Məlumat

Səth Plazmon Rezonansı (SPR) Molekulyar Çəki Limitini proqnozlaşdırır?

Səth Plazmon Rezonansı (SPR) Molekulyar Çəki Limitini proqnozlaşdırır?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Sadəcə soruşuram ki, SPR sistemimizin aşağı molekulyar çəkisi (LMW) analitinin LOD (aşkarlama həddi) və başqa bir zülal aşkarlamasında həssaslığımıza əsasən nə qədər aşkar edə biləcəyini təxmin edə bilərikmi? Beləliklə, hazırda inkişaf etmiş sistemimiz təxminən 5 fq/ml LOD ilə alfa-sinukleini (14 kDa) aşkar edə bilir. LMW-ni necə aşkarlaya biləcəyimizi təxmin edə bilərikmi? Hər hansı bir istinad kağızı və ya başqa bir şey var. Çünki mənim bildiyim qədər biz ilk olaraq təcrübələrə əsaslanaraq RII dəyişikliyini əldə edə bilərik. Ancaq indi mənim vəziyyətim odur ki, LMW-ni aşkar etmək üçün SPR cihazlarımızın limitini sınamaq istəyirəm (hazırda hansı LMW analitlərini almağı seçirəm)

Çox sağ ol! hər hansı bir müzakirə və ya şərh çox qiymətləndirilir


Hüceyrə biologiyasında yerüstü plazmon rezonans sensorları: əsaslar və tətbiq

Səth plazmonlarının həyəcanlanmasına əsaslanan və səthi plazmon rezonansı (SPR) sensorları adlandırılan optik sensorlar, reseptor-liqand kontaktları kimi geniş çeşidli makromolekulyar qarşılıqlı təsirləri xarakterizə etmək və ölçmək üçün mərkəzi analitik vasitəyə çevrilmişdir. Bu klassik tətbiq sahəsi ilə yanaşı, son 15 ildə liqand/hüceyrə və ya host/patogen qarşılıqlı təsirlərinin, hüceyrə/hüceyrə təmaslarının və hüceyrə reaksiyalarının aşkarlanması və təhlili üçün SPR sensorlarının inkişafı xeyli sürət qazanmışdır. Tibbi diaqnostika, ətraf mühitin monitorinqi və ya bioloji təhlükəsizlik üçün biotanıma elementləri kimi həyati vacib prokaryotik və ya eukaryotik hüceyrələri həyata keçirən SPR sensorlarının tətbiqi haqqında məlumat verən nəşrlərin sayı durmadan artır. Bu baxış səthi plazmon rezonansının texnikası və onun həyati hüceyrə sensorları sahəsində tətbiqi üçün vacib olan parametrlər haqqında qısa məlumat verir. Bundan əlavə, hüceyrədənkənar və hüceyrədaxili stimullara hüceyrə qarşılıqlı təsirlərinin və hüceyrə reaksiyalarının təhlilində bu cür sensorların tətbiqi ilə bağlı nəşrlər ümumiləşdirilmişdir.

Bu, abunə məzmununun, qurumunuz vasitəsilə girişin önizləməsidir.


Mücərrəd

Kiçik molekulları kommersiyada mövcud olan səth plazmon rezonansı (SPR) alətlərindən istifadə etməklə birbaşa aşkar etmək çətindir. Bunun səbəbi, aşağı molekulyar ağırlıqlı birləşmələrin qırılma indeksində ölçülə bilən dəyişikliyə səbəb olmaq üçün kifayət qədər kütləyə malik olmamasıdır. Qırılma indeksi analitin kütləsindən başqa digər xüsusiyyətlərə də həssasdır. Bu yaxınlarda SPR-dən istifadə edərək immobilizasiya edilmiş zülallar üçün əhəmiyyətli konformasiya dəyişikliklərinin aşkar edilməsi barədə məlumat verilmişdir. Bununla belə, bu xüsusiyyət immobilizasiya edilmiş protein reseptorları ilə aşağı molekulyar ağırlıqlı liqand bağlanmasının aşkarlanması üçün hələ də istifadə edilməmişdir. Burada göstəririk ki, liqandın yaratdığı konformasiya dəyişiklikləri kiçik molekulların immobilizasiya olunmuş maltoza bağlayan zülal və toxuma transqlutaminazına bağlanmasını izləmək üçün istifadə edilə bilər. Hidrodinamik radiusda azalan bir reseptorla ligand bağlanması sınma indeksində xalis azalma verdi. Hidrodinamik radiusda artan reseptor üçün refraktiv indeksdə xalis müsbət dəyişiklik müşahidə edilmişdir. Kırılma indeksinin dəyişməsini analitin molekulyar kütləsinin səthə əlavə edilməsi ilə izah etmək mümkün deyildi. Bu SPR cavabları, cavabın tərsinə çevrilməsi və SPR ilə müəyyən edilmiş tarazlıq dissosiasiya sabitləri ilə bildirilmiş dissosiasiya sabitləri arasındakı oxşarlıqlar əsasında qiymətləndirilən xüsusi reseptor-liqand qarşılıqlı təsirlərinin nəticəsi idi. Bundan əlavə, bu texnika kiçik molekullardan ibarət paneldən spesifik liqandların aşkarlanmasında effektiv olduğunu sübut etdi. Bu SPR metodu geniş istifadə olunan və kommersiya baxımından mövcud olan cihazlarda heç bir dəyişiklik tələb etmir, lakin kalsium ionları (40 Da) kimi çox kiçik molekulların birbaşa aşkarlanmasına imkan verirdi. Aşağı molekulyar ağırlıqlı analitləri aşkar etmək üçün reseptor konformasiyasından istifadə kiçik molekullu dərman kitabxanalarının yüksək məhsuldarlıqlı skrininqində və biosensorların inkişafında potensial tətbiqlərə malikdir.

Cari ünvan: Biokimya Departamenti, Wisconsin Madison Universiteti, Madison, WI 53706.

Müəllif: (e-poçt) [email qorumalı] (faks) 919-597-6400.


Mücərrəd

Kiçik molekulları kommersiyada mövcud olan səth plazmon rezonansı (SPR) alətlərindən istifadə etməklə birbaşa aşkar etmək çətindir. Bunun səbəbi, aşağı molekulyar ağırlıqlı birləşmələrin qırılma indeksində ölçülə bilən dəyişikliyə səbəb olmaq üçün kifayət qədər kütləyə malik olmamasıdır. Qırılma indeksi analitin kütləsindən başqa digər xüsusiyyətlərə də həssasdır. Bu yaxınlarda SPR-dən istifadə edərək immobilizasiya edilmiş zülallar üçün əhəmiyyətli konformasiya dəyişikliklərinin aşkarlanması barədə məlumat verilmişdir. Bununla belə, bu xüsusiyyət immobilizasiya edilmiş protein reseptorları ilə aşağı molekulyar ağırlıqlı liqand bağlanmasının aşkarlanması üçün hələ də istifadə edilməmişdir. Burada göstəririk ki, liqandın yaratdığı konformasiya dəyişiklikləri kiçik molekulların immobilizasiya olunmuş maltoza bağlayan zülal və toxuma transqlutaminazına bağlanmasını izləmək üçün istifadə edilə bilər. Hidrodinamik radiusda azalan bir reseptorla ligand bağlanması sınma indeksində xalis azalma verdi. Hidrodinamik radiusda artan reseptor üçün refraktiv indeksdə xalis müsbət dəyişiklik müşahidə edilmişdir. Kırılma indeksinin dəyişməsini analitin molekulyar kütləsinin səthə əlavə edilməsi ilə izah etmək mümkün deyildi. Bu SPR cavabları, cavabın tərsinə çevrilməsi və SPR ilə müəyyən edilmiş tarazlıq dissosiasiya sabitləri ilə bildirilmiş dissosiasiya sabitləri arasındakı oxşarlıqlar əsasında qiymətləndirilən xüsusi reseptor-liqand qarşılıqlı təsirlərinin nəticəsi idi. Bundan əlavə, bu texnika kiçik molekullardan ibarət paneldən spesifik liqandların aşkarlanmasında effektiv olduğunu sübut etdi. Bu SPR metodu geniş istifadə olunan və kommersiya baxımından mövcud olan cihazlarda heç bir dəyişiklik tələb etmir, lakin kalsium ionları (40 Da) kimi çox kiçik molekulların birbaşa aşkarlanmasına imkan verirdi. Aşağı molekulyar ağırlıqlı analitləri aşkar etmək üçün reseptor konformasiyasından istifadə kiçik molekullu dərman kitabxanalarının yüksək məhsuldarlıqlı skrininqində və biosensorların inkişafında potensial tətbiqlərə malikdir.

Cari ünvan: Biokimya Departamenti, Wisconsin Madison Universiteti, Madison, WI 53706.

Müəllif: (e-mail) [email qorumalı] (faks) 919-597-6400.


Materiallar və metodlar

Nümunələrin toplanması və limfositlərin təcrid edilməsi

Qan etilendiamintetraasetik turşu (EDTA) flakonlarında (Venoject K2E, Leuven, Belçika) müalicədən sonra periodontitdən sağalmış donordan (Oral Reabilitasiya Mərkəzi, İctimai Diş Sağlamlığına Qulluq, Östergötland İlçe Şurası, Linkopinq, İsveç) toplanıb. Tam qan 1:1 nisbətində 0,9% NaCl məhlulunda seyreltildi və diqqətlə iki fikol borusunda (Thermofischer Scientific Inc., Stokholm, İsveç) 6,0 mL limfoprep məhlulu (Axis-shield PoC, Oslo, Norveç) üzərinə qatlandı. 1800-də gradient sentrifuqa g 20 ° C-də 20 dəqiqə. Aydın fərqli limfosit təbəqəsi diqqətlə pipetlənmiş və fosfat tamponlu şoran məhlulu ilə yuyulmuşdur (PBS pH 7.2 Apoteket AB, Linkoping, İsveç). Hüceyrələr l -qlutamin (ATCC, Boras, İsveç) olan l -15 mühitində becərilmiş, 10% fetal iribuynuzlu zərdab (FBS Sigma-Aldrich, Stokholm, İsveç) ilə əlavə edilmiş və gecə ərzində 37 °C-də inkubasiya edilmişdir.

Linköpingdəki regional etik komitə tədqiqatı təsdiqlədi (2010/307-31) və tədqiqatımızda iştirak edən bütün xəstələr razılıqla məlumatlandırıldı.

Bakterial kultivasiya və limfositlərin stimullaşdırılması

Porphyromonas gingivalis yabanı tipli ATCC 33277 (Amerika Tipi Mədəniyyət Kolleksiyası, Manassas, VA), vəhşi tipli W 50, E8 (W50 əldə edilmiş RgpA çatışmazlığı və RgpB çatışmazlığı) və K1A (W50 əldə edilmiş Kgp çatışmazlığı) (zəhmət olmasa, Prof. Curtis, Molekulyar Patogenez Qrupu, Queen Mary, London Universiteti, Böyük Britaniya), vəhşi tip 381, DPG-3 (381 törəmə Fim A çatışmazlığı) və KRX-178 (381 törəmə Mfa-1 çatışmazlığı) (zəhmət olmasa təqdim olunur) Buffalo Universitetinin Mikrobiologiya və İmmunologiya Departamenti, professor RJ Genco tərəfindən anaerob şəraitdə (80% N) cəld anaerob bulyonda (29,7 q/L, pH 7,2) yetişdirilmişdir.2, 10% CO2və 10% H2) kamerada 37 °C-də (Concept 400 Anaerobik İş İstasyonu Ruskinn Technology Ltd., Lids, Böyük Britaniya). Bakteriyalar yuyuldu və Krebs-Ringer qlükoza tamponunda (120 mM NaCl, 4.9 mM KCl, 1.2 mM MgSO) yenidən dayandırıldı.4, 1,7 mM KH2PO4, 8.3 mM Na2HPO4, və 10 mM qlükoza, pH 7.3).

İstidən ölür P. diş əti 80 °C-də 20 dəqiqə inkubasiya yolu ilə hazırlanmışdır. Bakteriyaların öldürülməsini və 5 gün ərzində 37 °C-də inkubasiya edilməsini təmin etmək üçün cəld anaerob agar boşqabına cəmi 10 μL istiliklə məhv edilmiş süspansiyon yayıldı. İstidən öldürüldü P. diş əti ATCC 33277, 10 9 cfu/mL limfositləri stimullaşdırmaq üçün istifadə edildi və 37 °C-də inkubasiya edildi. Təzə mühit 21 günə qədər müntəzəm olaraq əlavə edilmişdir.

Limfositlərin axın sitometriyası analizi

Hüceyrə tərkibini öyrənmək üçün axın sitometrik analizi aparılmışdır. Hüceyrələr 300 dərəcə santrifüqa edilib g (Eppendorf Centrifuge 5702R5, Almaniya) 5 dəqiqə, və pellet supernatant atıldıqdan sonra 1000 μL PBS-də həll edildi. Hüceyrə tərkibi 100 μL nümunənin 20 μL CD19, CD3, CD16/56 və flüoroxrom allofikosiyanin (APC), floresein izotiosiyanat (FITC), fikoeritrin (PE) ilə işarələnmiş səth markerləri ilə antikor kokteyli ilə qarışdırılaraq müəyyən edilmişdir. Peridinin xlorofil zülal kompleksi (PerCP) (BD Biosciences, Stokholm, İsveç) və qaranlıqda 15 dəqiqə inkubasiya edildi. Qırmızı qan hüceyrələri 450 μL lizinq məhlulu (2% Fetal dana serumu (FCS Sigma-Aldrich, Stokholm, İsveç), PBS pH 7.4-də 0,1% natrium azid məhlulu) əlavə edilməklə parçalandı. 15 dəqiqəlik inkubasiyadan sonra hüceyrələr BD FACS Canto-da (BD Biosciences, Stokholm, İsveç) təhlil edildi. Nəticələr analiz üçün CD45+ lenfosit hüceyrələrinin qapısı ilə loqarifmik miqyasda tərtib edilmişdir. Hüceyrələr bakteriya ilə stimullaşdırıldıqdan 1 həftə sonra, stimullaşdırılmamış hüceyrələr isə 3 gündən sonra təhlil edildi. 3 gündən sonra stimullaşdırılmamış limfositlər aktivləşdirici maddənin olmaması səbəbindən əlavə analiz üçün kifayət qədər hüceyrə sayına malik deyildi. Buna görə də, axın sitometriyasının analizindən üç gün əvvəl əvvəllər təsvir edildiyi kimi, eyni xəstənin qanından limfositlər təcrid olunmuş və becərilmişdir.

İmmunofluoresan boyama və konfokal mikroskopiya

2 və 3 həftəlik inkubasiya ilə stimullaşdırılan hüceyrə süspansiyonları 170 ° C-də sentrifuqa edildi. g, və qranul 10% FBS olan 2 mL təzə l -15 mühitində həll edildi. Cəmi 200 μL 5 × 10 5 hüceyrə/ml suspenziya daha sonra 6 dəqiqə ərzində 600 rpm-də sitosentrifuqa edildi. Paraformaldehid (4%) otaq temperaturunda 2 saat ərzində hüceyrələri fiksasiya etmək üçün istifadə edilmişdir. Sabit hüceyrələr 5 dəqiqəlik inkubasiya intervalında dörd dəfə PBS ilə yuyuldu, otaq temperaturunda 1 saat ərzində 5% FBS istifadə edərək bloklandı və sonra eyni protokolla yenidən yuyuldu. Hüceyrələr anti-insan CD38 antikorları ilə (BD Biosciences, Stokholm, İsveç 1:100 nisbətində seyreltilmiş) bir gecədə 4 °C-də inkubasiya edildi. Hüceyrələr əvvəlki kimi PBS ilə yuyuldu və sonra otaq temperaturunda 2 saat ərzində flüoresein izotiyosiyanat konjugasiya edilmiş keçi anti-siçan antikorları ilə inkubasiya edildi. Hüceyrələr dörd dəfə PBS ilə yuyuldu və sonra 3 dəqiqə ərzində 1:200 nisbətində 4ʹ,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Sigma-Aldrich, Stokholm, İsveç) seyreltilməsi ilə əks boyandı. Dörd dəfə yuyulduqdan sonra hüceyrələr lazer tutma mikrodisseksiyasında (LCM) Zeiss konfokal mikroskopunda (Linköpinq Universiteti, İsveç Patologiya Departamenti) təhlil edildi.

Antikorların bərpası

3 həftədən sonra mədəniyyət mühiti steril 15 mL sentrifuqa borularına (Greiner Bio-One, Almaniya) köçürüldü və 3500 ° C-də sentrifuqa edildi. g hüceyrələri pellet etmək üçün 10 dəqiqə. Supernatant 0,45 µm steril filtrlərdən (Thermofisher Scientific, Stokholm, İsveç) istifadə edilərək süzüldü və 3500-də 100 KDa Amicon mikrokon kəsmə filtrləri (Millipore, Molsheim, Fransa) istifadə edərək sentrifuqa edildi. g 60 dəq. Antikor ehtiva edən supernatant P. diş əti molekulyar çəkisi və gt100 KDa toplanmış və steril 0,2 µm steril filtrlərlə (Thermofisher Scientific, Stokholm, İsveç) süzülərək -50 °C-də saxlanmışdır.

Natriumdodesil sulfat poliakrilamid gel elektroforezi

Antigenlərin antikorların spesifikliyini göstərmək üçün alternativ üsul kimi antigen-antikor qarşılıqlı təsirini vizuallaşdırmaq üçün standart natriumdodesil sulfat poliakrilamid gel elektroforezi aparılmışdır. İstidən ölür P. diş ətiEv sahibi lenfositləri stimullaşdırmaq üçün istifadə edilən , hər iki anti-inkubasiya edildi.P. diş əti in vitro və antikor istehsal olunan antikorlarEscherichia coli antikorlar (Swed Diagnostics, Stokholm, İsveç).

Bütün hazırlanmış nümunələr PBS (pH 7.4, Sigma-Aldrich, Stokholm, İsveç) ilə 1:4 nisbətində seyreltilmiş və 3450 ° C-də sentrifuqa edilmişdir. g 24 saat inkubasiyadan sonra 10 dəqiqə. Supernatantlar 100 KDa sentrifuqa filtrlərində (Millipore, Stokholm, İsveç) sentrifuqa edildi və bərabər həcmdə Laemmli tamponu ilə 5 dəqiqə qızdırıldı. Nümunələr natriumdodesil sulfat poliakrilamid gel elektroforez TGX prefabrik gellərində aparılmışdır (Bio-rad, Stokholm, İsveç).

IgG alt sinif analizi

IgG alt sinif analizi ELISA dəsti istifadə edərək in vitro istehsal olunan antikorlar üzərində aparılmışdır. Əvvəlcədən örtülmüş ELISA lövhələri və reagentlər istehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq hazırlanmışdır. qarşı istehsal olunan in vitro antikorlar P. diş əti 1:4 nisbətində ELISA seyreltici ilə seyreltildi. İkincil antikor kimi peroksidaza antiinsan IgG məhlulu, xromogen reaksiyası üçün isə 3,3ʹ,5,5ʹ-tetrametilbenzidin substrat məhlulu istifadə edilmişdir. Nəticələr ELISA mikro oxuyucuda dayandırma məhlulu əlavə edildikdən sonra bir saat ərzində 450 nm-də oxundu (Expert 96 ELISA reader, GmBH, Avstriya). İstehsalçı tərəfindən verilmiş insan serumundan nəzarət kimi istifadə edilmiş və konsentrasiyalar standartlardan hesablanmışdır.

Səth plazmon rezonansı

anti-P. diş əti antikorlar amin birləşmə metodundan istifadə edərək spesifik antigen-antikor qarşılıqlı təsirlərini araşdırmaq üçün Biacore® 1000 (GE Healthcare Ltd, İsveç) CM 5 sensor çipində immobilizasiya edildi. İmmobilizasiya üç mərhələdə həyata keçirilir. Əvvəlcə çipdəki karboksimetilləşdirilmiş dekstran ilə örtülmüş kanal səthi bir inyeksiya ilə aktivləşdirildi. N-hidroksisuksinimid və N-etil-Ndimetil aminopropil karbonamid hidroxlorid (GE Healthcare Ltd, İsveç) qarışığı (1:1 nisbətində). anti-P. diş əti antikorlar inyeksiya zamanı çipin aktivləşdirilmiş səthinə bağlanan asetat (pH 4.5) ilə seyreltildi. Nəhayət, sensor səthi digər hissəciklərin sensorun səthinə bağlanmasının qarşısını alan 70 μL etanolamin (GE Healthcare Ltd, İsveç) yeridilməklə deaktiv edildi.

İmmobilizasiya edilmiş antikorlar müsbət və mənfi nəzarətlər vasitəsilə sınaqdan keçirildi. Anti-insan IgG (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) və istiliklə öldürülür P. diş əti əvvəllər lenfositləri stimullaşdırmaq üçün istifadə edilənlər müsbət nəzarət kimi istifadə olunurdu. Bir neçə ATCC bakteriya ştammları (CCUG, Göteberq, İsveç) və anti-qvineya donuzu IgG (Sigma-Aldrich) mənfi nəzarət kimi istifadə edilmişdir. SPR ilə əldə edilən cavab Bia-qiymətləndirmə proqramından (GE Healthcare Ltd., İsveç) istifadə edərək RU-larda ölçüldü.

Aşkarlanması Porphyromonas gingivalis in vitro və klinik nümunələr

Sağlam qan donorlarından plazma nümunələri toplanmış və 10 8 cfu/ml yabanı tip və fimbria mutantları ilə inkubasiya edilmişdir. P. diş əti. Nümunələr PBS 7.4 (Sigma-Aldrich, Stokholm, İsveç) ilə 1:20 nisbətində seyreltildi və bunların dəsti anti-inkubasiya edildi.P. diş əti bir gecədə antikorlar. Anticisim inkubasiyası olan və olmayan nümunələr antikor ilə immobilizasiya edilmiş çip üzərində aparıldı.P. diş əti 5 μL/dəq axın sürətində antikorlar.

Xəstələrdən diş əti yarıq mayesi (GCF) nümunələri toplanmışdır (n = 30) İsveçin Linköpinq şəhərində Ağızın Reabilitasiyası Mərkəzinin Periodontologiya Departamentində ağır, müalicə olunmamış periodontit ilə və yaş və cinsə uyğun gələn periodontal cəhətdən sağlam nəzarətçilərdən (n = 30).

Nümunələr hər kvadrantda ən dərin periodontal cibdən və ya dərin cibləri olmayan nəzarət subyektlərində bütün birinci azı dişlərinin mezial yerindən götürülüb. Supragingival lövhə tüpürcəklə çirklənmədən çıxarıldı və dişin havada qurumasına icazə verildi. Periopaper zolaqları GCF toplamaq üçün təxminən 1-2 mm diş altı dərinliyə daxil edildi və zolaqlar tərəfindən udulmuş GCF həcmi daha əvvəl təsvir edildiyi kimi kalibrlənmiş Periotron 8000 (Oraflow Inc, NY) istifadə edərək müəyyən edildi (Chapple et al.., 1999). Hər xəstə üçün dörd periopaper zolağından alınan GCF seyreltici tampona (Quantikine Human HGF immunoassay, R&D Systems, Minneapolis, MN) birləşdirildi və istifadə olunana qədər -20 °C-də donduruldu.

Nümunələr istifadə etməzdən əvvəl əridildi və steril PBS (Sigma-Aldrich, Stokholm, İsveç) ilə 1:20 nisbətində seyreltildi. Nümunələr antiseptik ilə hərəkətsizləşdirilmiş çip üzərində aparıldı.P. diş əti 5 μL/dəq axın sürətində antikorlar.

DNT-DNT dama taxtası hibridləşmə analizi

Subgingival mikrob nümunələri GCF nümunəsi ilə eyni dörd sahədən toplanmışdır. Supragingival lövhə çıxarıldı və kök səthinin qurumasına icazə verildi. Bakterial nümunə periodontal cibə daxil edilmiş Steril-endodontik kağız nöqtəsi daxil edilərək toplandı, 20 saniyə ərzində GCF-nin toplandığı eyni dörd yerdən subgingival bakterial nümunələri toplamaq üçün istifadə edildi, sonra steril sınaq borusuna köçürüldü. Nümunələr İsveçin Göteborq Universitetinin Oral Mikrobiologiya və İmmunologiya Departamentində işlənmiş və mövcudluğu üçün təhlil edilmişdir. P. diş əti, ən azı 10.000 hüceyrə aşkarlama limiti ilə DNT-DNT dama taxtası hibridləşdirmə texnikasından istifadə etməklə (Socransky et al.., 1994). Nümunələr də əvvəlki tədqiqatlarımıza daxil edilmişdir (Lonn et al., 2014 ).

Real vaxtda polimeraza zəncirvari reaksiya

SPR analizinin aşkarlanması metodunu təsdiqləmək üçün real vaxt rejimində PCR analizi aparıldı P. diş əti GCF nümunələrində. DNT-DNT dama taxtası analizində və SPR üsullarında fərqli reaksiyalar göstərən nümunələr seçilmiş və sağlam nəzarətlə müqayisə edilmişdir. P. diş əti TGTAGATGACTGATGTGTAAAACC-nin 16S rRNA irəli primer ardıcıllığı və ACGTCATCCCCACCTTCCTC-nin tərs primer ardıcıllığı istifadə edilmişdir. SYBR Green (Maxima® SYBR Green/ROX qPCR Master Mix, Fermentas, İsveç) istifadə edildi və PCR şərtləri ilkin denaturasiya üçün 95 °C-də 10 dəqiqə, ardınca 95 °C, 40 dövr üçün 15 saniyə və sonra təyin edildi. 60 °C, 7900 HT real vaxt PCR alətində 60 saniyə (Applied Biosystems).

Transmissiya elektron mikroskopiyası

Transmissiya elektron mikroskopiyası anti-in bağlanma yaxınlığını öyrənmək üçün aparılmışdır.P. diş əti üçün P. diş əti. P. diş əti PBS-də 1:20 nisbətində seyreltilmiş anti-ant ilə inkubasiya edilmişdir.P. diş əti PBS-də 1:100 nisbətində seyreltilmiş antikorlar. Həddindən artıq antikorlar PBS ilə yuyuldu və 1:1000 nisbətində qızıl etiketli anti-insan IgG əlavə edildi (Nano Gold Probes, NY). Qarışıq 37 ° C-də 1 saat inkubasiya edildi. Həddindən artıq antikorlar PBS ilə yuyuldu və 1% osmium tetroksid (Sigma-Aldrich, Stokholm, İsveç) ilə 200 µm mesh formavar örtüklü mis şəbəkəyə (Agar Scientific, Stansted, Böyük Britaniya) quraşdırılana qədər sabitləndi. Uranil asetat (2%, Sigma-Aldrich, Stokholm, İsveç) JEOL 1230 ötürücü elektron mikroskopunda (Linköpinq Universiteti, İsveç Patologiya Departamenti) müayinədən əvvəl boyanma üçün istifadə edilmişdir.

Statistik təhlil

SPR analizinin iki üsulundan və DNT-DNT dama taxtası analizindən, SPR analizindən və əks transkripsiya-PCR (RT-PCR) ilə əldə edilən nəticələri müqayisə etmək üçün Qrafik pad prizması, 5.0 (GraphPad Software, Inc. , Kaliforniya, ABŞ). Sərbəstlik dərəcəsi üçün chi kvadrat paylama cədvəlindən 1 və P > 0.05 sıfır fərziyyənin rədd edilməsi kimi qəbul edildi (Fisher RAaY, 1963) təhlil edilən iki üsulla əldə edilən nəticələr arasında əhəmiyyətli fərqlər yoxdur.


Səth Plazmon Rezonansı (SPR) Molekulyar Çəki Limitini proqnozlaşdırır? - Biologiya

Səth plazmon rezonansı (SPR) fotonların metal-dielektrik interfeysində hərəkət edən səth elektron sıxlığı dalğasına enerji qoşmaq üçün edildiyi bir hadisədir. Birləşmə, əks olunan işığın aşağı düşməsinə səbəb olaraq, rezonans vəziyyəti kimi adlandırılan xüsusi bir enerji və impulsda baş verir. Daldırma xüsusiyyətləri interfeysdəki material xüsusiyyətlərinin bir funksiyasıdır, buna görə də çökmənin monitorinqi yerli səth mühiti haqqında məlumat verir. Son illərdə SPR texnologiyasında miniatürləşdirmə, artan həssaslıq, yüksək ötürmə qabiliyyəti və multimodal yanaşmalar istiqamətində təkan müşahidə edilmişdir. Bu dissertasiya SPR biosensorlarının işini yaxşılaşdırmaq üçün iki üsula diqqət yetirir. Birincisi, SPR həssaslığı səthi plazmon bant boşluq strukturunun istifadəsi ilə yaxşılaşdırılır. Burada göstərilir ki, SPR biosensorunu bucaqlı sorğu rejimində belə bir zolaq aralığının kənarına yaxın işləmək eyni şəraitdə düz metal səthdə SPR ilə müqayisədə həssaslığın altı dəfə artması ilə nəticələnəcək. İkincisi, təsvirin işlənməsinə əsaslanan yeni məlumatların təhlili texnikasından istifadə edərək aşkarlama limitinin təkmilləşdirilməsi üsulu göstərilir. Səthdən spektr-bucaq dispersiyanın 2-ölçülü görüntüsünü yaratmaq üçün multimodal səth plazmonu sorğulama texnikasından istifadə edilir, daha sonra spektr-bucaq məlumatından istifadə etmək üçün hazırlanmış öz vektor analiz texnikasından istifadə edərək səth mühiti haqqında məlumat çıxarmaq üçün istifadə olunur. Spektro-bucaq məlumatlarında ikiqat proyeksiya metodu (DPM) kimi təyin edilmiş yeni öz vektor texnikasından istifadə edərək, daha üstün olan 5x10-9 qırılma əmsalı vahidi (RIU) nəzəri aşkarlama həddi ilə geniş dinamik diapazonda sındırma indeksi qiymətləndirmələri əldə edilir. hazırkı ən yüksək həssaslıq mərhələsinə əsaslanan üsullara. Eksperimental iş real vaxt rejimində kiçik molekulyar ağırlıqlı reaktivlərlə (~ 400 Dalton) biomolekulyar qarşılıqlı təsirləri 2x10-6 RIU əldə edilmiş qətnamə ilə izləyə bilən DPM metodunu göstərir.


Səth plazmonunun rezonans tədqiqi: təmizlənmiş biomolekullardan bütöv hüceyrələrə qədər

Səth plazmon rezonansı (SPR) 1980-ci illərdə ilk SPR əsaslı immunosensorun ixtirasından bəri biomolekullar arasında bağlanma kinetikasını ölçmək üçün yaxşı tanınan etiketsiz bir texnikaya çevrilmişdir. SPR analizinin ən populyar və ənənəvi formatı, liqand molekullarını ehtiva edən məhlul təmizlənmiş reseptor molekulları ilə funksionallaşdırılmış sensor substratı üzərindən axan zaman real vaxtda optik siqnalları izləməkdir. Son illərdə bir neçə növ SPR görüntüləmə texnikasının sürətli inkişafı yüksək məkan və zaman ayırdetmələri və etibarlı həssaslıqla tək canlı hüceyrələr daxilində yerli kütlə sıxlığının dinamik paylanmasını xəritələşdirməyə imkan verdi. Bu cür qabiliyyət dərhal mühüm biomolekullar və bütöv hüceyrələr arasındakı qarşılıqlı əlaqəni etiketsiz, kəmiyyət və tək hüceyrəli şəkildə araşdırmağa imkan verdi və hüceyrə əsaslı SPR bioanalizinin maraqlı yeni tendensiyasına gətirib çıxardı. Bu Trend məqaləsində biz ilk növbədə prizma və obyektiv əsasında iki növ SPR təsvir texnikasının prinsipini və texniki xüsusiyyətlərini təsvir edirik. Sonra biz həm fundamental hüceyrə biologiyasında, həm də dərman kəşfində bütöv hüceyrə əsaslı tətbiqləri araşdırırıq. Məqaləni şərhlər və gələcək inkişaf perspektivləri ilə yekunlaşdırırıq.

Səth plazmon rezonansı (SPR) görüntüləmə üsullarında son inkişaflar tək canlı hüceyrələr daxilində kütlə paylanmasının etiketsiz xəritələşdirilməsinə imkan verir, bu, təmizlənmiş biomolekullarla funksionallaşdırılmış homojen substratlardan fərdi canlı hüceyrələri ehtiva edən heterojen substratlara qədər biomolekulyar qarşılıqlı əlaqə tədqiqatlarında böyük genişlənməyə səbəb olur.


İmmobilizasiya edilmiş papain əsasında sistatinin təyini üçün səthi plazmon rezonans görüntüləmə (SPRI) sensoru

Sistatinin spesifik təyini üçün Səth Plazmon Rezonans Görüntüleme (SPRI) sensoru işlənib hazırlanmışdır. Sensorda sistatini məhluldan bağlayan immobilizasiya edilmiş papain var. N-Hidroksisuksinimid (NHS) və N-Etil-N-(3-dimetil aminopropil)karbodiimid (EDC) ilə aktivləşdirilmiş papain aminlə dəyişdirilmiş qızıl səthində hərəkətsizləşdirilib. Sisteamin qızıl səthinin modifikasiyası üçün istifadə edilmişdir. Papain konsentrasiyası və qarşılıqlı pH optimallaşdırıldı. 1,5 μg mL-1 papain konsentrasiyası və 6,5 pH optimal olaraq seçilmişdir. Qarşılıqlı təsirin spesifikliyi insan albumini ilə qarşılıqlı əlaqənin olmaması ilə təsdiqləndi. Sensorların dinamik cavab diapazonu 0 və 0,6 μg mL-1, aşkarlama həddi isə 0,09 μg mL-1 arasındadır. Nəticələr yaxşı uyğunluq göstərən PETIA (hissəciklərlə gücləndirilmiş immunoturbidimetrik analiz) metodu ilə müqayisə edilərək təsdiq edilmişdir. Toyuq yumurtasının ağı sistatin və ya Sistatin C-nin kalibrləmə əyrisi istifadə edilmişdir. Sensorların potensialını nümayiş etdirmək üçün sistatin C qan plazmasında, sidikdə və tüpürcəkdə təyin olundu və ədəbiyyatda verilən məlumatlarla yaxşı uyğunlaşdı. Lösemidən əziyyət çəkən insanların qan plazmasında sistatinin konsentrasiyasına dair nəticələr sistatinin normal səviyyəsindən aşağı olduğu müəyyən edilmişdir.

Protein və peptid məktubları

Başlıq: İmmobilizasiya edilmiş papain əsasında sistatinin təyini üçün səthi plazmon rezonans görüntüləmə (SPRI) sensoru

HƏCM: 18 PROBLEM: 1

Müəllif(lər):E. Gorodkiewicz və J. Luszczyn

Mənsubiyyət:Elektrokimya şöbəsi, Kimya İnstitutu, Bialystok Universiteti, Al.J.Pilsudskiego11/4, 15-443 Bialystok, Polşa.

Xülasə: Sistatinin spesifik təyini üçün Səth Plazmon Rezonans Görüntüleme (SPRI) sensoru işlənib hazırlanmışdır. Sensorda sistatini məhluldan bağlayan immobilizasiya edilmiş papain var. N-Hidroksisuksinimid (NHS) və N-Etil-N-(3-dimetil aminopropil)karbodiimid (EDC) ilə aktivləşdirilmiş papain aminlə dəyişdirilmiş qızıl səthində hərəkətsizləşdirildi. Sisteamin qızıl səthinin modifikasiyası üçün istifadə edilmişdir. Papain konsentrasiyası və qarşılıqlı pH optimallaşdırıldı. 1,5 μg mL-1 papain konsentrasiyası və 6,5 pH optimal olaraq seçilmişdir. Qarşılıqlı təsirin spesifikliyi insan albumini ilə qarşılıqlı əlaqənin olmaması ilə təsdiqləndi. Sensorların dinamik cavab diapazonu 0 və 0,6 μg mL-1, aşkarlama həddi isə 0,09 μg mL-1 arasındadır. Nəticələr yaxşı uyğunluq göstərən PETIA (hissəciklərlə gücləndirilmiş immunoturbidimetrik analiz) metodu ilə müqayisə edilərək təsdiq edilmişdir. Toyuq yumurtasının ağı sistatin və ya Sistatin C-nin kalibrləmə əyrisi istifadə edilmişdir. Sensorların potensialını nümayiş etdirmək üçün qan plazmasında, sidikdə və tüpürcəkdə sistatin C təyin olundu və ədəbiyyatda bildirilən məlumatlarla yaxşı uyğunlaşdı. Lösemidən əziyyət çəkən insanların qan plazmasında sistatinin konsentrasiyasına dair nəticələr sistatinin normal səviyyəsindən aşağı olduğu müəyyən edilmişdir.


Nəticələr və Müzakirələr

Qrip A Virusunun və Silisium Nanohissəciklərinin SPRM Görünüşü.

Şəkil 2A müxtəlif ölçülü silisium nanohissəciklərinin və H1N1 qrip A virusunun SPRM şəkillərini göstərir. SPR görüntüsü səthə həssas olduğundan, yalnız səthdə və ya səthə çox yaxın olan hissəciklər görünür. Ədəbiyyata görə, A qripinin viral hissəciklərinin ölçüləri 90-110 nm arasında dəyişir (4). Silisium nanohissəcikləri də mikroskopun difraksiya həddindən kiçikdir və ötürücü təsvirdə görünmür. Həm viral, həm də silisium nanohissəciklərinin SPR şəkilləri maraqlı V formalı difraksiya nümunəsi olan parlaq ləkələr kimi göstərilir. Bu nümunə səthi plazmon dalğalarının nanohissəciklər tərəfindən səpilməsi ilə bağlıdır ki, bundan sonra ətraflı danışılacaq.

(A) H1N1 qrip A virusunun və PBS tamponunda üç müxtəlif ölçülü silisium nanohissəciklərinin SPRM şəkilləri. (Daxildir) Ədədi simulyasiya ilə yaradılan nanohissəciklərin təsvirləri. (BC) X və Y istiqamətləri üzrə seçilmiş hissəciklərin SPR intensivliyi profilləri (şəkildə kəsikli xətlərlə göstərilir) A, müvafiq olaraq. (Daxildir) Simulyasiya edilmiş şəkillərdən müvafiq profillər.

Məkan Rezolyusiya.

Şəkil 2 BC seçilmiş viral və silisium nanohissəciklərinin müvafiq olaraq (Y) və (X) səthinə perpendikulyar Plazmonun yayılma istiqaməti boyunca təsvir intensivliyi profillərini göstərir (Şəkil 2-də kəsikli xətlərlə işarələnmişdir).A). Hissəciklərin ölçüsündən asılı olmayaraq, perpendikulyar istiqamət profilləri təxminən 0,5 μm yarı maksimumda (FWHM) tam eni göstərir ki, bu da optik difraksiya həddi ilə bağlıdır. 632 nm lazer və NA 1,65 obyektivli mikroskopun nəzəri difraksiya həddi 0,23 mkm-dir və iki rəqəm arasındakı fərq ondan ibarətdir ki, bizim qurğumuzda düşən lazer şüası obyektivin bütün aperturasını tam əhatə etmir və nəticədə daha kiçik ölçülüdür. effektiv ədədi diafraqma (şək. 1). Səth plazmonunun yayılma istiqaməti boyunca intensivlik profili intensivliyin təqribən 3 μm çürümə uzunluğu ilə pozulduğunu göstərir. İntensivliyin tənəzzülü səthi plazmon dalğalarının sonlu yayılma uzunluğunu ölçür (şək. 2).C), metalın növündən və düşən işığın dalğa uzunluğundan asılıdır. Məsələn, 532 nm işıqdan istifadə edildikdə, yayılma uzunluğu suda qızıl üçün təxminən 0,2 μm-ə qədər azalır, difraksiya həddinə yaxındır (16). Optik sistemin müdaxilə nümunələrinin yaratdığı intensivlikdəki salınımlar tez-tez müşahidə olunur, lakin onlar mikroskopun x və ya y tərcüməsi ilə hərəkət etmir və həqiqi nümunə xüsusiyyətlərindən asanlıqla ayrıla bilər.

SPRM eksperimentinin sxemi (miqyaslı olmayan rəsm). Quraşdırmanın ətraflı təsviri ilə tanış ola bilərsiniz Materiallar və metodlar.

Difraksiya nümunəsi.

Fərdi hissəciklərlə əlaqəli difraksiya nümunələri fon səs-küylərindən və müdaxilə nümunələrindən nanohissəcikləri müəyyən etmək üçün bizə kömək edir. Nanohissəciklərin ədədi simulyasiya edilmiş SPRM şəkilləri (Şəkil 2A Daxildir) nümunələrin səthi plazmon dalğalarının nanohissəciklərin yaratdığı səpilməsi ilə bağlı olduğunu təsdiqləyin. Hesablanmış xətt profilləri (Şəkil 2 BC Daxildir) ölçülmüş profillərlə yaxşı uyğunlaşın. Bundan əlavə, difraksiya nümunəsinin hesablanmış pik intensivliyi hissəcik ölçüsü ilə artır, bu da eksperimental məlumatlarla uyğundur.

Virus-səthi qarşılıqlı əlaqə.

Zamanla hissəcik şəkillərini izləməklə biz virus-səth qarşılıqlı təsirlərinin müxtəlif növlərini fərqləndirə bilərik. Biz üç fərqli səthdə qrip virusunun SPRM şəkillərini əldə etdik: çılpaq qızıl, PEG-funksional səth və antiinfluenza funksionallaşdırılmış səth. şək. 3A qızıl üzərində A qripi hissəciklərinin SPRM şəkillərinin vaxt ardıcıllığını göstərir. Bu ardıcıllığın videosu (Movie S1) mövcuddur. Viral hissəciklərin qızıl səthə yapışması viral məhlulun tampon məhluluna hopdurulmasından dərhal sonra müşahidə olunur. Bunun əksinə olaraq, silisium nanohissəcikləri səthə yapışmır və Brownian hərəkəti səbəbindən təsvirdən görünür və yox olur (bax. Film S2).

Çılpaq qızıl üzərində A qrip virusunun SPRM şəkilləri. (A) Qrip Virusunun SPRM təsvir ardıcıllığı. Rəng xəritəsi mDeg-də nisbi SPR təsvir intensivliyini göstərir. (B) SPR intensivliyi zaman keçdikcə fərdi viral hissəciklərin qızıl səthinə adsorbsiya olunduğu bölgələrdə (düzbucaqlılarla göstərilir) dəyişir.

şək. 3B üç nümayəndəsi viral hissəciklərin orta intensivliyini göstərir (şəkil 3-də kəsikli düzbucaqlılar kimi göstərilmişdir.A) çılpaq qızıl səthdə zamanla. SPRM görüntüsündə viral hissəciklərin göründüyü anlar oxlarla göstərilir. Viral hissəcik səthə dəydikdən sonra səthdə qalır ki, bu da viral hissəciklərin qızıl üzərində güclü və geri dönməz qeyri-spesifik adsorbsiyasını göstərir.

Bunun əksinə olaraq, virus PEG və antikorla örtülmüş səthlərdə tamamilə fərqli davranır. şək. 4A iki səthdə fərdi qrip A viral hissəcikləri üçün zamanla tipik SPRM intensivliyi profillərini göstərir. On the PEG-functionalized surface, the individual viral particles are imaged only as transient events—they appear and disappear rapidly, which is completely different from the behavior on the bare gold surface. This observation is expected because PEG coating is well known for its capability to block nonspecific binding of biomolecules to surfaces. The transient appearance and disappearance of the viral particles on the PEG-coated surface is due to Brownian motion. On the antibody-functionalized surface, the behavior of the viral particles is in between the two limits described above. We observed that individual viral particles tended to stay on the surface for much longer time than on the PEG-coated surface, but they eventually leave the surface. This observation can be attributed to a reversible binding of the viral particles to the antibody-coated surface.

(A) SPR intensity vs. time profiles for influenza A viral particles on PEG and antiinfluenza A antibody-functionalized surfaces. (B) Histogram showing relative binding probabilities of influenza A on PEG and antiinfluenza A antibody-functionalized surfaces. The analysis of control experiment, HCMV on antiinfluenza A antibody-functionalized surfaces, is also shown for comparison. Note the vertical axis of the histogram is the probability of a particle stays on the surface (determined from the time profiles similar to A).

By tracking the individual viral particles in the SPRM image over time, we obtain the probabilities of individual influenza particles staying on the PEG and antiinfluenza-coated surfaces (Fig. 4B). For comparison, the statistical analysis of human cytomegalovirus (HCMV) on the antiinfluenza antibody-coated surface is also plotted in Fig. 4B. The histogram clearly shows that the specific binding of influenza A on the antibody-coated surface is significantly higher than the nonspecific bindings in the two control experiments, influenza A on the control PEG surface and the control virus, HCMV, on the antibody surface.

The single virus detection with our SPRM was carried out in a static solution, but the findings are consistent with those obtained with the conventional flow-through SPR measurement using samples with the same concentrations (Fig. S1). For example, the injection of 0.1 ml of 0.05 mg/ml influenza A solutions at a flow rate of 30 μl/ min resulted in a large irreversible binding of the virus on the bare gold chip, which is due to strong nonspecific interactions between influenza A and gold surface. On a PEG-functionalized chip, no virus binding was detected by the flow-through SPR. On an antibody-coated chip, approximately 45 mDeg SPR angular shift was observed, which is in between the two extremes. Finally, the flow-through SPR detected no significant binding of HCMV (0.25 mg/ml) onto the antiinfluenza A-coated chip.

Quantitative Analysis of Influenza A Size and Mass.

Mass is a fundamental physical parameter of substances, and precise measurement of mass is one of the most important analytical methods, such as mass spectroscopy (17). A widely used method to measure virus mass is based on ultracentrifugation, which determines the averaged mass of virus in a sample from density gradient sedimentation (18, 19). SPR measures the optical mass of each viral particle, which is directly related to the inertia mass of the particle. To determine the mass of influenza virus, we used silica nanoparticles with a refractive index of 1.46 as calibration standard. The refractive index of influenza based on its protein and lipid contents is approximately 1.48, close to that of the silica nanoparticles. Dry influenza consists of 70 to 75% proteins and 20 to 24% lipids (20), and the mass density of hydrated influenza virus is 1.19 g/ml (20, 21). At such a mass density, the refractive index of a protein solution is 1.48 (22), and the refractive index of lipids is similar (23). Based on these considerations, the refractive index of influenza virus was taken to be 1.48.

We measured the intensities of the individual nanoparticles from the SPRM images and constructed histograms for silica nanoparticles and influenza viral particles (Fig. 5A). The histograms of the silica nanoparticles can be approximately fit with Gaussian distributions, but a small peak appears at an intensity twice of the main peak in each histogram (arrows in Fig. 5A). We attributed it to the formation of nanoparticle dimers. Şəkil 5B plots the relative SPRM intensity at the peak of each histogram vs. silica nanoparticle volume determined from the size and density provided by the manufacturers for each particle sample (Table S1). The intensity of a nanoparticle is expected to be proportional to the volume of the particle exposed in the evanescent field associated with the propagating surface plamsons. By considering that the evanescent field decays exponentially with distance from the surface, we express the intensity with [1] where k is a constant (fitting parameter), z is distance above the gold surface, r is radius of the particle, and l is the decay constant of the evanescent field, which is approximately 200 nm. Eq. 1 provides a good fit to the experimental data shown in Fig. 5B (solid line).

(A) Histograms of relative SPR intensity distributions of individual silica nanoparticles and influenza A viral particles. The solid red lines are Gaussian fittings of the distributions. Arrows indicate peaks that are likely due to the formation of dimmers. (B) Calibration curve of SPR intensity plotted vs. particle volumes. The average volume of an influenza particle is obtained from the calibration curve and the average SPR intensity in the histogram plotted in A. The vertical error bars are standard deviations of the Gaussian fittings of the histograms of the SPR intensities. The horizontal error bars for the silica nanoparticles are standard deviations calculated from the coefficient of variation of particle diameter given by the manufacturers, and the horizontal error bars for the influenza are estimated from the standard deviation of the volume extracted from the SPR intensity.

From the calibration curve shown in Fig. 5B and the histogram in Fig. 5A, the volume and diameter of influenza A were found to be 6.8 ± 3.0 × 10 -4 μm 3 and 109 ± 13 nm, respectively. Given that the mass density of influenza A is 1.19 g/ml (19), the mass of influenza A virus was determined to be 0.80 ± 0.35 fg, which is in good agreement with the literature values (4, 20, 21) (see SI Əlavəsi for details).

Using the same method, we also obtained the histogram of SPRM image intensity for HCMV viral particles (Fig. S2). Using the calibration curve in Fig. 5B, we find that the average volume and diameter of a HCMV viron are 5.4 ± 0.7 × 10 -3 μm 3 and 218 ± 10 nm (assuming the refractive index of HCMV is 1.48), respectively, which are in consistent with the literature (approximately 230 nm diameter) (24). Using a reported density of 1.219 g/ml (25), we calculated that the mass of each HCMV viron is 6.5 ± 0.8 fg.

Detection Limit.

Fig. S3 shows the noise level of current setup. The noise level for an area covering a single particle image (∼3 × 5 μm) is 0.3 mDeg. Most SPR detections have time resolution of about one second. Using a one-second moving average, we can reduce the noise to 0.04 mDeg. This noise level, according to the calibration curve in Fig. 5, can detect 13 nm nanoparticles, corresponding to a detectable mass of approximately 1 × 10 -18 g (1 ag).

A more useful way to define the detection limit is detectable mass per unit sensing area, because it is directly related to the detectable analyte concentration in solution, an important quantity for most applications. This detection limit definition also allows one to compare sensors with different sensing areas. For instance, a small sensor may have a lower total mass detection limit, but its small sensing area makes it less likely to detect the analyte molecules. For our current SPRM setup, the entire image area is the sensing area, which is 0.08 × 0.06 mm 2 , so the binding of a single particle with mass as small as 1 ag on the sensing area can be detected. In terms of mass per unit area, the achieved detection limit is 0.2 fg/mm 2 , which is nearly four orders of magnitude better than the typical detection limit of the conventional SPR (15). This improved detection limit is provided by our capability of imaging single viral particles, which allows us to average signals in the regions of viral particles only so that noises in all other regions do not affect the signals of the particles. We note that further improvement in the detection limit may be achieved by using less noisy light source and CCD and by reducing mechanical vibrations of the system.


Biophysics uses biophysical instrumentation to characterize macromolecules in solution and study molecular interactions. The platform uses mass spectrometry for protein identification and small molecule identification and quantification and performs quality control of recombinant proteins for optimized data quality in downstream applications.

The platform ensures proper instrument function with routine maintenance and checks for high standards of performance.

As an active member of the ARBRE-MOBIEU EU network, a cluster of biophysics facilities across Europe, the platform contributes to improving information exchange, development and evaluation of new technologies.

  • State of the art instrumentation UV-VIS spectrophotometer: Protein/nucleic acid quantification. Enzyme kinetics.
  • Circular Dichroism (CD): Information about secondary structure and protein stability.
  • Fluorescence Spectroscopy (FS): Binding studies.
  • Differential Scanning Fluorimetry (DSF): Thermal stability of globular proteins. Protein quality controls (optimal buffers for downstream applications, storage conditions).
  • Dynamic Light Scattering (DLS): Sizes and distributions of biomolecules in solution.
  • Size Exclusion Chromatography coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS): Absolute molar mass determination.
  • MicroScale Thermophoresis (MST): Measurement of binding interactions.
  • Isothermal Titration Calorimetry (ITC): Thermodynamic technique to study different binding events.
  • Surface Plasmon Resonance (SPR): Measurement of biomolecular interactions in real time.Provides kinetic information (khaqqında və koff rates). Screening of low molecular weight analytes.
  • Mass spectrometer (ESI-TOF MS).: Protein identification. Small molecule identification and quantification.


Videoya baxın: Valentlik (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Werian

    Əlbəttə. Və mən bununla üzləşmişəm. Bu mövzuda ünsiyyət qura bilərik.

  2. Aineislis

    Yaxşı fikirdir. Sizi dəstəkləməyə hazırdır.

  3. Wambleesha

    Absurdlik nə

  4. Cynric

    Bu mövzuda çoxlu məlumatı olan bir sayta baxmağı təklif edirəm.

  5. Favian

    Bir tendensiya müşahidə etdim ki, bloqlarda çoxlu qeyri-adekvat şərhlər peyda oldu, başa düşə bilmirəm, kimsə bunu belə spam edir? Bəs niyə kiməsə piç etmək üçün))) IMHO axmaq ...

  6. Kazranris

    Siz çox istedadlı insansınız



Mesaj yazmaq