressiya effektinin membranlı Q hovuzunun redoks vəziyyətindən asılı olduğu müəyyən edilmişdir (Oh və Kaplan, 2000). Bununla belə, bildiyimizə görə, müxtəlif işıq şəraitində Q-redoks vəziyyətlərinin birbaşa eksperimental ölçüləri indiyədək mövcud deyil. Bu yaxınlarda oksidləşmiş Q-nın RegB/RegA tənzimləmə sistemini birbaşa maneə törətdiyi nümayiş etdirildi. Rhodobacter capsulatus in vitro (Swem və b, 2006), bununla da qaranlıqda yüksək oksigen şəraitində də ICM sintezinin repressiyasına potensial vasitəçilik edir.

Fərqli böyümə şəraitində fərdi ETC komponentlərinin redoks vəziyyətlərinin necə dəyişdiyinə dair kəmiyyət məlumatının olmaması redoks tənzimlənməsinin təklif olunan fərziyyələrinin yoxlanılmasını məhdudlaşdırır və ETC-nin davranışının təmiz keyfiyyət müzakirəsi qeyri-mümkündür, çünki çoxlu dəyişənlər iştirak edir. Burada biz (i) bənövşəyi qeyri-kükürdlü bakteriyaların ETC-nin struktur və funksional imkanlarını birmənalı şəkildə təsvir edən ETC-nin stoxiometrik modelini və (ii) əsas proseslərin termodinamik məhdudiyyətlərinə əsaslanan kinetik modeli təqdim edirik ki, bu da bizə prosesi simulyasiya etməyə imkan verir. müxtəlif ekoloji şəraitdə ETC-nin sabit vəziyyət davranışı, xüsusən də ETC komponentlərinin redoks vəziyyətləri.

Elementar rejim analizi (bax Schuster və b, 2000) ETC-nin sabit vəziyyətdə ETC-nin bütün potensial funksional davranışlarını ifadə edən doqquz əsas rejimi aşkar edir. Stokiometrik model fotosintetik (tsiklik fotosintez və əks elektron nəqli), tənəffüs (NADH və ya suksinatdan elektronların ubiquinol oksidaza və ya sitoxroma ötürülməsi) altında işləyərkən ETC üçün tanınmış dövrləri və yolları təkrarlayır.cbb3) oksidaz) və ya fermentativ (fumaratın reduksiyası) şərtləri. Bu məşhur funksiyalardan başqa, stoxiometrik model tənəffüs şəraitində əks elektron axını təmsil edən iki əməliyyat rejimini aşkar etdi. İndiyə qədər əks elektron axınının funksional rolu əsasən yalnız fotosintetik artım üçün müzakirə edilmişdir. Əslində, termodinamik məhdudiyyətlərə görə, aerob şəraitdə əks elektron axını yalnız kiçik bir rol oynayır və kinetik modelin simulyasiyalarından göründüyü kimi, bu vəziyyəti termodinamik cəhətdən əlverişli etmək üçün iştirak edən metabolitlərin konsentrasiya nisbətləri olduqca həddindən artıq səviyyədə olmalıdır. . Bununla belə, bu əməliyyat müəyyən (bəlkə də müvəqqəti) metabolik vəziyyətlər üçün vacib ola bilər, məsələn, NADH və suksinatın hazırkı redoks potensialında böyük bir disbalans baş verərsə.

Beləliklə, stoxiometrik model - qərəzsiz şəkildə - ETC-nin mənalı funksiyalarını müəyyən etdi, lakin o, yalnız ETC-nin potensial davranışlarını göstərə bilər (normal şəraitdə bunlar normal olaraq üst-üstə düşür). Müxtəlif ekoloji şəraitdə ETC-də baş verən faktiki hərəkətverici qüvvələri, elektron axınlarını və redoks vəziyyətlərini öyrənmək üçün biz buna görə də ETC komponentlərinin ifadəsini tənzimləyən məlum tənzimləyici yolları özündə birləşdirən kinetik model qurduq. Fotosintetik bakteriyalarda struktur və funksional cəhətdən fərqli olan iki növ enerjiyə çevrilən membran (ICM və sitoplazmik membran) mövcud olsa da, modeli yalnız bir membran bölməsi ilə qurduq. Biz bu yanaşmanı əsaslandırırıq, çünki simulyasiyalarda yalnız modelin ya təmiz fotosintetik membran (ICM modeli) (yəni oksidazların iştirakı yoxdur) və ya təmiz tənəffüs (sitoplazmik) membran kimi (fotosintetik RC-lərin iştirakı olmadan) fəaliyyət göstərdiyi ssenariləri nəzərdən keçiririk. Ferment komplekslərinin daxilində baş verən reaksiya mərhələləri, iştirak edən redoks cütlərinin redoks potensialındakı fərqlərə əsaslanan olduqca sadə, lakin termodinamik cəhətdən düzgün kinetik qanunlarla təsvir edilmişdir. ETC ilə birbaşa qarşılıqlı əlaqədə olan metabolitlər üçün sərhəd şərtləri olaraq biz NADH/NAD, suksinat/fumarat və ATP/ADP-nin konsentrasiya nisbətlərini təyin edirik (lakin bu, nəzərdən keçirilən müxtəlif ssenarilər üçün dəyişə bilər).

Bildiyimizə görə, bu, nəzərdən keçirilən komponentlərə və proseslərə münasibətdə bənövşəyi bakteriyalarda ETC-nin ən əhatəli modelidir. Mütləq kəmiyyət vahidləri nəzərə alındıqda modelin dəqiq olduğunu iddia edə bilməsək də (parametrlərdə qeyri-müəyyənliklər və yalnız bir neçə mövcud ölçmə buna imkan vermir), o, ETC-nin davranışı, xüsusən redoks haqqında dəyərli yarımkəmiyyət və keyfiyyət anlayışlarını təmin edir. ölçmək çox vaxt çətin olan əsas komponentlərin vəziyyəti.

Modelin sabit vəziyyət analizinin mühüm nəticələri Şəkil 5-də göstərilmişdir. Qrafiklər Q və sitoxromun redoks vəziyyətlərinin asılılığını göstərir. c2 hovuzlar (Q_chargec2_şarj), proton-hərəkətedici qüvvənin (pmf) və BChl konsentrasiyası (Bchl ICM ölçüsü kimi) dörd müxtəlif böyümə şəraiti üçün sitozolik redoks vəziyyəti (NADH/NAD ilə təmsil olunur): qaranlıqda aerob və yarı aerob və yüksək işıqlı və az işıqlı şəraitdə anaerob. Model aerob böyümə zamanı repressiya olunan və yarı aerob şəraitdə oksigen repressiyasından azad edilən İCM səviyyələri haqqında müşahidələri təkrar edə bilir. Əhəmiyyətli olan odur ki, ICM səviyyəsi Q-nun azalma dərəcəsinə uyğundur. Oksigen məhdudlaşdıran şərtlərin tam aerob böyümə ilə müqayisədə daha çox azalmış Q hovuzu ilə nəticələndiyini xətti tənəffüs zəncirinin işindən sadə şəkildə çıxarmaq olar. Bunun əksinə olaraq, siklik fotofosforilasiya sistemi müxtəlif işıq intensivliyi ilə qarşılaşdıqda Q-redoks vəziyyətinin uyğunlaşdırılmasını sadəcə olaraq saf intuisiya ilə çıxarmaq mümkün deyil. Bildiyimizə görə, yüksək işıq şəraitindən aşağı işıqlı şəraitə keçidin daha azaldılması (fizioloji tənzimləyici model ICM sintezinin yüksək işıqda repressiyasını izah etməyi tələb etdiyi üçün) və ya daha oksidləşmiş Q hovuzu ilə nəticələnirmi sualı hazırda həll olunmur. ədəbiyyat məlumatları. Təəccüblüdür ki, bu vəziyyətin riyazi modellə simulyasiyası birmənalı nəticə verir: Q hovuzu aşağı işıq şəraitində daha çox azalır ki, bu da onun ICM ifadəsi üçün metabolik siqnal kimi təklif olunan roluna uyğundur ( Swem və b, 2006). Qeyd etmək lazımdır ki, bu tapıntı praktiki olaraq istifadə olunan parametr dəyərlərindən müstəqildir, əksinə, sistemin xas xüsusiyyətidir. Əks nəticənin, yəni Q-nun yüksək işıq şəraitində daha çox azaldığı bir parametr dəsti tapa bilmədik.

Şəkil 5-dən çıxarıla bilən başqa bir nəticə ondan ibarətdir ki, (yalnız) fotosintetik şəraitdə ETC-nin elektronlarla optimal yükü (və buna görə də burada NADH/NAD nisbəti ilə əks olunan optimal sitozolik redoks vəziyyəti) mövcuddur və nəticədə maksimum Δsəh. Model optimal yükün işığın intensivliyindən asılı olduğunu aydın şəkildə nümayiş etdirir. Belə iki fazalı davranış tənəffüs artımı üçün görünə bilməz: Δsəh sitozolik redoks vəziyyəti ilə monoton şəkildə artır.

Bu nəticələr eksperimental təsdiqini gözləyən anoksigen fotosintetik bakteriyalarda ETC-nin davranışına dair proqnozların əldə edilməsində təqdim olunan modelin dəyərini və tətbiqini göstərir.


Bitkilərdə elektron nəqliyyat sistemi və ya oksidləşdirici fosforlaşma

Oksidləşdirici fosforlaşma konseptual olaraq sadə və mexaniki cəhətdən mürəkkəbdir. Fotosintezin işıq reaksiyasında görünür ki, günəş işığının foton hissəciklərini udaraq həyəcanlanan xlorofil yüksək enerjili elektron çıxarır və nəhayət bir sıra elektron kameralar vasitəsilə enerji itirərək bir-birinin ardınca yenidən xlorofillə qayıdır. Bu elektron daşıyıcıları birlikdə elektron daşıyıcı sistemlər adlandırırlar. Bu, hüceyrə tənəffüsü və ya bütövlükdə sadəcə tənəffüs adlanan bir sıra enerji çevrilmələrinin kulminasiya nöqtəsidir. Oksidləşdirici fosforlaşma, limon turşusu dövründən enerji prekursorlarından elektron nəqlinin ATP istehsal edərək ADP-nin fosforlaşmasına səbəb olduğu prosesdir. Bu, mitoxondrilərdə də baş verir.

Vəzifə: Bu daşıyıcılar xloroplastın tilakoidlərinin membranında düzülmüşdür. Daşıyıcılar aşağıdakılardır:


Fotosintez

Yüngül məhsul yığımı

Fotosintezdə ilk addım piqmentlər tərəfindən işığın udulmasıdır. Müxtəlif növ xlorofillə yanaşı, bu piqmentlərə karotenoidlər və məsələn, siyanobakteriyalarda olan açıq zəncirli tetrapirol bilin piqmentləri daxildir. Xlorofil, hemoglobinə bənzəyən tetrapirol halqasına əsaslanan bir piqmentdir, ancaq tərkibində dəmirdən çox maqnezium var. Üzük uzun yan zəncirlə bağlanır. Xlorofil mavi və qırmızı işığı udur, yaşıl işığı ötürür və beləliklə yaşıl görünür. Bitkilərdə iki növ xlorofil, ab, udulmuş dalğa uzunluqlarının diapazonunu artırın. Xlorofil molekulları tərəfindən udulan işıq enerjisi ya istilik və ya flüoresan kimi itirilə bilər, ya da rezonans ötürülməsi ilə qonşu xlorofil molekulları arasında ötürülə bilər. Xlorofil və karotenoidlər yüngül yığım komplekslərində zülallarla birləşirlər. Yüngül yığan komplekslər, ehtimal ki, reaksiya mərkəzini əhatə edən bakteriyalarda pişi şəklindədir. İşıq yığan kompleks, peyk antennasına bənzər bir antena kimi fəaliyyət göstərir, fotonları yüklərin ayrılması baş verən xlorofilin dimerik formasını ehtiva edən reaksiya mərkəzlərinə qidalandırır. Antena anlayışı 1932-ci ildə Emerson və Arnold tərəfindən yalnız bir CO2 molekul qısa bir işıq parıltısından sonra ~2500 xlorofil molekulundan əmələ gəldi.

Daha yüksək təşkilat səviyyəsində, yarpaq və onun hüceyrələri də işığı səmərəli şəkildə yığmağa uyğunlaşdırılır. Kölgədə, işıq tutma sahəsini artırmaq və işığın adekvat şəkildə nüfuz etməsinə imkan vermək üçün fotosintetik aparat böyük nazik yarpaqlarda yayılmışdır və hər antena üçün daha çox işıq yığan xlorofil var. Yarpaqda epidermal hüceyrələr işığa fokuslanmaq üçün fəaliyyət göstərə bilər, uzanmış palisade hüceyrələr işıq bələdçisi rolunu oynayır, mezofil hüceyrələri isə işığı əks etdirir, “güzgülər zalı” kimi fəaliyyət göstərir və fotonların getdiyi məsafəni artırır və bununla da onların vurma şansını artırır. antena kompleksi.


Nəticələr

Rotenon və TTFA çevrilmiş və xərçəng hüceyrələrində hüceyrə ölümünə səbəb olur

İnsan embrion böyrək hüceyrə xətti HEK 293 və glioma hüceyrə xətti U87 mETC-kompleks-I inhibitoru rotenon (50 μM) və ya mETC-kompleks-II inhibitoru TTFA (0,5 mM) ilə 0, 24, 48 və 72 saat ərzində inkubasiya edilmişdir və hüceyrə ölümü membran keçiriciliyi ilə ölçülür. HEK 293 və U87 hüceyrələrində 72 saatlıq bir kurs ərzində hüceyrə ölümü rotenon və TTFA tərəfindən induksiya edilmişdir (Şəkil 1). HEK 293 hüceyrələrində rotenon və TTFA 72 saatdan sonra müvafiq olaraq 30% və 40% hüceyrə ölümünə səbəb oldu (Şəkil 1A), U87 hüceyrələrində isə müvafiq olaraq 40% və 90% hüceyrə ölümünə səbəb oldular (Şəkil 1B). . Rotenon və TTFA həmçinin HEK 293 və U87 hüceyrələrində dozadan asılı hüceyrə ölümünə səbəb oldu (məlumatlar göstərilmir).

Rotenon və TTFA HEK 293 və U87 hüceyrələrində 72 saatlıq müddət ərzində hüceyrə ölümünə səbəb olur. Hüceyrə ölümü Materiallar və Metodlar bölməsində göstərildiyi kimi ölçüldü. HEK 293 (A) və U87 (B) hüceyrələri 72 saat ərzində 50.0 μM rotenon (R kompleks-I inhibitoru) və ya 0.5 mM TTFA (T kompleks-II inhibitoru) ilə müalicə edildi. Səhv çubuqları s.e. üç müstəqil təcrübədən.

Rotenon və TTFA HEK 293 və U87 hüceyrələrində 72 saatlıq müddət ərzində hüceyrə ölümünə səbəb olur. Hüceyrə ölümü Materiallar və Metodlar bölməsində göstərildiyi kimi ölçüldü. HEK 293 (A) və U87 (B) hüceyrələri 72 saatlıq müddət ərzində 50.0 μM rotenon (R kompleks-I inhibitoru) və ya 0.5 mM TTFA (T kompleksi-II inhibitoru) ilə müalicə edilmişdir. Səhv çubuqları s.e. üç müstəqil təcrübədən.

Rotenon və TTFA çevrilmiş və xərçəng hüceyrələrində otofagiyaya səbəb olur

Otofagiya turşu vezikulyar orqanellələrin (AVO) (autofaqosomlar və avtolizosomlar) əmələ gəlməsi ilə xarakterizə olunur və autofagiya zamanı beclin 1 və ATG5 kimi otofagiya zülalları ifadə edilir və mikrotubulla əlaqəli zülal 1 yüngül zənciri 3 (LC3, MAP1LC3) yerləşir. autofaqosomlar (Baehrecke, 2005 Codogno and Meijer, 2005 Gozuacik and Kimchi, 2004 Guimarães and Linder, 2004 Levine and Yuan, 2005 Mariño and López-Otín, 2004). Bu tədqiqatda autofagiyanın aşkarlanması aşağıdakı ölçülərlə həyata keçirildi: (1) axın sitometriyası (FACS) ilə AVO-ların əmələ gəlməsi (2) AVO-ların elektron mikroskopiyası (EM) (3) GFP-LC3 etiketli vakuolların əmələ gəlməsi (AVO-lardan) transfeksiya və flüoresan mikroskopiya və (4) western blot ilə LC3-ün sitoplazmatik formasının (LC3-I, 18 kDa) LC3-ün pre-autofagosomal və autofagosomal membrana bağlı formasına (LC3-II, 16 kDa) çevrilməsi və western blot tərəfindən beclin 1 ifadəsi. Kompleks-I inhibitoru rotenon və kompleks-II inhibitoru TTFA, 72 saat ərzində HEK 293 və U87 hüceyrələrində AVO əmələ gəlməsini əhəmiyyətli dərəcədə induksiya etdi (Şəkil 2Ai-ii, əlavə material Şəkil S1). HEK 293 hüceyrələrində və U87 hüceyrələrində rotenon və TTFA tərəfindən induksiya olunan AVO-ların əmələ gəlməsi, hüceyrələr 48 saat müalicə olunduqdan sonra otofagiya inhibitoru 3-metilladenin (3-MA) ​​tərəfindən müvafiq olaraq təxminən 40% və 50% bastırıldı (Şəkil 2). 2Aiii). Müsbət bir nəzarət olaraq, HEK 293 hüceyrələri AVO əmələ gəlməsini artırmaq üçün aclıq şəraitində yerləşdirildi, bu artım 3-MA tərəfindən bloklandı (əlavə material Şəkil S2A). Elektron mikroskopiyadan istifadə edərək, fərqli olaraq 48 saat ərzində TTFA ilə müalicə edildikdən sonra HEK 293 hüceyrələrində sitozolik məzmunu olan ikiqat membranlı autofagosomları (Şəkil 2B, qara oxlar) müəyyən etdik, nüvələr (N) təmizlənməmiş hüceyrələrdə aydın görünürdü (Şəkil 2B). ). LC3 otofaqosom formalaşması üçün xüsusi bir marker olduğundan (Mizushima, 2004), GFP-LC3 cDNA hüceyrələrə köçürüldü və GFP-LC3 etiketli vakuolları olan hüceyrələr 48 saatlıq bir kurs ərzində flüoresan mikroskopdan istifadə edilərək sayıldı. AVO əmələ gəlməsinin nəticələri ilə razılaşaraq, rotenon və TTFA 48 saatlıq müalicədən sonra HEK 293 və U87 hüceyrələrində GFP-LC3 ilə işarələnmiş vakuolların (25-30%) əhəmiyyətli dərəcədə formalaşmasına səbəb oldu, halbuki 6 saatlıq müalicə az GFP-LC3 göstərdi. -etiketli vakuollar (şəkil 2Ci,ii). Şəkil 2Ciii, U87 hüceyrələri 48 saat ərzində rotenonla müalicə edildikdən sonra GFP-LC3 etiketli vakuolların əmələ gəlməsini göstərir. U87 hüceyrələrində TTFA müalicəsindən sonra və HEK 293 hüceyrələrində rotenon və ya TTFA müalicəsindən sonra GFP-LC3 etiketli vakuol formalaşması da 3-MA tərəfindən inhibə edilmişdir (Şəkil 2Civ). Müsbət bir nəzarət olaraq, GFP-LC3 etiketli vakuolların miqdarını artırmaq üçün HEK 293 hüceyrələri aclıq şəraitində yerləşdirildi, bu artım 3-MA tərəfindən bloklandı (əlavə material Şəkil S2B). Mənfi nəzarət olaraq hüceyrələr tək GFP ilə transfeksiya edilib və ya gözlənildiyi kimi DMSO ilə müalicə olunub, rotenon və ya TTFA müalicəsindən sonra heç bir vakuol əmələ gəlməsi müşahidə olunmayıb (məlumatlar göstərilməyib).

Rotenon və TTFA otofagiyaya səbəb olur. HEK 293 və U87 hüceyrələri Şəkil 1-də təsvir olunduğu kimi müalicə olundu. (A) AVO (autophagosomes və autolysosomes) olan hüceyrələrin faizi axın sitometriyası ilə müəyyən edildi. Rotenon (R) və TTFA (T) tərəfindən induksiya edilən AVO əmələ gəlməsinin dərəcələri (i) HEK 293 və (ii) U87 hüceyrələrində 72 saatlıq müddət ərzində göstərilmişdir. (iii) 3-MA-nın (2.0 mM) U87 və HEK 293 hüceyrələrində 48 saatlıq müalicədən sonra rotenon və ya TTFA tərəfindən induksiya edilmiş AVO-ların əmələ gəlməsinə təsiri. P 0,05-dən aşağı qiymətlər qeyd edildiyi kimi şərtlər arasında əhəmiyyətli fərqi ifadə edir. (B) 48 saat ərzində müalicə olunmamış (nəzarət) və ya TTFA (0,5 mM) ilə müalicə edilmiş HEK 293 hüceyrələrinin elektron-mikroskopiya şəkilləri çəkilmişdir. Oklar TTFA ilə müalicə olunan hüceyrələrdə ikiqat membranlı vakuolları təmsil edir (böyüdülmüş şəkil). N nüvəni təmsil edir. (C) GFP-LC3 etiketli vakuolların (nöqtələrin) formalaşması. 48 saat ərzində rotenon və ya TFFA müalicəsindən sonra (i) HEK 293 və (ii) U87 hüceyrələrində GFP-LC3 etiketli vakuolları (nöqtələri) olan hüceyrələrin faizi müəyyən edilmişdir. Səhv çubuqları s.e. üç müstəqil təcrübədən ibarətdir. (iii) Təkcə GFP ilə işlənmiş U87 hüceyrələrinin üç müstəqil eksperimentindən olan nümayəndə şəkilləri yalnız GFP-LC3 GFP-LC3 və rotenon və GFP-LC3, rotenon və 3-MA (2.0 mM) Olympus mikroskopu və soyuducu kamera ilə çəkilmişdir. Nükleolus DAPI (mavi) ilə boyandı. (iv) HEK 293 və U87 hüceyrələri 3-MA (2.0 mM) varlığında və ya olmamasında rotenon və ya TTFA ilə müalicə edildi. (D) LC3-I-nin LC3-II-yə çevrilməsi (i) HEK 293 və (ii) lizosomal inhibitor NH-nin mövcudluğu və ya olmaması ilə 6, 16 və ya 24 saat ərzində rotenon və ya TTFA ilə müalicə edilmiş U87 hüceyrələrində müəyyən edilmişdir.4Cl (30 mM). LC3 ifadəsi üçün hüceyrələr parçalandı və qərbdən ləkələndi. Ləkələr soyulmuş və bərabər yükləmə üçün anti-aktin antikoru ilə yenidən sınaqdan keçirilmişdir. (E) Beclin 1 ifadəsi 48 saatlıq müalicədən sonra HEK 293 və U87 hüceyrələrində rotenon və TTFA müalicəsindən sonra müəyyən edilmişdir. Hüceyrələr parçalandı və beclin 1 üçün western blotlandı və aktin yükləmə nəzarəti olaraq istifadə edildi.

Rotenon və TTFA otofagiyaya səbəb olur. HEK 293 və U87 hüceyrələri Şəkil 1-də təsvir olunduğu kimi müalicə olundu. (A) AVO (autophagosomes və autolysosomes) olan hüceyrələrin faizi axın sitometriyası ilə müəyyən edildi. Rotenon (R) və TTFA (T) tərəfindən induksiya edilən AVO əmələ gəlməsinin dərəcələri (i) HEK 293 və (ii) U87 hüceyrələrində 72 saatlıq müddət ərzində göstərilmişdir. (iii) 3-MA-nın (2.0 mM) U87 və HEK 293 hüceyrələrində 48 saatlıq müalicədən sonra rotenon və ya TTFA tərəfindən induksiya edilmiş AVO-ların əmələ gəlməsinə təsiri. P 0,05-dən aşağı qiymətlər qeyd edildiyi kimi şərtlər arasında əhəmiyyətli fərqi ifadə edir. (B) 48 saat ərzində müalicə olunmamış (nəzarət) və ya TTFA (0,5 mM) ilə müalicə edilmiş HEK 293 hüceyrələrinin elektron-mikroskopiya şəkilləri çəkilmişdir. Oklar TTFA ilə müalicə olunan hüceyrələrdə ikiqat membranlı vakuolları təmsil edir (böyüdülmüş şəkil). N nüvəni təmsil edir. (C) GFP-LC3 etiketli vakuolların (nöqtələrin) formalaşması. 48 saat ərzində rotenon və ya TFFA müalicəsindən sonra (i) HEK 293 və (ii) U87 hüceyrələrində GFP-LC3 etiketli vakuolları (nöqtələri) olan hüceyrələrin faizi müəyyən edilmişdir. Səhv çubuqları s.e. üç müstəqil təcrübədən ibarətdir. (iii) Təkcə GFP ilə işlənmiş U87 hüceyrələrinin üç müstəqil eksperimentindən olan nümayəndə şəkilləri yalnız GFP-LC3 GFP-LC3 və rotenon və GFP-LC3, rotenon və 3-MA (2.0 mM) Olympus mikroskopu və soyuducu kamera ilə çəkilmişdir. Nükleolus DAPI (mavi) ilə boyandı. (iv) HEK 293 və U87 hüceyrələri 3-MA (2.0 mM) varlığında və ya olmamasında rotenon və ya TTFA ilə müalicə edildi. (D) LC3-I-nin LC3-II-yə çevrilməsi (i) HEK 293 və (ii) lizosomal inhibitor NH-nin mövcudluğu və ya olmaması ilə 6, 16 və ya 24 saat ərzində rotenon və ya TTFA ilə müalicə edilmiş U87 hüceyrələrində müəyyən edilmişdir.4Cl (30 mM). LC3 ifadəsi üçün hüceyrələr parçalandı və vestern blotlandı. Ləkələr soyulmuş və bərabər yükləmə üçün anti-aktin antikoru ilə yenidən sınaqdan keçirilmişdir. (E) Beclin 1 ifadəsi 48 saatlıq müalicədən sonra HEK 293 və U87 hüceyrələrində rotenon və TTFA müalicəsindən sonra müəyyən edilmişdir. Hüceyrələr parçalandı və beclin 1 üçün western blotlandı və aktin yükləmə nəzarəti olaraq istifadə edildi.

LC3-I-nin LC3-II-yə çevrilməsi otofagiya üçün başqa bir xüsusi markerdir. HEK 293 və U87 hüceyrələrində həm rotenon, həm də TTFA 16 və 24 saatlıq müalicədən sonra nəzarətlə müqayisədə daha çox LC3-II ifadəsini induksiya etdi, halbuki LC3-II ifadəsi 6 saatlıq müalicədən sonra arta bilmədi (Şəkil 2D) . Lizosomal inhibitorun iştirakı ilə ammonium xlorid (NH4Otofaqosomlarda LC3-ün deqradasiyasının qarşısını alan Cl), həm HEK 293, həm də U87 hüceyrələrində rotenon və ya TTFA ilə müalicədən sonra LC3-II miqdarı artmışdır (Şəkil 2D). Bununla belə, NH4Cl müalicəsi rotenon və ya TTFA ilə müalicədən sonra GFP-LC3 etiketli vakuolların əmələ gəlməsini əhəmiyyətli dərəcədə artıra bilmədi (məlumatlar göstərilmir). LC3-II toplanmasına bənzər olaraq, beclin 1 ifadəsi də 6 saatlıq müalicədən sonra HEK 293 və U87 hüceyrələrində rotenon və TTFA ilə əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 2E). Birlikdə götürüldükdə, rotenon və TTFA transformasiya edilmiş və xərçəng hüceyrələrində otofagiyaya səbəb ola bilər.

Rotenon və TTFA transformasiya edilmiş və xərçəng hüceyrələrində otofagik hüceyrə ölümünə səbəb olur

Otofagiya tez-tez aclıq nəticəsində yaranan sağ qalma mexanizmi kimi qəbul edilir və onun hüceyrə ölümü mexanizmi kimi rolu mübahisəlidir (Mariño və López-Otín, 2004). Rotenon və ya TTFA tərəfindən törədilən otofagiyanın hüceyrə ölümünə töhfə verib-vermədiyini müəyyən etdik. Həm HEK 293, həm də U87 hüceyrələrində rotenon və ya TTFA tərəfindən induksiya edilən hüceyrə ölümü 3-MA tərəfindən 40% inhibə edildi, halbuki kaspaz inhibitoru zVAD-fmk (zVAD) HEK 293 hüceyrələrində rotenon və TTFA ilə induksiya olunan hüceyrə ölümünü inhibə edə bilmədi ( Şəkil 3A). Bundan əlavə, zVAD tək başına HEK 293 və U87 hüceyrələrində autofagiyaya səbəb ola bilmədi. U87 hüceyrələrində zVAD həm rotenon, həm də TTFA səbəb olduğu hüceyrə ölümünü azalda bildi ki, bu da U87 hüceyrələrində həm autofagiya, həm də apoptozun baş verdiyini göstərir (Şəkil 3A). Bu nəticələri təsdiqləmək üçün biz sub-G1 pik və TUNEL analizi ilə DNT parçalanmasının miqdarını (apoptozun əlaməti) təyin etdik. Rotenon və ya TTFA ilə müalicə olunan HEK 293 hüceyrələri apoptozu induksiya edə bilmədi, etoposid (DNT-yə zərər verən agent) HEK 293 hüceyrələrində apoptoza səbəb oldu (Şəkil 3B). U87 hüceyrələrində həm rotenon, həm də TTFA apoptoza səbəb oldu, lakin etoposidlə müalicədən daha az dərəcədə (Şəkil 3B). Rotenon və ya TTFA müalicəsindən sonra HEK 293 və ya U87 hüceyrələrində apoptozun miqdarı 3-MA varlığında dəyişməyib (əlavə material Şəkil S3). Beclin 1 və ATG5 zülallarının ifadəsi otofagiyanın induksiyasına kömək etdiyi üçün biz onların ifadəsini beclin 1 və ATG5 U87 hüceyrələrinə (Şəkil 3Ci) və HEK 293 hüceyrələrinə (əlavə material Şəkil S4). Rotenon və TTFA müalicəsinin otofagiya, hüceyrə ölümü və apoptoza təsiri müəyyən edilmişdir. Beclin 1 və transfeksiyası ATG5 Hüceyrələrə siRNA-lar rotenon və TTFA ilə induksiya olunan AVO əmələ gəlməsini və GFP-LC3 etiketli vakuol əmələ gəlməsini azaldıb (Şəkil 3Cii,iii) və rotenon və TTFA (Şəkil 3Di) tərəfindən törədilən hüceyrə ölümünün səviyyəsini maneə törətdi. Rotenon və TTFA-nın yaratdığı apoptoza (sub-G1 zirvələrinin formalaşması) beclin 1 və ATG5 siRNA-lar (Şəkil 3Dii). Similar results were found for HEK 293 cells (supplementary material Fig. S4). These results indicate that autophagy induced by rotenone and TTFA contributes to cell death.

ROS are a mediator for autophagic cell death induced by rotenone and TTFA

Because ROS have been implicated in autophagy (Xu et al., 2006 Yu et al., 2006) and apoptosis (Pelicano et al., 2004), we determined whether ROS mediate autophagy and autophagic cell death induced by rotenone and TTFA. Both rotenone and TTFA induced elevated ROS generation in a 72-hour time course in HEK 293 and U87 cells (Fig. 4A, supplementary material Fig. S5). ROS generation was detected following 1 hour of treatment and remained elevated throughout the 72-hour time course. Presence of the ROS scavenger tiron (1.0 mM) reduced ROS generation following rotenone and TTFA treatment in both HEK 293 and U87 cells (Fig. 4Bi). A reduction in AVO formation and in the formation of GFP-LC3-labeled vacuoles was also detected in these tiron-treated cells (Fig. 4Bii,iii). Similar results were found with the ROS scavengers glutathione and L-cysteine (supplementary material Fig. S6A-C). Expression of beclin 1 and conversion of LC3-I to LC3-II induced by rotenone and TTFA were significantly reduced by the presence of tiron (Fig. 4C). Total cell death was also reduced by tiron in HEK 293 and U87 cells (Fig. 4Di). Similar findings were found with other ROS scavengers in HEK 293 cells (supplementary material Fig. S6D). By contrast, tiron failed to affect apoptosis (formation of sub-G1 peaks) following rotenone or TTFA treatment in HEK 293 and U87 cells (Fig. 4Dii). This indicates that ROS scavengers decreased autophagy and autophagic cell death induced by rotenone and TTFA in transformed and cancer cells.

Manganese-superoxide dismutase (SOD2) is one of the mitochondrial antioxidant enzymes that reduce superoxide levels within cells (Pelicano et al., 2004). The effects of rotenone and TTFA on ROS generation, autophagy, cell death and apoptosis were investigated in wild-type and SOD2-overexpressing HeLa cells (western blot of SOD2, see supplementary material Fig. S7). After a treatment of 24 hours, rotenone and TTFA induced 40% and 60% ROS generation, respectively, in the wild-type cells these figures were reduced to 14% and 24%, respectively, in the SOD2-overexpressing cells (Fig. 5A). Importantly, the overexpression of SOD2 in HeLa cells also reduced rotenone- or TTFA-induced autophagy. Rotenone and TTFA induced 20% and 30% formation of AVOs, respectively, in HeLa cells, and this was reduced to 6% and 4%, respectively, in SOD2-overexpressing cells (Fig. 5Bi). In agreement with the results of AVO formation, rotenone and TTFA induced the formation of GFP-LC3-labeled vacuoles in wild-type cells but not in SOD2-overexpressing cells (Fig. 5Bii, supplementary material Fig. S8). Again, compared with controls, rotenone and TTFA significantly induced beclin 1 expression and conversion of LC3-I to LC3-II in wild-type cells, whereas these processes were blocked in SOD2-overexpressing cells (Fig. 5C). Treatment with NH4Cl increased LC3-II expression in wild-type cells following rotenone or TTFA treatment but failed to increase LC3-II expression in SOD2-overexpressing cells (Fig. 5Cii). Overexpression of SOD2 also decreased the levels of cell death induced by rotenone and TTFA by 34% and 45%, respectively (Fig. 5D). The autophagy inhibitor 3-MA inhibited rotenone- and TTFA-induced cell death by 30% and 34%, respectively, in the wild-type cells, but it had no effect on the rotenone- and TTFA-induced cell death when SOD2 was overexpressed (Fig. 5D). As a control, 3-MA was able to reduce the formation of GFP-LC3-labeled vacuoles induced by rotenone and TTFA in these cells (supplementary material Fig. S8). When zVAD was added, cell death was reduced in wild-type cells and in SOD2-overexpressing cells, and, when 3-MA and zVAD were combined, cell death was further reduced in wild-type cells. This indicates that both autophagy and apoptosis that occur in wild-type cells contribute to overall cell death induced by rotenone or TTFA, whereas only apoptosis was induced in SOD2-overexpressing cells. To confirm that apoptosis is occurring, wild-type and SOD2-overexpressing cells were treated with rotenone or TTFA and sub-G1 peak analysis or TUNEL assay was preformed. Rotenone and TTFA induced apoptosis both in wild-type and SOD2-overexpressing cells (Fig. 5E). As a positive control, HeLa cells were treated with etoposide, which induced apoptosis to a greater extent than rotenone or TTFA (Fig. 5E). Etoposide induced total cell death to a similar extent as rotenone in wild-type cells (data not shown). Taken together, these results indicate that the rotenone and TTFA-induced cell death in SOD2-overexpressing cells might be mainly apoptotic because it was not inhibited by 3-MA (Fig. 5D). This is in agreement with the fact that rotenone and TTFA did not induce autophagy when SOD2 was overexpressed (Fig. 5B,C).

Rotenone and TTFA induce autophagic cell death in HEK 293 and U87 cells. Cells were treated with 50.0 μM rotenone (R) 0.5 mM TTFA (T) 3-MA, 2.0 mM (autophagy inhibitor) and/or zVAD, 0.1 mM (caspase inhibitor). (A) Effect of autophagy and apoptosis inhibitors on rotenone- or TTFA-induced cell death after treatment for 48 hours was determined. HEK 293 or U87 cells were treated with TTFA or rotenone alone or with each in combination with 3-MA, zVAD or both. Etoposide (100 μM) was used as an apoptotic stimuli. The amount of cell death was determined by membrane permeabilization, as described in the Materials and Methods section. (B) The amount of apoptotic cell death was determined by sub-G1 peak or TUNEL analysis. HEK 293 or U87 cells were treated with rotenone, TTFA or etoposide and the percentage of apoptotic cells was determined. (C) Effect of siRNAs against the autophagic genes beclin 1 and ATG5 on rotenone- or TTFA-induced autophagy, cell death and apoptosis in U87 cells after a treatment of 48 hours was determined. U87 cells were not transfected (non siRNA) or were transfected with scrambled siRNA or siRNAs against beclin 1 or ATG5. (i) Cells were lysed and western blotted for beclin 1 and ATG5. Blots were stripped and re-probed with anti-actin antibody for equal loading. (Cii,Ciii,Di,Dii) The effects of siRNA against beclin 1 and ATG5, and of scrambled siRNA, on AVO formation (Cii), GFP-LC3-labeled vacuoles (Ciii), cell death (Di) and apoptosis (formation of sub-G1 peaks) (Dii) following rotenone or TTFA treatment were determined. Error bars represent s.e. from three independent experiments. * Represents significant difference from control conditions (P<0.05). # (A) Represents a lack of significant difference from control conditions (P>0.05).

Rotenone and TTFA induce autophagic cell death in HEK 293 and U87 cells. Cells were treated with 50.0 μM rotenone (R) 0.5 mM TTFA (T) 3-MA, 2.0 mM (autophagy inhibitor) and/or zVAD, 0.1 mM (caspase inhibitor). (A) Effect of autophagy and apoptosis inhibitors on rotenone- or TTFA-induced cell death after treatment for 48 hours was determined. HEK 293 or U87 cells were treated with TTFA or rotenone alone or with each in combination with 3-MA, zVAD or both. Etoposide (100 μM) was used as an apoptotic stimuli. The amount of cell death was determined by membrane permeabilization, as described in the Materials and Methods section. (B) The amount of apoptotic cell death was determined by sub-G1 peak or TUNEL analysis. HEK 293 or U87 cells were treated with rotenone, TTFA or etoposide and the percentage of apoptotic cells was determined. (C) Effect of siRNAs against the autophagic genes beclin 1 and ATG5 on rotenone- or TTFA-induced autophagy, cell death and apoptosis in U87 cells after a treatment of 48 hours was determined. U87 cells were not transfected (non siRNA) or were transfected with scrambled siRNA or siRNAs against beclin 1 or ATG5. (i) Cells were lysed and western blotted for beclin 1 and ATG5. Blots were stripped and re-probed with anti-actin antibody for equal loading. (Cii,Ciii,Di,Dii) The effects of siRNA against beclin 1 and ATG5, and of scrambled siRNA, on AVO formation (Cii), GFP-LC3-labeled vacuoles (Ciii), cell death (Di) and apoptosis (formation of sub-G1 peaks) (Dii) following rotenone or TTFA treatment were determined. Error bars represent s.e. from three independent experiments. * Represents significant difference from control conditions (P<0.05). # (A) Represents a lack of significant difference from control conditions (P>0.05).

ROS scavenger tiron decreases autophagy and autophagic cell death induced by rotenone and TTFA in HEK 293 and U87 cells. Cells were treated with 50.0 μM rotenone (R), 0.5 mM TTFA (T), and/or tiron (1.0 mM). (A) ROS generation after (i) HEK 293 and (ii) U87 cells were treated with rotenone or TTFA over a 72-hour time course. (B) HEK 293 and U87 cells were treated with tiron alone or in combination with rotenone or TTTF. The percentages of (i) ROS generation, (ii) AVO formation and (iii) GFP-LC3-labeled vacuoles (dots) were determined after 48 hours. (C) Expression of beclin 1 (i) and conversion of LC3-I to LC3-II (ii) were determined by western blotting after 48 hours in the presence or absence of tiron. Actin was used as a loading control. NH4Cl was used as a lysosomal inhibitor. (Di) Cell death was determined by membrane permeabilization following rotenone or TTFA treatment in the presence or absence of tiron in HEK 293 and U87 cells after 48 hours. (Dii) Apoptosis (formation of sub-G1 peaks) was determined in HEK 293 and U87 cells treated as above. Error bars represent s.e. from three independent experiments. P values less than 0.05 represent significant difference between conditions, as indicated.

ROS scavenger tiron decreases autophagy and autophagic cell death induced by rotenone and TTFA in HEK 293 and U87 cells. Cells were treated with 50.0 μM rotenone (R), 0.5 mM TTFA (T), and/or tiron (1.0 mM). (A) ROS generation after (i) HEK 293 and (ii) U87 cells were treated with rotenone or TTFA over a 72-hour time course. (B) HEK 293 and U87 cells were treated with tiron alone or in combination with rotenone or TTTF. The percentages of (i) ROS generation, (ii) AVO formation and (iii) GFP-LC3-labeled vacuoles (dots) were determined after 48 hours. (C) Expression of beclin 1 (i) and conversion of LC3-I to LC3-II (ii) were determined by western blotting after 48 hours in the presence or absence of tiron. Actin was used as a loading control. NH4Cl was used as a lysosomal inhibitor. (Di) Cell death was determined by membrane permeabilization following rotenone or TTFA treatment in the presence or absence of tiron in HEK 293 and U87 cells after 48 hours. (Dii) Apoptosis (formation of sub-G1 peaks) was determined in HEK 293 and U87 cells treated as above. Error bars represent s.e. from three independent experiments. P values less than 0.05 represent significant difference between conditions, as indicated.

The above results indicate that overexpression of SOD2 prevents ROS accumulation, autophagy and autophagy-induced cell death. Inversely, the suppression of SOD2 expression might increase ROS generation, autophagy and autophagy-induced cell death. The expression of SOD2 was suppressed by transfection of HeLa cells (wild type) with siRNA against SOD2 (Fig. 6A). Fig. 6B demonstrates that rotenone or TTFA-induced ROS generation was increased from approximately 30% to 50% following transfection with siRNA against SOD2. Similarly, rotenone or TTFA-induced autophagy (formation of AVOs and GFP-LC3-labeled vacuoles) was increased by silencing SOD2 expression with siRNA (Fig. 6C,D). Finally, rotenone and TTFA-induced cell death was increased from 27% to 37% and from 33% to 44%, respectively, by silencing SOD2 expression, and treatment with 3-MA decreased rotenone- and TTFA-induced total cell death to 23% and 27%, respectively, in cells lacking SOD2 (Fig. 6E). However, apoptosis (formation of sub-G1 peaks) induced by rotenone or TTFA was not affected by SOD2 siRNA (Fig. 6F). Nə vaxt SOD2 siRNA was transfected into HEK 293 cells, similar results were obtained to those of HeLa cells, with TTFA-induced ROS generation, autophagy (formation of AVOs) and cell death (supplementary material Fig. S9).

Because it was reported that ROS generation could be a downstream effect of autophagy (Yu et al., 2006), we investigated whether the inhibition of autophagy could affect ROS generation induced by mETC inhibitors. Fig. 7 shows that rotenone- and TTFA-induced ROS generation was not affected by the autophagy inhibitor 3-MA or by siRNAs against the autophagy genes beclin 1 or ATG5 in HEK 293 cells. A similar result was obtained in U87 cells: TTFA-induced ROS generation was not affected by siRNAs against the autophagy genes beclin 1 or ATG5 (supplementary material Fig. S10).

Rotenone and TTFA induce apoptosis but not autophagy in non-transformed primary mouse astrocytes

Rotenone and TTFA can induce autophagy and autophagic cell death in transformed cells (HEK 293 cells) and cancer cells (U87 and HeLa cells). The effect of rotenone and TTFA in normal, non-transformed cells is unknown. We isolated normal primary astrocytes from mice and treated the cells with rotenone and TTFA. As shown in Fig. 8A, in mouse astrocytes, rotenone and TTFA failed to significantly induce ROS generation compared with controls over a 48-hour time course. Rotenone and TTFA also failed to significantly increase the amount of AVO formation or GFP-LC3-labeled vacuoles compared with controls, even in the presence of lysosomal inhibitor NH4Cl, over a 48-hour time course (Fig. 8B). In addition, rotenone and TTFA failed to induce a higher amount of beclin 1 expression (Fig. 8Ci). LC3-I expression was undetectable in mouse primary astrocytes compared with the cancer cell lines (Fig. 8Cii). The conversion of LC3-I to LC3-II was unchanged compared to control and NH4Cl increased LC3-II expression, but rotenone or TTFA treatment failed to further increase LC3-II expression (Fig. 8Cii). Mouse astrocytes were still capable of inducing autophagy. Under starvation conditions, LC3-II expression was increased (Fig. 8Cii). In addition, both AVO formation and the amount of GFP-LC3-labeled vacuoles were increased following starvation of mouse astrocytes and were reduced in the presence of 3-MA (supplementary material Fig. S11). Rotenone and TTFA, however, induced cell death in mouse astrocytes (Fig. 8D). This was mainly caused by apoptosis (formation of sub-G1 peaks), as shown in Fig. 8Dii: rotenone and TTFA increased sub-G1 peaks. Therefore, rotenone and TTFA preferentially induced apoptosis in normal non-transformed astrocytes, unlike in the transformed cells.

Overexpression of SOD2 in HeLa cells decreases autophagy and autophagic cell death induced by rotenone and TTFA. Wild-type (wt) and SOD2-overexpressing (SOD2) HeLa cells were treated with rotenone (R, 50.0 μM) or TTFA (T, 0.5 mM) as indicated. (A) ROS generation was determined following 48 hours of rotenone or TTFA treatment. DMSO is a solvent control. (B) AVO formation (i) was determined after 48 hours of treatment with rotenone or TTFA and representative pictures of HeLa (wt and SOD2) cells with GFP-LC3-labeled vacuoles (green dots, ii) were obtained by a fluorescent microscope. In HeLa (wt) cells: a, control b, rotenone c, TTFA. In HeLa (SOD2) cells: d, control e, rotenone f, TTFA. The nucleolus was stained with DAPI (blue). (C) Beclin 1 expression (i) and conversion of LC3-I to LC3-II (ii) in the presence or absence of NH4Cl (30 mM) was determined by western blot. Actin was used as a loading control. (D) Cell death was determined after cells were treated with rotenone or TTFA in the presence or absence of 3-MA (2.0 mM) and/or zVAD (0.1 mM). * Represents significant difference between rotenone or TTFA treatment alone and combined treatment with 3-MA and/or zVAD (P<0.05). @ Represents significant differences between wt and SOD2 cells treated with rotenone or TTFA (P<0.05). # Represents a lack of significant difference between rotenone or TTFA treatment alone and the combined treatment with 3-MA in SOD2 cells (P>0.05). (E) Apoptosis (formation of sub-G1 peak and TUNEL assay) was determined after treatment with rotenone, TTFA or etoposide (Et, apoptotic stimuli). # Represents significant differences between etoposide treatment and control wt cells. * Represents a lack of significant differences between wt and SOD2 cells treated with rotenone or TTFA alone (P>0.05). Error bars represent s.e. from three independent experiments. P values less than 0.05 represent significant difference between conditions, as indicated.

Overexpression of SOD2 in HeLa cells decreases autophagy and autophagic cell death induced by rotenone and TTFA. Wild-type (wt) and SOD2-overexpressing (SOD2) HeLa cells were treated with rotenone (R, 50.0 μM) or TTFA (T, 0.5 mM) as indicated. (A) ROS generation was determined following 48 hours of rotenone or TTFA treatment. DMSO is a solvent control. (B) AVO formation (i) was determined after 48 hours of treatment with rotenone or TTFA and representative pictures of HeLa (wt and SOD2) cells with GFP-LC3-labeled vacuoles (green dots, ii) were obtained by a fluorescent microscope. In HeLa (wt) cells: a, control b, rotenone c, TTFA. In HeLa (SOD2) cells: d, control e, rotenone f, TTFA. The nucleolus was stained with DAPI (blue). (C) Beclin 1 expression (i) and conversion of LC3-I to LC3-II (ii) in the presence or absence of NH4Cl (30 mM) was determined by western blot. Actin was used as a loading control. (D) Cell death was determined after cells were treated with rotenone or TTFA in the presence or absence of 3-MA (2.0 mM) and/or zVAD (0.1 mM). * Represents significant difference between rotenone or TTFA treatment alone and combined treatment with 3-MA and/or zVAD (P<0.05). @ Represents significant differences between wt and SOD2 cells treated with rotenone or TTFA (P<0.05). # Represents a lack of significant difference between rotenone or TTFA treatment alone and the combined treatment with 3-MA in SOD2 cells (P>0.05). (E) Apoptosis (formation of sub-G1 peak and TUNEL assay) was determined after treatment with rotenone, TTFA or etoposide (Et, apoptotic stimuli). # Represents significant differences between etoposide treatment and control wt cells. * Represents a lack of significant differences between wt and SOD2 cells treated with rotenone or TTFA alone (P>0.05). Error bars represent s.e. from three independent experiments. P values less than 0.05 represent significant difference between conditions, as indicated.


Production of ATP using NADH and FADH

So far we have in total, from one glucose molecule.

Now all the hydrogen from the reduced hydrogen carriers enters a chain of reactions, which ultimately yields energy in the form of ATP.

Each hydrogen atom is split into its constituent H + (hydrogen ion) and electron. The electron is the part that actually gets passed down the chain from carrier to carrier. The H+, however, remains in the mitochondrial matrix.

The electron carriers are at successively lower energy levels hence, as the electron moves on from one carrier to the next some energy is released.

This energy is used to pump H + from the matrix into the space between the inner and outer mitochondrial membrane. The H + concentration therefore increases, forming a concentration gradient.

This means that the H + ions have electrical potential energy. H + then flows back down the gradient into the matrix through protein channels.

Associated with each channel is an enzyme, ATP synthase. As the H + ions flow through, their energy is used to make ATP.

This theory about how the ATP is actually made is called the chemiosmotic theory. Oxygen acts as the final electron acceptor in the chain, so the oxygen, electrons and hydrogen ions together form water.

Chemiosmotic theory

For every reduced NAD feeding hydrogen into the chain, enough energy is released to make 3 ATP molecules.
For every reduced FAD feeding hydrogen into the chain, enough energy is released to make 2 ATP molecules.

ATPs made directly = 4
ATPs made from reduced NAD = 10 x 3
ATPs made from reduced FAD = 2 x 2

TOTAL ATPs = 38

Qeyd: 38 ATPs will be made under only the most favourable conditions. Usually, slightly less than this will be made per glucose molecule.


An electron transport chain consists of a properly arranged & oriented set of electron carriers transporting electrons in a specific sequence from a reduced nicotinamide coenzyme (NADH) or a reduced flavin prosthetic group (FADH2) to molecular O2.

Transport chain called the mitochondrial respiratory chain, which forms the final path for electron flow from tissue substrates to molecular O2.

At each step, electrons flow from the reluctant of a redox couple, having a lower redox potential to the oxidant of another redox couple possessing a higher redox potential.

The free energy, liberated during the transmitting of electrons along the chain, is used in forming high-energy bonds of ATP.


Modeling the electron transport chain of purple non-sulfur bacteria

*Corresponding author. Max Planck Institute for Dynamics of Complex Technical Systems, Sandtorstrasse 1, Magdeburg D-39106, Germany. Tel.: +49 391 6110480 Fax: +49 391 6110509 E-mail: [email protected]

Purple non-sulfur bacteria (Rhodospirillaceae) have been extensively employed for studying principles of photosynthetic and respiratory electron transport phosphorylation and for investigating the regulation of gene expression in response to redox signals. Here, we use mathematical modeling to evaluate the steady-state behavior of the electron transport chain (ETC) in these bacteria under different environmental conditions. Elementary-modes analysis of a stoichiometric ETC model reveals nine operational modes. Most of them represent well-known functional states, however, two modes constitute reverse electron flow under respiratory conditions, which has been barely considered so far. We further present and analyze a kinetic model of the ETC in which rate laws of electron transfer steps are based on redox potential differences. Our model reproduces well-known phenomena of respiratory and photosynthetic operation of the ETC and also provides non-intuitive predictions. As one key result, model simulations demonstrate a stronger reduction of ubiquinone when switching from high-light to low-light conditions. This result is parameter insensitive and supports the hypothesis that the redox state of ubiquinone is a suitable signal for controlling photosynthetic gene expression.

Synopsis

The attractiveness of anoxygenic non-sulfur photosynthetic bacteria (Rhodospirillaceae) for studying gene regulation in response to cellular redox events is based on their energetic flexibility, which enables growth under a variety of environmental conditions. In the presence of oxygen, electrons are transferred through a respiratory chain comprising NADH (or FADH), ubiquinone (Q), cytochrome bc1, cytochrome c2 and finally to oxygen by cytochrome oxidases or ubiquinol oxidases, thereby enabling phosphorylation of ADP via ATPase complexes. Note the functional homology to the mitochondrial respiratory chain. At low oxygen tensions, the biosynthesis of intracytoplasmic membranes (ICMs) is induced. Specific polypeptide-bacteriochlorophyll (BChl) components of these membranes––the photosynthetic light-harvesting complexes (LHCs) and reaction centers (RCs)––capture light energy, which drive a cyclic photophosphorylation system via RC-Q-cyt bc1-cyt c2 back to RC. It has been stated as early as 1957 that the redox state of components of the respiratory and photosynthetic electron transport chain (ETC) may constitute metabolic signals that govern the expression of LHC- and RC-encoding genes and therefore determine the adaptation of the cells to a given environmental condition ( Cohen-Bazire və b, 1957 ). The repression of ICM synthesis under high oxygen tension and also anaerobically by high light intensities has been studied in detail during the last years and some regulatory systems involved were identified, including the two-component system RegA/RegB (PrrA/PrrB), the PpsR (CrtJ) repressor and the Fnr-like transcriptional regulator FnrL ( Oh and Kaplan, 2000 Bauer və b, 2003). However, particularly for light regulation of ICM synthesis, the molecular signals and mechanisms involved in the initiation of signal transduction pathways governing photosynthetic gene expression are still poorly characterized or even unidentified. The high-light repression effect has been attributed to be dependent on the redox state of the membranous Q pool ( Oh and Kaplan, 2000 ). However, to our knowledge, no direct experimental measurements of Q redox states under different light conditions are available so far. Recently, it was demonstrated that oxidized Q directly inhibits the RegB/RegA regulatory system of Rhodobacter capsulatus in vitro ( Swem və b, 2006 ), thereby potentially mediating the repression of ICM synthesis also under high oxygen conditions in the dark.

The lack of quantitative information about how the redox states of individual ETC components change under different growth conditions limits the verification of the proposed hypotheses of redox regulation and a pure qualitative discussion of the behavior of the ETC is infeasible as too many variables are involved. Here, we present (i) a stoichiometric model of the ETC unambiguously describing the structural and functional capabilities of the ETC of purple non-sulfur bacteria and (ii) a kinetic model based on thermodynamic constraints of the underlying processes that enables us to simulate the steady-state behavior of the ETC, in particular the redox states of ETC components, under different environmental conditions.

Elementary-mode analysis (see Schuster və b, 2000 ) of the ETC reveals nine fundamental modes expressing all the potential functional behaviors of the ETC in the steady state. The stoichiometric model reproduces well-known cycles and pathways for the ETC when operating under photosynthetic (cyclic photosynthesis and reverse electron transport), respiratory (electron transfer from NADH or succinate to ubiquinol oxidase or cytochrome (cbb3) oxidase) or fermentative (fumarate reduction) conditions. Apart from these well-known functions, the stoichiometric model revealed two operational modes representing reverse electron flow under respiratory conditions. So far, the functional role of reverse electron flow has been mainly discussed for photosynthetic growth only. In fact, due to thermodynamic constraints, reverse electron flow under aerobic conditions plays only a minor role and as shown by simulations of the kinetic model, the concentration ratios of the metabolites involved have to be at rather extreme levels, to make this state thermodynamically favorable. However, this operation might become important for certain (possibly temporary) metabolic states, for example, if a great imbalance in the current redox potentials of NADH and succinate occurs.

The stoichiometric model thus identified––in an unbiased way––the meaningful functions of the ETC however, it can only show the potential behaviors of the ETC (which are under real conditions normally superimposed). For studying the actual driving forces, electron flows and redox states occurring in the ETC under different environmental conditions, we therefore constructed a kinetic model that also includes known regulatory pathways governing the expression of ETC components. Although in photosynthetic bacteria two types of energy-converting membranes (ICM and cytoplasmic membrane) are present, which are structurally and functionally different, we set up the model with only one membrane compartment. We justify this approach because we consider in the simulations only scenarios where the model functions either as a pure photosynthetic membrane (ICM model) (i.e. no participation of oxidases) or as a pure respiratory (cytoplasmic) membrane (no participation of photosynthetic RCs). The reaction steps taking place inside the enzyme complexes have been described with rather simple, yet thermodynamically correct kinetic laws based on the differences in the redox potentials of the participating redox couples. As boundary conditions for metabolites directly interacting with the ETC, we fix the concentration ratios of NADH/NAD, succinate/fumarate and ATP/ADP (which can, however, be varied for the different scenarios considered).

To our knowledge, it is the most comprehensive model of the ETC in purple bacteria with respect to the components and processes considered. Even though we cannot claim that the model is accurate when absolute quantitative units are considered (uncertainties in parameters and only few available measurements do not permit this), it provides valuable semiquantitative and qualitative insights into the behavior of the ETC, in particular on the redox states of key components which are often difficult to measure.

Important results of the steady-state analysis of the model are shown in Figure 5. The plots show the dependency of the redox states of the Q and cytochrome c2 pools (Q_chargec2_charge), of the proton-motive force (pmf) and BChl concentration (Bchl as a measure of ICM) on the cytosolic redox state (represented by NADH/NAD) for four different growth conditions: aerobic and semi-aerobic in the dark and anaerobic under high-light and low-light conditions. The model is able to reproduce the observations about the ICM levels that are repressed during aerobic growth and are relieved from oxygen repression under semi-aerobic conditions. Importantly, the level of ICM corresponds to the reduction degree of Q. That oxygen-limiting conditions result in a more reduced Q pool compared to fully aerobic growth can be deduced in a straightforward manner from the operation of a linear respiratory chain. In contrast, the adaptation of the Q redox state when the cyclic photophosphorylation system faces different light intensities is not deducible simply by pure intuition. To our knowledge, the question whether a switch from high- to low-light conditions results in a more reduced (as the physiological regulatory model demands to explain high-light repression of ICM synthesis) or a more oxidized Q pool is currently not resolved by literature data. Strikingly, the simulation of this situation with the mathematical model yields an unambiguous result: the Q pool is reduced more under low-light conditions, which is in accordance to its proposed role as a metabolic signal for ICM expression ( Swem və b, 2006). It is important to point out that this finding is virtually independent of the parameter values employed, instead it is an inherent feature of the system. We could not find a parameter set where the opposite result, that is Q gets reduced more under high-light conditions, is produced.

Another conclusion that can be drawn from Figure 5 is, that (only) under photosynthetic conditions there is an optimal load of the ETC with electrons (and therefore an optimal cytosolic redox state here reflected by the ratio NADH/NAD) resulting in a maximum of Δsəh. The model clearly demonstrates that the optimal load is dependent on the light intensity. Such a biphasic behavior cannot be seen for respiratory growth: Δsəh increases monotonically with the cytosolic redox state.

These results illustrate the value and applicability of the model presented in deriving predictions on the behavior of the ETC in anoxygenic photosynthetic bacteria, which await experimental validation now.


Bahr, J.T. and W.D. Bonner, Jr.: Cyanide-insensitive respiration. I. The steady state of skunk cabbage spadix and bean hypocotyl mitochondria. J. biol. Kimya. 248, 3441–3445 (1973a)

——: Cyanide-insensitive respiration. II. Control of the alternate pathway. J. biol. Kimya. 248, 3446–3550 (1973b)

Camerino, P.W. and T.E. King: Studies on cytochrome oxidase in soluble and particulate forms. J. biol. Kimya. 241, 970–979 (1966)

Chance, B.: Enzyme mechanisms in living cells. In: A symposium of enzyme action, pp 399–453. Ed. by W.D. McElroy and B. Glass. Baltimore: Johns Hopkins Press 1954

—: Reaction of oxygen with the respiratory chain in cells and tissues. J. gen. Fiziol. 49, 163–188 (1965)

—, W.D. Bonner, Jr. and B.T. Storey: Electron transport in respiration. A. Rev. Pl. Fiziol. 19, 295–320 (1968)

—, L. Ernster, P.B. Garland, C.P. Lee, P.A. Light, T. Ohnishi, C.I. Ragan and D. Wong: Flavoproteins of the mitochondrial respiratory chain. Proc. natn. akad. Sci. ABŞ. 57, 1498–1505 (1967)

— and G.R. Williams: Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. VI. The effects of adenosine diphosphate on azide-treated mitochondria. J. biol. Kimya. 221, 447–489 (1956a)

——: The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. 27, 65–134 (1956b)

Curl, H.C., Jr. and J. Sandberg: The measurement of dehydrogenase activity in marine organisms. J. mar. Res. 19, 123–138 (1961)

Ernster, L., M. Ljunggren and L. Danielson: Purification and some properties of highly dicumarol-sensitive liver diaphorase. Biokimya. biofiz. Res. Kommun. 2, 88–92 (1960)

Gahan, P.B. and M. Kalina: The use of tetrazolium salts in the histochemical demonstration of succinic dehydrogenase activity in plant tissue. Histochemie 14, 81–88 (1968)

Green, D.E.: The mitochondrion. alim. am. 210, 63–74 (1964)

Hatefi, Y.: Oxidation of reduced triphosphopyridine nucleotide by submitochondrial particles from beef heart. Biokimya. biofiz. Res. Kommun. 50, 978–984 (1973)

Kenner, R.A. and S.I. Ahmed: Correlation between oxygen utilization and electron transport activity in marine phytoplankton. Mar. Biol. 33, 129–133 (1975)

Lambowitz, A.M., E.W. Smith and C.W. Slayman: Electron transport in Neyrospora mitochondria Studies on wild type and poky. J. biol. Kimya. 247, 4850–4858 (1972a)

———: Oxidative phosphorylation in Neyrospora mitoxondriya. Studies on wild type, poky, and chloramphenicol-induced wild type. J. biol. Kimya. 247, 4859–4865 (1972b)

Lester, R.L. and A.L. Smith: Studies on the electron transport system. XXVIII. The mode of reduction of tetrazolium salts by beef heart mitochondria role of coenzyme Q and other lipids. Biokim. biofiz. Akta 47, 475–496 (1961)

Linnane, A.W., E. Vitols and P.C. Nowland: Studies on the origin of yeast mitochondria. J. Cell Biol. 13, 345–350 (1962)

Nachlas, M.M., S.I. Margulies and A.M. Seligman: A colorimetric method for the estimation of succinic dehydrogenase activity. J. biol. Kimya. 235, 449–503 (1960a)

———: Site of electron transfer to tetrazolium salts in the succinoxidase system. J. biol. Kimya. 235, 2739–2743 (1960b)

Ohnishi, T., K. Kawaguchi and B. Hagihara: Preparation and some properties of yeast mitochondria. J. biol. Kimya. 241, 1797–1806 (1966a)

—, G. Sottocas and L. Ernster: Current approaches to the mechanism of energy-coupling in the respiratory chain. Studies with yeast mitochondria. Buğa. Soc. Çim. biol. 48, 1189–1203 (1966b)

Packard, T.T.: The measurement of respiratory electron transport activity in marine plankton. J. mar. Res. 29, 235–244 (1971)

— and M.L. Healy: Electrochemical standardization of the dehydrogenase assay used in the estimation of respiratory rates. J. mar. Res. 26, 66–74 (1968)

—— and F.A. Richards: Vertical distribution of the activity of the respiratory electron transport system in marine plankton. Limnol. Okeanoqr. 16, 60–70 (1971)

Pavlou, S.P.: Phytoplankton growth dynamics. Technical Series 1. Chemostat methodology and chemical analyses. Xüsusi. Rep. Dep. Okeanoqr. Univ. Wash. 52, 1–130 (1972)

Siekevitz, P.: Origin and functional nature of microsomes. Fedn Proc. Fedn Am. Socs exp. Biol. 24, 1153–1155 (1965)

Strittmatter, P.: Microsomal electron transport. In: Biological oxidations, pp 171–192. Ed. by T.P. Singer. New York: Wiley Interscience 1968

Udenfriend, S., S. Stein, P. Bohlen, W. Dairman, W. Leimbruber and M. Weigele: Applications of fluorescamine, a new reagent for amino acids, peptides, proteins and other primary amines in the picomole range. Science, N.Y. 178, 871–872 (1972)

Vitols, E. and A.W. Linnane: Studies on the oxidative metabolism of Saccharomyces cerevisiae. II. Morphology and oxidative phosphorylation capacity of mitochondria and derived particles from Baker's yeast. J. biophys. biochem. Sitol. 9, 701–710 (1961)

Weigele, M., S. Debernardo, J. Tengi and W. Leimgruber: A novel reagent for the fluorometric assay of primary amines. J. Am. chem. Soc. 94, 5927–5928 (1972)


Videoya baxın: Steps of glycolysis. Cellular respiration. Biology. Khan Academy (Iyun 2022).