Məlumat

16.2: Mikro-hesabat 1- Seçici örtük təcrübəsi - Biologiya

16.2: Mikro-hesabat 1- Seçici örtük təcrübəsi - Biologiya



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Rəqəm hər bir mikro hesabatın mərkəzindədir. Ləkəli örtük təcrübəsinin bu çox panelli fiquru qabaqcıl laboratoriya sinfində tələbələr tərəfindən hazırlanmışdır.

Şəklin aşağıdakı xüsusiyyətlərinə diqqət yetirin:

  • Plitələr eyni istiqamətə yönəldilmişdir ki, onları asanlıqla müqayisə etmək olar
  • Ştammlar və media etiketlidir. Ştam adları şəklin özündə istifadə edilə bilər və ya əfsanədə müəyyən edilmiş kodla göstərilə bilər.
  • Ştamm adları ştammların genotipləri qeyri-müəyyən olduqda istifadə olunur (sizin təcrübəniz). Bu rəqəm genotiplərin məlum olduğu bir təcrübənin nəticələrini təqdim edir.
  • Oxucu media və təcrübə haqqında əlavə təfərrüatlar üçün M&M bölməsinə müraciət etməlidir.

Mikro-hesabat 1 üçün xüsusi təlimatlara əməl edin.

Məqsəd: BY4742 ştamından əldə edilən üç maya ştammınız var. Bir cümlə ilə bu təcrübədə nə etməyə çalışırsınız?

Materiallar və metodlar: M&M hazırlayarkən özünüzdən soruşun: “Təcrübələrimizi təkrar etmək üçün müstəntiqə hansı məlumat lazımdır?” İstifadə etdiyiniz ştammlar və media, həmçinin ləkələmə üçün istifadə etdiyiniz prosedurlar haqqında məlumat verin.

Ştammlar: Suşlarınızın adlarını, həmçinin BY4742 ana ştamının genotipini daxil edin.

Media: Təcrübələrdə istifadə etdiyiniz mədəniyyət mühitini müəyyənləşdirin. Adlandırma konvensiyasına qərar verin - eyni nomenklatura həm şəkildə, həm də M&M-də istifadə edilməlidir. Bütün komponentləri buraya daxil etməkdənsə, medianın tərkibi üçün təlimata istinad edin.

Spot örtük: Nəticələrinizi təkrarlamağa çalışan biri sizin başlanğıc kulturalarınızın necə yarandığını (kulturalar YPD-də bir gecədə yetişdirilib) və mədəniyyətlərin ləkə lövhələri üçün necə seyreltildiyini bilməlidir (məs. steril suda 1:10 seyreltmə seriyası). 10 μL maya mədəniyyətini 90 μL suya köçürdüyünüzü bilmələrinə ehtiyac yoxdur. Oxucular hər bir ləkə üçün neçə mikrolitr istifadə edildiyini və plitələrin inkubasiyası üçün istifadə olunan şərtləri (vaxt, temperatur) bilməlidirlər.

Nəticələr və Müzakirə - Skan edilmiş lövhələrlə fiqurunuz bu bölmənin diqqət mərkəzindədir. Ar-Ge bölməsi örtük məlumatlarınızı müəyyən etmək üçün necə istifadə etdiyinizi izah edir görüşdü YMP suşlarında delesiyalar. Nəticələriniz və düşüncələrinizlə oxucunu istiqamətləndirən qısa bir hekayə təqdim edin. Sizin silmələr necə olardı MET genlər YMP suşlarınızın müxtəlif kükürd mənbələrindən istifadə etmək qabiliyyətinə təsir edirmi? Məlumatlar ştammları inamla müəyyən etməyə imkan verirmi?

A subay müxtəlif mədəniyyət mühitlərində YMP və BY4742 ştammlarının artımını sənədləşdirən xülasə məlumat cədvəli eksperimental məlumatları və nəticələrinizi bir araya gətirmək üçün yaxşı bir yoldur. böyüməsini təsvir edin görüşdü müxtəlif mediada silinmə ştammlarını və eksperimental məlumatlardan ilkin gərginlik identifikasiyalarınızı daxil edin.


In situ məməli bağırsaq mikrobiomunun metagenomik mühəndisliyi

Açıq mühitlərdə mikrob icmalarının mühəndisliyi çətin olaraq qalır. Burada biz in situ icma miqyasında üfüqi gen transferi hadisələrinin mühəndisliyi ilə genetik cəhətdən izlənilə bilən məməli mikrobiotasını müəyyən etmək və dəyişdirmək üçün istifadə olunan platformanı təsvir edirik. Bu yanaşma ilə biz nümayiş etdiririk ki, siçan bağırsağı mikrobiomunda müxtəlif taksonlar istənilən genetik yüklə birbaşa dəyişdirilə bilər. Canlı heyvanlarda in situ mikrobiom mühəndisliyi yeni imkanların öz doğma mühitlərində qurulmuş icmalara təqdim edilməsinə imkan verir.


Mücərrəd

AML-də genetik anormallıqların və fenotipik heterojenliyin bolluğu təkmilləşdirilmiş müalicələrin inkişafı üçün əhəmiyyətli problemlər yaradır. Burada əsas GAS6/AXL oxunun AML xəstə hüceyrələrində, xüsusən də kök/əcdad hüceyrələrində yüksək dərəcədə aktivləşdiyini nümayiş etdirdik. Biz əlverişli əczaçılıq xüsusiyyətlərinə və AML-nin preklinik xəstədən əldə edilən ksenotransplantasiya (PDX) modellərinə qarşı effektivliyə malik güclü, selektiv AXL inhibitoru hazırladıq. Əhəmiyyətli odur ki, AXL həssaslaşmış AML kök/progenitor hüceyrələrinin venetoklaks müalicəsinə mane olması, güclü sinergik təsirlərlə in vitro və PDX modellərində. Mexanik olaraq, təkhüceyrəli RNT ardıcıllığı və funksional qiymətləndirmə tədqiqatları AXL inhibisyonunun və ya venetoklaks ilə birlikdə potensial olaraq fərqli transkriptomik profil göstərən və mitoxondrial oksidləşdirici fosforlaşmanı maneə törədən AML kök/progenitör hüceyrələrinin daxili metabolik zəifliklərini hədəf aldığını aşkar etdi. AXL və ya BCL-2-nin inhibisyonu həmçinin leykemiya hüceyrələrinin öldürülməsində sinerji yaratmaq üçün əsas siqnal zülallarını diferensial şəkildə hədəfləyir. Bu tapıntılar AML və yüksək AXL aktivliyi olan digər xərçənglərin müalicəsinə birbaşa tərcümə təsirinə malikdir.


Nəticələr

Transgen bitkilər: sağ qalma və EkoRI irsiyyəti və ifadəsi

İlkin olaraq, doqquz müstəqil transgen tütün (Nicotiana tabacum CV. Xanthi) sığınacaq verən hadisələr yaradıldı EkoRI konstruksiyası (Şəkil 1a) xətləri aşağıda təsvir olunduğu kimi aşağı seçilmişdir. Southern blot analizi E1, E2, E3 və E4 transgen xətlərinin hiqromisin geni üçün müsbət olduğunu, E7, E8 və E9 xətlərinin isə yüksək molekulyar çəkidə zəif zolaqlara malik olduğunu aşkar etdi (Şəkil S1). Qeyri-transgen nəzarət tütünü üçün ləkədə heç bir zolaq müşahidə edilməmişdir. E6 xətti istixanada böyüdükdə sağ qalmadı və E5 xətti transgeni ifadə etmədi, bu iki xətt sonrakı təhlillərdə xaric edildi. Qalan bütün T0 Ekoİstehsal edilən RI hadisələri T. istehsal etmək üçün öz-özünə tozlandı1- və sonra T2- nəsil toxumları. Hər T0 hadisənin hər bir daxiletmə yerində hemizigot olması gözlənilirdi və transgen məhsulu poleni ablasiya edərsə, hər nəsil üçün hemizigotların və homozigot boşluqların saxlanması gözlənilirdi. Əgər EkoRI təsirli bir şəkildə ablasyon tozcuqlarının ötürülməsi hpt genin (hiqromisin fosfotransferaza, hiqromisinə müqavimət göstərən) qarşısı alınacaq və tək nüsxəli öz-özünə hazırlanmış xətt üçün gözlənilən seqreqasiya nisbəti 1:1 transgen: qeyri-transgen olacaq. Bununla belə, qadın gametofit və ya toxumun inkişafına təsir edərsə, transgen nəsil faizi aşağı ola bilər. EkoTransgen nüsxə sayı birdən çox olarsa, RI ifadəsi və ya daha yüksəkdir.

Proqnozlaşdırılan seqreqasiya nisbətini yoxlamaq üçün selektiv mühitdə nəsil analizi göstərdi ki, T2 nəsil nəsli, E3 xətti (Cədvəl S1) istisna olmaqla, hiqromisinə davamlı (hmR) və hiqromisinə həssas (hmS) fərdlərin gözlənilən 1:1 nisbətindən əhəmiyyətli dərəcədə kənara çıxdı. HmR-nin ötürülməsi E1, E3 və E4 xətləri üçün qadın vasitəsilə proqnozlaşdırılandan əhəmiyyətli dərəcədə daha az hmR fərdləri (≤1 : 1) tərəfindən müəyyən edildiyi kimi azalmışdır. Bundan əlavə, E7, E8 və E9 sətirləri populyasiyalarda hmR-nin artdığını nümayiş etdirdi, çünki müşahidə edilən nisbətlər hmR ilə hmS üçün ≥1 : 1 idi. Bütün qeyri-transgen şitillər selektiv mühitdə yetişdirildikdə öldü (Cədvəl S1) və bütün şitillər qeyri-selektiv mühitdə böyüdükdə sağ qaldı (məlumatlar göstərilmir).

Polendə, EkoRI transkripti bütün transgen xətlərdə mövcud idi, heç biri transgen olmayan nəzarət bitkilərində aşkar edilməmişdir (Şəkil 2a və S2). E1 xətti ən yüksək idi EkoRI transkript bolluğu digər transgenik xətlərə nisbətən (Şəkil 2a) və E9 xətti ən aşağı transkript bolluğuna malikdir (Şəkil S2). E7, E8 və E9 sətirləri daha da xüsusi toxumalardan çıxarıldı EkoKeçid eksperimentlərinin nəsil analizi nəticələrinə görə RI transkript analizi. Təhlil edilən bütün digər toxumalar üçün cüzi idi EkoRI transkripti aşkar edildi (Şəkil 2b). The EkoRI transkript bolluğu polendə müşahidə edilən ən aşağı siqnalın <0,5%-i olmuşdur. Bununla belə, E3 sətirindən qaynaqlanan transkript bolluğu bütün digərlərindən əhəmiyyətli dərəcədə yüksək idi (Şəkil 2b). E3 xətti vəziyyətində, bioloji təkrarlar arasında ölçmələrdə böyük fərq var idi (təkrar 1 = 0,01, təkrar 2 = 0,14 və təkrar 3 = 0,00), lakin heç bir morfoloji variasiya müşahidə edilmədi.

Bitki morfologiyası

Transgen bitkilər E1, E4 və E7 transgen xətləri tərəfindən istehsal edilən daha az biokütlə istisna olmaqla, transgen olmayan nəzarət bitkilərindən morfoloji cəhətdən fərqlənmirdi (Şəkil 3).P ≤ 0,01) (Cədvəl 1). E1 və E4 xətlərinin biokütlə istehsalı və gövdə ətrafı bütün digərlərindən əhəmiyyətli dərəcədə aşağı idi (Cədvəl 1). Transgen bitki boyu (P = 0,66), internode uzunluğu (P = 0,10) və bir çiçəklənməyə düşən çiçəklərin sayı (P = 0.50) transgen xətlər və nəzarət arasında əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənməmişdir (Cədvəl 1).

Xətt N Quru ümumi biokütlə (q) Bitki boyu (sm) Gövdə ətrafı torpaq səviyyəsindən 5 sm (sm) İnternode uzunluğu (sm) Çiçəklənməyə görə çiçək sayı
Qeyri-transgen 5 541,2 ± 27,8 a 146.5 ± 0.8 5,3 ± 0,1 a 6.2 ± 0.4 28 ± 3
E1 5 394,4 ± 21,5 c 140.3 ± 1.0 4,6 ± 0,1 c 6.4 ± 0.5 28 ± 3
E2 5 529,3 ± 60,0 ab 146.0 ± 1.0 5,0 ± 0,04 ab 7.3 ± 0.6 31 ± 3
E3 5 528,0 ± 17,0 ab 145.7 ± 2.5 5,1 ± 0,1 a 7.7 ± 0.3 27 ± 2
E4 5 382,2 ± 31,0 c 148.4 ± 0.7 4,7 ± 0,0 bc 7.2 ± 0.8 27 ± 3
E7 5 434,6 ± 30,3 e.ə 145.9 ± 1.8 5.0 ± 0.1 abc 6.6 ± 0.5 26 ± 3
E8 5 449,6 ± 25,6 abc 143.5 ± 1.9 5,0 ± 0,0 ab 7.7 ± 0.5 32 ± 4
E9 5 516,4 ± 44,6 ab 137.4 ± 0.5 5.0 ± 0.0 abc 5.7 ± 0.5 31 ± 3
  • Sütundakı yuxarı hərflər əhəmiyyətli fərqləri ifadə edir (Fisher's LSD, P ≤ 0.05).

Tozcuqların sayı transgen xətlər və transgen olmayan nəzarət arasında oxşar idi (Şəkil S3). Bir neçə seraxanada yetişdirilən transgen xətlər nəzarətlə müqayisədə hər podda əhəmiyyətli dərəcədə az toxum istehsal etmişdir (Şəkil 4a, P = 0,03), E4, E7 sətirləri və nəzarət arasında heç bir fərq yoxdur. Sahə şəraitində yetişdirildikdə, E1 və E4 xətləri üçün orta toxum istehsalı, görünür, aşağı idi, lakin xətlər və nəzarət arasında heç bir əhəmiyyətli fərq aşkar edilməmişdir (Şəkil 4b).

Biohəbs

İstixanada erkək steril stamensiz tütünlə (cv. ‘MS TN90’) əllə çarpazlaşdıqda, təhlil etdiyimiz bütün transgen xətlər F əmələ gətirdi.1 istixana və tarla xaçlarında toxum və cücərmə normal idi (Cədvəl 2). E1, E2 və E3 xətlərindən istifadə edilən xaçlar istixanada heç bir transgen nəsil yaratmadı, nəticədə 100% effektiv bioməhdudlaşdırma, digər xətlər isə ən azı bir transgen toxum istehsal etdi (Cədvəl 2). E4 xətti ən çox transgenik nəsli, ardından E8 və E7 xətləri istehsal etdi, lakin transgenik xətlərdən istehsal edilən bütün nəsillər >99% transgensiz idi. Hiqromisin seçimindən sağ çıxan bütün transgen nəsillər (Şəkil S4) morfoloji cəhətdən normal görünür. Bundan əlavə, bütün transgen xətlər qeyri-transgenik nəzarətlə müqayisədə polen cücərməsini azaltmışdır (P ≤ 0,01 Cədvəl 2). E4 xətti bütün transgen xətlər arasında ən yüksək polen cücərmə sürətinə malik idi.

Xətt Bioconfinement səmərəliliyi (%) Transgen nəsil Toxumlar cücərdi Toxumlar süzülür Polen cücərməsi (%)
Glasshouse MS TN90 çarpaz nəsil ekranı
Qeyri-transgen Yoxdur 0 36 860 38 800 42,33 ± 0,08 a
E1 100.00 0 38 000 40 000 18,33 ± 0,09 c
E2 100.00 0 28 310 29 800 21,25 ± 0,09 e.ə
E3 100.00 0 38 000 40 000 19,75 ± 0,04 e.ə
E4 99.12 248 38 000 40 000 30,58 ± 0,04 b
E7 99.99 1 38 000 40 000 17,58 ± 0,04 c
E8 99.77 36 22 420 23 600 17,33 ± 0,05 c
E9 99.85 17 15 200 16 000 12.50 ± 0.05 c
Sahə MS TN90 çarpaz nəsil ekranı
Qeyri-transgen Yoxdur 0 8124 9249 38.51 ± 0.05
E1 100.00 0 1690 1764 28.34 ± 0.02
E2 99.95 1 2037 2167 27.94 ± 0.03
E3 100.00 0 861 909 34.26 ± 0.04
E4 100.00 0 1021 1253 30.73 ± 0.02
  • Sütundakı yuxarı hərflər əhəmiyyətli fərqləri ifadə edir (Fisher's LSD, P ≤ 0.05).

Bütün açıq tozlanan tarla təcrübələri F1 MS TN90-dan toplanmış toxum. Tarlada əllə kəsişmə aparılmadığından, transgenlik üçün yoxlanılan toxumların ümumi sayı istixana təcrübələrində aparılan xaçlardan nəzərəçarpacaq dərəcədə az olmuşdur (Cədvəl 2). 13 733 F1 nəsil şitilləri hiqromisin mühitində yoxlanılmış, E2 xəttindən sağ qalan tək bir transgen F1 nəsli aşkar edilmişdir. E1, E2 və E4 cərgələrində istehsal olunan toxumlar 100% transgensizdir (Cədvəl 2). Nəzarət vasitələri ilə müqayisədə polen cücərmə vasitələri tarlada yetişdirilən transgen xətlər üçün bir qədər aşağı idi, lakin əhəmiyyətli fərqlər aşkar edilməmişdir (P = 0.15 Cədvəl 2).

Oxşar nəticələr çoxlu nəsillər ərzində transgen xətləri kəsilmiş transgen olmayan tütünə (cv. 'Ksanthi') keçdikdə müşahidə edilmişdir. E1, E2 və E3 xətləri heç bir transgen F istehsal etməmişdir1 nəsil, yenə də 100% bioconfinement ilə nəticələnir (Cədvəl S2). E4, E7, E8 və E9 xətləri transgenik nəsillər əmələ gətirdi, lakin bütün F1 populyasiyalar 99% transgensiz idi (Cədvəl S2). Transgen F1 E4, E7, E8 və E9 sətirlərindən olan ayrı-ayrı bitkilər BC istehsal etmək üçün yenidən kəsilmiş “Ksanti”yə çevrildi.1F1 nəsil. Bioconfinement səmərəliliyi transgenik xətt daxilində hər bir bitki üçün qeydə alınmış və bütün BC-də 99%-dən 100%-ə qədər dəyişmişdir.1F1 nəsil populyasiyaları (Cədvəl S2). F ilə həyata keçirilən bekkroslar1 E7 xəttindən olan şəxslər heç bir BC istehsal etməmişdir1F1 toxum.


Biotexnologiyada Virtual Laboratoriya Təcrübələri: Bakterial Transformasiya

Cold Spring Harbor Laboratoriyasının DNT Öyrənmə Mərkəzi bu kursu koronavirus məktəblərinin bağlanması zamanı Çində müəllim və tələbələri cəlb etmək üçün bir xidmət kimi təqdim etdi.

Bakterial transformasiya təcrübəsi orqanizmin genetik tamamlayıcısı (genotip) və onun müşahidə olunan xüsusiyyətləri (fenotip) arasında birbaşa əlaqəni göstərir. E. coli bakteriyasına antibiotik müqaviməti üçün bir gen daxil edilir. Bir gecədə inkubasiya edildikdən sonra transformasiya edilmiş bakteriyalar ampisillinin iştirakı ilə böyümək qabiliyyətinə görə məruz qalmamış bakteriyalarla müqayisə edilir.

Müddət: 1 saat, 4 dəqiqə, 4 saniyə

e coli bakteriyaları, DNT transformasiyası, DNT molekulu, Herbert Boyer, Stanley Cohen, rekombinant DNT, DNT ardıcıllığı, e coli, plazmid, ifadə

Əlaqədar Məzmun

15916. DNT transformasiyası

Stanley Cohen və Herbert Boyer, yaratdıqları rekombinant DNT molekulunu bir plazmid vasitəsi ilə E. coli bakteriyasına daxil etdilər və bununla da "çevrilmə" olaraq bilinən yad DNT ardıcıllığının mənimsənilməsinə və ifadəsinə səbəb oldular.

16705. Animasiya 34: Genlər növlər arasında köçürülə bilər.

Stanley Cohen və Herbert Boyer bakteriyaları rekombinant plazmidlə çevirir, Doug Hanahan isə transformasiyanı tədqiq edir.

16721. Bioqrafiya 34: Herb W. Boyer (1936 - )

Herb Boyer və Stan Cohen rekombinant DNT texnologiyasını "icad etdilər".

15074. Plazmid DNT-nin parçalanması, Stanley Cohen

Stenli Koen özünün və Herbert Boyerin xarici DNT-ni ehtiva etmək üçün hazırlanmış ilk plazmidi hazırlamaq təcrübəsi haqqında danışır.

15918. Transformasiya

DNT transformasiyası, DNT-nin bakteriyalara köçürülə biləcəyi təbii, lakin nadir bir hadisədir. 1970-ci ildə Morton Mandel və Akiko Hiqa E. coli-ni yad DNT-ni dəyişdirmək üçün daha "bacarıqlı" etmək üçün bir üsul kəşf etdilər. Onların kalsium xlorid üsuludur

15162. DNT-nin ardıcıllığa hazırlanması, Şeyn Yeager

Whitehead İnstitutu Genom Tədqiqat Mərkəzindən Shane Yeager, DNT-nin saxlanması və ardıcıllıq üçün hazırlanması proseslərini izah edir.

15028. Plazmidlərə maraq, Herbert Boyer

Herb Boyer, Stanley Cohen-dən və onun plazmidlərə DNT-nin vektorları kimi olan marağından danışır.

15915. İlk rekombinant DNT

Stanley Cohen və Herbert Boyerin tarixi təcrübəsi rekombinasiya edilmiş və ya "rekombinant" DNT ehtiva edən ilk xüsusi hazırlanmış orqanizm yaratmaq üçün DNT-ni kəsib yapışdırmaq üsullarından istifadə etdi.

15020. Rekombinant DNT-nin mümkün təhlükələri, Paul Berg

Paul Berg rekombinant DNT-nin mümkün təhlükələrindən danışır.

15626. Pol Berq və Stenli Koen

Herbert Boyer: Keçmiş universitet köməkçisi biotexnologiyaya çevrildi. Əksər insanlar bunun edilə biləcəyini bilmədən əvvəl DNT-ni kəsmək üzrə mütəxəssis. Stenli Koen: Anadangəlmə tənzimləyici bakterial DNT-ni çevirmək üçün plazmid adlanan DNT halqalarından istifadə etmək hiyləsini tapdı.


Nematodlar və bakterial suşlar

C. elegans Başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə bütün təcrübələr üçün istifadə edilən N2 (əcdad) ştammı J.J. Ewbank (Marsel, Fransa). TJ375 gərginliyi (gpIs1[hsp-16.2::GFP]) və mutant suşları CF1038 (daf-16 (mu86) I), GR1307 (daf-16 (mgDf50) I), NU3 (dbl-1 (nk3) V) və KU25 (pmk-1(km25) IV) Caenorhabditis Genetika Mərkəzindən (Minneapolis, Minnesota, ABŞ) əldə edilmişdir. N2 nəzarəti nematod mutantları ilə hər bir təcrübəyə daxil edilmişdir.

E. coli bu işdə istifadə edilən ştammlar patogen ştam 536 [23] və urasil çatışmazlığı olan ştam OP50 [16] idi. Bu suşların genotipik və fenotipik xarakteristikası daha əvvəl təsvir edilmişdir [19]. Enterococcus faecalis ştammı OG1RF [63] (əvvəllər adlandırılmışdır Streptococcus faecalis OG1-RF1) Dr. P. Courvalin (Paris, Fransa) tərəfindən təqdim edilmişdir.

Nematodların saxlanması və sinxronizasiyası

Nematodlar 0,1 mL LB yetişdirilmiş stasionar faza bakterial mədəniyyəti ilə toxumlanmış nematod böyümə mühiti (NGM) agar lövhələrində 25 ° C-də saxlanıldı və 18 saat 37 ° C-də 7,3 × 10 9 ± 3 × 10 8, 1,4 × sıxlıqda inkubasiya edildi. 10 10 ± 5 × 10 9 və 1,5 × 10 10 ± 2 × 10 9 CFU/boşqab üçün E. coli OP50, 536 və E. faecalis OG1RF, müvafiq olaraq. Nematodların yaşa uyğunlaşdırılmış populyasiyaları 25°C-də saxlanılan və qidalanan qravidi yetkinlərin natrium hidroksid (0,5 M son) və natrium hipoxlorit (0,96% yekun) müalicəsindən sonra bərpa edilən yumurtalardan başladıldı. E. coli OP50. Bütün analizlər vulva morfologiyasına əsasən 4-cü sürfə (L4) mərhələsinin sonunda yalnız nematodları seçməklə inkişafın sonunda ikinci dəfə sinxronlaşdırılan nematodlarla 25°C temperaturda aparılmışdır.

Sağ qalma analizləri

Sağ qalma analizləri ən azı üç nüsxədə aparıldı. Sağ qalma testləri üçün bütün nematod ştammları hazırlanmış və 25°C-də saxlanılmış, nəsli aradan qaldırmaq üçün ilk 5 gün ərzində hər gün, sonra isə hər 2-3 gün ərzində yeni lövhələrə köçürülmüşdür. Ölü nematodlar hər 24 saatdan bir vurulur. Nematod kortəbii şəkildə hərəkət edə bilməyən və ya platin məftillə yumşaq toxunuşa cavab verə bilməyəndə ölü sayılırdı. Ağarda və ya plitələrin kənarlarında basdırılmış nematodlar analizlərdən tsenzura edilmişdir. Ömür L4 sürfə mərhələsinin sonundan (yetkinliyin başlanğıcından) ölümə qədər olan vaxt kimi ölçülür.

Nematodların bağırsaqlarından bakteriyaların aradan qaldırılması

Təcrübələrdə nematodlar inkişaf etdikdə E. coli 536 və ya E. faecalis OG1RF və sonra başqa bir bakteriya ştammına köçürüldü, L4 mərhələ nematodları yuyuldu və ilkin gərginliyi bağırsaq traktından çıxarmaq üçün antibiotiklərlə müalicə edildi. Nematodlar artıq bakteriyaları səthindən çıxarmaq üçün M9 minimal duz tamponunda yuyuldu və sonra bağırsaq bakteriyalarını çıxarmaq üçün NGM-də 1 saat inkubasiya edildi. Daha sonra nematodlar M9 minimum duz tamponunda 20 μg/ml Polimiksin B antibiotiki ilə 1 saat müalicə olundu. Nəhayət, nematodlar M9 minimum duz tamponunda yuyuldu və müvafiq bakteriya ştamını ehtiva edən lövhələrə köçürüldü.Müalicəni analizlərdə iştirak edən bütün nematod populyasiyalarına tətbiq etməklə antibiotik müalicəsinin nematodların sağ qalmasına təsiri nəzərə alınmışdır. Sağ qalma təcrübələri üçün müalicə olunan nematodlar mütəmadi olaraq ilkin bakterial ştammın olmaması üçün yoxlanılırdı. Sağ qalma analizindən bir neçə nematod nümunə götürüldü, Dounce homogenizatorunda əzildi və ekstrakt koloniya müşahidəsi üçün LB agar mühitinə vuruldu (bu prosedur haqqında ətraflı məlumat üçün nematod bağırsağında canlı bakterial hüceyrələrin kəmiyyət göstəricilərinə baxın). Koloniya morfologiyası və rəngi bu işdə istifadə edilən müxtəlif bakteriya ştammları arasında birbaşa vizual ayrı-seçkiliyə imkan verdi.

Nematodların istilik şokuna davamlılığının ölçülməsi

OP50 və ya 536-da inkişaf etdirilən L4 nematodları Polimiksin B antibiotikində yuyuldu (yuxarıda nematodların bağırsaqlarından bakteriyaların aradan qaldırılmasına baxın). Sonra nematodlar bağırsaqlarında eyni bakteriya gərginliyinə malik olan nematodlardan istifadə edərək istilik şokuna davamlılığını ölçmək üçün OP50 qazonuna köçürüldü. Nematodların 25°C-də 12 saat bərpasına icazə verdikdən sonra, onlar 35°C-də 10 saat müddətinə köçürüldü. Ölü nematodlar 35°C-də 10 saatlıq inkubasiyanın sonunda qeydə alınıb. Bu analiz daxili üçlü nəzarətlərlə üç nüsxədə aparılmışdır.

Nematod istilik şok zülalının (HSP) ifadəsinin ölçülməsi

HSP ifadə ölçmə analizləri ilə həyata keçirilmişdir C. elegans nəzarəti altında bir floresan müxbiri daşıyan TJ375 gərginliyi hsp-16.2 promotor (gpIs1hsp-16-2::GFP]). Nematodlar soyuq (4°C) steril su ilə toplanmış, 2 x Fosfat Tamponlu Şoran (PBS) içində bərabər həcmdə soyuq 2% formaldehid əlavə etməklə dərhal fiksasiya edilmiş və 10 dəqiqə buz üzərində inkubasiya edilmişdir. Sabit nematodlar qravitasiya ilə çökmə yolu ilə toplandı və təhlil edilənə qədər qaranlıqda 4°C-də saxlanılan 96 quyuluq boşqaba yüklənmədən əvvəl soyuq 1x PBS-də yuyuldu. İki günlük yetkinlər birinci və ikinci gün M9 minimal duzlar tamponunda 2 dəqiqə ərzində 15 ml şahin borularında cazibə qüvvəsi ilə çökmə yolu ilə öz nəsillərindən ayrıldı, sürfələr supernatantla birlikdə çıxarıldı. Yumurtaların və sürfələrin olmaması parçalayıcı mikroskop altında yoxlanıldı. Gen reportyor səviyyələri [64]-də təsvir olunduğu kimi COPAS Biosort (Union Biometrica) ilə ölçüldü. Qısaca, qurdlar ölçü (TOF) və yaşıl (GFP) flüoresans üçün təhlil edilmişdir. Toz, qabarcıqlar və yığılmış qurdları istisna etmək üçün xam məlumatlar TOF-da (200-1000) süzüldü. Floresans məlumatları daxili təkrarlar da daxil olmaqla iki müstəqil təcrübədən əldə edilmişdir.

Nematod bağırsağında canlı bakteriya hüceyrələrinin miqdarının təyini

İki günlük köhnə nematodlar defekasiyanı dayandırmaq üçün 4 ° C-də işlənmişdir. Nematodlar bakteriyasız yeni boşqaba köçürüldü, 1,5 ml 10 -2 M MgSO-da bərpa edildi.4, və nematod cuticles artıq bakteriyalar aradan qaldırılması üçün 30 saniyə vorteks. Sonra fərdi nematodlar yenidən bakteriyasız yeni boşqaba köçürüldü və bütün bakteriyaları cuticledən çıxarmaq üçün boşqabın üzərinə sürtüldü. Daha sonra nematodlar ayrı-ayrılıqda 10-2 M MgSO-da quraşdırılmış məhlulla (B) Dounce homojenizatorunda əzildi.4. Canlı bakteriyaların miqdarı LB agarın üzərinə müvafiq seyreltmələrin vurulması ilə müəyyən edilmişdir. 37°C-də bir gecədə inkubasiya edildikdən sonra böyüyən koloniyalar sayılır.

Statistik təhlillər və rəqəmlər

Statistik təhlillər və qrafik displeylər GraphPad Software, Inc şirkətinin Prism 5.0d proqramından istifadə etməklə aparılıb. Ölçmə analizləri iki qrupun müqayisəsi üçün qoşalaşdırılmamış t-testi ilə və ya ikidən çox qrup iştirak etdikdə 1-yollu dispersiya təhlilindən (ANOVA) istifadə etməklə təhlil edilib. ) ardınca Tukey-Kramer testi kimi də tanınan, bütün qrup cütlərini müqayisə edən və qeyri-bərabər nümunə ölçülərinə imkan verən Tukey's Multiple Comparison Test (TMCT). Sağ qalma analizləri şərtləri cütlər üzrə müqayisə edərək və qeyri-bərabər təhlükə nisbətlərinə imkan verən Gehan-Breslow-Wilcoxon Testindən (GBWT) istifadə edərək təhlil edildi. Təqdim olunan məlumatlar, başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə, orta ± s.e.m.-dir. Sağ qalma analizləri üçün tipik, nümayəndəli eksperiment təqdim olunur, təkrarlar arasında əhəmiyyətli fərqin olmaması GBWT istifadə edərək təsdiq edilmişdir.


Materiallar və metodlar

Eksperimental model

HeLa hüceyrələri və HeLa Kyoto BAC hüceyrə xətləri 37°C və 5% CO-da yetişdirildi.2 DMEM yüksək qlükoza (4,5 q/l) mühitində 2 mM l -qlutamin, 100 U/ml penisilin/streptomisin və 10% fetal iribuynuzlu zərdab. Hela Kyoto BAC hüceyrə xətləri genetikində (G-418, Thermo Fisher, 400 μg/ml) seçim altında saxlanıldı.

Transfeksiya, cDNA-lar, zülalların çıxarılması və immunoblotinq

cDNA-ların və siRNA-ların transfeksiyaları istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq Lipofectamine 2000 (Life Technologies) istifadə edərək həyata keçirildi. Təcrübələr cDNA və ya siRNA-nın transfeksiyasından müvafiq olaraq 24 və 72 saat sonra aparılmışdır.

İstifadə olunan cDNA-lar aşağıdakılardır: RPL23a-GFP (RG217630, OriGene) eGFP (Clonetech) GFP-GR50 (Lee) və b, 2016 ) və Flag-VCP (Ritson və b, 2010 ) mCherry-PML bu tədqiqat üçün yaradılıb GFP-TDP43 (Zhang) və b, 2009 ) mCherry-VHL (Mateju və b, 2017 ) NLuc-GFP (Nollen və b, 2001 ) HA-Ubiquitin və Flag-Ubiquitin (en Engelsman) və b, 2003 ).

Ümumi zülalları çıxarmaq üçün hüceyrələr Laemmli nümunə tamponunda parçalandı və sonikasiya ilə homojenləşdirildi. SDS-PAGE ilə ayrılmadan əvvəl zülal nümunələri 100°C-də 3 dəqiqə qaynadılmış və β-merkaptoetanol ilə azaldılmışdır. Zülallar nitroselüloz membranlara köçürüldü və Western blot üsulu ilə analiz edildi.

Nukleolların izolyasiyası

Nukleollar əvvəllər təsvir edildiyi kimi HeLa hüceyrələrindən təcrid edilmişdir (Andersen və b, 2002 ) bəzi dəyişikliklərlə. Qısaca, birləşən HeLa hüceyrələrinin 5 × 150 mm Petri qabları üç dəfə soyuq PBS ilə yuyuldu. Hüceyrələr kazındı və 218-də sentrifuqa ilə toplandı g və 4°C-də 5 dəqiqə. Hüceyrələr daha sonra 5 ml soyuq Bufer A (10 mM Hepes pH 7.9, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl) içində yenidən dayandırıldı.2, 0.5 mM DTT, EDTA-sız proteaz inhibitorları, Roche) və buz üzərində 15 dəqiqə inkubasiya edildi. Hüceyrələr daha sonra sıx bir pestle istifadə edərək 20 dəfə homojenləşdirildi və 218-də sentrifuqa edildi. g və 4°C-də 5 dəqiqə. Supernatant sitoplazmik fraksiya şəklində toplandı, nüvələri olan qranul isə 3 ml S1 məhlulu (0,25 M saxaroza, 10 mM MgCl) ilə yenidən dayandırıldı.2, EDTA-sız proteaz inhibitorları). Yenidən dayandırılmış nüvələr 3 ml S2 məhlulu (0,35 M saxaroza, 0,5 mM MgCl) üzərində qatlanmışdır.2, EDTA-sız proteaz inhibitorları) və 1,430-da sentrifuqa edilmişdir g və 4°C-də 5 dəqiqə. Yaranan nüvə pelleti 3 ml S2 məhlulu ilə yenidən dayandırıldı və 20% amplituda 6 × 10 s partlamalarla səsləndi (Branson Digital Sonifier 450-D). Sonicləşdirilmiş nümunə 3 ml S3 məhlulu (0,88 M saxaroza, 0,5 mM MgCl) üzərinə qatlanmışdır.2, EDTA-sız proteaz inhibitorları) və 3000-də sentrifuqa edilmişdir g və 4°C-də 10 dəqiqə. Supernatant nukleoplazmatik fraksiya şəklində toplandı. Tərkibində nüvələr olan qranul 0,5 ml S2 məhlulunda yenidən suspenziya edilib, 1430 dərəcə sentrifuqa edilib. g və 5 dəqiqə ərzində 4°C-də, 0,1 ml S2 məhlulunda yenidən suspenziya edilib və Western blotting vasitəsilə nüvələrin saflığını və DRiP paylanmasını qiymətləndirmək üçün istifadə olunub.

Mədəniyyət hüceyrələri üzərində immunofluoressensiya və yaranan peptidlərin OP-puro ilə etiketlənməsi

Hüceyrələr polilizinlə örtülmüş şüşə örtükdə yetişdirildi. Soyuq PBS ilə yuyulduqdan sonra, hüceyrələr otaq temperaturunda 9 dəqiqə ərzində PBS-də 3,7% formaldehid ilə sabitləndi, sonra -20 ° C-də 5 dəqiqə soyuq aseton ilə permeabilizasiya edildi. Alternativ olaraq, hüceyrələr -20 ° C-də 10 dəqiqə ərzində buz kimi soyuq metanol ilə sabitlənmişdir. Tərkibində 3% BSA və 0,1% Triton X-100 olan PBS, birincili və ikincili antikorların bloklanması və inkubasiyası üçün istifadə edilmişdir.

Yeni sintez edilmiş zülalların etiketlənməsi göstərilən vaxt nöqtələri üçün hüceyrələri 25 μM O-propargil-puromisin (OP-puro) ilə inkubasiya etməklə həyata keçirilmişdir. OP-puro-etiketli peptidlər əvvəllər təsvir edildiyi kimi klik kimyası ilə aşkar edilmişdir (Ganassi və b, 2016 ).

Mədəniyyət hüceyrələrinin amilo-qlo boyanması

HeLa hüceyrələri örtülməmiş şüşə örtüklərə əkilmişdir. 24 saat sonra hüceyrələr ya müalicə edilməmiş, ya da əsas mətndə təsvir olunduğu kimi stresə məruz qalmışdır. Hüceyrələr daha sonra soyuq PBS ilə yuyuldu, otaq temperaturunda 9 dəqiqə ərzində PBS-də 3,7% formaldehid ilə sabitləndi və 0,2% Triton X-100 olan PBS ilə keçiriciləşdirildi. Hüceyrələr otaq temperaturunda 15 dəqiqə ərzində 0,9% NaCl-də Amylo-glo (1X) ilə boyandı və 5 dəqiqə ərzində 0,9% NaCl ilə yuyuldu. Hüceyrələr dərhal konfokal mikroskopiya ilə təhlil edildi.

Yüksək məzmunlu təsvirə əsaslanan analiz

Şəkillər Leica SP2 AOBS sistemi (Leica Microsystems) və 63 × yağlı linzadan istifadə etməklə əldə edilmişdir. PML gövdə nömrəsi, DRiP fokus sayı və PML gövdələrindəki DRiP və polyUb zülalları üçün zənginləşdirmə Scan R Analysis proqram təminatından (Olympus) istifadə edilərək təhlil edilmişdir. Birincisi, PML orqanları kənar aşkarlama alqoritmindən istifadə edərək PML siqnalı əsasında seqmentlərə bölündü. PML bədən seqmentasiyasından sonra biz hər aşkar edilmiş PML orqanında maraq doğuran zülalın orta flüoresans intensivliyini ölçdük. Bundan əlavə, zülalın orta flüoresan intensivliyi PML gövdəsini əhatə edən ərazidə ölçüldü. Fərdi PML orqanlarında zülalın nisbi zənginləşməsi PML orqanının daxilindəki orta floresans intensivliyinin PML orqanını əhatə edən bölgədəki orta intensivliyə bölünən nisbəti kimi hesablanmışdır. Qiymətlər zənginləşdirmə > 1.5 ilə PML orqanlarının hissəsini təmsil edən sütun qrafikləri kimi tərtib edilmişdir. İki quyruqlu t-iki qrup arasında zənginləşmə dəyərlərini müqayisə etmək üçün test aparıldı.

Canlı hüceyrə görüntüləmə və fotoağartmadan sonra Floresensiya bərpası

Canlı hüceyrə təsviri DeltaVision görüntüləmə sistemi və SoftWorx 4.1.2 və Leica SP8 sistemi ilə həyata keçirilib. PML-GFP HeLa Kyoto hüceyrələrində FRAP ölçmələri fırlanan diskli konfokal mikroskop (Olympus IX81), GFP-PSMA7 HeLa Kyoto hüceyrələrində FRAP ölçmələri isə Leica SP8 sistemindən istifadə etməklə həyata keçirilib.

PML-GFP HeLa Kyoto hüceyrələrində FRAP analizi üçün biz 100 × neft immersion obyektivindən istifadə etdik. Təxminən 2,02 × 2,02 μm olan bir bölgə 405 nm-də 30% lazer intensivliyi ilə 60 ms müddətində ağardıldı. Bərpa ağartmadan sonra 120 vaxt nöqtəsi üçün qeydə alınıb (600 s). GFP-PSMA7 HeLa Kyoto hüceyrələrində FRAP analizi üçün biz 63 × neftə batırma məqsədindən istifadə etdik. Təxminən 2,2-2,5 × 2,2-2,5 mkm olan bölgə 405 nm-də 30% lazer intensivliyi ilə 1 saniyə ərzində ağardıldı. Dərmansız mühitdə stressin bərpası zamanı müalicə olunmamış hüceyrələrin və ya hüceyrələrdə FRAP analizi üçün 5 saniyə ərzində 100% lazer intensivliyindən istifadə edilmişdir. Bərpa ağartmadan sonra 600 vaxt nöqtəsi üçün qeydə alınıb (600 s). Həm PML-GFP, həm də GFP-PSMA7 üçün bərpa əyrilərinin təhlili FIJI/ImageJ ilə aparılmışdır.

PML gövdəsi və ya GFP-PSMA7 ilə zənginləşdirilmiş gövdə daxilində zülalın axını ağartılmamış bölgənin dəyəri ilə ağardılmış ərazinin bərpasının kəmiyyətinin müəyyən edilməsi və xüsusi yazılmış FIJI/ImageJ rejimindən istifadə etməklə ölçüldü. Təsvirin alınması zamanı ağartılmış bölgə ümumi ağartma üçün düzəldildi. Ağartılmamış bölgədən ağartılmış bölgəyə hərəkət edən və ağardılmış bölgənin bərpasına səbəb olan molekulların miqdarını təyin etdik.

FRAP təhlilindən əvvəl biz FIJI proqram dəstinin StackReg plug-in funksiyasından istifadə edərək şəkilləri sürüşmə üçün düzəltdik. FRAP təhlili üçün istifadə olunan tənlik aşağıdakı kimidir ((Ibleach − Ibackground)/(Ibleach(t0) − Ibackground(to)))/(((Itotal-Ibackground)/(Itotal(t0) − Ibackground(to))), burada Itotal bütün hüceyrə strukturunun flüoresan intensivliyidir, Ibleach ağartma sahəsindəki flüoresan intensivliyini və Ibackground kamera ofsetinin fonunu təmsil edir. Orta və standart kənarlaşmanı əldə etmək üçün FRAP əyriləri orta hesablanmışdır. Floresan sıxlığı analizi FIJI/ImageJ istifadə edərək və xüsusi maraq bölgəsini (ROI) seçərək həyata keçirilib.

Koloniya formalaşması analizi

Koloniya formalaşması təhlili əvvəllər təsvir edildiyi kimi aparıldı (Crowley və b, 2016). Qısaca olaraq, toxum əkdikdən 24 saat sonra HeLa hüceyrələri ya müalicə edilməmiş, ya da əsas mətndə təsvir olunduğu kimi proteotoksik stresə məruz qalmışdır. Hüceyrələrin daha sonra stresdən sağalmasına və 37°C, 5% CO-da koloniyalar yaratmasına icazə verildi.2 10 gün ərzində. Sonra koloniyalar otaq temperaturunda 100% metanol ilə 20 dəqiqə sabitlənmiş və 5 dəqiqə ərzində 25% metanolda 0,5% kristal bənövşəyi ilə boyanmışdır.

Kəmiyyət və statistik təhlil

Bütün statistik təhlillər birtərəfli ANOVA, ardınca üç və ya daha çox qrup arasında müqayisələr üçün Bonferroni-Holm post hoc testi və ya Tələbə testindən istifadə etməklə aparılmışdır. tDaniel's XL Toolbox-dan istifadə edərək iki qrup arasında müqayisə üçün test.


Materiallar və metodlar

Caco-2 hüceyrələrinin yetişdirilməsi

İnsan epitelial kolorektal adenokarsinoma Caco-2 hüceyrələri Alman Mikroorqanizmlər və Hüceyrə Mədəniyyətləri Kolleksiyasından (DSMZ, Cat. No. ACC 169) əldə edilmiş və müntəzəm olaraq MEM mühitində (Gibco) GlutaMAX və Earle duzları ilə keçilmiş, fetal 20% əlavə edilmişdir. serum (FCS, Biochrom), 1% əsas olmayan amin turşuları (NEAA, Gibco) və 1% natrium piruvat (Gibco) 5% CO2 37 ° C-də nəmləndirilmiş atmosfer. Hüceyrələr T-75 (Sarstedt) balonlarında 80-90% birləşənə qədər becərildi və 1/2-dən 1/10-a qədər subkultura nisbətində keçdi. Keçid üçün hüceyrələr bir dəfə DPBS (CaCl olmadan Dulbecco fosfat tamponlu salin) ilə yuyuldu.2 və MgCl2, Gibco) qalıq FCS-ni çıxarmaq və sonradan 37°C-də 5 dəqiqə ərzində 3 ml 0,05% Tripsin-EDTA (Gibco) ilə müalicə etmək. Tripsinizasiya prosesi kolbaya təzə hüceyrə mədəniyyət mühitinin əlavə edilməsi və homogen tək hüceyrəli suspenziya əldə etmək üçün hüceyrələrin yumşaq qarışdırılması ilə dayandırıldı. Keçid nisbətindən asılı olaraq, bu suspenziyanın müəyyən həcmi 10-13 ml təzə əlavə edilmiş hüceyrə mədəniyyət mühiti olan yeni kolbaya köçürüldü və hüceyrələrə yenidən birləşməyə qədər böyümək üçün müvafiq vaxt verildi.

Etika bəyanatı

Hüceyrəsizləşdirilmiş bağırsaq iskelesinin (SISmuc) hazırlanması üçün Almaniyanın Dettelbach şəhərindən olan donuz yetişdiricisi Niedermayer tərəfindən təmin edilmiş altı həftəlik donuz balalarından donuz jejunal seqmentləri eksplantasiya edilmişdir. Donuzlar 55.2-2532-2-256 saylı araşdırma altında Almaniyanın Bavariya əyalətində Aşağı Frankoniya hökuməti tərəfindən verilən icazəyə uyğun olaraq heparinizasiyadan sonra qurban verildi.

İnsanın ilkin biopsiya nümunələri Würzburg Universitet Xəstəxanasının cərrahi bölməsi (PD Dr. med. Christian Jurowich, PD Dr. med. Florian Seyfried) ilə birgə mədə bypass əməliyyatı zamanı obez yetkinlərdən toplanmış və xəstələrdən məlumatlı razılıq alınmışdır. əvvəlcədən. İnsanın ilkin toxumasının istifadəsi Julius-Maximilians-Würzburg Universitetinin insan tədqiqatları üzrə institusional etika komitəsi tərəfindən 182/10 nömrəsi ilə təsdiq edilmişdir.

3D toxuma modellərinin yaradılması və maye dinamikasının simulyasiyası

SISmuc iskelesi əvvəllər dərc edilmiş standart protokol vasitəsilə donuz bağırsaq toxumasının hüceyrəsizləşdirilməsi yolu ilə yaradılmışdır [35,36]. Qısaca olaraq, fosfat tamponlu salin (PBS, Gibco) ilə geniş yuyulduqdan sonra jejunal toxuma PBS-də yuyulma mərhələləri ilə növbə ilə 4% natrium deoksixolat (Sigma Aldrich) ilə çoxlu decellularizasiyaya məruz qaldı. Daha sonra toxuma DNase I məhlulu (Roche) ilə həzm olundu və qamma radiasiyasından istifadə edərək sterilizasiya edildi (BBFS Sterilisationsservice GmbH, Rommelhausen, Almaniya). SISmuc iskeleləri istifadə olunana qədər bu vəziyyətdə PBS-də 4°C-də saxlanıldı. 3D toxuma modellərini yaratmaq üçün skafoldlar uzununa açıldı, 2 x 2 sm ölçülü kvadratlara kəsildi və iki metal halqa arasında sabitləndi (sözdə hüceyrə tacları, Fraunhofer IGB, Stuttgart, Almaniya). Bu, keçmiş selikli qişanın səthi apikal tərəfə baxaraq effektiv şəkildə apikal və bazolateral bölmə yaratdı. Bu iskelelərin səth sahəsi əvvəllər 3,1 sm 2 [36] olduğu təxmin edilirdi və 500 μl hüceyrə mədəniyyət mühitində (MEM + 20% FCS + 1% NEAA + 1%) 3 x 10 5 Caco-2 hüceyrəsi ilə səpildi. natrium piruvat), bazolateral bölmə 1,5 ml eyni mühitlə dolduruldu. Doku modelləri daha sonra müntəzəm olaraq 5% CO-da 65 rpm-də orbital çalkalayıcıda (Celltron Infors HT) statik və ya dinamik şəkildə kultura edildi.2 21-28 gün ərzində 37 ° C-də nəmləndirilmiş atmosfer. Təzə mühit hər iki gündən bir verilir. 2D-Transwell əlavələri (polikarbonat, Ø 12 mm, 0,4/3,0 μm məsamə ölçüsü, Corning) oxşar şəkildə 3 x 10 5 Caco-2 hüceyrəsi ilə səpildi və hər ikinci gündə orta yenilənmə ilə statik olaraq becərildi. Dinamik mədəniyyət şərtləri üçün çalkalayıcının fırlanma tezliyini təyin etmək üçün maye dinamikası COMSOL Multiphysics proqram təminatından (Comsol Multiphysics GmbH, Berlin, Almaniya) istifadə edərək simulyasiya edilmiş və əvvəllər olduğu kimi İvo Şvedhelm (Toxuma Mühəndisliyi və Regenerativ Tibb, Würzburg Universitet Xəstəxanası, Almaniya) tərəfindən yerinə yetirilmişdir. təsvir edilmişdir [40].

Epiteliya maneəsinin bütövlüyünün qiymətləndirilməsi

Hüceyrə taclarında rekonstruksiya edilmiş selikli qişa toxumasının, eləcə də 2D-Transwell əlavələrində birləşən hüceyrə monolaylarının mədəniyyət və ya infeksiya zamanı maneə bütövlüyü. C. jejuni floresein izotiyosiyanat-dekstranın (FITC-dekstranın) parasellüler axınının müəyyən edilməsi ilə qiymətləndirilmişdir. Xüsusilə, 0,25 mq/ml FITC-dekstran (4 kDa, Sigma Aldrich) tərkibində 20% FCS, 1% NEAA və 1% Natrium Piruvat olan 500 μl hüceyrə mədəniyyət mühitində yenidən dayandırıldı və toxuma modellərinin apikal bölməsinə tətbiq edildi. və ya 2D-Transwells. Bundan əvvəl, bazolateral bölməni doldurmaq üçün FITC-dekstran olmadan 1,5 ml eyni mədəniyyət mühitindən istifadə edilmişdir. Həm ilkin FITC-dekstran məhlulundan, həm də təzə bazolateral hüceyrə mədəniyyəti mühitindən müvafiq olaraq müsbət və mənfi nəzarət kimi üç 100 μl nümunə götürüldü və qara rəngli 96 quyulu boşqabın ayrı-ayrı quyularına pipetlendi. Hüceyrə mədəniyyəti modelləri FITC-dekstran məhlulu ilə apikal bölmələrində 37°C-də 30 dəqiqə inkubasiya edilmişdir. Daha sonra hər bir bazolateral bölmədən üç 100 μl nümunə götürüldü və Sonsuz 200 PRO boşqab oxuyucusu (TECAN) istifadə edərək flüoresans intensivliyi ölçüldü. Saf hüceyrə mədəniyyət mühitinin avtoflüoresansı ümumi flüoresan intensivliklərindən çıxarıldı və hər bir hüceyrə mədəniyyəti modeli üçün FITC-dekstran keçiricilik dəyərləri ilkin FITC-dekstran məhlulunun flüoresans intensivliyinə nisbətən hesablandı. Mədəniyyət zamanı hər yeddi gündə bir maneənin bütövlüyü müntəzəm olaraq qiymətləndirildi. İnfeksiya təcrübələri zamanı keçiricilik eyni yoluxmuş tac üçün, eləcə də yoluxmamış nəzarət hüceyrə mədəniyyəti modelləri üçün hər 24 saatdan bir ölçüldü.

Histoloji və immunoflüoresan boyama və görüntüləmə

Histoloji boyanma üçün insan nazik bağırsaq biopsiyası nümunələri və 3D toxuma modelləri ən azı 1 saat otaq temperaturunda (RT) 2% PFA (paraformaldehid, Roth) ilə fiksasiya edilmiş, Leica ASP200S toxuma prosessoru (Leica Biosystems) istifadə edərək parafinlə yerləşdirilməsi üçün işlənmişdir. , və Leica RM2255 mikrotomundan (Leica Biosystems) istifadə edərək 5 μm qalınlığında kəsilmişdir. Deparafinləşdirmə və rehidrasiyadan sonra bölmələr Hematoksilin və Eozin ilə boyandı (H&E [94]-dən uyğunlaşdırılıb). Boyanma prosesindən sonra Leica DM4000 B mikroskopu (Leica Microsystems) ilə işıq mikroskopiyası şəkilləri əldə edildi.

İmmunofluoressensiya ilə boyanma üçün toxuma bölmələrinin deparafinizasiyası və rehidrasiyası tamamlanana qədər yuxarıda təsvir olunduğu kimi toxuma işlənmişdir. Sonradan antigenlər 20 dəqiqə ərzində 90°C-də pH 6 olan 10 mM natrium sitratda inkubasiya yolu ilə götürüldü. Üçün boyanma zamanı C. jejuniRT-də 12 dəqiqə ərzində Proteinaz K (Dako) ilə inkubasiya yolu ilə əlavə enzimatik antigen axtarışı mərhələsi tətbiq olundu. Bölmələr daha sonra RT-də 30 dəqiqə ərzində 0,5% Triton X-100 (Roth) ilə DPBS-də keçiriciləşdirildi və sonra RT-də 30 dəqiqə ərzində PBS-də 1% iribuynuzlu serum albumini (BSA, Roth) ilə bloklandı. Sonra bölmələr bir gecədə 4°C temperaturda ilkin antikor məhlulu (DCS labline) ilə rütubət kamerasında inkubasiya edildi, ardınca 3 x 15 dəqiqə PBS + 0,05% Tween 20 (Roth) ilə yuyuldu. Sonradan toxuma bölmələri DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol, Sigma Aldrich) olan müvafiq ikincili antikor məhlulu ilə RT-də 4 saat ərzində qaranlıqda inkubasiya edilmişdir. Hər biri RT-də 15 dəqiqə ərzində PBS + 0,05% Tween 20 ilə üç yuma addımından sonra nümunələr Mowiol-a (Sigma Aldrich) quraşdırılıb və z-stack skan rejimindən istifadə edərək lazer skan edən Leica TCS SP5 II konfokal mikroskop (Leica Microsystems) ilə təsvir edilib. Bütün ilkin anticisimlər 1:100 nisbətində seyreltilmiş və monoklonal siçan anti-E-kaderini (BD Biosciences, 610181), monoklonal siçan anti-okludin (ThermoFisher Scientific, OC3F10), poliklonal dovşan əleyhinə antikor daxildir.Campylobacter jejuni (GeneTex, GTX40882) və poliklonal dovşan anti-sitokeratin-18 (abcam, 1924-1). Bütün ikincili antikorlar 1:400 nisbətində seyreltildi və keçi siçan əleyhinə IgG AlexaFluor555-konjugatı (ThermoFisher Scientific, A21424), keçi anti-siçan IgG AlexaFluor647-konjugatı (ThermoFisher Scientific, AlexaFluor647-konjugatı (ThermoFisher Scientific, A12xaFluor649), Scientific, A21207), keçi anti-dovşan IgG AlexaFluor647-konjugatı (ThermoFisher Scientific, A21246).

Hüceyrə hündürlüyünün təyini

2D-Transwell insertləri və SISmuc (statik və dinamik mədəniyyət) üzərində yetişdirilmiş Caco-2 hüceyrələri üçün, həmçinin yerli insan bağırsaq toxumaları üçün hüceyrələrin orta hündürlüyü aşağıdakı kimi müəyyən edilmişdir. Dokular 2% PFA ilə bərkidildi və yuxarıda təsvir edilən immunofluoressensiya ilə boyanma proseduruna uyğun olaraq işləndi. Beş fərqli Caco-2 hüceyrə əsaslı 2D-Transwell əlavələri və toxuma modelləri (statik və dinamik mədəniyyət) üçün on konfokal mikroskop şəkli çəkilmişdir. Bundan əlavə, yerli toxumada hər ikinci hüceyrənin hüceyrə hündürlüyünü ölçmək üçün oxşar şəkildə işlənmiş kiçik bağırsaq xəstə nümunələrinin on təsviri (n = 5) istifadə edilmişdir. Ölçmələr ImageJ proqramı vasitəsilə aparılmışdır. Ümumilikdə, 2D-Transwell əlavələrində becərilmiş Caco-2 hüceyrələri üçün 269 hüceyrə, statik olaraq yetişdirilmiş Caco-2 modelləri üçün 271 hüceyrə, dinamik toxuma modelləri üçün 277 hüceyrə və yerli insan bağırsağı üçün 199 hüceyrə ölçüldü.

Caco-2 3D toxuma modellərində hüceyrə nömrələrinin təyini

Tam işlənmiş toxuma modelində (21 günlük mədəniyyət) mövcud epitel hüceyrələrinin son sayını qiymətləndirmək üçün iki üsul istifadə edilmişdir. Əvvəlcə toxuma modelləri 37°C-də 0,05% Tripsin-EDTA ilə 30 dəqiqəlik müalicəyə məruz qaldı, hüceyrələr pipet ucu ilə cızılaraq ayrıldı və nəhayət Neubauer hesablama kamerasından istifadə edərək sayıldı. 24 statik və 12 dinamik mədəniyyətli toxuma modeli üçün hüceyrə nömrələri müvafiq olaraq hesablandı (S1 və S3 Cədvəlləri). İkincisi, bir toxuma modelində mövcud olan DNT miqdarı istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq Quant-iT PicoGreen dsDNA analiz dəsti (ThermoFisher Scientific) ilə ölçüldü. Qısaca olaraq, DNT 300.000 və 600.000 Caco-2 hüceyrəsindən təcrid olunmuş və DNT miqdarını müəyyən edilmiş sayda Caco-2 hüceyrələri ilə əlaqələndirmək üçün əvvəllər müəyyən edilmiş standart əyriyə nisbətən kəmiyyəti müəyyən edilmişdir. DNT, həmçinin üç statik olaraq yetişdirilmiş Caco-2 toxuma modelindən və üç toxumsuz SISmuc iskelesindən təcrid edilib və eyni dərəcədə ölçüldü. Bu nuklein turşusu miqdarına əsaslanaraq, toxuma modellərində hüceyrə nömrələri (boş iskelelərin qalıq DNT tərkibi çıxılmaqla) hesablanmışdır (S2 Cədvəl).

Bakterial ştammlar, oliqonukleotidlər və plazmidlər

C. jejuni Bu işdə istifadə edilən ştammlar S4 Cədvəlində verilmişdir. DNT-nin klonlanması üçün istifadə olunan oliqonukleotidlər C. jejuni mutant suşlar S5 Cədvəlində verilmişdir. Plazmidlər S6 Cədvəlində verilmişdir.

C. jejuni standart böyümə şərtləri

Hamısı C. jejuni ştamlar HERAcell 150i inkubatorunda (ThermoFisher Scientific) 1-2 keçid üçün 10 μg/ml vankomisin ilə əlavə edilmiş Mueller-Hinton (MH, Becton Dickinson) agar plitələrində mikroaerob mühitdə (% CO2) müntəzəm olaraq 37°C-də yetişdirilmişdir.2, 5% O2, 85% N2). Transformasiya edilmiş klonların seçilməsi üçün agar lövhələri marker-selektiv antibiotiklərlə (20 mkq/ml xloramfenikol, 250 mkq/ml hiqromisin, 50 mkq/ml kanamisin) əlavə edilmişdir. Bakteriyalar daha sonra boşqabdan son OD-yə peyvənd olunmaqla T25 şüşələrində (Corning) Brucella Broth (BB, Becton Dickinson) maye kulturalarına köçürüldü.600 0,005 və 140 rpm və 37 ° C-də qarışdırma altında böyüdü.

Hərəkətlilik analizi

Maye mədəniyyətləri C. jejuni Tərkibində 10 μg/ml vankomisin olan BB mühitindəki ştamlar çalkalama altında orta log fazasına (OD) qədər böyüdüldü.600 0,4) mikroaerob mühitdə 37°C-də. Hər bir ştam üçün 0,5 μl bakterial kultura eksperimentdən bir gün əvvəl tökülmüş hərəkətli yumşaq-aqar plitəsinə (BB bulyonu + 0,4% Difco agar) aşılandı. Plitələr, halo əmələ gəlməsi müşahidə olunana qədər (təxminən peyvənddən sonra 12-20 saat) sağ tərəfi yuxarı inkubasiya edildi. Hər bir peyvənd üçün halo radiusu üç dəfə ölçüldü və hər boşqabdakı hər gərginlik üçün orta üzmə məsafəsini vermək üçün orta hesabla götürüldü. Hər bir ştam hər bir sınaq üçün texniki üç nüsxədə aşılanmış və hərəkətlilik təhlilləri üç müstəqil bioloji təkrarda aparılmışdır. Aralarındakı hərəkətliliyi müqayisə etmək üçün hər bir gərginlik üçün orta halo radiusu istifadə edilmişdir C. jejuni yabanı tipli və mutant suşlar.

Tikintisi C. jejuni mutant suşlarının silinməsi

mutantların silinməsi C. jejuni Bu işdə istifadə edilənlər, genomik lokusda kodlaşdırma ardıcıllığının çoxunu aradan qaldırmaq və bununla da müvafiq genləri pozmaq üçün antibiotik müqavimət kasetləri ilə ikiqat krossover homoloji rekombinasiya yolu ilə qurulmuşdur. Klonlama üçün istifadə edilən müqavimət kasetləri ya idi aphA-3 (Kan R ) [95], aph(7") (Hyg R ) [96], və ya pişik.coli (Cm R ) [97]. Qeyri-qütblü müqavimət kasetləri Kan R üçün pGG1 [58] plazmidindən HPK1/HPK2 primerləri, Hyg R üçün pAC1H [96] plazmidindən CSO-1678/CSO-1679 və ya CSO-0613/0614 primerləri ilə gücləndirilmişdir. C. jejuni Cm R üçün CSS-0643 [58] gərginliyi. Üst-üstə düşən PCR məhsulları bu müqavimət kasetlərini yanlarında daşıyırdı

Silinəcək genin yuxarı və aşağı axınında 500 bp homoloji ardıcıllıq. Məsələn, silinməsi kpsMT in C. jejuni gərginlik NCTC11168 (CSS-0032) ətraflı təsvir olunacaq. Birinci,

500 bp-dən yuxarı kpsM (Cj1448c) CSO-2009 və CSO-2008-dən istifadə edərək kodona başlayır və

500 bp aşağı axınında kpsM CSO-2011 və CSO-2010 istifadə edərək stop kodonu NCTC11168 vəhşi tipli ştammın genomik DNT-sindən gücləndirilmişdir. Aşağı axın genin başlanğıc kodonu kimi kpsT (Cj1447c) dayanma kodonu ilə üst-üstə düşür kpsM, burada yaradılmış mutant çox güman ki, inaktivasiyası ilə nəticələndi kpsT həmçinin. Kanamisin müqavimət kaseti (aphA-3) HPK1 və HPK2 istifadə edərək pGG1-dən gücləndirildi. Yuxarı və aşağı axın bölgəsini birləşdirmək üçün kpsM ilə aphA-3 müqavimət kaseti, antisens oliqonukleotidi kpsM upstream region (CSO-2008) gücləndirmək üçün istifadə olunan hiss oliqonukleotid ilə 22 bp üst-üstə düşür. aphA-3 müqavimət kaseti (HPK1). Eynilə, oliqonukleotidin hissiyyatı kpsM aşağı axın bölgəsi (CSO-2011) gücləndirmək üçün antisens oliqonukleotid ilə 26 bp üst-üstə düşür. aphA-3 müqavimət kaseti (HPK2). Son 100 μl Phusion polimeraz PCR reaksiyasında, təmizlənmiş (Macherey-Nagel NucleoSpin PCR təmizləmə dəsti) yuxarı və aşağı axın bölgələri kpsM ilə birlikdə əlavə edilmişdir aphA-3 müqavimət kaseti 50:50:90 ng nisbətində və CSO-2009 və CSO-2011 (son konsentrasiya 1 μM) ilə gücləndirilmişdir. Üst-üstə düşən PCR proqramı aşağıdakı kimi idi: 1 dövr [98°C, 1 dəq 61°C, 1 dəq 72°C, 10 dəq 98°C, 1 dəq], 40 dövr [98°C, 15 s. 57°C, 30 s 72°C, 1 dəq], ardınca 10 dəqiqə ərzində 72°C. Üst-üstə düşən PCR məhsulları agaroz gel elektroforezi ilə ölçülərinə görə yoxlanılmış və təmizləndikdən sonra alıcıya çevrilmişdir. C. jejuni elektroporasiya ilə gərginləşdirin (aşağıda təsvir olunan protokola baxın). Nəticə klonların CSO-2008 və HPK2 ilə koloniya PCR vasitəsilə yoxlanılmasından sonra final üçün müsbət klon seçildi. kpsMT silinmə gərginliyi (CSS-6198 NCTC11168 ΔkpsMT). Üçün mutantların silinməsi flaA (CSS-1512) [58], csrA (CSS-0643) [58], cas9 (CSS-3836) [78] və ptmG (CSS-2966) ilə C. jejuni gərginlik NCTC11168, eləcə də üçün flaA (CSS-2380), kpsMT (CSS-6200) və csrA (CSS-6202) 81-176 (CSS-0063) ştammı analoji yanaşmadan istifadə etməklə qurulmuşdur və oliqonukleotidlər S5 Cədvəlində verilmişdir.

sRNA lokusu CJnc180/190, promotor və terminator ardıcıllığını ehtiva edən müqavimət kasetindən istifadə istisna olmaqla, təsvir edildiyi kimi silindi. Bu müqavimət kaseti pGG1-dən JVO-5068 və HPK2termindən istifadə edərək gücləndirilmiş və CJnc180/190-ın ​​təmizlənmiş yuxarı və aşağı axın fraqmentləri ilə birlikdə tavlanmışdır. CJnc180/190-ın ​​yuxarı və aşağı axın bölgələri NCTC11168 ştamının vəhşi tipli genomik DNT-dən müvafiq olaraq CSO-0247/CSO-0248 və CSO-0249/CSO-0250 istifadə edilməklə gücləndirilmişdir. CSO-0248 və CSO-0249, qütb kanamisin müqavimət kasetinin promotor və terminator bölgəsi ilə üst-üstə düşən bölgələri ehtiva edir. H. pylori sRNA RepG [98]. Yuxarı bölgə və aşağı axın bölgəsi, eləcə də kaset PCR amplikonları daha sonra tavlandı və bütün məhsul CSO-0247 və CSO-0250 ilə gücləndirildi və elektroporasiya edildi. C. jejuni NCTC11168 vəhşi tipli gərginlik. Kanamisinə davamlı koloniyalar CSO-0246 və HPK1 istifadə edərək koloniya PZR vasitəsilə təsdiq edildi, nəticədə CJnc180/190::aphA-3 (CSS-1157).

Tikintisi C. jejuni tamamlama və həddindən artıq ifadə suşları

Bir genin silinməsini tamamlamaq və ya həddindən artıq ifadə konstruksiyasını yaratmaq üçün maraq doğuran genin vəhşi tipli bir nüsxəsi genin içərisinə daxil edilmişdir. rdxA (Cj1066) lokusu, tez-tez tamamlamaq üçün istifadə olunur C. jejuni [99]. Buna nail olmaq üçün əvvəlcə plazmidlərdə tamamlama/həddən artıq ifadə konstruksiyaları yaradıldı ki, onlar plazmidlərdə təxminən 500 bp yuxarı və aşağı axın ardıcıllığını ehtiva edir. rdxA gen, hər birində promotor və terminator olan və ya üst-üstə düşən PCR ilə yaradılan Cm R və ya Kan R müqavimət kasetləri.

Plazmid əsaslı yanaşmaya misal olaraq, konstruksiya ptmG NCTC11168 ştamında tamamlama və həddindən artıq ifadə ətraflı təsvir edilmişdir. Kodlaşdırma bölgəsi ptmG başlanğıc və dayanma kodonunun təxminən 100 nt yuxarı və aşağı axını daxil olmaqla, genomik DNT-dən gücləndirilmişdir. C. jejuni CSO-2928 və CSO-2929 istifadə edərək NCTC11168-i süzün və həzm edin XmaMən və PstI. üçün onurğa ptmG tamamlama/aşırı ifadə vektoru pST1.1 [78]-dən CSO-0762 və CSO-0493 ilə tərs PCR ilə gücləndirildi və eyni şəkildə həzm olundu (Xmamən/PstI). Plazmid onurğası və insert bağlandı və çevrildi E. coli TOP10. Klonlar CSO-0023 və CSO-2929 istifadə edərək koloniya PZR ilə təsdiqləndi və CSO-0023 (Makrogen) istifadə edərək ardıcıllıqla pSSv63.1 ilə nəticələndi. CSO-2276 və CSO-2277 ilə pSSv63.1-dən gücləndirilmiş təmizlənmiş tamamlama konstruksiyasına çevrildi. C. jejuni gərginlik NCTC11168 ΔptmG (CSS-2966) tamamlama üçün elektroporasiya yolu ilə və ya həddindən artıq ifadə üçün NCTC11168 WT (CSS-0032) ilə ptmG. Son tamamlama/aşırı ifadə klonları CSO-0023 və CSO-0349 istifadə edərək koloniya PZR və CSO-0023 istifadə edərək ardıcıllıqla yoxlanıldı, nəticədə komplementasiya ştammı C yarandı. ptmG (CSS-2978 ptmG::aph(7") rdxA::aphA-3-ptmG) və həddindən artıq ifadə gərginliyi OE ptmG (CSS-2980 rdxA::aphA-3-ptmG), müvafiq olaraq. Analoji yanaşma C CJnc180/190 üçün həyata keçirildi (CSS-1158 CJnc180/190::aphA-3, rdxA::pişik.coli-CJnc180/190) müvafiq silmə mutant suşlarında.

Üst-üstə düşən PCR ilə tamamlayıcı konstruksiyaların yaradılması (yəni, rxdA::pişik.coli-flaA, rdxA::pişik.coli-kpsMT, və rdxA::aphA-3-csrA) NCTC11168 istifadə edərək aşağıdakı kimi yerinə yetirildi flaA misal kimi. kodlayan fraqment rdxA yuxarı bölgə (təxminən 500 bp) ilə birləşdirilir pişik.coli Cm R müqavimət kaseti (promotor və terminator ilə) CSO-2276/CSO-0573 istifadə edərək pGD34.7-dən PCR ilə gücləndirildi və rdxA aşağı axın bölgəsi NCTC11168 vəhşi tipli genomik DNT-dən CSO-0347/CSO-2277 ilə gücləndirildi. The flaA gen, öz doğma promotoru [55], CSO-4744/CSO-4745 istifadə edərək NCTC11168 vəhşi tipli genomik DNT-dən gücləndirilmişdir, beləliklə, amplikonun 5'-ucu CSO-0573-ü tamamlayır və 3'- amplikonun ucu CSO-0347 ilə üst-üstə düşür. The rdxA_yuxarı-pişik.coli, flaA daxil edin və rdxA_down fraqmentləri sonra tavlandı və bütün məhsul CSO-2276 və CSO-2277 ilə gücləndirildi. Nəticədə əldə edilən PCR məhsulu elektroporasiya edildi C. jejuni NCTC11168 ΔflaA, və daxiletmə mutantları CSO-0643/CSO-0349 ilə koloniya PCR və CSO-0643/CSO-4474/CSO-3270 ilə ardıcıllıqla təsdiq edilmişdir. Eyni yanaşma Δ-nın tamamlanması üçün istifadə edilmişdirkpsMT suşlar. Δ-nı tamamlamaq üçüncsrA, kodlaşdırılmış yuxarı fraqment istisna olmaqla, oxşar yanaşma istifadə edilmişdir rdxA_yuxarı-aphA-3. Bu fraqment pST1.1-dən CSO-2276/CSO-0762 ilə gücləndirilib. The csrA hər iki ştamm üçün insertə yuxarı axın daxilində kodlanmış ehtimal olunan promotor daxildir trB diferensial RNT-seq [55] ilə müəyyən edilən lokus. Tamamlanmış csrA suşlar CSO-0023/CSO-3270 ilə koloniya PCR və CSO-0023 ilə ardıcıllıqla təsdiq edilmişdir.

-nin çevrilməsi C. jejuni elektroporasiya yolu ilə

C. jejuni NCTC11168 və ya 81-176 vəhşi tip və ya müvafiq delesiya mutantları kriyostoklardan uyğun antibiotiklərlə MH-aqar plitələrinə cizilmişdir. Bir keçiddən sonra bakteriya hüceyrələri pambıq çubuqla yığıldı və soyuq elektroporasiya məhlulunda (272 mM saxaroza, 15% (v/v) qliserin) yenidən dayandırıldı. Bakteriyalar 4°C və 6500 x-də sentrifuqalama yolu ilə yığılmışdır g 5 dəqiqə, sonra eyni məhlulda yenidən dayandırılır. İki əlavə yuyulma addımından sonra son qranul pelletin ölçüsündən asılı olaraq müvafiq kiçik həcmdə elektroporasiya məhlulunda yenidən dayandırıldı. Sonra, bu hüceyrə suspenziyasının 50 μl 200-400 ng təmizlənmiş PZR məhsulu (ümumilikdə 4 μl-dən çox olmayan) ilə qarışdırıldı və 2,5 kV, 200 Ω və 1 mm boşluqlu kyuvetdə (PEQLAB) elektroporasiya edildi (Biorad Genepulser) və 25 μF. 200 μl əvvəlcədən isidilmiş Brucella Bulyonu əlavə etməklə, hüceyrələr qeyri-selektiv MH agar boşqabına köçürüldü və mikroaerob mühitdə 37°C-də gecə ərzində bərpa edildi. Ertəsi gün bakteriya hüceyrələri pambıq çubuqla yığıldı, müvafiq selektiv MH agar boşqabına çəkildi və koloniyalar müşahidə olunana qədər (adətən 2-4 gün) mikroaerobik olaraq 37°C-də inkubasiya edildi. Klonlar koloniya PZR və ardıcıllıqla yoxlanılmış, kriyostoklar BB mühitində 25% qliserolda dondurulmuş və -80°C-də saxlanılmışdır.

3D toxuma modelinin infeksiyası C. jejuni

Caco-2 hüceyrə əsaslı toxuma modelləri, infeksiya təcrübələri üçün istifadə edilməzdən əvvəl 21 gün ərzində ya statik, ya da dinamik şəkildə becərilmişdir. C. jejuni. Toxuma modellərinin pre-kulturasından asılı olmayaraq, infeksiya ilə C. jejuni həmişə əlavə mexaniki stimullaşdırma olmadan statik şəraitdə aparılırdı. Bakteriyalar yuxarıda göstərildiyi kimi yetişdirilmiş, maye kulturadan orta log fazasında yığılmışdır (OD600 0.4) və 20% infeksiya çoxluğuna (MOI) nail olmaq üçün 20% FCS, 1% NEAA və 1% Natrium Pyruvate olan təzə hüceyrə mədəniyyət mühitində yenidən dayandırıldı. Bu bakterial hüceyrə suspenziyasından seriyalı seyreltmələr MH agar plitələrinə vuruldu. və koloniya əmələ gətirən vahidlərin (CFU) giriş miqdarını müəyyən etmək üçün mikroaerob şəraitdə 37°C-də inkubasiya edilir. Bu bakterial suspenziyalardan 500 μl toxuma modellərini apikal yoluxdurmaq üçün istifadə edildi və 5% CO-da birgə inkubasiya aparıldı.2 37 ° C-də nəmləndirilmiş atmosfer. Köçürülmə təcrübələri üçün yoluxmuş toxuma modellərinin bazolateral bölməsindən 100 μl nümunə infeksiyadan sonra göstərilən vaxt nöqtələrində (10 dəqiqədən 8 saata qədər) götürüldü və transmiqrasiya edilmiş bakteriyaların sayını müəyyən etmək üçün MH agar plitələrinə seriyalı seyreltmələr vuruldu. Toxuma modellərinə yapışan və onlara daxil olan bakteriyaları təcrid etmək üçün infeksiya infeksiyadan sonra göstərilən vaxt nöqtələrində (4-120 saat) dayandırıldı. Daha uzun vaxt nöqtələrini (24-120 saat) əhatə edən təcrübələr üçün sərf edilmiş hüceyrə mədəniyyəti mühiti gündəlik olaraq toxumanın apikal və bazolateral bölməsində 20% FCS, 1% NEAA və 1% Natrium Piruvat əlavə edilmiş təzə hüceyrə mədəniyyəti mühiti ilə dəyişdirildi. modellər. Hüceyrə ilə əlaqəli bakteriyaları toplamaq üçün hüceyrə tacları bütün yapışmayan bakteriya hüceyrələrini çıxarmaq üçün üç dəfə DPBS ilə yuyuldu. Sonradan hər tacdan iki toxuma parçası toxuma zımbası (Ø 5 mm, Kai Medical) istifadə edərək toplandı və DPBS-də 500 μl 0,1% saponin olan Eppendorf borusuna köçürüldü.Toxuma parçaları, bakteriyaları ev sahibi hüceyrələrdən təcrid etmək üçün çalkalama altında 37°C-də 10 dəqiqə inkubasiya edilmişdir. Sonra seriyalı seyreltmələr MH agar plitələrinə vuruldu, koloniyalar sayıldı və CFU nömrələri hər bir ştam üçün daxil olan CFU-ların faizi kimi hesablandı. Xüsusi olaraq ev sahibi hüceyrəni təcrid etmək üçün daxili C. jejuni, 200 μg/ml gentamisin ehtiva edən 20% FCS, 1% NEAA və 1% Natrium Piruvat ilə təzə hüceyrə mədəniyyəti mühiti hüceyrədənkənar bakteriyaları 2 saat ərzində 37°C-də öldürmək üçün toxuma modellərinin bazolateral və apikal bölməsinə verildi. Gentamisinin bu konsentrasiyası hər ikisinə məruz qalaraq müəyyən edilmişdir C. jejuni 81-176 və NCTC11168 müxtəlif vaxt dövrləri (30-240 dəq) üçün gentamisinin müxtəlif konsentrasiyalarına (10-400 μg/ml) qədər. CFU üçün örtük antibiotik müalicəsindən sağ qalan bakteriyalar üçün oxunuş kimi istifadə edilmişdir. 2 saat ərzində 200 mkq/ml ilə müalicədən sonra yabanı tipli ştamların heç biri üçün heç bir koloniya bərpa oluna bilmədi. Bundan əlavə, hər biri üçün supernatantın CFU örtüklənməsi C. jejuni Bu gentamisin müalicəsindən sonra ştamm heç bir hüceyrədənkənar bakteriyanın sağ qalmamasını təmin etdi. Hüceyrədaxili sağ qalmasını əhatə edən təcrübələr üçün C. jejuni toxuma modelində, 2 saat ərzində 200 μg/ml gentamisin ilə ilkin müalicə, 20% FCS, 1% NEAA və 1% Natrium ehtiva edən təzə hüceyrə mədəniyyəti mühiti üçün bazolateral və apikal bölmədə mühitin dəyişdirilməsi ilə izlənildi. Piruvat 10 μg/ml gentamisin ilə əlavə edilmişdir. Yenə də supernatantın CFU ilə örtülməsi bu müalicədən sonra hüceyrədənkənar bakteriyaların bərpa olunmamasını təmin etdi. Gentamisin müalicəsindən sonra yuxarıda təsvir olunduğu kimi CFU nömrələri müəyyən edilməzdən əvvəl toxuma modelləri üç dəfə DPBS ilə yuyuldu.

2D hüceyrə mədəniyyəti modellərinin (2D-monolayer və 2D-Transwell) infeksiyası C. jejuni

Ümumiyyətlə, infeksiya təcrübələri bir neçə modifikasiya ilə 3D toxuma modelləri üçün təsvir edildiyi kimi aparılmışdır. 2D-monolayer infeksiyaları üçün Caco-2 hüceyrələri birləşən hüceyrə monolayına nail olmaq üçün infeksiya təcrübəsindən iki gün əvvəl 6 quyu boşqablarına əkilmişdir. C. jejuni maye kulturada orta log fazasına qədər böyüdülmüş, hüceyrə mədəniyyət mühitində yenidən dayandırılmış və 20 MOI-də epiteliya monolayının infeksiyası üçün istifadə edilmişdir. İnfeksiyadan sonra hüceyrələr DPBS ilə üç dəfə yuyulmuş, 1 ml DPBS-də 0,1% saponin ilə parçalanmışdır. , və nəticədə hüceyrə suspenziyası MH agar plitələrində ardıcıl seyreltmələrə qoyuldu. Hüceyrədaxili bakteriyaların spesifik bərpası üçün hüceyrələr 37°C-də 2 saat ərzində 200 μg/ml gentamisinlə müalicə olundu və CFU-lar təsvir olunduğu kimi təyin olundu. Bundan əlavə, gentamisinlə müalicə olunan quyuların supernatantının CFU ilə örtülməsi antibiotik müalicəsi zamanı bütün hüceyrədənkənar bakteriyaların öldürülməsini təmin etdi. 2D-Transwell infeksiyaları üçün Caco-2 hüceyrələri polikarbonat 2D-Transwell əlavələrində (Corning, 12 mm, 3.0 μm) 21 gün ərzində 5% CO-da yetişdirildi.2 37 ° C-də nəmləndirilmiş atmosfer. Kolonizasiya edən və ya köçürülmüş bakteriyaların CFU nömrələrinin təcrid edilməsi və sadalanması yuxarıda 3D toxuma modelləri üçün təsvir edildiyi kimi həyata keçirilmişdir.

Hüceyrə mədəniyyət mühitində və infeksiya supernatantlarında böyümə əyrisinin təhlili

Böyümə davranışını təhlil etmək C. jejuni Toxuma mədəniyyəti mühitində WT ştammları, bakteriyalar əvvəlcə MH agar plitələrində, sonra isə yuxarıda göstərildiyi kimi bir gecədə BB maye kulturalarında yetişdirildi. Ertəsi gün səhər bakteriya hüceyrələri bir dəfə PBS ilə yuyuldu və son OD-yə aşılandı600 0,05-dən 50 ml hüceyrə kultura mühitinə (MEM + 20% FCS, 1% NEAA, 1% Natrium Piruvat) və mikroaerob mühitdə (10% CO) HERAcell 150i inkubatorunda (ThermoFisher Scientific) 140 rpm-də qarışdırma altında yetişdirildi.2, 5% O2, 85% N2). Nümunələr CFU/ml müəyyən etmək üçün MH-aqar üzərinə örtmək üçün peyvənddən sonra müvafiq vaxt nöqtələrində çıxarıldı. Artımını ölçmək üçün C. jejuni 3D toxuma modelləri və 2D-Transwells üzərindəki supernatantda vəhşi tipli suşlar, infeksiya təcrübələri C. jejuni NCTC11168 və 81-176 ştammları yuxarıda təsvir olunduğu kimi həyata keçirildi, istisna olmaqla, hüceyrə mədəniyyəti mühitinin gündəlik mübadiləsi aparılmadı. Peyvənddən sonra müvafiq vaxt nöqtələrində CFU/ml-ni müəyyən etmək üçün MH agar plitələrinə örtmək üçün supernatantdan 10 μl nümunə götürüldü.


Kim, Y. G., Cha, J. və Chandrasegaran, S. Hibrid məhdudlaşdırıcı fermentlər: sink barmaqlarının Fok I parçalanma sahəsinə birləşmələri. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 93, 1156–1160 (1996).

Wolfe, S. A., Nekludova, L. & Pabo, C. O. Cys2His2 sink barmaq zülalları ilə DNT-nin tanınması. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struktur. 29, 183–212 (2000).

Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K. & amp Carroll, D. Dizayn edilmiş sink barmaq nükleazları ilə gen hədəflənməsinin artırılması. Elm 300, 764 (2003).

Miller, J. C. və başqaları. Yüksək spesifik genomun redaktəsi üçün təkmilləşdirilmiş sink-barmaq nükleaz arxitekturası. Nat. Biotexnol. 25, 778–785 (2007).

Porteus, M. H. & amp Baltimore, D. Kimerik nüvələr insan hüceyrələrində gen hədəflənməsini stimullaşdırır. Elm 300, 763 (2003).

Boch, J. et al. TAL-tip III effektorların DNT bağlama spesifikliyinin kodunun pozulması. Elm 326, 1509–1512 (2009).

Moscou, M. J. & Bogdanove, A. J. Sadə bir şifrə TAL effektorları tərəfindən DNT-nin tanınmasını idarə edir. Elm 326, 1501 (2009).

Christian, M. et al. TAL effektor nükleazları ilə hədəflənmiş DNT cüt zəncirinin qırılması. Genetika 186, 757–761 (2010).

Miller, J. C. və başqaları. Effektiv genom redaktəsi üçün TALE nukleaz arxitekturası. Nat. Biotexnol. 29, 143–148 (2011).

Mahfouz, M. M. və b. Yeni dizayn edilmiş transkripsiya aktivatoruna bənzər effektor (TALE) hibrid nukleaza yeni DNT bağlama spesifikliyi ilə ikiqat zəncirli qırılmalar yaradır. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 108, 2623–2628 (2011).

Li, T. və başqaları. TAL nukleazları (TALNs): TAL effektorlarından və FokI DNT-parçalanma domenindən ibarət hibrid zülallar. Nuklein turşuları Res. 39, 359–372 (2011).

Jinek, M. et al. Adaptiv bakterial toxunulmazlıqda proqramlaşdırıla bilən ikili-RNT idarə olunan DNT endonukleaza. Elm 337, 816–821 (2012).

Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W. & Schouls, L. M. Prokaryotlarda DNT təkrarları ilə əlaqəli genlərin identifikasiyası. Mol. Mikrobiol. 43, 1565–1575 (2002).

Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonukleoprotein kompleksi bakteriyalarda adaptiv toxunulmazlıq üçün xüsusi DNT parçalanmasına vasitəçilik edir. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 109, E2579–E2586 (2012).

Cong, L. et al. CRISPR/Cas sistemlərindən istifadə edərək multipleks genom mühəndisliyi. Elm 339, 819–823 (2013).

Jeggo, P. A. DNT qırılması və təmiri. in Genetikada irəliləyişlər Cild. 38 (eds Hall, J. et al.) 185–218 (Academic Press, 1998).

Rouet, P., Smih, F. & amp Jasin, M. Nadir kəsici endonükleazın ifadəsi ilə siçan hüceyrələrinin genomuna cüt zəncirli qırılmaların tətbiqi. Mol. Hüceyrə. Biol. 14, 8096–8106 (1994).

Lukacsoviç, T., Yang, D. & amp Waldman, A. S. Maya endonükleazı I-Scel tərəfindən məməli xromosomu daxilində əmələ gələn spesifik cüt zəncirli qırılmanın təmiri. Nuklein turşuları Res. 22, 5649–5657 (1994).

Yeh, C. D., Richardson, C. D. & amp Corn, J. E. DNT təmir yollarına nəzarət vasitəsilə genomun redaktəsində irəliləyişlər. Nat. Hüceyrə Biol. 21, 1468–1478 (2019).

Haapaniemi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B. & amp Taipale, J. CRISPR-Cas9 genomunun redaktəsi p53 vasitəçiliyi ilə DNT zədələnməsinə cavab verir. Nat. Med. 24, 927–930 (2018).

Ihry, R. J. et al. p53 insan pluripotent kök hüceyrələrində CRISPR-Cas9 mühəndisliyini maneə törədir. Nat. Med. 24, 939–946 (2018).

Shen, M. W. et al. Patogen variantların proqnozlaşdırıla bilən və dəqiq şablonsuz CRISPR redaktəsi. Təbiət 563, 646–651 (2018).

van Overbeek, M. et al. DNT təmir profili Cas9 vasitəçiliyi ilə yaranan fasilələrdə təsadüfi olmayan nəticələri aşkar edir. Mol. Hüceyrə 63, 633–646 (2016).

Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera, M. D. C. & amp Yusa, K. lentiviral CRISPR bələdçi RNT kitabxanası olan məməli hüceyrələrində genom miqyasında resessiv genetik skrininq. Nat. Biotexnol. 32, 267–273 (2014).

Kosicki, M., Tomberg, K. & Bradley, A. CRISPR–Cas9 tərəfindən törədilən ikiqat tel qırılmalarının təmiri böyük silinmələrə və mürəkkəb yenidən qurulmalara səbəb olur. Nat. Biotexnol. 36, 765–771 (2018).

Adikusuma, F. et al. Cas9 parçalanması ilə səbəb olan böyük silinmələr. Təbiət 560, E8–E9 (2018).

Jasin, M. & Rothstein, R. Homoloji rekombinasiya yolu ilə tel qırılmalarının təmiri. Soyuq Bahar Harb. Perspektiv. Biol. 5, a012740 (2013).

Paquet, D. et al. CRISPR/Cas9 istifadə edərək spesifik homozigot və heterozigot mutasiyaların effektiv tətbiqi. Təbiət 533, 125–129 (2016).

Rees, H. A., Yeh, W.-H. & Liu, D. R. HDR-də ikiqat telsiz fasilələr olmadan vasitəçilik edən hRad51–Cas9 nikaza birləşmələrinin inkişafı. Nat. Kommun. 10, 2212 (2019).

Richardson, C. D., Ray, G. J., Dewitt, M. A., Curie, G. L. & amp Corn, J. E. Asimmetrik donor DNT-dən istifadə edərək katalitik aktiv və qeyri-aktiv CRISPR-Cas9 ilə homoloji yönümlü genomun redaktəsinin gücləndirilməsi. Nat. Biotexnol. 34, 339–344 (2016).

Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K. və Doudna, J. A. CRISPR/Cas9 çatdırılmasının idarə olunan vaxtı ilə təkmilləşdirilmiş homoloji yönümlü insan genomu mühəndisliyi. eLife 3, e04766 (2014).

Landrum, M. J. və başqaları. ClinVar: ardıcıllığın dəyişməsi və insan fenotipi arasındakı əlaqələrin ictimai arxivi. Nuklein turşuları Res. 42, D980–D985 (2013).

Landrum, M. J. və başqaları. ClinVar: klinik cəhətdən uyğun variantların şərhlərinin ictimai arxivi. Nuklein turşuları Res. 44, D862–D868 (2015).

Stenson, P. D. et al. İnsan Geni Mutasiya Məlumat Bazası: tibbi tədqiqatlar, genetik diaqnostika və yeni nəsil ardıcıllıq tədqiqatları üçün irsi mutasiya məlumatlarının hərtərəfli deposuna doğru. zümzümə. Genet. 136, 665–677 (2017).

Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & amp Liu, D. R. İki zəncirli DNT parçalanması olmadan genomik DNT-də hədəf bazanın proqramlaşdırıla bilən redaktəsi. Təbiət 533, 420–424 (2016).

Gaudelli, N. M. və başqaları. DNT parçalanmadan genomik DNT-də A•T-nin G•C-yə proqramlaşdırıla bilən əsas redaktəsi. Təbiət 551, 464–471 (2017).

Mok, B. Y. və başqaları. Bakterial sitidin deaminaz toksini CRISPR-dən azad mitoxondrial baza redaktə etməyə imkan verir. Təbiət 583, 631–637 (2020).

Nishimasu, H. et al. Bələdçi RNT və hədəf DNT ilə kompleksdə Cas9-un kristal quruluşu. Hüceyrə 156, 935–949 (2014).

Huang, T. P. et al. Dairəvi olaraq dəyişdirilmiş və PAM-də dəyişdirilmiş Cas9 variantları əsas redaktorların hədəf dairəsini genişləndirir. Nat. Biotexnol. 37, 626–631 (2019).

Jiang, W. et al. BE-PLUS: genişləndirilmiş redaktə pəncərəsi və təkmilləşdirilmiş sədaqəti ilə yeni əsas redaktə aləti. Cell Res. 28, 855–861 (2018).

Ma, Y. et al. Məqsədli AİD vasitəçiliyi ilə mutagenez (TAM) məməli hüceyrələrində səmərəli genomik diversifikasiyaya imkan verir. Nat. Metodlar 13, 1029–1035 (2016).

Hess, G. T. və b. Məməli hüceyrələrində dCas9 hədəflənmiş somatik hipermutasiyadan istifadə edərək istiqamətləndirilmiş təkamül. Nat. Metodlar 13, 1036–1042 (2016).

Liu, L. D. və başqaları. Diversifikasiya edən əsas redaktorların daxili nukleotid üstünlükləri antikorları istiqamətləndirir ex vivo yaxınlığın yetişməsi. Cell Rep. 25, 884–892.3 (2018).

Wang, Y., Zhou, L., Liu, N. & Yao, S. BE-PIGS: Cas9 PI domeninə daxil edilmiş deaminazları olan əsas redaktə aləti redaktə dairəsini əhəmiyyətli dərəcədə genişləndirdi. Siqnal ötürülməsi. Hədəf. Orada. 4, 36 (2019).

Kim, Y. B. və başqaları. Mühəndisləşdirilmiş Cas9-sitidin deaminaz füzyonları ilə genom hədəfləmə sahəsinin və əsas redaktə dəqiqliyinin artırılması. Nat. Biotexnol. 35, 371–376 (2017).

Grünewald, J. et al. CRISPR tərəfindən idarə olunan DNT bazası redaktorları tərəfindən induksiya edilən transkriptom geniş hədəfdən kənar RNT redaktəsi. Təbiət 569, 433–437 (2019).

Tan, J., Zhang, F., Karcher, D. & Bock, R. Sayta xüsusi tək nukleotidlərin dəyişdirilməsi üçün yüksək dəqiqlikli baza redaktorlarının mühəndisliyi. Nat. Kommun. 10, 439 (2019).

Pluciennik, A. et al. Uyğunsuzluğun təmirində MutLa endonükleazının aktivləşdirilməsi və strand istiqamətində PCNA funksiyası. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 107, 16066–16071 (2010).

Heller, R. C. & amp Marians, K. J. Replisome montajı və dayanmış replikasiya çəngəllərinin birbaşa yenidən işə salınması. Nat. Rahib Mol. Hüceyrə Biol. 7, 932–943 (2006).

Kurt, I. C. və başqaları. İnsan hüceyrələrində hədəflənmiş DNT transversiyalarını induksiya etmək üçün CRISPR C-to-G baza redaktorları. Nat. Biotexnol. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0609-x (2020).

Zhao, D. et al. Glikosilaz baza redaktorları C-to-A və C-to-G baza dəyişikliklərinə imkan verir. Nat. Biotexnol. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0592-2 (2020).

Kim, H. S., Jeong, Y. K., Hur, J. K., Kim, J.-S. & Bae, S. Adenin bazası redaktorları insan hüceyrələrində sitozin çevrilməsini kataliz edir. Nat. Biotexnol. 37, 1145–1148 (2019).

Arbab, M. et al. Hədəf kitabxana təhlili və maşın öyrənməsindən əsas redaktə nəticələrinin müəyyənediciləri. Hüceyrə 182, 463–480.e30 (2020).

Nishida, K. et al. Hibrid prokaryotik və onurğalıların adaptiv immun sistemlərindən istifadə edərək hədəflənmiş nukleotidlərin redaktəsi. Elm 353, aaf8729 (2016).

Komor, A. C. və başqaları. Təkmilləşdirilmiş baza eksizyonunun bərpasının qarşısının alınması və Mu Gam zülalı daha yüksək effektivliyə və məhsulun saflığına malik C:G-to-T:A baza redaktorları verir. Sci. Adv. 3, eaao4774 (2017).

Landrum, M. J. və başqaları. ClinVar: məlumat əldə etmək üçün təkmilləşdirmələr. Nuklein turşuları Res. 48(D1), D835–D844 (2020).

Koblan, L. W. et al. İfadə optimallaşdırılması və əcdadların yenidən qurulması ilə sitidin və adenin bazası redaktorlarının təkmilləşdirilməsi. Nat. Biotexnol. 36, 843–846 (2018).

Zafra, M. P. və başqaları. Optimallaşdırılmış baza redaktorları hüceyrələrdə, orqanoidlərdə və siçanlarda səmərəli redaktə etməyə imkan verir. Nat. Biotexnol. 36, 888–893 (2018).

Wang, L. et al. Sərbəst urasil DNT qlikosilaz inhibitorunun birgə ifadəsi ilə təkmilləşdirilmiş əsas redaktə. Cell Res. 27, 1289–1292 (2017).

Zhang, X. və başqaları. Tək zəncirli DNT bağlayan zülal domeninin birləşməsi yolu ilə sitidin əsas redaktorlarının effektivliyinin və hədəf spektrinin artırılması. Nat. Hüceyrə Biol. 22, 740–750 (2020).

Cheng, T.-L. və b. Diversifikasiya olunmuş sitidin deaminazları ilə C-T bazası redaktə alətlərinin genişləndirilməsi. Nat. Kommun. 10, 3612 (2019).

Li, C. et al. İkili sitozin və adenin bazası redaktorları ilə bitki genlərinin məqsədyönlü, təsadüfi mutagenezi. Nat. Biotexnol. 38, 875–882 (2020).

Sakata, R. C. və başqaları. C-to-T və A-to-G mutasiyalarının eyni vaxtda tətbiqi üçün əsas redaktorlar. Nat. Biotexnol. 38, 865–869 (2020).

Grünewald, J. et al. İkili deaminazlı CRISPR baza redaktoru adenin və sitozin ilə eyni vaxtda redaktə etməyə imkan verir. Nat. Biotexnol. 38, 861–864 (2020).

Zhang, X. və başqaları. İkili baza redaktoru insan hüceyrələrində həm sitozin, həm də adenin bazası çevrilmələrini katalizləyir. Nat. Biotexnol. 38, 856–860 (2020).

Levy, J. M. və başqaları. Adeno ilə əlaqəli viruslar vasitəsilə siçanların beyninin, qaraciyərinin, tor qişasının, ürəyinin və skelet əzələsinin sitozin və adenin əsasının redaktəsi. Nat. Biomed. Eng. 4, 97–110 (2020).

Villiger, L. et al. Yetkin siçanlarda in vivo genom bazası redaktəsi ilə metabolik qaraciyər xəstəliyinin müalicəsi. Nat. Med. 24, 1519–1525 (2018).

Hə, W.-H. və b. In vivo baza redaktəsi sensor transduksiyanı bərpa edir və resessiv karlığın siçan modelində eşitmə funksiyasını müvəqqəti təkmilləşdirir. Sci. Tərcümə. Med. 12, eaay9101 (2020).

Ryu, S.-M. və b. Siçan embrionlarında adenin bazası redaktəsi və Duchenne əzələ distrofiyasının yetkin siçan modeli. Nat. Biotexnol. 36, 536–539 (2018).

Yang, L. et al. Sitidin əsaslı redaktə ilə de novo başlanğıc kodonunun yaradılması yolu ilə irsi metabolik qaraciyər xəstəliyinin yaxşılaşdırılması. Mol. Orada. 28, 1673–1683 (2020).

Kleinstiver, B. P. et al. Dəyişdirilmiş PAM spesifikliyi ilə hazırlanmış CRISPR-Cas9 nükleazları. Təbiət 523, 481–485 (2015).

Kleinstiver, B. P. et al. Hədəf dairəsinin genişləndirilməsi Staphylococcus aureus PAM tanınmasını dəyişdirərək CRISPR-Cas9. Nat. Biotexnol. 33, 1293–1298 (2015).

Kleinstiver, B. P. et al. Yüksək dəqiqlikli CRISPR–Cas9 nüvələri, aşkarlana bilən genom miqyasında hədəfdən kənar təsirləri yoxdur. Təbiət 529, 490–495 (2016).

Nishimasu, H. et al. Genişləndirilmiş hədəf sahəsinə malik mühəndis CRISPR-Cas9 nüvəsi. Elm 361, 1259–1262 (2018).

Hu, J. H. və başqaları. Geniş PAM uyğunluğu və yüksək DNT spesifikliyi ilə inkişaf etdirilmiş Cas9 variantları. Təbiət 556, 57–63 (2018).

Ran, F. A. və başqaları. In vivo istifadə edərək genomun redaktəsi Staphylococcus aureus Cas9. Təbiət 520, 186–191 (2015).

Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N. & amp Kleinstiver, B. P. PAM-sız mühəndisləşdirilmiş CRISPR-Cas9 variantları ilə məhdudlaşdırılmamış genomun hədəflənməsi. Elm 368, 290 (2020).

Miller, S. M. və başqaları. Qeyri-G PAM-larla uyğun gələn SpCas9 variantlarının davamlı təkamülü. Nat. Biotexnol. 38, 471–481 (2020).

Toth, E. et al. Dəyişdirilmiş PAM spesifikliyi ilə təkmilləşdirilmiş LbCas12a variantları Cas12a nukleazlarının genom hədəfləmə diapazonunu daha da genişləndirir. Nuklein turşuları Res. 48, 3722–3733 (2020).

Chatterjee, P., Jakimo, N. & Jacobson, J. M. Çox oxşar SpCas9 ortoloqunun minimal PAM spesifikliyi. Sci. Adv. 4, eau0766 (2018).

Chatterjee, P. et al. Geniş PAM diapazonuna və yüksək spesifikliyə və aktivliyə malik mühəndis ScCas9. Nat. Biotexnol. 38, 1154–1158 (2020).

Chatterjee, P. et al. Adenin dinukleotidləri üçün PAM tanınması ilə Cas9. Nat. Kommun. 11, 2474 (2020).

Cox, D. B. T., Platt, R. J. & amp Zhang, F. Terapevtik genom redaktəsi: perspektivlər və problemlər. Nat. Med. 21, 121–131 (2015).

Anzalone, A. V., Koblan, L. W. & amp Liu, D. R. CRISPR-Cas nukleazları, əsas redaktorlar, transposazlar və əsas redaktorlar ilə genomun redaktəsi. Nat. Biotexnol. 38, 824–844 (2020).

Yang, L. et al. TadA deaminazının Cas9 variantları ilə birləşməsi yolu ilə siçan və siçovul embrionlarında adenozin bazası redaktorlarının hədəf dairəsinin artırılması. Zülal hüceyrəsi 9, 814–819 (2019).

Kleinstiver, B. P. et al. Gen, epigenetik və əsas redaktə üçün artırılmış fəaliyyət və təkmilləşdirilmiş hədəfləmə diapazonu ilə hazırlanmış CRISPR–Cas12a variantları. Nat. Biotexnol. 37, 276–282 (2019).

Zhang, Y. et al. Dəyişdirilmiş CRISPR-Cas9 sistemindən istifadə edərək zebrafish genomunun proqramlaşdırıla bilən əsas redaktəsi. Nat. Kommun. 8, 118 (2017).

Chadwick, A. C., Wang, X. & Musunuru, K. In vivo əsas redaktə PCSK9 (protein konvertaz subtilisin/keksin tip 9) genomun redaktəsinə terapevtik alternativ kimi. Ateroskler. Tromb. Vasc. Biol. 37, 1741–1747 (2017).

Liu, Z. və başqaları. ABE və BE vasitəçiliyi ilə əsas redaktə vasitəsilə insan xəstəliklərinin siçan modellərinin effektiv nəsli. Nat. Kommun. 9, 2338 (2018).

Wu, Y. və başqaları. Mühəndisləşdirilmiş Cas9-PmCDA1 birləşmələri və düyüdə dəyişdirilmiş sgRNA ilə sitozin əsasının redaktə sahəsinin və səmərəliliyinin artırılması. Ön. Genet. 10, 379 (2019).

Ren, B. et al. Düyüdə genetik dəyişikliklərə səbəb olmaq üçün effektiv hədəflənmiş əsas redaktə üçün CRISPR/Cas9 alət dəsti. Sci. Çin Həyat Elmi. 60, 516–519 (2017).

Li, H. K. və başqaları. Əsas redaktədən istifadə edərək siçan embrionlarında əlaqəli lokusların eyni vaxtda hədəflənməsi. Sci. Rep. 9, 1662 (2019).

Gapinske, M. et al. CRISPR-SKIP: tək baza redaktorları ilə proqramlaşdırıla bilən gen birləşməsi. Genom Biol. 19, 107 (2018).

Gehrke, J. M. et al. Minimum müşahidəçi və hədəfdən kənar fəaliyyətlərə malik APOBEC3A-Cas9 əsas redaktoru. Nat. Biotexnol. 36, 977–982 (2018).

Zhou, C. et al. İnsan üçnüvəli ziqotlarında yüksək effektiv baza redaktəsi. Zülal hüceyrəsi 8, 772–775 (2017).

Yuan, J. et al. CRISPR tərəfindən idarə olunan sitidin deaminaza ilə RNT birləşməsinin genetik modulyasiyası. Mol. Hüceyrə 72, 380–394.e7 (2018).

Hua, K., Tao, X. & amp Zhu, J.-K. Cas9 variantlarından istifadə etməklə düyüdə əsas redaktə dairəsinin genişləndirilməsi. Bitki biotexnologiyası. J. 17, 499–504 (2019).

Li, X. və başqaları. Cpf1-sitidin deaminaz füzyonu ilə əsas redaktə. Nat. Biotexnol. 36, 324–327 (2018).

Lee, C. et al. CRISPR-pass: adenin bazası redaktorlarından istifadə edərək cəfəng mutasiyaların gen xilası. Mol. Orada. 27, 1364–1371 (2019).

Liu, Z. və başqaları. Mühəndisləşdirilmiş Spy-mac Cas9 variantından istifadə edərək genişləndirilmiş hədəfləmə dairəsi ilə səmərəli əsas redaktə. Cell Discov. 5, 58 (2019).

Ren, B. et al. Cas9-NG, düyüdə NG və digər atipik PAM-ları tanıyaraq, genomun redaktəsi alət dəstinin hədəfləmə dairəsini xeyli genişləndirir. Mol. bitki 12, 1015–1026 (2019).

Zhong, Z. et al.Yüksək dəqiqlikli xCas9 və qeyri-kanonik PAM hədəfləmə Cas9-NG ilə bitki genomunun redaktəsinin təkmilləşdirilməsi. Mol. bitki 12, 1027–1036 (2019).

Liu, Z. və başqaları. Mühəndis insan APOBEC3G-nCas9 birləşmələrindən istifadə edərək CC kontekstinə uyğun dəqiq əsas redaktə. BMC Biol. 18, 111 (2019).

Liu, Z. və başqaları. Optimallaşdırılmış AID-Cas9 füzyonu ilə dovşanlarda GC kontekstlərində səmərəli redaktə üçün təkmilləşdirilmiş baza redaktoru. FASEB J. 33, 9210–9219 (2019).

Endo, M. et al. NG PAM-ı tanıyan mühəndis CRISPR–Cas9 tərəfindən bitkilərdə genomun redaktəsi. Nat. Bitkilər 5, 14–17 (2019).

Richter, M. F. et al. Təkmilləşdirilmiş Cas domeni uyğunluğu və fəaliyyəti ilə adenin bazası redaktorunun faj yardımlı təkamülü. Nat. Biotexnol. 38, 883–891 (2020).

Hu, Z. və başqaları. Kompakt Cas9 ortoloqu Staphylococcus Auricularis (SauriCas9) DNT hədəfləmə dairəsini genişləndirir. PLOS Biol. 18, e3000686 (2020).

Agudelo, D. et al. Çox yönlü və möhkəm genom redaktəsi Streptococcus thermophilus CRISPR1-Cas9. Genom Res. 30, 107–117 (2020).

Tan, J., Zhang, F., Karcher, D. & amp Bock, R. Yüksək dəqiqlikli baza redaktorlarının genom hədəfləmə dairəsinin və sayt seçiciliyinin genişləndirilməsi. Nat. Kommun. 11, 629 (2020).

Li, X. və başqaları. Mutasiya edilmiş TERT promotorunun proqramlaşdırıla bilən əsas redaktəsi beyin şişinin böyüməsini maneə törədir. Nat. Hüceyrə Biol. 22, 282–288 (2020).

Wang, X. et al. Cas12a baza redaktorları aşağı DNT zədələnməsi reaksiyası ilə səmərəli və spesifik redaktəyə səbəb olur. Cell Rep. 31, 107723 (2020).

Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A. & amp Liu, D. R. Sitozin bazası redaktorları tərəfindən Cas9-dan asılı olmayan hədəf DNT redaktəsinin qiymətləndirilməsi və minimuma endirilməsi. Nat. Biotexnol. 38, 620–628 (2020).

Slaymaker, I. M. et al. Təkmilləşdirilmiş spesifikliyə malik rasional şəkildə hazırlanmış Cas9 nukleazları. Elm 351, 84–88 (2016).

Rees, H. A. və başqaları. Zülal mühəndisliyi və zülal çatdırılması vasitəsilə baza redaktəsinin DNT spesifikliyinin və tətbiqinin təkmilləşdirilməsi. Nat. Kommun. 8, 15790 (2017).

Xu, W. və başqaları. Düyüdə təkmilləşdirilmiş effektivliyə malik yüksək keyfiyyətli Cas9 variantları ilə multipleks nukleotid redaktəsi. BMC Bitki Biol. 19, 511 (2019).

Li, J. K. və başqaları. Spesifikliyini artırmaq üçün CRISPR-Cas9-un təkamülünü yönləndirdi. Nat. Kommun. 9, 3048 (2018).

Liang, P. et al. Siçan ziqotlarında yüksək keyfiyyətli əsas redaktor 2 ilə effektiv gen redaktəsi. Zülal hüceyrəsi 8, 601–611 (2017).

Kim, D., Kim, D.-E., Lee, G., Cho, S.-I. & Kim, J.-S. CRISPR RNT ilə idarə olunan adenin bazası redaktorlarının genom miqyasında hədəf spesifikliyi. Nat. Biotexnol. 37, 430–435 (2019).

Hong, R., Ma, S. & Wang, F. Yüksək keyfiyyətli Cas9 istifadə edərək adenin bazası redaktorunun spesifikliyinin təkmilləşdirilməsi. Əvvəlcədən çap bioRxiv https://doi.org/10.1101/712109 (2019).

Casini, A. et al. Yüksək spesifik SpCas9 variantı mayada in vivo skrininq yolu ilə müəyyən edilir. Nat. Biotexnol. 36, 265–271 (2018).

Thuronyi, B. W. et al. Genişlənmiş hədəf uyğunluğu və təkmilləşdirilmiş fəaliyyət ilə baza redaktorlarının davamlı təkamülü. Nat. Biotexnol. 37, 1070–1079 (2019).

Yu, Y. və başqaları. Minimum idarəedilməmiş DNT və RNT-nin hədəfdən kənar hadisələri və yüksək hədəfdə aktivliyi ilə sitozin bazası redaktorları. Nat. Kommun. 11, 2052 (2020).

Wang, X. et al. İnsan APOBEC3A-Cas9 füzyonu ilə metilləşdirilmiş bölgələrdə səmərəli əsas redaktə. Nat. Biotexnol. 36, 946–949 (2018).

Gaudelli, N. M. və başqaları. Artan aktivlik və terapevtik tətbiqi ilə adenin bazası redaktorlarının istiqamətləndirilmiş təkamülü. Nat. Biotexnol. 38, 892–900 (2020).

Zhou, C. et al. DNT bazasının redaktəsi və mutagenez yolu ilə aradan qaldırılması ilə səbəb olan hədəfdən kənar RNT mutasiyası. Təbiət 571, 275–278 (2019).

Rees, H. A., Wilson, C., Doman, J. L. və Liu, D. R. DNT adenin bazası redaktorları tərəfindən hüceyrə RNT redaktəsinin təhlili və minimuma endirilməsi. Sci. Adv. 5, eax5717 (2019).

Liu, Z. və başqaları. YFE-BE4max istifadə edərək dovşanlarda yüksək dəqiqliklə effektiv əsas redaktə. Hüceyrə Ölümü Dis. 11, 36 (2020).

Martin, A. S. və başqaları. APOBEC-Cas9 editosom kompleksləri tərəfindən tək əsaslı redaktə üçün eGFP müxbirlərindən ibarət panel. Sci. Rep. 9, 497 (2019).

St Martin, A. et al. Canlı hüceyrələrdə APOBEC–Cas9 tərəfindən DNT redaktəsinin və ya Cas9 tərəfindən parçalanmasının kəmiyyətinin müəyyən edilməsi və zənginləşdirilməsi üçün flüoresan reportyor. Nuklein turşuları Res. 46, e84 (2018).

Coelho, M. A. və b. BE-FLARE: əsas redaktə fəaliyyətinin flüoresan müxbiri APOBEC3A və APOBEC3B-nin redaktə xüsusiyyətlərini ortaya qoyur. BMC Biol. 16, 150 (2018).

Zuo, E. et al. Rasional olaraq hazırlanmış sitozin bazası redaktoru həm DNT, həm də RNT-nin hədəfdən kənar təsirlərini azaldaraq yüksək hədəfdə aktivliyi saxlayır. Nat. Metodlar 17, 600–604 (2020).

Zuo, E. et al. Sitozin bazası redaktoru siçan embrionlarında əhəmiyyətli hədəfdən kənar tək nukleotid variantları yaradır. Elm 364, 289–292 (2019).

Grünewald, J. et al. Hədəfdən kənarda azaldılmış RNT və özünü redaktə fəaliyyətləri ilə CRISPR DNT bazası redaktorları. Nat. Biotexnol. 37, 1041–1048 (2019).

Wang, T., Badran, A. H., Huang, T. P. & Liu, D. R. Təkmilləşdirilmiş həll olunan ifadə ilə zülalların davamlı yönəldilmiş təkamülü. Nat. Kimya. Biol. 14, 972–980 (2018).

Rees, H. A. və Liu, D. R. Əsas redaktə: canlı hüceyrələrin genomu və transkriptomunda dəqiq kimya. Nat. Rev Genet. 19, 770–788 (2018).

Shimatani, Z. et al. CRISPR-Cas9 sitidin deaminaz füzyonundan istifadə edərək düyü və pomidorda hədəflənmiş əsas redaktə. Nat. Biotexnol. 35, 441–443 (2017).

Sasaguri, H. et al. Patogen mutasiyaların siçana daxil edilməsi Psen1 Baza Redaktoru və Hədəf-AID tərəfindən gen. Nat. Kommun. 9, 2892 (2018).

Farzadfard, F. et al. Canlı hüceyrələrdə tək nukleotid ayırdetmə hesablama və yaddaş. Mol. Hüceyrə 75, 769–780.e4 (2019).

Shevidi, S., Uchida, A., Schudrowitz, N., Wessel, G. M. & Yajima, M. Dəniz kirpisi embrionunda CRISPR/Cas9-deaminazdan istifadə edərək DNT parçalanmadan tək nukleotid redaktəsi. Dev. Dyn. 246, 1036–1046 (2017).

Banno, S., Nishida, K., Arazoe, T., Mitsunobu, H. & Kondo, A. Deaminaz vasitəçiliyi ilə multileks genomun redaktəsi Escherichia coli. Nat. Mikrobiol. 3, 423–429 (2018).

Wang, Y. et al. MACBETH: multipleks avtomatlaşdırılmış Corynebacterium glutamicum əsas redaktə üsulu. Metab. Eng. 47, 200–210 (2018).

Xie, J. et al. Baza redaktorlarından istifadə edərək donuzlarda çoxlu genlər və lokuslar üçün effektiv əsas redaktə. Nat. Kommun. 10, 2852 (2019).

Zong, Y. et al. nCas9 və insan APOBEC3A-nın birləşməsindən istifadə edərək bitkilərdə C-to-T bazasının effektiv redaktəsi. Nat. Biotexnol. 36, 950–953 (2018).

Gammage, P. A., Moraes, C. T. & Minczuk, M. Mitoxondrial genom mühəndisliyi: inqilab CRISPR-ə uyğunlaşdırılmaya bilər. Trendlər Genet. 34, 101–110 (2018).

Molla, K. A. və Yang, Y. CRISPR/Cas vasitəçiliyi ilə əsas redaktə: texniki mülahizələr və praktik tətbiqlər. Trends Biotechnol. 37, 1121–1142 (2019).

Hess, G. T., Tycko, J., Yao, D. & amp Bassik, M. C. Eukaryotik genomlarda CRISPR vasitəçiliyi ilə əsas redaktə üsulları və tətbiqləri. Mol. Hüceyrə 68, 26–43 (2017).

Liu, Z. və başqaları. Dovşanda yüksək effektiv RNT-yə rəhbərlik edən əsas redaktə. Nat. Kommun. 9, 2717 (2018).

Li, Q. və başqaları. Siçanlarda CRISPR-Cas9 vasitəçiliyi ilə əsas redaktə skrininqi ilkin mikrob hüceyrələrinin inkişafı üçün vacib olan DND1 amin turşularını müəyyən edir. Nat. Hüceyrə Biol. 20, 1315–1325 (2018).

Yeh, W.-H., Chiang, H., Rees, H. A., Edge, A. S. B. & Liu, D. R. Post-mitotik həssas hüceyrələrin in vivo əsas redaktəsi. Nat. Kommun. 9, 2184 (2018).

Zeng, Y. et al. Marfan sindromunun patogen FBN1 mutasiyasının insan hüceyrələrində və heterozigot embrionlarda baza redaktəsi ilə korreksiyası. Mol. Orada. 26, 2631–2637 (2018).

Li, G. və başqaları. Atılmış insan üçnüvəli embrionlarında yüksək səmərəli və dəqiq əsas redaktə. Zülal hüceyrəsi 8, 776–779 (2017).

Liang, P. et al. İnsan embrionlarında əsas redaktor tərəfindən β-talassemiya mutantının korreksiyası. Zülal hüceyrəsi 8, 811–822 (2017).

Zong, Y. et al. Cas9-sitidin deaminaz füzyonu ilə düyü, buğda və qarğıdalıda dəqiq əsas redaktə. Nat. Biotexnol. 35, 438–440 (2017).

Lu, Y. & amp Zhu, J. K. Dəyişdirilmiş CRISPR/Cas9 sistemindən istifadə edərək düyü genomunda hədəf bazanın dəqiq redaktəsi. Mol. bitki 10, 523–525 (2017).

Park, D.-S. və b. RNT ilə idarə olunan sitidin deaminazları vasitəsilə hədəflənmiş əsas redaktə Xenopus laevis embrionlar. Mol. Hüceyrələr 40, 823–827 (2017).

Rossidis, A. C. və başqaları. Uşaqlıqda CRISPR vasitəçiliyi ilə metabolik genlərin terapevtik redaktəsi. Nat. Med. 24, 1513–1518 (2018).

Kim, K. və b. Siçan embrionlarında yüksək effektiv RNT-yə rəhbərlik edən əsas redaktə. Nat. Biotexnol. 35, 435–437 (2017).

Tanaka, S. et al. Zebra balığında in vivo hədəflənmiş tək nükleotid redaktəsi. Sci. Rep. 8, 1–11 (2018).

Qin, L. et al. Allotetraploid pambıqda C•G-dən T•A-ya qədər yüksək səmərəli və dəqiq əsaslı redaktə (Gossypium hirsutum) dəyişdirilmiş CRISPR/Cas9 sistemindən istifadə edərək genom. Bitki biotexnologiyası. J. 18, 45–56 (2020).

Chen, Y. et al. CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə əsas redaktə sistemi effektiv şəkildə funksiya qazanma mutasiyalarını yaradır. Ərəbidopsis. Sci. Çin Həyat Elmi. 60, 520–523 (2017).

Li, J., Sun, Y., Du, J., Zhao, Y. və Xia, L. Dəyişdirilmiş CRISPR/Cas9 sistemi ilə düyüdə hədəf nöqtə mutasiyalarının yaradılması. Mol. bitki 10, 526–529 (2017).

Li, Y. və başqaları. Proqramlaşdırıla bilən tək və multipleks əsas redaktə Bombyx mori RNT ilə idarə olunan sitidin deaminazlarından istifadə etməklə. G3 (Bethesda) 8, 1701–1709 (2018).

Qin, W. et al. Zebra balığı genomunda dəqiq A•T-dən G•C-yə əsas redaktə. BMC Biol. 16, 1–8 (2018).

Li, C. et al. Cas9-adenozin deaminaz füzyonundan istifadə edərək düyü və buğdada genişləndirilmiş əsas redaktə. Genom Biol. 19, 59 (2018).

Liang, P. et al. Siçan ziqotlarında effektiv və dəqiq adenin bazası redaktəsi. Zülal hüceyrəsi 9, 808–813 (2018).

Ma, Y. et al. Siçovullarda mühəndis dCas9-bələdçi tRNA adenozin deaminazı ilə yüksək səmərəli və dəqiq baza redaktəsi. Cell Discov. 4, 1–4 (2018).

Kang, B.-C. və b. Bitkilərdə adenin bazası redaktəsi vasitəsilə dəqiq genom mühəndisliyi. Nat. Bitkilər 4, 427–431 (2018).

Hua, K., Tao, X., Yuan, F., Wang, D. & amp Zhu, J.-K. Düyü genomunda dəqiq A· T - G· C bazası redaktəsi. Mol. bitki 11, 627–630 (2018).

Mahnı, C.-Q. və b. Tirozinemiyanın yetkin siçan modelində adenin bazası redaktəsi. Nat. Biomed. Eng. 4, 125–130 (2020).

Yan, F. et al. Düyüdə Cas9n tərəfindən idarə olunan tRNA adenozin deaminazı ilə yüksək effektiv A· T - G· C bazası redaktəsi. Mol. bitki 11, 631–634 (2018).

Kuscu, C. et al. CRISPR-STOP: əsas redaktə ilə bağlı cəfəng mutasiyalar vasitəsilə gen susdurulması. Nat. Metodlar 14, 710–712 (2017).

Billon, P. et al. CRISPR vasitəçiliyi ilə əsas redaktə STOP kodonlarının induksiyası vasitəsilə eukaryotik genlərin səmərəli şəkildə pozulmasına imkan verir. Mol. Hüceyrə 67, 1068–1079.e4 (2017).

Tang, W. & amp Liu, D. R. Bakterial və məməli hüceyrələrində yenidən yazıla bilən çox hadisəli analoq qeyd. Elm 360, eaap8992 (2018).

Hwang, B. et al. Endojen L1 elementlərini hədəf alan Cas9-deaminaz ştrix kodlama sistemindən istifadə edərək nəsil izləmə. Nat. Kommun. 10, 1234 (2019).

Yin, K., Gao, C. & amp Qiu, J.-L. Bitki genomunun redaktəsində tərəqqi və perspektivlər. Nat. Bitkilər 3, 17107 (2017).

Anzalone, A. V. et al. İki zəncirli qırılma və ya donor DNT olmadan genomun redaktəsini axtarın və dəyişdirin. Təbiət 576, 149–157 (2019).

Heyer, W.-D., Ehmsen, K. T. & Liu, J. Eukaryotlarda homolog rekombinasiyanın tənzimlənməsi. Annu. Rev Genet. 44, 113–139 (2010).

Moynahan, M. E. & amp Jasin, M. Mitotik homoloji rekombinasiya genomik sabitliyi qoruyur və şişin yaranmasına mane olur. Nat. Rahib Mol. Hüceyrə Biol. 11, 196–207 (2010).

Jiang, T. et al. Adenin əsas redaktoru mRNT və bələdçi RNT-nin kimyəvi modifikasiyası onun tətbiq dairəsini genişləndirir. Nat. Kommun. 11, 1979 (2020).

Zeng, J. et al. İnsan hematopoetik kök hüceyrələrinin terapevtik əsas redaktəsi. Nat. Med. 26, 535–541 (2020).

Ran, F. A. və başqaları. CRISPR-Cas9 sistemindən istifadə edərək genom mühəndisliyi. Nat. Protok. 8, 2281–2308 (2013).

Chen, J. S. et al. Təkmilləşdirilmiş düzəliş CRISPR–Cas9 hədəfləmə dəqiqliyini idarə edir. Təbiət 550, 407–410 (2017).

Kim, J. et al. Struktur və kinetik xarakteristikası Escherichia coli TadA, yırğalanan spesifik tRNA deaminazı. Biokimya 45, 6407–6416 (2006).

Gao, X. və başqaları. Genom redaktə agentlərinin in vivo çatdırılması ilə otozomal dominant eşitmə itkisinin müalicəsi. Təbiət 553, 217–221 (2018).

Ma, X. və başqaları. Dərin növbəti nəsil ardıcıllıq məlumatlarında səhv profillərinin təhlili. Genom Biol. 20, 50 (2019).

Petrackova, A. və başqaları. NGS-də ardıcıllıqla əhatə dairəsinin dərinliyinin standartlaşdırılması: xərçəng diaqnostikasında klonal və subklonal mutasiyaların aşkarlanması üçün tövsiyə. Ön. Oncol. 9, 851 (2019).

Hvanq, G.-H. və b. CRISPR baza redaktəsi üçün veb-əsaslı dizayn və təhlil alətləri. BMC Bioinformatika 19, 542 (2018).

Clement, K. et al. CRISPResso2 dəqiq və sürətli genom redaktə ardıcıllığının təhlilini təmin edir. Nat. Biotexnol. 37, 224–226 (2019).

Kluesner, M. G. et al. EditR: Sanger ardıcıllığından əsas redaktənin kəmiyyətini qiymətləndirmək üçün bir üsul. CRISPR J. 1, 239–250 (2018).

Tsai, S. Q. və başqaları. GUIDE-seq, CRISPR-Cas nukleazları tərəfindən hədəfdən kənar parçalanmanın genom miqyasında profilinə imkan verir. Nat. Biotexnol. 33, 187–197 (2015).

Tsai, S. Q. və başqaları. CIRCLE-seq: genom miqyasında CRISPR–Cas9 nükleazından kənar hədəflər üçün yüksək həssas in vitro ekran. Nat. Metodlar 14, 607–614 (2017).

Kim, D. et al. Digenome-seq: insan hüceyrələrində CRISPR-Cas9-un hədəfdən kənar təsirlərinin genom miqyasında profilləşdirilməsi. Nat. Metodlar 12, 237–243 (2015).

Gao, Z., Harwig, A., Berkhout, B. & Herrera-Carrillo, E. 3-cü tip polimeraza III promotorlarının +1 mövqeyi ətrafında nukleotidlərin mutasiyası: transkripsiya aktivliyinə və saytın istifadəsinə təsiri. Transkripsiya 8, 275–287 (2017).

Kim, S., Bae, T., Hwang, J. & Kim, J.-S. Uyğun 5′ nukleotidləri olan sgRNA-lardan istifadə edərək yüksək spesifik Cas9 variantlarının xilas edilməsi. Genom Biol. 18, 218 (2017).

Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B. & Valen, E. CHOPCHOP v2: CRISPR genom mühəndisliyinin növbəti nəsli üçün veb alət. Nuklein turşuları Res. 44, W272–W276 (2016).

Haeussler, M. et al. Hədəfdən kənar və hədəfdə olan qiymətləndirmə alqoritmlərinin qiymətləndirilməsi və bələdçi RNT seçim aləti CRISPOR-a inteqrasiya. Genom Biol. 17, 148 (2016).

Bae, S., Park, J. və Kim, J. S. Cas-OFFinder: Cas9 RNT ilə idarə olunan endonükleazların potensial hədəfdən kənar sahələrini axtaran sürətli və çox yönlü alqoritm. Bioinformatika 30, 1473–1475 (2014).


Əlavə material

Müəlliflər əvvəllər qeyd olunan tədqiqatlar üçün qan təmin edən xəstələrə, Leykemiya & Lenfoma Cəmiyyətindən və Milli Xərçəng İnstitutundan (P50 CA140158 və 1K12 <"type":"entrez-nucleotide","attrs") tədqiqat dəstəyinə görə minnətdardırlar. :<"text":"CA133250","term_id":"35019051","term_text":"CA133250">> CA133250). Müəlliflər konfokal görüntüləmə ilə bağlı kömək üçün Els Vanstreels-ə də təşəkkür edirlər (Şəkil 2 G-H).

Bu iş Milli Sağlamlıq İnstitutları (R01-GM069909 YMC), Welch Fondu (I-1532 YMC), Leykemiya & Lenfoma Cəmiyyəti Alim mükafatı (YMC), Texas Xərçəngin qarşısının alınması Araşdırma İnstitutu (CPRIT RP120352 YMC və PR) tərəfindən maliyyələşdirilir. -101496 QS) və Texas Universiteti Cənub-Qərb Təqdimatlı Alimlər Proqramı (YMC). Bu hesabatda göstərilən nəticələr Arqon Milli Laboratoriyasında, Qabaqcıl Foton Mənbəsindəki Struktur Biologiya Mərkəzində aparılan işlərdən əldə edilmişdir. Argonne DE-AC02-06CH11357 müqaviləsi əsasında ABŞ Enerji Departamenti, Bioloji və Ətraf Mühitin Tədqiqatları Ofisi üçün UChicago Argonne MMC tərəfindən idarə olunur. Bu yazıda təqdim olunan bütün immunofluoressensiya şəkilləri (Şəkil 2 G-H istisna olmaqla) Ohayo Dövlət Universitetində Konfokal Mikroskop Təsviri Təsislərində (CMIF) toplanmışdır. Cənab və xanım Maykl Tomas, The Harry Manqurian Foundation və The D. Warren Brown Foundation da bu işi dəstəklədilər.


Videoya baxın: Бу Видеони Куриб Булгач, Узингизни Ёкотиб Куйманг! (Avqust 2022).