Məlumat

İmmunoqlobulin G-nin dimerləşməsi

İmmunoqlobulin G-nin dimerləşməsi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

IgG dimerlərinin əmələ gəlməsi üçün xüsusi təyinediciləri bilmək istərdim. Anladığım kimi, antikorun kökü menteşə bölgəsi adlanan iki disulfid körpüsü ilə kovalent şəkildə bağlanmış iki ağır zəncirdən ibarət homodimerdir. Daimi bölgə arasında hər hansı bir əlaqə varmı? Oxumağım xeyr təklif edərdi, amma belə bir xüsusi istinad tapmadım.


İnsan IgG1 və 4 üçün yeganə ağır zəncirlərarası disulfid bağları menteşə bölgəsindəki ikisidir. IgG2-nin menteşəsində 4 disulfid, IgG3-də isə 11 var:

Fc bölgəsində ağır zəncirdaxili disulfidlər var və təbii ki, strukturu saxlamaq üçün iki ağır zəncir (həmçinin yüngül zəncirlər) arasında kovalent olmayan bağlar var, lakin menteşə bölgəsindən başqa yeganə digər zəncirlərarası bağlar disulfidlər ağır və yüngül arasındadır.

İnsan İgG-lərində klassik (1960-cı illərdə müəyyən edilmiş) və qeyri-klassik (daha yaxınlarda kəşf edilmiş) disulfid bağının formalaşması və quruluşunun maraqlı icmalı.


Bakterial endoqlikozidaza S və immunoqlobulin G fraqmentləri hər birinin deqlikozilləşməyə töhfə verən alt domenlərini aşkar edir *

Endoglycosidase S (EndoS) bakteriya tərəfindən ifraz olunan qlikozid-hidrolazdır. Streptococcus pyogenes. EndoS üstünlüklü olaraq hidroliz edir N- infeksiya zamanı IgG-nin Fc bölgəsindən əlaqəli qlikanlar. Bu hidroliz Fc funksionallığına mane olur və immun sistemindən yayınma strategiyasına kömək edir S. pyogenes. Burada insan serum IgG-nin EndoS tərəfindən deaktivasiya mexanizmini araşdırırıq. Biz IgG1 fraqmentlərini ifadə etdik və EndoS-nin Fc domeninin təcrid olunmuş CH2 domeni də daxil olmaqla onların hamısına qarşı katalitik olaraq aktiv olduğunu nümayiş etdirdik. Eynilə, biz EndoS daxilində hansı domenlərin fəaliyyətə töhfə verə biləcəyini araşdırmaq istədik. EndoS-in domen təşkilatının bioinformatika təhlili xitinaz domeninin və leysinlə zəngin təkrarın əvvəlki proqnozlarını təsdiqlədi, eyni zamanda C-terminal bölgəsinin izlədiyi ehtimal olunan karbohidrat bağlama modulunu (CBM) aşkar etdi. EndoS-in ifadə edilmiş fraqmentlərindən istifadə edərək, təcrid olunmuş CBM-nin dairəvi dikroizmi və CBM-C-terminal bölgəsinin birləşməsi müvafiq olaraq β vərəq və α spiral quruluşun üstünlük təşkil etdiyi qatlanmış domenləri aşkar etdi. CBM-nin monosaxaridlərlə nüvə maqnit rezonans analizi karbohidrat bağlama funksiyasını göstərirdi. EndoS-in kəsilməsinin funksional təhlili göstərdi ki, EndoS-in C-terminalı fəaliyyət üçün lazımsız olsa da, onun silinməsi IgG qlikanlarının hidrolizinə mane olur.


İmmunoqlobulinlərin sinifləri

İmmunoqlobulinlərin beş əsas sinfi IgG, IgM, IgA, IgD və IgE-dir. Bunlar molekulda olan ağır zəncir növü ilə fərqlənir. IgG molekulları qamma zəncirləri kimi tanınan ağır zəncirlərə malikdir IgM-lərin mu-zəncirləri var IgA-ların alfa zəncirləri var IgE-lərin epsilon zəncirləri və IgD-lərin delta zəncirləri var.

Ağır zəncir polipeptidlərindəki fərqlər bu immunoqlobulinlərin müxtəlif növ immun reaksiyalarında və immun cavabın müəyyən mərhələlərində fəaliyyət göstərməsinə imkan verir. Bu fərqlərə cavabdeh olan polipeptid zülal ardıcıllığı ilk növbədə Fc fraqmentində olur. Beş müxtəlif növ ağır zəncir olsa da, yüngül zəncirlərin yalnız iki əsas növü var: kappa (κ) və lambda (λ).

Antikor sinifləri tam zülal meydana gətirmək üçün birləşən Y-yə bənzər vahidlərin (monomerlərin) müxtəlif sayları nəticəsində valentliyə görə fərqlənir. Məsələn, insanlarda fəaliyyət göstərən IgM antikorları cəmi 10 yüngül zəncir, 10 ağır zəncir və 10 antigen bağlayan beş Y-formalı vahidə (pentamer) malikdir.

IgG sinfi

  • Molekulyar çəki: 150.000
  • H-zəncir növü (MW): qamma (53,000)
  • Serum konsentrasiyası: 10-16 mq/mL
  • Ümumi immunoqlobulinin faizi: 75%
  • Qlikozilləşmə (çəki ilə): 3%
  • Paylanması: damardaxili və ekstravaskulyar
  • Funksiya: ikinci dərəcəli cavab

IgM sinfi

  • Molekulyar çəki: 900.000
  • H-zəncir növü (MW): mu (65,000)
  • Serum konsentrasiyası: 0,5-2 mq/ml
  • Ümumi immunoqlobulinin faizi: 10%
  • Qlikozilləşmə (çəki ilə): 12%
  • Paylanması: əsasən damardaxili
  • Funksiya: ilkin cavab

IgA sinfi

  • Molekulyar çəki: 320.000 (sekretor)
  • H-zəncir növü (MW): alfa (55.000)
  • Serum konsentrasiyası: 1-4 mq/ml
  • Ümumi immunoqlobulinin faizi: 15%
  • Qlikozilləşmə (çəki ilə): 10%
  • Paylanması: damardaxili və sekresiya
  • Funksiya: selikli qişaları qoruyur

IgD və IgE sinifləri

  • Molekulyar çəki: 180.000
  • H-zəncir növü (MW): delta (70,000)
  • Serum konsentrasiyası: 0-0,4 mq/ml
  • Ümumi immunoqlobulinin faizi: 0,2%
  • Qlikozilləşmə (çəki ilə): 13%
  • Paylanması: limfosit səthi
  • Funksiya: naməlum
  • Molekulyar çəki: 200.000
  • H-zəncir növü (MW): epsilon (73,000)
  • Serum konsentrasiyası: 10-400 ng/ml
  • Ümumi immunoqlobulinin faizi: 0,002%
  • Qlikozilləşmə (çəki ilə): 12%
  • Yayılma: tüpürcək və burun sekresiyasında bazofillər və mast hüceyrələri
  • Funksiya: parazitlərdən qoruyur

Daha ətraflı

Məhsulları seçin


Mücərrəd

Terminal karbohidrat qalıqları N-immunoqlobulin G (IgG) fraqmentinin kristallaşan (Fc) üzərindəki qlikan IgG-nin pro- və ya antiinflamatuar reseptorları aktivləşdirdiyini müəyyən edir. Təkcə IgG Fc α2-6 ilə əlaqəli əlavə edildikdə güclü antiinflamatuar olur. N-asetilneuramin turşusu qalıqları N-qlikan, bu varlığın otoimmün xəstəliklərin yeni müalicələrində istifadəsinə marağı stimullaşdırır [Kaneko et al. (2006) Elm313, 670–3]. Bununla belə, tam Fc sialilasiyası filial spesifikliyi və qlikan-protein qarşılıqlı təsirləri ilə qəbul edilən qorunmanın birləşməsinə görə çətin hesab edilmişdir. Burada müvəqqəti transformasiya edilmiş insan hüceyrə mədəniyyətində ifadə edilən kifayət qədər miqdarda yüksək aktiv α2-6 sialiltransferaza (ST6Gal1) preparatından istifadə etməklə yüksək səviyyələrdə disialilləşdirilmiş Fc hazırlanması barədə məlumat veririk. Təəccüblüdür ki, ST6Gal1 kompleks tipli binantenar qlikanın iki ucunu sialilləşdirdi. N-qlikan, Fc polipeptidinin ST6Gal1 spesifikliyinə böyük təsir göstərmədiyini göstərir. Bundan əlavə, hər iki budaq terminalının sialilasiyası, görünür, hərəkətli davranışı kəskin şəkildə dəyişdirmir. N-qlikan məhlul NMR spektroskopiyası ilə mühakimə olunur. Bunlar birlikdə, məlumatlar göstərir N-qlikan iki fərqli vəziyyətə malikdir: biri polipeptid səthi ilə α1-6Man-budaq qarşılıqlı təsiri ilə enzimatik modifikasiyadan ayrılmış hər iki qlikan ucları ilə, digəri isə hər iki qlikan ucları toplu həllediciyə məruz qalmış və qlikan-polipeptid qarşılıqlı təsirindən azaddır. Nəticələr disialilləşdirilmiş Fc-nin antiinflamatuar effektor kimi çıxış edə biləcəyi yeni rejimləri təklif edir.


Mücərrəd

Antikor terapevtikləri indi geniş istifadə olunur və revmatik xəstəliklər və xərçəng kimi ciddi xəstəliklərin müalicəsi üçün yeni bir yanaşma təmin edir. Terapevtik vasitə kimi istifadə edilən monoklonal anticisimlər yüksək keyfiyyətli olmalı, onların təhlükəsizliyinə zəmanət verilməlidir. Birləşdirilmiş antikor istehsal prosesi zamanı yarana bilən deqradasiya məhsuludur. Antikor terapevtiklərinin yüksək keyfiyyətini və təhlükəsizliyini qorumaq üçün aqreqasiya mexanizmini başa düşmək və aqreqat əmələ gəlməsinə ciddi nəzarət etmək üçün texnologiyalar hazırlamaq lazımdır. Burada biz təcrid olunmuş antikor sabit domenlərinin konformasiya və kolloid xüsusiyyətlərini geniş şəkildə araşdırdıq və antikor birləşməsinin molekulyar mexanizmi haqqında məlumat verdik. İnsan immunoqlobulini G-nin təcrid olunmuş domenləri (CH2, CH3, CL və CH1-CL dimer) sintez edilmiş, 49 dəst məhlul şəraitində (pH 2-8 və 0-300 mM NaCl) istifadə edərək həll edilmiş və dairəvi dikroizm, daxili triptofan istifadə edərək xarakterizə edilmişdir. flüoresans və dinamik işığın səpilməsi. Duzdan qaynaqlanan konformasiya dəyişiklikləri və oliqomer əmələ gəlməsi NaCl-atlama ölçmələri (pH 3-də 0-dan 300 mM-ə qədər) kinetik olaraq təhlil edilmişdir. Faza diaqramları domenlərin müxtəlif konformasiya və kolloid sabitliyə malik olduğunu ortaya qoydu. pH 3-də CH3 və CH2-nin açılmamış fraksiyaları CL və CH1-CL dimerindən daha böyük idi. CH3 və CH2-nin ikinci və üçüncü strukturları və hissəcik ölçüləri göstərdi ki, qeyri-doğma dövlətlərdə bu domenlər duz konsentrasiyasına həssasdır. Kinetik təhlillər göstərir ki, CH3 və CH2 ilə oliqomer formalaşması qismən yenidən qatlanmış konformasiyalar vasitəsilə baş verir. Qeyri-doğma dövlətlərdə CH3-ün kolloid sabitliyi sınaqdan keçirilmiş şərtlər altında dörd domendən ən aşağısıdır. Biz təklif edirik ki, IgG sabit domenlərinin aqreqasiyaya təsiri CH3 > CH2 > CH1-CL dimer > CL sırasına uyğundur, bundan əlavə, CH3-ün turşu şəraitdə bütöv antikor aqreqasiyasını idarə etməkdə ən mühüm rol oynadığını təklif edirik.


Antikor funksiyaları

Humoral immun cavabın bir hissəsi olan antikorlar patogenin aşkarlanması və zərərsizləşdirilməsində iştirak edir.

Öyrənmə Məqsədləri

Antikorlarda yaxınlıq, avidlik və çarpaz reaktivliyi fərqləndirin

Əsas Çıxarışlar

Əsas Nöqtələr

  • Antikorlar plazma hüceyrələri tərəfindən istehsal olunur, lakin ifraz edildikdən sonra hüceyrədənkənar patogen və toksinlərə qarşı müstəqil hərəkət edə bilər.
  • Antikorlar patogenlər üzərində spesifik antigenlərə bağlanır, bu birləşmə əsas hüceyrədənkənar yerləri, məsələn, ev sahibi hüceyrəyə daxil olmaqda iştirak edən reseptorları bloklayaraq patogenin yoluxuculuğunu maneə törədə bilər.
  • Antikorlar həmçinin antikorla bağlı hüceyrələrə cəlb olunan makrofaqlar və ya neytrofillər kimi faqositləri aktivləşdirərək patogeni məhv etmək üçün fitri immun reaksiyaya səbəb ola bilər.
  • Yaxınlıq bir antikorun müəyyən bir antigeni necə güclü şəkildə bağladığını, avidlik isə multimerik antikorun çoxsaylı antigenlərə bağlanmasını təsvir edir.
  • Multimerik antikor aşağı yaxınlığa malik olan fərdi qollara malik ola bilər, lakin bağlanma yerləri arasında sinergik təsirlərə görə yüksək ümumi avidliyə malikdir.
  • Çarpaz reaktivlik, bir antikor, qaldırıldığı antigendən fərqli, lakin oxşar antigenə bağlandıqda baş verir, bu, patogen müqavimətini artıra və ya otoimmün reaksiya ilə nəticələnə bilər.

Əsas Şərtlər

  • həvəs: zülallar arasında fərdi qarşılıqlı təsirlərin gücünün sinerjisinin ölçüsü
  • qohumluq: antikor və antigen arasındakı cazibə

Antikor funksiyaları

Diferensiallaşmış plazma hüceyrələri humoral toxunulmazlıq reaksiyasında həlledici oyunçulardır. Onların ifraz etdiyi antikorlar hüceyrədənkənar patogenlərə və toksinlərə qarşı xüsusilə əhəmiyyətlidir. İfraz edildikdən sonra antikorlar sərbəst dövr edir və plazma hüceyrələrindən asılı olmayaraq hərəkət edirlər. Bəzən antikorlar bir şəxsdən digərinə ötürülə bilər. Məsələn, bu yaxınlarda müəyyən bir xəstəlik agentinə qarşı uğurlu immun cavabı yaradan bir şəxs, donorun qan zərdabında olan antikorlar vasitəsilə müvəqqəti toxunulmazlığı təmin edərək, qeyri-immun resipiyentə qan verə bilər. Pasif toxunulmazlıq adlanan bu fenomen həm də ana südü ilə qidalanma zamanı təbii olaraq baş verir ki, bu da ana südü ilə qidalanan körpələrin həyatının ilk bir neçə ayı ərzində infeksiyalara qarşı yüksək müqavimət göstərməsinə səbəb olur.

Antikorlar hüceyrədənkənar patogenləri örtür və onların yoluxuculuğunu artıran patogenin əsas yerlərini, məsələn, patogenləri ana hüceyrələrə yerləşdirən reseptorları bloklamaqla onları zərərsizləşdirir. Antikorların zərərsizləşdirilməsi, müəyyən edilmiş infeksiyanın inkişafının qarşısını almaq üçün artıq yoluxmuş hüceyrələri öldürmək üçün sitotoksik T-hüceyrə vasitəçiliyi ilə yanaşmadan fərqli olaraq, patogenlərin host hüceyrələrə daxil olmasının və yoluxmasının qarşısını ala bilər. Zərərsizləşdirilmiş antikorla örtülmüş patogenlər daha sonra dalaq tərəfindən süzülərək sidik və ya nəcislə xaric oluna bilər.

Antikorların təsir mexanizmləri: Antikorlar (a) antigenin öz hədəfinə bağlanmasının qarşısını almaqla, (b) patogeni makrofaqlar və ya neytrofillər tərəfindən məhv edilmək üçün işarələməklə və ya (c) komplement kaskadını aktivləşdirməklə infeksiyanın qarşısını ala bilər.

Antikorlar, həmçinin makrofaqlar və ya neytrofillər kimi faqositik hüceyrələr tərəfindən məhv edilməsi üçün patogenləri qeyd edirlər, çünki onlar antikorlarla kompleksləşmiş makromolekullara yüksək dərəcədə cəlb olunurlar. Antikorlar tərəfindən faqositik güclənmə opsonizasiya adlanır. Başqa bir prosesdə, komplementin fiksasiyası, serumda IgM və IgG antigenlərə bağlanır və ardıcıl tamamlayıcı zülalların bağlana biləcəyi dok yerləri təmin edir. Antikorların və komplementin birləşməsi opsonizasiyanı daha da gücləndirir, patogenlərin sürətli təmizlənməsini təşviq edir.

Yaxınlıq, avidlik və çarpaz reaktivlik

Bütün antikorlar eyni güc, spesifiklik və sabitliklə bağlanmır. Əslində, antikorlar, antigen və antikor molekulları arasındakı molekulyar tamamlayıcılıqdan asılı olaraq müxtəlif yaxınlıqlar (cəlbetmə) nümayiş etdirirlər. Müəyyən bir antigenə daha yüksək yaxınlığı olan bir antikor daha güclü və sabit bir şəkildə bağlanacaqdır. Xüsusi antigenə uyğun gələn patogenə qarşı daha çətin bir müdafiə təqdim edəcəyi gözlənilir.

Antikor yaxınlığı, avidliyi və çarpaz reaktivliyi: (a) Yaxınlıq antigen və antikor arasındakı tək qarşılıqlı təsirlərin gücünə, avidlik isə birləşmiş bütün qarşılıqlı təsirlərin gücünə aiddir. (b) Antikor müxtəlif epitoplarla çarpaz reaksiya verə bilər.

Avidlik termini birləşmiş, multivalent strukturlar (məsələn, IgM və IgA) kimi ifraz olunan antikor sinifləri ilə bağlanmanı təsvir edir. Baxmayaraq ki, avidlik, yaxınlıq kimi, bağlanma gücünü ölçsə də, avidlik sadəcə olaraq multimer quruluşda olan antikorların yaxınlıqlarının cəmi deyil. Avidlik aşkar edilən antigenin eyni bağlanma yerlərinin sayından, həmçinin digər fiziki və kimyəvi amillərdən asılıdır. Tipik olaraq, pentamerik IgM kimi multimerik antikorlar monomerik antikorlara nisbətən daha az yaxınlıq, lakin yüksək avidliyə malik olaraq təsnif edilir. Əslində, multimerik antikorların eyni vaxtda bir çox antigeni bağlaya bilməsi onların hər bir antikor/antigen qarşılıqlı əlaqəsi üçün bir qədər aşağı bağlama gücünü tarazlaşdırır.

Bir antigen üzərində bir epitopla bağlandıqdan sonra ifraz olunan antikorlar müxtəlif antigenlərdə eyni və ya oxşar epitoplar üçün çarpaz reaktivlik nümayiş etdirə bilər. Çarpaz reaktivlik, bir antikor onun sintezini və ifrazını təmin edən antigenlə deyil, fərqli bir antigenlə bağlandıqda baş verir. Epitop belə kiçik bir bölgəyə (təxminən dörd-altı amin turşusunun səthi sahəsi) uyğun gəldiyi üçün müxtəlif makromolekulların qısa bölgələrdə eyni molekulyar eynilikləri və istiqamətləri nümayiş etdirməsi mümkündür.

Fərd yalnız birinə məruz qalmasına və ya peyvənd olunmasına baxmayaraq, bir neçə əlaqəli patogenlərə qarşı immunitet inkişaf etdirərsə, çarpaz reaktivlik faydalı ola bilər. Məsələn, müxtəlif qram-mənfi bakteriyaların oxşar səth strukturlarına qarşı antikor çarpaz reaktivliyi baş verə bilər. Əksinə, öz molekullarına bənzəyən patogen molekulyar komponentlərə qarşı qaldırılan antikorlar, otoimmün zədələnməyə səbəb olaraq, ev sahibi hüceyrələrin məhv edilməsi üçün yanlış işarələyə bilər. Sistemik lupus eritematozus (SLE) inkişaf etdirən xəstələr adətən öz DNT-ləri ilə reaksiya verən antikorlar nümayiş etdirirlər. Bu antikorlar əvvəlcə mikroorqanizmlərin nuklein turşusuna qarşı qaldırılmış, lakin sonradan öz antigenləri ilə çarpaz reaksiyaya girmiş ola bilər. Bu hadisəyə molekulyar mimikriya da deyilir.


İstinadlar

Lynch, I. & amp Dawson, K. A. Protein-nanohissəciklərin qarşılıqlı təsiri. Nano Bu gün 3, 40–47 (2008).

Luker, K. E. və b. Hüceyrələrdə və canlı heyvanlarda atəşböcəyi lusiferaza tamamlama görüntüləri ilə tənzimlənən zülal-zülal qarşılıqlı təsirlərinin kinetikası aşkar edilmişdir. Proc. Natl. akad. Sci. 101, 12288–12293 (2004).

Tiwary, P., Limongelli, V., Salvalaglio, M. & Parrinello, M. Protein-liqandın bağlanmasının kinetikası: Yolların, dərəcələrin və sürəti məhdudlaşdıran addımların proqnozlaşdırılması. Proc. Natl. akad. Sci. 112, E386–E391 (2015).

Boccaletti, S., Latora, V., Moreno, Y., Chavez, M. & Hwang, D. U. Kompleks şəbəkələr: Struktur və dinamika. Fizik. Rep. 424, 175–308 (2006).

Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C. & Skidmore, J. Kiçik molekullar, böyük hədəflər: Dərman kəşfi zülal-zülal qarşılıqlı əlaqə problemi ilə üzləşir. Nat. Rev. Drug Discov. 15, 533–550 (2016).

Əbu-Salah, K. və b. Xəstəliyin aşkarlanması üçün inkişaf etməkdə olan platforma kimi DNT əsaslı nanobiosensorlar. Sensorlar 15, 14539–14568 (2015).

Vo-Dinh, T. və b. SERS Nanosensorları və Nanoreportyorlar: Biotibbi Tətbiqlərdə Qızıl İmkanlar. Wiley Discip. Rev. Nanomedicine Nanobiotexnologiya 7, 17–33 (2015).

Cooper, M. A. Dərman kəşfində optik biosensorlar. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 515–528 (2002).

Nguyen, H. H., Park, J., Kang, S., Kim, M. və Cooper, M. A. Səth plazmon rezonansı: biosensor tətbiqləri üçün çox yönlü bir texnika. Sensorlar (İsveçrə) 15, 10481–10510 (2015).

Yan, Y. & amp Marriott, G. Flüoresan texnologiyalarından istifadə edərək zülalların qarşılıqlı təsirinin təhlili. Curr. Rəy. Kimya. Biol. 7, 635–640 (2003).

Charmet, J., Arosio, P. & Knowles, T. P. J. Protein Biofizikası üçün Mikrofluidics. J. Mol. Biol. 430, 565–580 (2018).

Homola, J. və Piliarik, M. Səthi Plazmon Rezonans (SPR) Sensorları. 45-67-ci illərdə (2006).

Patching, S. G. Membran zülal-ligand qarşılıqlı təsirinin xarakteristikası və onun dərman kəşfi potensialı üçün səthi plazmon rezonans spektroskopiyası. Biokim. Biofiz. Acta - Biomembr. 1838, 43–55 (2014).

Olaru, A., Bala, C., Jaffrezic-Renault, N. & Aboul-Enein, H. Y. Əczaçılıq Analizində Səth Plazmon Rezonansı (SPR) Biosensorları. Tənqid. Rev. Anal. Kimya. 45, 97–105 (2015).

Sonra, W. L., Aguilar, M. I. & amp Garnier, G. Səth plazmon rezonansından istifadə edərək kəmiyyət qan qrupunun yazılması. Biosenslər. Bioelektron. 73, 79–84 (2015).

Kim, S., Wark, A. W. & amp Lee, H. J. Səthi Plazmon Rezonansından istifadə edərək Seyreltilməmiş Plazmada Tau Zülallarının Femtomolar Aşkarlanması. Analiz. Kimya. 88, 7793–7799 (2016).

Šípová, H. & amp Homola, J. Nuklein turşularının səthi plazmon rezonansının tədqiqi: Baxış. Analiz. Çim. Akta 773, 9–23 (2013).

Michaelis, S., Wegener, J. & Robelek, R. Hüceyrə əsaslı analizlərin etiketsiz monitorinqi: Multiparametrik hüceyrə profili üçün SPR ilə empedans analizinin birləşdirilməsi. Biosenslər. Bioelektron. 49, 63–70 (2013).

Raz, S. R., Bremer, M. G. E. G., Haasnoot, W. & amp Norde, W. Görüntü səthi plazmon rezonansa əsaslanan immunosensordan istifadə edərək süddə antibiotik qalıqlarının etiketsiz və multipleks aşkarlanması. Analiz. Kimya. 81, 7743–7749 (2009).

Duan, X. və b. Silikon nanotelli biosensorlardan istifadə edərək zülal qarşılıqlı təsirlərinin yaxınlıqlarının və kinetikasının kəmiyyətcələşdirilməsi. Nat. Nanotexnol. 7, 401–407 (2012).

Wang, W. U., Chen, C., Lin, K.-H., Fang, Y. & Lieber, C. M. Nanotelli nanosensorlardan istifadə etməklə kiçik molekul-zülal qarşılıqlı təsirlərinin etiketsiz aşkarlanması. Proc. Natl. akad. Sci. 102, 3208–3212 (2005).

Chen, K. I., Li, B. R. & amp Chen, Y. T. Biotibbi diaqnostika və hüceyrə qeydinin tədqiqi üçün Silikon nanotelli sahə effektli tranzistor əsaslı biosensorlar. Nano Bu gün 6, 131–154 (2011).

Zheng, G., Patolsky, F., Cui, Y., Wang, W. U. & Lieber, C. M. Nanotel sensor massivləri ilə xərçəng markerlərinin çoxaldılmış elektrik aşkarlanması. Nat. Biotexnol. 23, 1294–1301 (2005).

Im, H., Huang, X. J., Gu, B. & Choi, Y. K. Biosensing üçün dielektrik modullaşdırılmış sahə effektli tranzistor. Nat. Nanotexnol. 2, 430–434 (2007).

Esadze, A. & amp Iwahara, J. Hədəf DNT axtarış prosesində zülal sürüşməsinin və seqmentlərarası köçürmənin dayanıqlı floresan kinetik tədqiqi. J. Mol. Biol. 426, 230–244 (2014).

Berlow, R. B., Dyson, H. J. & amp Wright, P. E. Hipoksiya reaksiyanın pozulmuş protein keçidi ilə həddindən artıq həssas dayandırılması. Təbiət 543, 447–451 (2017).

Guinn, E. J., Jagannathan, B. & amp Marqusee, S. Tək molekullu kimya-mexaniki açılma kiçik bir domenli zülalda çoxsaylı keçid vəziyyəti maneələrini aşkar edir. Nat. Kommun. 6, 1–8 (2015).

Hessel, V., Löwe, H. & Schönfeld, F. Micromixers - Passiv və aktiv qarışdırma prinsiplərinə baxış. Kimya. Eng. Sci. 60, 2479–2501 (2005).

Lin, X. və b. VEGF165 hüceyrə metabolitinin təyini və mikrofluidik texnika və luminescent işə salınan zondun birləşməsi ilə zülal-DNT qarşılıqlı təsirinin dinamik təhlili. Biosenslər. Bioelektron. 79, 41–47 (2016).

Li, Y. və b. DNT-zülal qarşılıqlı təsirinin kinetikasını öyrənmək üçün ikili-hidrodinamik fokuslamaya əsaslanan yeni mikrofluidik qarışdırıcı. Analitik 138, 4475–4482 (2013).

Duncombe, T. A., Tentori, A. M. & amp Herr, A. E. Mikrofluidics: Bioloji sorğunun yenidən qurulması. Nat. Rahib Mol. Hüceyrə Biol. 16, 554–567 (2015).

Srisa-Art, M., Dyson, E. C., DeMello, A. J. & amp Edel, J. B. Damcı mikrofluidiklərindən istifadə edərək real vaxt rejimində streptavidin-biotin bağlama kinetikasının monitorinqi. Analiz. Kimya. 80, 7063–7067 (2008).

Shang, L., Cheng, Y. & amp Zhao, Y. Emerging Droplet Microfluidics. Kimyəvi rəylər 117, 7964–8040 (2017).

Song, H. & Ismagilov, R. F. Nanolitr reagentlərdən istifadə edərək mikrofluidik çipdə millisaniyəlik kinetika. J. Am. Kimya. Soc. 125, 14613–14619 (2003).

Mercadal, P. A., Fraire, J. C., Motrich, R. D. & Coronado, E. A. Ultra aşağı konsentrasiyalarda gliadinin aşkarlanması üçün gümüş nanohissəciklərdən istifadə edərək fermentsiz immunoanaliz. ACS Omega 3, 2340–2350 (2018).

Fraire, J. C., Motrich, R. D. və Coronado, E. A. Ultrahəssas antigenin miqdarının təyini üçün yeni plazmonik nanokonjugasiya edilmiş analitik alətin dizaynı. Nanoölçülü 8, 17169–17180 (2016).

Mercadal, P. A., Fraire, J. C., Motrich, R. D. & Coronado, E. A. Ag nanohissəciklərinin biokonjuqasiyası yolu ilə plazmonik zondlama: Koloidal dispersiyalarda antigenlərin ultra aşağı miqdarının təyini üçün immunoanalizlərin inkişafına doğru. Adv. Mater. Lett. 9(6), 456–461 (2018).

Ianni, J. C. Kimyəvi kinetik kodu Kintecus əsasında GRI-MECH 3.0 modeli üçün Bader-Deuflhard və Cash-Karp Runge-Kutta inteqratorlarının müqayisəsi. In Hesablama mayeləri və bərk cisimlər mexanikası 2003 1368–1372, https://doi.org/10.1016/B978-008044046-0.50335-3 (Elsevier, 2003).

Ianni, J. C. Kintecus. Windows versiyası 4.55. (2014).

Mandl, A., Filbrun, S. L. və Driskell, J. D. Sabit Antigenlə Yığılmış Dimerlər Yaratmaq üçün Asimmetrik Funksional Antikor-Qızıl Nanohissəcik Konjuqatları. Biokonjug. Kimya. 28, 38–42 (2017).

Kang, J.-H. və b. Xərçəng diaqnozu üçün qızıl nanohissəciklərə əsaslanan kolorimetrik analiz. Biosenslər. Bioelektron. 25, 1869–1874 (2010).

Medley, C.D. və b. Xərçəng Hüceyrələrinin Birbaşa Aşkarlanması üçün Qızıl Nanohissəciklərə əsaslanan Kolorimetrik Təhlil. Analiz. Kimya. 80, 1067–1072 (2008).

Rosi, N. L. və Mirkin, C. A. Biodiaqnostikada nanostrukturlar. Kimya. Rev. 105, 1547–1562 (2005).

Zhao, W., Brook, M. A. & Li, Y. Qızıl Nanohissəciklərə əsaslanan Kolorimetrik Biosensasiya Təhlillərinin Dizaynı. Kimya. Bio. Kimya. 9, 2363–2371 (2008).

Kimling, J. və b. Qızıl Nanohissəciklərin Sintezi üçün Turkeviç Metoduna yenidən baxıldı. J. Fizika. Kimya. B 110, 15700–15707 (2006).

Fraire, J. C., Perez, L. A. və Coronado, E. A. Biomolekulyar aşkarlama üçün plazmonik nanostrukturların rasional dizaynı: Nəzəriyyə və təcrübələr arasında qarşılıqlı əlaqə. ACS Nano 6, 3441–3452 (2012).

Palik, E. D. Bərk Cisimlərin Optik Sabitləri Təlimatı (1985).


Materiallar və metodlar

Materiallar

PECAM-1.3, Ig homoloji domeni 1 (Sun et al. 1996b) üçün spesifik bir siçan anti-insan PECAM-1 mAb, zülal etiketləmə dəsti (Molekulyar Zondlar) istifadə edərək Alexa 488 ilə flüoresanla etiketlənmişdir. Siçan anti-insan mAb, FKBP-12, MAR4 (siçan anti-insan α) üçün xüsusi5 integrin) və IIA1 (siçan anti-insan β1 integrin) PharMingen-dən alınıb. P1D6 (siçan anti-insan α5 integrin) və P4C10 (siçan anti-insan β1 integrin) GIBCO BRL-dən alınmışdır. AP1510 və FKBP cDNA-nı kodlayan pCF1E vektoru ARIAD Pharmaceuticals, Inc. (Cambridge, MA) tərəfindən təmin edilmişdir. PMSF Sigma-Aldrich-dən alınıb. Kimyəvi çarpaz birləşdirici maddələr, bis(sulfosuccinikidyl) suberat (BS 3) və dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate) (DTSSP) Pierce Chemical Co-dan alınmışdır. DTSSP tiolla parçalana bilir, BS 3 isə parçalanmır.

PECAM-1/FKBP-1 və PECAM-1/FKBP-2 Fusion zülallarını kodlayan cDNA-ların qurulması

FK506 bağlayan zülalın (FKBP) bir və ya iki nüsxəsi, FKBP-12, standart üst-üstə düşən PCR üsullarından istifadə edərək PECAM-1-in sitoplazmik sahəsinin COOH terminalına birləşdirildi (Şəkil 1). Bir FKBP motivi olan PECAM-1/FKBP-1, PCR ilə istehsal edilmişdir. PECAM-1 seqmenti PECAM-1 primer 1 (5′-CCTGTCAAGTAAGGTGGTGGAGTCT-3′) və PECAM-1 primer 2 (5′-CACCTGCA-CGCCTCTAGGAGAGCCATCC) istifadə edərək amin turşusu qalığı 375-dən PECAM-1-in COOH terminalına qədər gücləndirildi. 3′) və FKBP primeri 3 (5′-GGCTCCCTTGATGGAACTTCTAGAGGCGTGCAGGTG-3′) və FKBP primer 4 (5′-GTCCTGAATGCTCTTCCAGGCGGCCGCTTATGCGTAG3′′) istifadə edərək tam uzunluqlu FKBP motivinə birləşdirildi. İki seqment sonradan 1 və 4-cü primerlərlə qarışdırıldı və ikincili üst-üstə düşən PCR aparıldı. Son gücləndirilmiş məhsul Nhe I və Not I ilə həzm olundu və məməlilərin ifadə vektoru pcDNA3-ə klonlaşdırılmış oxşar şəkildə kəsilmiş vəhşi tip PECAM-1 cDNA-ya daxil edildi. PECAM-1/FKBP-1-ə ikinci FKBP domeninin əlavə edilməsi ilə PECAM-1-in COOH terminalına birləşdirilən iki FKBP domenini ehtiva edən PECAM-1/FKBP-2 qurulmuşdur. Hər iki konstruktun bütövlüyü və həqiqiliyi nukleotidlərin ardıcıllığı ilə təsdiq edilmişdir.

Stabil PECAM-1/FKBP-1- və PECAM-1/FKBP-2-ifadə edən HEK-293 Hüceyrə Xətlərinin inkişafı

HEK (insan embrion böyrəyi)-293 hüceyrələri və insan eritroleykemiya (HEL) hüceyrələri Amerika Tipi Mədəniyyət Kolleksiyasından əldə edilmiş və müvafiq olaraq MEM və RPMI-1640 mühitində (Sigma-Aldrich) becərilmiş, 10% istiliklə təsirsizləşdirilmiş fetal dana serumu ilə 5% CO olan nəmlənmiş atmosferdə 37°C2. HEK-293 hüceyrələri lipofektamin qarışığında PECAM-1/FKBP-1 və ya PECAM-1/FKBP-2 olan 10 μg pcDNA3.0 (Invitrogen) ilə inkubasiya edilmiş 100 mm-lik qablarda 80-90% birləşməyə qədər böyüdüldü ( GIBCO BRL) 4 saat serumsuz mühitdə (Sigma-Aldrich). Hüceyrələr 0,6 mq/ml G418 (genetisin GIBCO BRL) əlavə edilməzdən əvvəl əlavə 48 saat ərzində serum tərkibli MEM-də becərildi. G418-ə davamlı hüceyrə xətləri, PECAM-1/FKBP-1 və PECAM-1/FKBK2-nin hüceyrə səthinin ifadəsi üçün axın sitometriyasından istifadə edərək təhlil edilmişdir. Hüceyrə klonları hüceyrə çeşidlənməsi və məhdud seyreltmə subklonlaşdırılması yolu ilə əldə edilmişdir. Ən azı üç müxtəlif klonal xəttin xassələri tədqiq edilmişdir ki, klonal variasiyanın müşahidə olunan fenotipə təsirini müəyyən etmək mümkün olsun.

Western Blot və İmmunoprecipitation Təhlili

HEL və HEK-293 hüceyrələri 0,01% tripsin və 10 mM EDTA istifadə edərək qaldırıldı, steril HPBS-də yuyuldu və 10 6 hüceyrə/ml yekun konsentrasiyada yenidən suspenziya edildi. Kimyəvi çarpaz əlaqə 4°C-də 1 saat ərzində 2 mM BS 3 və ya DTSSP əlavə etməklə başladıldı və sonra reaksiyanı dayandırmaq üçün 50 mM Tris-HCl əlavə edildi. Hüceyrə lizatları lizis tamponunda (2% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl, 2 mM PMSF) və 15.000 g Tritonda həll olunan fraksiya həm azaldan, həm də reduksiya etməyən şəraitdə 7% SDS-poliakrilamid geldə təhlil edilmişdir. Immobilion-P membranına (Millipore) köçürüldükdən sonra zülallar, peroksidaza ilə birləşdirilmiş keçi anti-siçan IgG istifadə edərək, gücləndirilmiş kimilüminesans immunodeteksiyası (Amersham Pharmacia Biotech) ilə birlikdə PECAM-1 (PECAM-1.3) və ya FKBP-12-yə qarşı antikorlardan istifadə edilərək görüntüləndi. (Jackson ImmunoResearch Laboratories). İmmunopresipitasiya analizi üçün yuyucu hüceyrə lizatları yuxarıdakı kimi hazırlanmış və Tritonda həll olunan fraksiyalar 4°C-də gecə ərzində 10 μg/ml PECAM-1.3 IgG ilə inkubasiya edilmişdir. İmmun komplekslər 4°C-də 1 saat ərzində 50 μl 50% protein G-Sefaroza məhlulu ilə tutuldu və sonra immunopresipitasiya yuyucu bufer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl və 2) ilə beş dəfə yuyuldu. % Triton X-100). Bağlanmış zülallar 30 μl SDS azaldıcı tamponda 10 dəqiqə qaynadılmaqla muncuqlardan çıxarıldı və yuxarıda göstərildiyi kimi SDS-PAGE ilə təhlil edildi.

Axın Sitometriyası

100 μl HPBS-də 4 μg PECAM-1.3 və ya PECAM-1/IgG 100 μl HPBS-də 5 × 10 5 yabanı tipli və ya transfeksiya edilmiş HEK-293 hüceyrələrinə əlavə edildi və otaq temperaturunda 60 dəqiqə inkubasiyaya buraxıldı. AP1510-un müxtəlif konsentrasiyalarının olması və ya olmaması. Hüceyrələr daha sonra 1 ml HPBS ilə sentrifuqa ilə yuyuldu və sonra 1 μg FITC etiketli keçi anti-insan və ya keçi anti-siçan IgG γ zənciri (Jackson ImmunoResearch Laboratories) olan 100 μl HPBS-də yenidən dayandırıldı. 4°C-də 30 dəqiqəlik inkubasiyadan sonra hüceyrələr HPBS-də bir daha yuyuldu və sonra axın sitometrik analizinə məruz qaldı.

Floresan mikroskopiyası

Yabanı tipli və ya stabil şəkildə transfeksiya edilmiş 293 hüceyrə 1 μM AP1510 varlığında və ya olmamasında otaq temperaturunda 30 dəqiqə, sonra isə 5 μg/ml Alexa 488-birləşdirilmiş PECAM-1.3 ilə 4°C-də 30 dəqiqə ərzində inkubasiya edilmişdir. Sonra hüceyrələr yuyuldu, 1% formaldehidlə bərkidildi və sitospin preparatından istifadə edərək şüşə slaydlara quraşdırıldı. PECAM-1-in hüceyrə səthi paylanması Zeiss floresan mikroskopundan (ZEISS) istifadə edilərək təhlil edilmişdir.

293 Hüceyrənin İmmobilize Fibronektinlə Bağlanmasının Kəmiyyət Qiymətləndirilməsi

Yapışqan 293 hüceyrə 0,01% tripsin və 10 mM EDTA istifadə edərək qaldırıldı, steril HPBS-də yuyuldu və əvvəlcədən isidilmiş (37°C) zərdabsız mühitdə 10 6 hüceyrə/ml-də yenidən suspenziya edildi. 2 μg/ml kalsein AM (Molekulyar Problar) ilə 37°C-də 30 dəqiqə inkubasiya edildikdən sonra hüceyrələr yuyuldu və əvvəlcədən isidilmiş serumsuz mühitdə 106 hüceyrə/ml həcmində yenidən suspenziya edildi və sonra bu dəfə müxtəlif konsentrasiyalarda inkubasiya edildi. AP1510 22°C-də 30 dəqiqə ərzində seçilmiş antikorların iştirakı ilə. Daha sonra 10 μg/ml fibronektin (Sigma-Aldrich) və ya 10 mq/ml BSA (ICN Biomedicals) ilə örtülmüş 96 quyulu mikrotitr toxuma mədəniyyəti lövhələrinin (Dynatech Laboratories) quyularına 200 μl hüceyrə alikotları əlavə edildi. Antikor rəqabəti təcrübələri hüceyrələr quyulara əlavə edilməzdən əvvəl 22°C-də 30 dəqiqə ərzində seçilmiş inteqrin-spesifik mAb-ların müxtəlif konsentrasiyaları ilə əvvəlcədən inkubasiya edilmiş hüceyrələri həyata keçirdi. Reaksiya 37°C-də 15 dəqiqə ərzində 70 μl 4%-li formaldehid əlavə edilməklə dayandırıldı və ümumi quyu floresansı CytoFluor flüoresan lövhə oxuyucusunda (PerSeptive Biosystem) müəyyən edildi. Daha sonra boş bir şəkildə yapışmış və bağlanmamış hüceyrələr quyuların əvvəlcədən isidilmiş serumsuz mühitlə yuyulması yolu ilə çıxarıldı və hüceyrə yapışmasının faizini müəyyən etmək üçün flüoresans bir daha ölçüldü.


MÜZAKİRƏ

Bitki hüceyrələrində müxtəlif ER borularının birləşməsində vasitəçilik edən Atlastin GTPase ailəsinin üzvü olaraq, ER membranının birləşməsində RHD3-ün təsirinin mexaniki əsasları hələ də yaxşı öyrənilməyib. Əvvəlki tədqiqatlar göstərdi ki, RHD3 GTP-dən asılı homotipik qarşılıqlı təsirə məruz qalır ki, bu da RHD3-ün CT-nin fərqli ardıcıllıqlarında fosforlaşma ilə gücləndirilə bilər (Chen et al., 2011 Ueda et al., 2015). RHD3-ün strukturu həll edilməsə də, RHD3 və Atlastin GTPases-in maya üzvü olan Sey1p arasında yüksək struktur oxşarlığına əsaslanaraq, biz RHD3-ün sitozolik N terminalının strukturunu simulyasiya etdik. RHD3-ün simulyasiya edilmiş sitozolik quruluşu iki RHD3 monomerinin GD-lərinin və ilk iki 3HB-nin bir dimer yaratmaq üçün bir-birinə bükülə biləcəyini göstərir. Bu simulyasiyaya uyğun olaraq, biz tapırıq ki, tam uzunluqlu RHD3 GD və orta sahə ilə homotipik qarşılıqlı əlaqə yarada bilər. Dimerin interfeysində bir RHD3 monomerinin D185-i ilə digər monomerin R101-i arasında potensial qütb əlaqəsi pozulduqda, tam uzunluqlu RHD3 ilə RHD3-ün GD-si arasında qarşılıqlı əlaqə zəifləyir. Eynilə, orta domendəki ilk iki 3HB-dəki mutasiyalar da tam uzunluqlu RHD3 və onun orta sahəsi arasındakı qarşılıqlı əlaqəni azalda bilər. Biz təklif edirik ki, RHD3-ün GD və 3HB-lərinin vasitəçiliyi ilə dimerizasiyası yüksək ehtimal olunur. Maraqlıdır ki, biz bitki hüceyrələrində RHD3-ün GD və ya sitozolik N sonunu ifadə etdikdə, ifadə çoxbucaqlı ER şəbəkəsinin formalaşmasına mənfi təsir göstərir və bu, endogen RHD3 funksiyasının təsirləndiyini göstərir. Bu təsir, ehtimal ki, RHD3-ün GD və ya sitozolik N terminalı ilə tam uzunluqlu, endogen RHD3 arasındakı qarşılıqlı əlaqə vasitəsilə baş verir. Heyvan hüceyrələrində, fərqli ER membranlarının birləşməsini asanlaşdırmaq üçün iki fərqli ER membranında Atlastin-1-in sitozolik N terminalının əvvəlcə müxtəlif ER membranlarını bir-birinə bağlamaq üçün GD-lər arasında dimerizasiyaya məruz qaldığına inanılır. Bu dimerləşmə daha sonra orta domendə 3HBs ilə sabitləşir, bundan sonra ER membranlarını birləşdirmək üçün GTP-hidrolizdən asılı olan konformasiya dəyişikliyi baş verir. Tam uzunluqlu RHD3 və onun GD və ya ilk iki 3HB arasında qarşılıqlı əlaqə effektiv ER qaynaşması üçün tələb olunduğundan, RHD3 üçün də oxşar mexanizmin mövcud ola biləcəyini düşünürük.

RHD3 və Atlastin-1 arasındakı əsas fərq, RHD3-ün proqnozlaşdırılan spiral paketinin zənginləşdirilmiş orta sahəsinin Atlastin-1-dən daha uzun olmasıdır (Stefano və Brandizzi, 2014). RHD3 kimi, Sey1p də Atlastin-1-dən daha uzun orta domenə malikdir. Göstərilmişdir ki, 3HB-3 və 3HB-4-ün silinməsi Sey1p-ni təsirsiz hala gətirir (Yan et al., 2015). Burada RHD3, 3HB-3 və 3HB-4-də RHD3-ün zülal sabitliyində mühüm rol oynadığını görürük. RHD3-ün mümkün dimerizasiyası üçün həm 3HB-1, həm də 3HB-2 tələb olunsa da, maraqlıdır ki, 3HB-1 mutantları RHD3(A285P) və RHD3(L355P) qalın dəstələnmiş ER borularında, 3HB-2 mutantları isə RHD3( L379P) and RHD3(A434P) form punctates and aggregations on the ER tubules. This suggests that the mutations in 3HB-2 (L379P and A434P) may also influence the distribution of RHD3 on ER tubules.

RHD3 is an ER localized protein. Our results indicate that the TMs of RHD3 are important for the targeting and retention of RHD3 in the ER. The TMs not only serve as an ER membrane anchor, they are also able to interact with each other. Atlastin-1 in animal cells undergo a GTP-independent association through its TMs. This TM-mediated association is proposed to increase the density of Atlastin-1 at the site of membrane tethering ( Liu et al., 2012 Yan et al., 2015), so multiple cycles of dimerization of Atlastin-1 in the different membranes can occur for the efficient ER membrane fusion. Likely, RHD3 may also undergo a TM-mediated association for the efficient ER membrane fusion in plant cells.

Although the TMs are important for the targeting and retention of RHD3 in the ER, we also found the amphipathic helix located in the CT of RHD3 has an ability for the ER and Golgi targeting. Given the fact that a large portion of RHD3(ƊTM) or the CT of RHD3 is in the cytosol, we think a portion of RHD3(ƊTM) or the CT of RHD3 is anchored to the membrane of the ER and Golgi. When the hydrophobic residues on the same hydrophobic face in the amphipathic helix are replaced by the acidic residues, all the mutations abolished the membrane attachment ability of the CT of RHD3 however, different hydrophobic residue replacement did not compromise the membrane association of the CT of RHD3. Thus, it is highly likely that the membrane anchoring of RHD3(ƊTM) or the CT of RHD3 is due to a hydrophobic interaction between the amphipathic helix and membrane lipids. The amphipathic helix of Atlastin-1 has been proposed to facilitate the ER membrane fusion by providing the driving force for outer leaflet mixing of two different membranes through interacting with and destabilizing the lipid bilayer ( Liu et al., 2012). The mutations in the hydrophobic residues on the same hydrophobic face in the helix not only abolish the membrane attachment ability of the CT of RHD3, the full-length RHD3 with such mutations in the amphipathic helix also has reduced ability to rescue ƊSey1prhd3-8 mutantlar. This indicates that membrane anchoring mediated by the amphipathic helix of RHD3 also play a role in the efficient ER membrane fusion, possibly through its interaction with lipid bilayers like the amphipathic helix of Atlastin-1.

It is interesting to note that a portion of RHD3(ƊTM) or the CT of RHD3 is not only anchored to the ER membrane, but also the Golgi membrane. This is probably a reflection of the specific organization of the ER-Golgi interface in plant cells that Golgi is physically linked to the ER ( Sparkes et al., 2009). However, when the CT of yeast Sey1p was expressed in plant cells, no Golgi targeting is revealed ( Supplemental Fig. S5A ), but replacing the amphipathic helix in the CT of yeast Sey1p with the amphipathic helix of RHD3 will target YFP to the Golgi or ER membrane ( Supplemental Fig. S5B ), so the Golgi targeting of RHD3(ƊTM) or the CT of RHD3 is RHD3 specific and is determined by the amphipathic helix of the CT of RHD3. However, the full-length RHD3 is ER localized ( Chen et al., 2011), so the physiological relevance of this Golgi membrane preference of the CT of RHD3 is not clear.

CONCLUSIONS

Based on our systemic structure-function analysis of RHD3, we hypothesize that, to mediate different ER membrane fusion, different RHD3 molecules in different ER membranes need to undergo homotypic interaction through their GDs and middle domains. Likely, RHD3 may also undergo a TM-mediated association to increase the density of RHD3 in the same ER membrane for efficient ER membrane fusion. Meanwhile, the amphipathic helix of the C terminus of RHD3 would attach to the ER membrane to disturb the lipid bilayer to facilitate the membrane fusion.


1. Edelman GM, Cunningham BA, Gall WE, Gottlieb PD, Rutishauser U, Waxdal MY. The covalent structure of an entire γG immunoglobulin molecule. The Rockefeller University. Communicated by Theodore Shedlovsky. 1969

2. Germenis A. Medical Immunology. Papazisis Publications. 2000

3. Branden C, Tooze J. Introduction to protein structure. 2nd Edition, Garland Publishing, Inc, New York. 1999

4. Owen JA, Punt J, Stanford SA, Jones PP. KUBY Immunology. Seventh Edition, W. H. Freeman and Company, New York. 2013

5. Abbas AK, Lichtman AH. Basic Immunology. Functions and Disorders of the Immune System. Saunders, second edition. 2004

6. Schroeder HW Jr, Cavacini L. Structure and Function of Immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 2009125:41-52

7. Bruhns P. Properties of mouse and human IgG receptors and their contribution to disease models. Blood Journal. 2012199:5640-5649

8. Biermann MHC, Griffante G, Podolska MJ, Boeltz S, Strurmer J, Munoz LE, Bilyy R, Herrmann M. Sweet but dangerous - the role of immunoglobulin G glycosylation in autoimmunity and imflammation. Lupus. 201625:934-942

9. Hmiel LK, Brorson KA, Boyne MT. Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity. Anal Bioanal Chem. 2014 Springer

10. Derry C, Rooperanian DC, Akilesh S. FcRn: The neonatal Fc receptor comes of age. Nature Reviews Immunology. 20077:715-725

11. Hirschberg C. Topography of glycosylation in the Rough Endoplasmic Protein Reticulum and Golgi apparatus. Ann. Rev. Biokimya. 198756:63-87

12. Maverakis E, Kim K, Shimoda M, Gershwin ME, Patel F, Wilken R, Raychaudhuri S, Renee Ruhaak L, Lebrilla CB. Glycans in the immune system and the altered glycan theory of Autoimmunity: A critical review. J Autoiummun. 20150:1-13

13. Walsh G. Post-translational Modification of Protein Biopharmaceuticals. Part One, Glycosylation. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. 2009

14. Walsh T. Christopher. Posttranslational Modification of Proteins. Expanding Nature Inventory. Romberts and Company Pumplshers, Englegood, Colorado. 2006

15. Shinkawa T, Nakamura K, Yamane N, Shoji-Hosaka E, Kanda Y, Sakurada M, Uchida K, Anazawa H, Satoh M, Yamasaki M, Hanai N, Shitara K. The absence of fucose but not the presence of Galactose or Bisecting N-Acetylglucosamine of Human IgG1 Complex-type Oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. The journal of biological chemistry. 2003278:3466-3473

16. Arnold JN, Wormald MR, Sim RB, Rudd PM, Dwek RA. Structure of Human Immunoglobulins. Annu. Rev. İmmunol. 200725:21-50

17. Krapp S, Mimura Y, Jefferis R, Huber R, Sondermann P. Structural Analysis of Human IgG-Fc Glycoforms Reveals a Correlation Between Glycosylation and Structural Integrity. J Mol Biol. 2003325:979-989

18. Ravetch JM, Bolland S. IgG Fc Receptors. Annu. Rev. İmmunol. 200119:275-90

19. Mimura Y. və b. Contrasting glycosylation profiles between Fab and Fc of a human IgG protein studied by electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Immunological Methods. 2007326:116-126

20. Masuda K, Yamaguchi Y. və b. Pairing of oligosaccharides in the Fc region of immunoglobulin G. FEBS Letters. 2000473:349-357

21. Nimmerjahn F, Anthony RM, Ravetch JV. Agalactosylated IgG antibodies depend on cellular Fc receptors for in vivo fəaliyyət. Proceedings of the National Academy on Sciences (PNAS). 2007104:20

22. De Haan N, Reiding KR, Driessen G, Van Der Burg M, Wuhrer M. Changes in healthy human IgG Fc-glycosylation after birth and during early childhood. Journal of Proteome Research. 2016 http://pubs.acs.org

23. Williams PJ, Arkwright PD, Rudd P, Scragg IG, Edge CJ, Wormald MR, Rademacher TW. Short Communication: Selective Placental Transport of Maternal IgG to the Fetus. Placenta. 199516:749-756

24. Sazinsky SL, Ott RG, Silver NW, Tidor B, Ravetch JM, Wittrup KD. Aglycosylated immunoglobulin G1 variants productively engage activating Fc receptors. Proceedings of the National Academy on Sciences (PNAS). 2008105:20167-20172

25. Ferrara C, Stuart F, Sondermann P, Brunker P, Umana P. The Carbohydrate at FcγRIIIa Asn-162. An element required for high affinity binding to non-fucosylated IgG glycoforms. The Journal of Biological Chemistry. 2006281:5032-5036

26. Shields RL, Lai J, Keck R, O'Conneli LY, Hong K, Meng YG, Weikert SHA, Presta L. Lack of Fucose on human IgG1 N-Linked Oligosaccharide improves binding to human FcγRIII and Antibody-dependent Cellular Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 2002277:26733-26740

27. Warner TG, deKremer RD, Sjoberg ER, Mock AK. Characterization and analysis of Branched-chain N-Acetylglucosaminyl Oligosaccharides Accumulating in Sandhoff Disease Tissue. The Journal of Biological Chemistry. 1985260:6194-6199

28. Kibe T, Fujimoto S, Ishida C, Togari H, Wada Y, Okada S, Nakagawa H, Tsukamoto Y, Takahashi N. Glycosylation and Placental Transport of Immunoglobulin G. J Clin Biochem Nutr. 199621:57-63

29. Nimmerjahn F, Ravetch JV. Fcγ Receptors: Old Friends and New Family Members. İmmunitet. 200624:19-28

30. Kouings A. və b. Site-specific glycosylation of human immunoglobulin G is altered in four rheymatoid arthritis patients. The Biochemical Journal. 1996314:621-630

31. Malhotra R, Wormald MR, Rudd PM, Fischer PB, Dwek RA, Sim RB. Glycosylation changes of IgG associated with rheumatoid arthritis can activate complement via the mannose-binding protein. Nature Publishing Group. 19951:237-243

32. Malhotra R. və b. Glycosylation changes of IgG associated with rheumatoid arthritis can activate complement via the mannose-binding protein. Nature Medicine. 19951:237-243

33. Theodoratou E, Thaci K, Agakov F, Timofeeva MN, Stambuk J, Pucic-Bakovic M, Vuckovic F, Orchard P. və b. Glycosylation of plasma IgG in colorectal cancer prognosis. Scientific Reports 6. 2016 article number 28098

34. Vuckovic F, Theodoratou E, Thaci K, Timofeeva M, Vojta A, Stambuk J, Pucic-Bakovic M, Rudd PM. və b. IgG glycome in colorectal cancer. Biology of Human Tumors, Clinical Cancer Research. 2016 American Association for Cancer Research

35. Ruhaak LR, Miyamoto S, Lebrilla C. Developments in the identification of Glycan Biomarkers for the detection of cancer. Mol Hüceyrə Proteomikası. 201312:846-855



Şərhlər:

  1. Archere

    Təbrik edirəm, nə lazımlı sözlər...

  2. Valkoinen

    This excellent phrase, by the way, falls

  3. Nejar

    Məqaləni yenidən oxumağa hazıram. Yaxşı material və sadə yazılmışdır! Sizə lazım olan budur.

  4. Tojanris

    Is compliant



Mesaj yazmaq