Məlumat

Şimal analizi ilə xüsusi mRNA dsRNA-nı necə aşkar etmək olar?

Şimal analizi ilə xüsusi mRNA dsRNA-nı necə aşkar etmək olar?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

  1. Mən bir geni RNAi üsulu ilə susdurdum, bunun üçün geni seçdim və genin ölçüsü 1,5 kb, insert ölçüsüm isə 500 nts. mən transfeksiya etdim və şimal analizi ilə susdurulmasını təsdiqləmək istəyirəm. Mən bunu edəndə xüsusi mRNT azaldılması və dsRNA yığılması əvəzinə ribosomal RNT aldım.

  2. Ümumi RNT TRIzol reagenti (Sigma) ilə hazırlanmış və 20 μg/zolaq 1,2% agaroza, 2,2 M formaldehid gel üzərində fraksiyalaşdırılmışdır. RNT etidium bromid ilə vizuallaşdırıldı. RNT 14 saat ərzində neylon membrana (Hybond; Amersham Biosciences) köçürüldü və [α-32P] UTP etiketli istifadə SSC ilə ötürülmə və Prehibridləşdirmə üçün 55-də 2 saat inkubasiya, zondda 10 saat və yuyulma üçün 60-da yoxlandı. 2X SSC 20 dəqiqə iki dəfə.

Bu şəkildə siz TET induksiyalı və induksiya olunmamış RNT nümunələrini görə bilərsiniz. lakin nəticə çaşdırıcı oldu və belə güclü ribosomal RNT (2.2 Kb) çirklənməsi əldə edirəm.


Mikro-RNT analizinə və hədəf gen proqnozuna cari yanaşmalar

Mikro-RNT-lərin (miRNA) hüceyrə mexanizmlərinin tənzimlənməsində əhəmiyyətli rol oynadığı getdikcə daha aydın olur. Bu ~22-nt kodlaşdırmayan RNT-lər gen ifadəsinin mənfi tənzimləyiciləri kimi fəaliyyət göstərir. Onların kəşfindən bəri miRNT biologiyası və onların təsir mexanizmi haqqında kifayət qədər məlumat əldə edilmişdir. miRNA nomenklaturası üçün təlimatlar yaradılmışdır və bir çox növdən olan bütün miRNA-ları yerləşdirmək üçün verilənlər bazası yaradılmışdır. miRNA analizi üçün bir sıra metodologiyalar mövcuddur. MiRNA hədəf genlərini proqnozlaşdırmaq üçün bioinformatika yanaşmalarının işlənib hazırlanmasına böyük maraq var. Bu məqalə miRNA biologiyası, miRNA analizi üçün yanaşmalar və miRNA funksional rolları haqqında fikir əldə etmək üçün hesablama strategiyaları haqqında mövcud biliklərimiz haqqında məlumatları bir araya gətirəcək.

Bu, abunə məzmununun, qurumunuz vasitəsilə girişin önizləməsidir.


Müəllif Xülasəsi

RNT müdaxiləsi (RNAi) cüt zəncirli RNT (dsRNA) tərəfindən aktivləşdirilən hüceyrə mexanizmidir. Hüceyrə dsRNA-ya xas RNaseIII fermentləri (Dicer) dsRNA-nı tanıyır və onu 21-25 nukleotiddən (nt) ibarət ikiqat zəncirli kiçik müdaxilə edən RNT-lərə (ds-siRNA) emal edir. siRNA-lar RNT-ni tətiklə homolog olan tək zəncirli RNT-ni deqradasiyaya yönəldir. RNTİ gen ifadəsini tənzimləyir, transpozonları idarə edir və mühüm antiviral müdafiə mexanizmini təmsil edir. Buna görə də, viruslar RNT-yə qarşı mübarizə aparan zülalları kodlayır. Bu tədqiqatda balıq DNT virusunun (PPIV) və bitki RNT virusunun (SPCSV) RNaseIII fermentləri, sahib olmayan orqanizmlərdə RNTİ-nin bastırılması üçün müqayisə edilmişdir. Balıq iridovirusu RNaseIII bitki və nematodda RNT-ni basdırmışdır. O, həmçinin bitkilərdə RNT supressor çatışmazlığı virusunun yığılmasını gücləndirdi və antiviral RNT-ni basdırdı və nematodlarda əlaqəsi olmayan, RNT supressoru ilə qüsurlu virusun çoxalmasını xilas edə bildi. Bunun əksinə olaraq, bitki virusu RNaseIII yalnız bitkilərdə RNT-ni yatıra bilirdi. Nəticələrimiz vurğulayır ki, aktiv virus RNaseIII fermentləri RNTİ-ni sıxışdırır. Onların RNT-nin basdırılmasında aktivliyi əlaqəli olmayan orqanizmlərin spektri üçün fərqli görünür. RNT-nin basdırılmasının bu yeni mexanizminin başa düşülməsi RNaseIII tərkibli virusların heyvan və bitki istehsalında səbəb olduğu xəstəliklərə və iqtisadi itkilərə nəzarət vasitələrinə dair məlumat verə bilər.

Sitat: Weinheimer I, Jiu Y, Rajamäki M-L, Matilainen O, Kallijärvi J, Cuellar WJ, et al. (2015) Heyvanlarda və Bitkilərdə Virusların dsRNA-Deqradasiyaya uğrayan RNaseIII fermentləri ilə RNTİ-nin bastırılması. PLoS Pathog 11(3): e1004711. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004711

Redaktor: Hui-Şan Quo, Çin Elmlər Akademiyasının Mikrobiologiya İnstitutu, ÇİN

Qəbul edildi: 31 avqust 2014-cü il Qəbul edildi: 28 yanvar 2015-ci il Nəşr olundu: 6 mart 2015-ci il

Müəlliflik hüququ: © 2015 Weinheimer et al. Bu, Creative Commons Attribution License şərtləri əsasında paylanmış açıq giriş məqaləsidir və orijinal müəllif və mənbə qeyd olunmaqla istənilən mühitdə qeyri-məhdud istifadə, paylama və reproduksiyaya icazə verir.

Məlumatın mövcudluğu: Bütün müvafiq məlumatlar kağızda və onun dəstəkləyici məlumat fayllarındadır.

Maliyyələşdirmə: Bu iş Finlandiya Akademiyası (1134335, 1253126 və 1276136 JPTV, 133552 JJ və 259797 CIH), Lundbeck Fondu (MS üçün) və Milli Sağlamlıq İnstitutu (1R03AI0921159-I üçün) tərəfindən maliyyələşdirilib. Molekulyar Biosciences (VGSB) üzrə Viikki Doktorluq Proqramı tərəfindən dəstəklənir. Tədqiqatın dizaynında, məlumatların toplanmasında və təhlilində, nəşr etmək qərarında və ya əlyazmanın hazırlanmasında maliyyə verənlərin heç bir rolu olmayıb.

Rəqabətli maraqlar: Müəlliflər heç bir rəqabət aparan maraqların olmadığını bəyan ediblər.


Materiallar və metodlar

Rr-Luc mRNT 926-nukleotiddən ibarət idi RrpSP64 plazmid polilinkerindən 25 5′-lik tərcümə edilməmiş ardıcıllığın 25 nukleotidi və pSP64 plazmid polilinker ardıcıllığının 19 nukleotidindən ibarət tərcümə olunmamış 3′ ardıcıllığın 25 nukleotidi ilə əhatə olunmuş lusiferaza kodlaşdırma ardıcıllığıSacmən sayt. PP-Luc mRNT-də 1653-nt Pp lusiferaza kodlaşdırma ardıcıllığı var idi. KpnMən saytdan dərhal əvvəl tanıtdım Səh lusiferaza dayandırıcı kodonu. TheSəh kodlaşdırma ardıcıllığı 21 nt pSP64 plazmid polilinkerindən ibarət 5' tərcümə edilməmiş ardıcıllıqla, ardınca isə 5' tərcümə olunmamış bölgənin (UTR) 512 nt ilə əhatə olunmuşdur. Drosophila donqar mRNT və 562-nt-dən ibarət 3' tərcümə edilməmiş ardıcıllıq donqar 3′ UTR, ardınca 6-nt Sacmən sayt. The donqar İstifadə edilən 3′ UTR ardıcıllığı, in vivo və in vitro Nanos Cavab Elementlərinin funksiyasını pozan altı G-to-U mutasiyasından ibarət idi (D. Chagnovich, P.D. Zamore, R. Lehman və D.P. Bartel, nəşr olunmamış). Hər iki məruzəçi mRNA transkripsiya edilmiş plazmiddə kodlanmış 25 nt poli(A) quyruğunda bitir. Hər ikisi üçünRr-Luc və Səh-Luc mRNA-lar, transkriptlər bir nöqtədə parçalanmış plazmid şablonlarından axın transkripsiyası ilə yaradılmışdır.NsiMən dərhal 25-nt-kodlanmış poli(A) quyruğunu izləyən sayt. Transkriptlərin poli(A) quyruğu ilə bitdiyinə əmin olmaq üçünNsiI-yarılmış transkripsiya şablonları dNTP-lərin iştirakı ilə T4 DNT Polimeraz ilə rezeksiya edilmişdir. SP6 mMessage mMachine dəsti (Ambion) in vitro transkripsiya üçün istifadə edilmişdir. Bu dəstlə əldə edilən transkriptlərin ~80%-i 7-metil quanozinlə örtülmüşdür. 32 P-radiolabelinq transkripsiya reaksiyasına [α- 32 P]UTP daxil etməklə həyata keçirilmişdir.

üçün Pp-Luc, ssRNA, asRNA və dsRNA tərcümənin başlanğıcına nisbətən 93-597 mövqelərinə uyğun gəldi və 505-bp dsRNA verdi. Rr üçün-Luc, asRNA, ssRNA və dsRNA tərcümənin başlanğıcına nisbətən 118-618 mövqelərinə uyğun gəldi və 501-bp dsRNA verdi. The Drosophila nanos rəqib dsRNA tərcümənin başlanğıcına nisbətən 122-629 mövqelərinə uyğun gəldi və 508-bp dsRNA verdi. ssRNA, asRNA və dsRNA (Şəkil A-da göstərilmişdir) PCR tərəfindən yaradılan şablonlardan T7 RNT polimeraza ilə in vitro transkripsiya edilmişdir. T7 RNT transkriptlərinin gellə təmizlənməsindən sonra qalıq DNT şablonu RQ1 DNase (Promega) ilə müalicə edilərək çıxarıldı. RNT fenol və xloroform ilə ekstraksiya edilmiş, sonra çökdürülmüş və suda həll edilmişdir.

RNT yumşaldılması və yerli gel elektroforezi

ssRNA və asRNA (0,5 μ m) 10 m m Tris-HCl (pH 7,5) ilə 20 m m NaCl ilə 1 dəqiqə ərzində 95°C-yə qədər qızdırılıb, sonra soyudulub və otaq temperaturunda 12-16 saat müddətində tavlanıb. RNT-lər çökdürüldü və liziz tamponunda (aşağıda) yenidən dayandırıldı. Yuyulmanı izləmək üçün RNT-lər TBE buferində 2%-lik agaroz geldə elektroforezləşdirilmiş və etidium bromidlə boyanmışdır (Sambrook et al. 1989).

Lizat hazırlığı

Oreqon R milçəklərindən sıfırdan 2 saata qədər olan embrionlar 25°C temperaturda mayalanmış bəkməz ağarında toplandı. Embrionlar 50% (həcm/həcm) ağartıcıda 4-5 dəqiqə dexorionlaşdırıldı, su ilə yuyuldu, qurudulmuş və soyudulmuş Potter-Elvehjem toxuma dəyirmanına (Kontes) köçürüldü. Embrionlar 5 mm ditiotreitol (DTT) və 1 mq/ml Pefabloc Manheimringer SCn (Boeheh) olan 1 ml lizis tamponunda (100 mm kalium asetat, pH 7,4-də 30 mm HEPES-KOH, 2 mm maqnezium asetat) 4°C-də parçalanmışdır. ) hər qram nəm embrion. Lizat 14500-də 25 dəqiqə sentrifuqa edildig 4°C-də və supernatant maye azotda alikvotlarda dondurulur və -80°C-də saxlanılır.

Reaksiya şərtləri

Lizat hazırlanması və reaksiya şərtləri Hussain və Leibowitz (1986) tərəfindən təsvir edilənlərdən əldə edilmişdir. Reaksiyalar 50% (həcm/həcm) lizat, mRNA-lar (10-50 pm son konsentrasiya) və ssRNA, asRNA və ya dsRNA (10 n m son konsentrasiya) olan 10% (həcm/həcm) liziz tamponundan ibarət idi. Hər bir reaksiya həmçinin 10 mm kreatin fosfat, 10 μg/ml kreatin fosfokinaz, 100 μ m GTP, 100 μ m UTP, 100 μ m CTP, 500 μ m ATP, 5 mm DTT, 0,1 U/μLme) və Hər amin turşusundan 100 μm. Kalium asetatın son konsentrasiyası 100 m-ə düzəldildi. Standart şərtlər üçün reaksiyalar buz üzərində yığılmış və sonra mRNT əlavə edilməzdən əvvəl 10 dəqiqə ərzində 25°C-də əvvəlcədən inkubasiya edilmişdir. mRNA-lar əlavə edildikdən sonra inkubasiya əlavə 60 dəqiqə davam etdirildi. Şəkillər və Şəkillərdəki təcrübələr üçün 10 dəqiqəlik preinkubasiya mərhələsi buraxıldı. Reaksiyalar 4 cild 1,25 × Passiv Lizis Buferi (Promega) ilə söndürüldü. SəhRr lusiferaza aktivliyi Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) ilə Monolight 2010 Luminometrdə (Analitik Lüminesans Laboratoriyası) aşkar edilmişdir.

RNT sabitliyi

32 P-radiolabelli mRNT ilə reaksiyalar 40 həcmli 2x PK tamponunun (pH 7.5-də 200 m m Tris-HCl, 25 m EDTA, 300 m NaCl, 2% ağırlıq/həcm sulfat dode) əlavə edilməsi ilə söndürüldü. Proteinaz K (suda həll olunan E.M. Merck) 465 μg/ml yekun konsentrasiyaya əlavə edildi. Sonra reaksiyalar 65°C-də 15 dəqiqə inkubasiya edildi, fenol/xloroform/izoamil spirti (25:24:1) ilə ekstraksiya edildi və bərabər həcmdə izopropanol ilə çökdürüldü. Reaksiyalar formaldehid/aqaroza (0,8% ağırlıq/həc) geldə elektroforez yolu ilə təhlil edilmişdir (Sambrook et al. 1989). Radioaktivlik agaroz geli [Nytran Plus membranında (Amersham) vakuum altında qurudulmuş] təsvir lövhəsinə (Fujix) məruz qoymaqla aşkar edilmiş və Fujix Bas 2000 və Image Gauge 3.0 (Fujix) proqram təminatı ilə ölçülmüşdür.

Ticarət lizatları

Təmizlənməmiş dovşan retikulosit lizat (Ambion) və buğda cücərti ekstraktı (Ambion) reaksiyaları istehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq yığılmışdır. dsRNA mRNA-ların əlavə edilməsindən əvvəl 10 dəqiqə ərzində 27°C (buğda rüşeym) və ya 30°C-də (retikulosit lizatında) lizatda inkubasiya edilmişdir.


NƏTİCƏLƏR VƏ MÜZAKİRƏ

LNA-lar, şəkər-fosfat onurğasındakı furanoza halqasının N-tipində (C3′-) kimyəvi cəhətdən kilidləndiyi bisiklik yüksək yaxınlıqlı RNT analoqlarının yeni sinfini təşkil edir. endo ) 2′- daxil edilməsi ilə uyğunlaşma O ,4′- C metilen körpüsü ( 15 , 16 ). Bir sıra tədqiqatlar göstərdi ki, LNT ilə dəyişdirilmiş oliqonukleotidlər DNT və RNT hədəf molekulları ilə hibridləşdikdə görünməmiş istilik sabitliyi nümayiş etdirirlər (16-22). Nəticədə, ərimə temperaturunun artması ( Tm ) dəyişdirilməmiş duplekslərlə müqayisədə tamamlayıcı DNT-yə qarşı tətbiq edilən LNT monomerinə görə +1-8°C və tamamlayıcı RNT-yə qarşı monomerə görə +2-10°C olduğu bildirilmişdir. NMR spektroskopiyası və rentgen kristalloqrafiyasına əsaslanan müxtəlif LNT-RNT və LNT-DNT heteroduplekslərinin struktur tədqiqatları göstərdi ki, LNT RNT təqlididir və A tipli Watson-Crick dupleks həndəsəsinə (23-26) uyğun gəlir. dsRNA dupleksləri. Bundan əlavə, LNT oliqonukleotidləri və onların tamamlayıcı DNT oliqonukleotidləri arasındakı heteroduplekslərdə, heteroduplekslərin sabitliyinin artması ilə nəticələnən B tipli dupleksdən A tipli dupleksə ümumi keçid bildirilmişdir. Digər mühüm müşahidə odur ki, LNT monomerləri həm də S tipli (C2′-) qanadlı DNT nukleotidlərinin şəkər konformasiyasını bükməyə qadirdirlər. endo ) LNT ilə modifikasiya olunmuş DNT oliqonukleotidlərindəki N tipli şəkər puckerinə doğru (25 – 26). LNT oliqonukleotidlərinin misli görünməmiş istilik sabitliyi və təkmilləşdirilmiş uyğunsuzluq ayrı-seçkiliyi onları yüksək dəqiqlikli genotipləşdirmə analizləri üçün yaxşı uyğunlaşdırmışdır (20, 27-29). Bundan əlavə, LNT ilə əvəzlənmiş oliqonukleotidlər, LNT antisensisi (18 – 19, 31 – 33) və daha çox güclü və seçici gen yıxmaqda, ləkəli oliqonukleotid mikroarraylar (30) ilə gen ifadə profilinin yaradılmasında həssaslıq və spesifikliyi artırmaq üçün istifadə edilmişdir. bu yaxınlarda, LNA oliqo (T) yaxınlıq tutması (21) ilə lizizə olunmuş hüceyrə və toxuma ekstraktlarından bütöv poli(A) + RNT-nin səmərəli izolyasiyasında.

LNT-lərin tamamlayıcı RNT hədəflərinə qarşı təkmilləşdirilmiş hibridləşmə xassələrindən və LNT monomerlərinin kimerik LNT-DNT oliqonukleotidlərindəki qonşu DNT nukleotidlərini A tipli həndəsə ilə pozmaq qabiliyyətindən istifadə etmək üçün biz müxtəlif mikroRNA-ların aşkarlanması üçün bir neçə LNA-dəyişdirilmiş oliqonukleotid zondları hazırladıq. heyvanlar və bitkilər LNA əvəzetmə modelində müntəzəm intervallarla (Cədvəl 1). Birincisi, biz nisbətən az miqdarda yetkin olan LNT ilə dəyişdirilmiş oliqonukleotidləri sintez etdik. A.thaliana miR171, hər ikinci və hər üçüncü nukleotid mövqeyini burada müvafiq olaraq miR171LNA2 və miR171LNA3 kimi təyin edilmiş LNA monomeri ilə əvəz etməklə (Cədvəl 1). miR171 DNT zondunun müntəzəm aralıklı LNA-larla əvəz edilməsi, yetkin miR171-in aşkarlanmasında həssaslığın əhəmiyyətli dərəcədə artması ilə nəticələndi. A.thaliana çiçəklər və yarpaqlar 5′-etiketli zondlarla, şimal ləkə analizində aşağı sərt yuma şərtlərindən istifadə edildikdə (Şəkil 1), onların artan termal dupleks sabitliyinə uyğun olaraq (Cədvəl 1). Həm LNA ilə modifikasiya olunmuş miR171 zondları, həm də DNT zondları ilə aşkar edilən daha böyük RNT-lər 123 nt miRNA 171 kök döngə sələfinin gözlənilən ölçüsünə uyğun gəlmirdi, lakin çox güman ki, digərləri ilə qeyri-spesifik hibridləşməni təmsil edirdi. A.thaliana RNT-lər (Şəkil 1). Radioaktiv etiketli miR171LNA2 zondunun istifadəsi DNT zondu ilə müqayisədə artan həssaslıq göstərsə də, bu, həmçinin verilmiş şəraitdə yüksək fonla nəticələndi, ehtimal ki, zondun yüksək LNT əvəzetmə dərəcəsi (50% LNA) sayəsində dönüş, LNT-RNT duplekslərinin son dərəcə yüksək dupleks sabitliyi ilə nəticələndi. Bunun əksinə olaraq, miR171LNA3 zondu əhəmiyyətli dərəcədə təkmilləşdirilmiş həssaslıq göstərdi, eyni zamanda DNT nəzarət zondu ilə müqayisə edilə bilən şimal ləkəsində aşağı fon var. Nəticə etibarilə, yetkinliyə uyğun gələn xüsusi hibridləşmə siqnalı A.thaliana miR171 miR171LNA3 oliqonukleotid zondu ilə 3 saat məruz qaldıqdan sonra əldə edilə bilərdi, halbuki DNT nəzarət zondu müqayisə edilə bilən hibridləşmə siqnalını əldə etmək üçün 48 saat məruz qalma tələb edirdi (Şəkil 1). Gözlənildiyi kimi, miR171LNA2 və miR171LNA3 ilə yoxlanmış şimal ləkələrinin uzun müddət məruz qalması yüksək dərəcədə ifşa olunmuş avtoradioqramlarla nəticələndi. Oxşar nəticələr, yetkin miR159-un aşkarlanmasında LNA2- və LNA3-dəyişdirilmiş zondları müqayisə etməklə əldə edilmişdir. A.thaliana , istisna olmaqla, güclü miRNA159-a xas siqnallar 1 saat məruz qaldıqdan sonra etiketli miR159LNA3 zondu ilə əldə edilmişdir (məlumatlar göstərilmir). LNT ilə dəyişdirilmiş mikroRNT zondları ilə əldə etdiyimiz tapıntılar müxtəlif LNT-RNT hibrid strukturlarının NMR spektroskopik tədqiqatları ilə dəstəklənir (25, 26). Yaranan qeyri-adsız LNA3-RNT hibridində tamamlayıcı 9mer DNT zəncirinin üç LNA ilə əvəz edilməsi belə nəticəyə gəldi ki, LNA modifikasiyalarının sayı A kimi dupleks həndəsəyə struktur dəyişikliyi ilə bağlı doyma səviyyəsinə çatıb. Beləliklə, LNA-RNT dupleksində tam dəyişdirilmiş LNA nonameri tərəfindən təqdim edilən struktur dəyişikliyinin LNA3-RNT dupleksi ilə müqayisədə kiçik olduğu aşkar edildi. Tm bu dupleks əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (26). Eynilə, hesablanmış Tm dəyərlərimiz A.thaliana LNA2 ilə modifikasiya edilmiş miRNA zondları LNA3 zondları ilə müqayisədə daha yüksək idi, şimaldakı yüksək fonun nümayiş etdirdiyi kimi şimal ləkə analizində hibridləşmə və yuyulma şəraitinin daha da optimallaşdırılmasını tələb edir. Bunun əksinə olaraq, LNA3 ilə modifikasiya edilmiş miRNA zondları hibridləşmə şərtlərinin əlavə tənzimlənməsi olmadan standart şimal ləkələrində asanlıqla istifadə edilə bilər. Beləliklə, biz bütün sonrakı müqayisəli təcrübələrdə LNA3 ilə əvəz edilmiş mikroRNT zondlarından istifadə etmək qərarına gəldik.

Az miqdarda miR171-in aşkarlanmasında LNA2- və LNA3-lə dəyişdirilmiş oliqonukleotid zondlarının DNT zondları ilə müqayisəsi A.thaliana şimal blot analizi ilə çiçəklər və yarpaqlar. Ümumi RNT-lər (40 μg/nümunə). A.thaliana çiçəklər (1-ci zolaq) və ya yarpaqlar (2-ci zolaq) denaturasiya şəraitində 12%-li poliakrilamid geldə elektroforasiya edilmiş, ləkələnmiş və 32 P etiketli miR171LNA2 () ilə hibridləşdirilmişdir. A ), miR171LNA3 ( B ) və miR171DNA ( C ) 37°C-də oliqonukleotid zondları. Membranlar aşağı sıxlıqla yuyulur. Gel yükləmə nəzarətləri rRNA-ların (alt panellər) etidium bromid boyanmasından göstərilir. M 20-80 nukleotidin RNT molekulyar çəkisi markerini bildirir.

Az miqdarda miR171-in aşkarlanmasında LNA2- və LNA3-lə dəyişdirilmiş oliqonukleotid zondlarının DNT zondları ilə müqayisəsi A.thaliana şimal blot analizi ilə çiçəklər və yarpaqlar. Ümumi RNT-lər (40 μg/nümunə). A.thaliana çiçəklər (1-ci zolaq) və ya yarpaqlar (2-ci zolaq) denaturasiya şəraitində 12%-li poliakrilamid geldə elektroforasiya edilmiş, ləkələnmiş və 32 P etiketli miR171LNA2 () ilə hibridləşdirilmişdir. A ), miR171LNA3 ( B ) və miR171DNA ( C ) 37°C-də oliqonukleotid zondları. Membranlar aşağı sıxlıqla yuyulur. Gel yükləmə nəzarətləri rRNA-ların (alt panellər) etidium bromid boyanmasından göstərilir. M 20-80 nukleotidin RNT molekulyar çəkisi markerini bildirir.

LNA3 ilə modifikasiya olunmuş oliqonukleotid zondları tərəfindən şimal ləkələri ilə yetkin mikroRNT-lərin aşkarlanmasında həssaslıq eyni miqyasda ardıcıl seyreltmələrin yüklənməsi ilə qiymətləndirilmişdir. A.thaliana şimal gellərində 100-dən 2.5 μg-a qədər ümumi RNT nümunəsi, ardınca müvafiq olaraq 5′ son etiketli miR171LNA3, miR171DNA, miR319LNA3 və miR319DNA zondları ilə hibridləşmə (Şəkil 2). LNA3 zondlarının istifadəsi yetkinlər üçün həssaslığın əhəmiyyətli dərəcədə artması ilə nəticələndi A.thaliana miR171 və miR319, ilkin nəticələrimizə uyğun olaraq, 2,5 μg ümumi RNT-də asanlıqla aşkar edilə bilən bir siqnal göstərir. Həssaslığın orta artımının müvafiq DNT nəzarət zondları ilə müqayisədə ən azı 10 dəfə olduğu təxmin edilmişdir (Şəkil 2).

miR171 və miR319-un aşkarlanmasında DNT zondları ilə müqayisədə LNA3 ilə dəyişdirilmiş zondların həssaslığının qiymətləndirilməsi A.thaliana şimal blot analizi ilə çiçəklər. İki dublikat seyreltmə seriyası A.thaliana 100-dən 2,5 mkq-a qədər olan ümumi RNT denaturasiya şəraitində 12% poliakrilamid geldə elektroforezləşdirilmiş, ləkələnmiş və 32 P işarəli DNT ilə hibridləşdirilmişdir ( A ) və LNA3 ( B ) oliqonukleotid zondları, müvafiq olaraq, 34°C-də. Filtrlər əvvəlcə yetkin mir171 üçün spesifik LNA3 və DNT zondları ilə hibridləşdirilmiş, aşağı sərtliklə yuyulmuş və göstərildiyi kimi ifşa edilmişdir. Filtrlər soyulmuş, zondların çıxarılmasının tamamlandığını yoxlamaq üçün ifşa edilmiş, sonra yetkin miR319 üçün xüsusi olan LNA3 və DNT zondları ilə yenidən hibridləşdirilmiş, aşağı sərtliklə yuyulmuş və göstərildiyi kimi ifşa edilmişdir. Gel yükləmə nəzarətləri rRNA-ların (alt panellər) etidium bromid boyanmasından göstərilir.

miR171 və miR319-un aşkarlanmasında DNT zondları ilə müqayisədə LNA3 ilə dəyişdirilmiş zondların həssaslığının qiymətləndirilməsi A.thaliana şimal blot analizi ilə çiçəklər. İki dublikat seyreltmə seriyası A.thaliana 100-dən 2,5 mkq-a qədər olan ümumi RNT denaturasiya şəraitində 12% poliakrilamid geldə elektroforezləşdirilmiş, ləkələnmiş və 32 P işarəli DNT ilə hibridləşdirilmişdir ( A ) və LNA3 ( B ) oliqonukleotid zondları, müvafiq olaraq, 34°C-də. Filtrlər əvvəlcə yetkin mir171 üçün spesifik LNA3 və DNT zondları ilə hibridləşdirilmiş, aşağı sərtliklə yuyulmuş və göstərildiyi kimi ifşa edilmişdir. Filtrlər soyulmuş, zondların çıxarılmasının tamamlandığını yoxlamaq üçün ifşa edilmiş, sonra yetkin miR319 üçün xüsusi olan LNA3 və DNT zondları ilə yenidən hibridləşdirilmiş, aşağı sərtliklə yuyulmuş və göstərildiyi kimi ifşa edilmişdir. Gel yükləmə nəzarətləri rRNA-ların (alt panellər) etidium bromid boyanmasından göstərilir.

Daha sonra, şimal ləkələri ilə mikroRNT aşkarlanmasında spesifikliyi yaxşılaşdırmağa imkan verən yüksək sərt hibridləşmə və yuyulma şərtlərindən istifadə etmək imkanını araşdırdıq, xüsusən də yüksək homoloji miRNA-ları aşkar etdikdə, məsələn. let-7 mikroRNT ailəsinin üzvləri (34). hibridləşməsi A.thaliana miR171LNA3 zondu ilə kiçik RNT şimal ləkələri hətta yüksək sərt yuma şərtlərindən (0,1 × SSC, 0,1% SDS-də 65°C-də Şəkil 3A) istifadə edərkən yetkin miR171-ə uyğun yüksək spesifik siqnallarla nəticələndi. Bunun əksinə olaraq, zondun mərkəzi mövqelərində iki ardıcıl uyğunsuzluq olan miR171LNA3/2MM zondu (Cədvəl 1) və DNT-yə nəzarət oliqonukleotidi şimal ləkəsində miR171-i zəif aşkar etdi (Şəkil 3B və C). Bundan əlavə, TCVLNA3 nəzarət zondu xüsusi olaraq virusdan əldə edilən siRNA-ları aşkar etdi. Şalgam qırış virusu (TCV) ilə yoluxmuşdur A.thaliana bitkilər, lakin yoluxmamış bitki RNT nümunələrində kiçik RNT yoxdur (Şəkil 3D). Birlikdə götürüldükdə, bu nəticələr göstərir ki, DNT oliqonukleotid zondlarının LNA3 əvəzetmə modelindən istifadə edərək LNT ilə modifikasiyası şimal analizi ilə yetkin mikroRNT-lərin aşkarlanmasında yüksək sərt hibridləşmə şərtlərindən istifadə etməyə imkan verir.

miR171-in aşkarlanmasında təkmilləşdirilmiş həssaslıq və spesifiklik A.thaliana çiçəklər və yarpaqlar LNA3-dəyişdirilmiş oliqonukleotid zondundan istifadə edərək şimal ləkəsi analizi ilə. Ümumi RNT-lər (20 μg/nümunə). A.thaliana tinglər (1-ci zolaq), yarpaqlar (2-ci zolaq), çiçəklər (3-cü zolaq) və TCV (Şalğam qırışları virusu) ilə yoluxmuş yarpaqlar (zolaq 4) denaturasiya şəraitində 12%-li poliakrilamid gel üzərində elektroforezləşdirilmiş, ləkələnmiş və 32 P işarəsi ilə hibridləşdirilmişdir. miR171LNA3 ( A ), miR171LNA3/2MM ( B ), miR171DNA ( C ) və TCVLNA3 oliqonukleotid zondları 42°C-də ( D ). Güclü yuyulmalar 0,1 × SSC, 0,1% SDS-də 65 ° C-də iki dəfə 5 dəqiqə ərzində aparıldı. Gel yükləmə nəzarətləri rRNA-ların (alt panellər) etidium bromid boyanmasından göstərilir.

miR171-in aşkarlanmasında təkmilləşdirilmiş həssaslıq və spesifiklik A.thaliana çiçəklər və yarpaqlar LNA3-dəyişdirilmiş oliqonukleotid zondundan istifadə edərək şimal ləkəsi analizi ilə. Ümumi RNT-lər (20 μg/nümunə). A.thaliana tinglər (1-ci zolaq), yarpaqlar (2-ci zolaq), çiçəklər (3-cü zolaq) və TCV (Şalğam büzüşmə virusu) ilə yoluxmuş yarpaqlar (zolaq 4) denaturasiya şəraitində 12%-li poliakrilamid geldə elektroforezləşdirilmiş, ləkələnmiş və 32 P işarəsi ilə hibridləşdirilmişdir. miR171LNA3 ( A ), miR171LNA3/2MM ( B ), miR171DNA ( C ) və TCVLNA3 oliqonukleotid zondları 42°C-də ( D ). Güclü yuyulmalar 0,1 × SSC, 0,1% SDS-də 65 ° C-də iki dəfə 5 dəqiqə ərzində aparıldı. Gel yükləmə nəzarətləri rRNA-ların (alt panellər) etidium bromid boyanmasından göstərilir.

LNA3 ilə dəyişdirilmiş mikroRNT zondlarının ayrı-seçkilik gücünü daha da araşdırmaq üçün biz üç əlavə uyğunsuzluq zondunu sintez etdik. A.thaliana miR171, miR171LNA3/MM8, miR171LNA3/MM11, miR171LNA3/MM14, oliqonukleotid ardıcıllığının üç müxtəlif mövqeyində tək uyğunsuzluğa malikdir (Cədvəl 1). hibridləşməsi A.thaliana kiçik RNT şimal ləkəsi mükəmməl uyğunlaşma zondu ilə müqayisədə hər üç uyğunsuzluq zondu tərəfindən yetkin miRNA171 üçün siqnalların əhəmiyyətli dərəcədə azalması ilə nəticələndi, baxmayaraq ki, bir qədər fərqli dərəcədə, ikiqat uyğunsuzluq zondu tərəfindən heç bir siqnal aşkar edilmədi (Şəkil 4). Yüksək sərt yuma şərtlərindən istifadə etməklə, tək uyğunsuzluq zondları tərəfindən əldə edilən hibridləşmə siqnalı daha da azaldıla bilər, halbuki mükəmməl uyğunluq zondu miR171LNA3 ilə əldə edilən siqnal eyni şəraitdə dəyişməz qalmışdır (Şəkil 4). Bu, LNA zondları (20, 27 – 29) tərəfindən təkmilləşdirilmiş uyğunsuzluq ayrı-seçkiliyinə dair əvvəlki hesabatlarla yaxşı uyğunlaşır və etiketli, LNA3 ilə əvəz edilmiş zondlar tərəfindən mikroRNT aşkarlanmasının yüksək spesifik olduğunu nəzərdə tutur.

MiR171-in aşkarlanmasında mükəmməl uyğunluq və müxtəlif uyğunsuz zondlardan istifadə edərək LNA3 ilə dəyişdirilmiş zondların spesifikliyinin qiymətləndirilməsi A.thaliana şimal blot analizi ilə çiçəklər və yarpaqlar. Ümumi RNT-lər (20 μg/nümunə). A.thaliana çiçəklər (1-ci zolaq) və yarpaqlar (2-ci zolaq) denaturasiya şəraitində 12%-li poliakrilamid geldə elektroforasiya edilmiş, ləkələnmiş və 32 P işarəli miR171LNA3 () ilə hibridləşdirilmişdir. A ), miR171LNA3/2MM ( B ), miR171LNA3/MM11 ( C ), miR171LNA3/MM8 ( D ) və miR171LNA3/MM14 ( E ) 45°C-də LNT ilə dəyişdirilmiş oliqonukleotid zondları. Filtrlər aşağı sərtlikdə (yuxarı panellər) və yüksək sərtlikdə (orta panellər) yuyulur. Gel yükləmə nəzarətləri rRNA-ların (alt panellər) etidium bromid boyanmasından göstərilir. ( F ) Mükəmməl uyğunluğun və tamamlayıcı DNT oliqonukleotid hədəflərindən istifadə edərək fərqli uyğunsuz LNT zondlarının təsdiqi. Son etiketli LNT ilə dəyişdirilmiş zondlar mükəmməl uyğun DNT oliqonukleotid hədəflərinə, həmçinin yetkin miRNA171 ardıcıllığına uyğun gələn DNT oliqonukleotidinə hibridləşdirildi.

MiR171-in aşkarlanmasında mükəmməl uyğunluq və müxtəlif uyğunsuz zondlardan istifadə edərək LNA3 ilə dəyişdirilmiş zondların spesifikliyinin qiymətləndirilməsi A.thaliana şimal blot analizi ilə çiçəklər və yarpaqlar. Ümumi RNT-lər (20 μg/nümunə). A.thaliana çiçəklər (1-ci zolaq) və yarpaqlar (2-ci zolaq) denaturasiya şəraitində 12%-li poliakrilamid geldə elektroforasiya edilmiş, ləkələnmiş və 32 P etiketli miR171LNA3 () ilə hibridləşdirilmişdir. A ), miR171LNA3/2MM ( B ), miR171LNA3/MM11 ( C ), miR171LNA3/MM8 ( D ) və miR171LNA3/MM14 ( E ) 45°C-də LNT ilə dəyişdirilmiş oliqonukleotid zondları. Filtrlər aşağı sərtlikdə (yuxarı panellər) və yüksək sərtlikdə (orta panellər) yuyulur. Gel yükləmə nəzarətləri rRNA-ların (alt panellər) etidium bromid boyanmasından göstərilir. ( F ) Mükəmməl uyğunluğun və tamamlayıcı DNT oliqonukleotid hədəflərindən istifadə edərək fərqli uyğunsuz LNT zondlarının təsdiqi. Son etiketli LNT ilə dəyişdirilmiş zondlar mükəmməl uyğun DNT oliqonukleotid hədəflərinə, həmçinin yetkin miRNA171 ardıcıllığına uyğun gələn DNT oliqonukleotidinə hibridləşdirildi.

Nəhayət, biz beş müxtəlif mikroRNA-nın, siçan miR122a, miR124 və miR128 və bitki miR161 və miR167-nin ifadə nümunələrinin səciyyələndirilməsində LNA3 ilə dəyişdirilmiş miRNA oliqonukleotid problarının faydasını nümayiş etdirdik. Siçan beynindən və qaraciyərindən çıxarılan ümumi RNT nümunələri və A.thalianaN.benthamiana çiçəklər və yarpaqlar şimal ləkə analizlərinə məruz qalmış və müxtəlif LNA3-dəyişdirilmiş zondlarla hibridləşdirilmişdir. Yetkin siçan miR124 və miR128-ə uyğun yüksək spesifik siqnallar siçan beynində aşkar edildi, lakin qaraciyərdə yox (Şəkil 5B və C), miR122a isə yalnız qaraciyər RNT nümunəsində (Şəkil 5A) aşkar edildi, bu da yaxşı uyğunluq təşkil edir. əvvəlki hesabatlarla (35). Mənfi nəzarət kimi TCVLNA3 probundan istifadə etməklə qeyri-spesifik fon siqnalları aşkar edilmədi (Şəkil 5D). Yetkin miR167 hər ikisində aşkar edilmişdir A.thalianaN.benthamiana çiçəklər və yarpaqlar (Şəkil 5E), halbuki bizim nəticələrimiz miR161 varlığının spesifik olduğunu ortaya qoydu. A.thaliana mənşəli nümunələrdə heç bir siqnal aşkar edilmədiyi üçün toxumalardan N.benthamiana (Şəkil 5F).

Üç siçanın və ikisinin Northern blot analizi A.thaliana LNA3 ilə dəyişdirilmiş oliqonukleotid zondlarından istifadə edən mikroRNA-lar. (A–D) Siçan beynindən (1-ci zolaq), qaraciyərdən (2-ci zolaq) və ümumi RNT-lər (20 μg/nümunə) A.thaliana çiçəklər (3-cü zolaq) denaturasiya şəraitində 12% poliakrilamid gellərində elektroforezləşdirilmiş, ləkələnmiş və 32 P işarəli miR122aLNA3 () ilə hibridləşdirilmişdir. A ), miR128LNA3 ( B ), miR124LNA3 ( C ) LNA zondları, eləcə də mənfi nəzarət zondu kimi TCVLNA3 ( D ) 45°C-də. ( EF ) Ümumi RNT (20 μg/nümunə) -dən A.thaliana çiçəklər (1-ci zolaq), yarpaqlar (2-ci zolaq) və N.benthamiana çiçəklər (3-cü zolaq), yarpaqlar (4-cü zolaq) denaturasiya şəraitində 12%-li poliakrilamid geldə elektroforasiya edilmiş, ləkələnmiş və 45°C-də 32 P işarəli miR167LNA3 (E), miR161LNA3 (F) oliqonukleotid zondları ilə hibridləşdirilmişdir. Filtrlər aşağı sıxlıqda yuyulur. Gel yükləmə nəzarətləri rRNA-ların (alt panellər) etidium bromid boyanmasından göstərilir.

Üç siçanın və ikisinin Northern blot analizi A.thaliana LNA3 ilə dəyişdirilmiş oliqonukleotid zondlarından istifadə edən mikroRNA-lar. (A–D) Siçan beynindən (1-ci zolaq), qaraciyərdən (2-ci zolaq) və ümumi RNT-lər (20 μg/nümunə) A.thaliana çiçəklər (3-cü zolaq) denaturasiya şəraitində 12% poliakrilamid gelləri üzərində elektroforasiya edilmiş, ləkələnmiş və 32 P işarəli miR122aLNA3 () ilə hibridləşdirilmişdir. A ), miR128LNA3 ( B ), miR124LNA3 ( C ) LNA zondları, eləcə də mənfi nəzarət zondu kimi TCVLNA3 ( D ) 45°C-də. ( EF ) Ümumi RNT (20 μg/nümunə) -dən A.thaliana çiçəklər (1-ci zolaq), yarpaqlar (2-ci zolaq) və N.benthamiana çiçəklər (3-cü zolaq), yarpaqlar (4-cü zolaq) denaturasiya şəraitində 12%-li poliakrilamid geldə elektroforezləşdirilmiş, ləkələnmiş və 45°C-də 32 P işarəli miR167LNA3 (E), miR161LNA3 (F) oliqonukleotid zondları ilə hibridləşdirilmişdir. Filtrlər aşağı sıxlıqda yuyulur. Gel yükləmə nəzarətləri rRNA-ların (alt panellər) etidium bromid boyanmasından göstərilir.

Yekun olaraq, biz burada məlumat veririk ki, DNT oliqonukleotidlərinin LNT ilə qismən əvəzlənməsi şimal ləkə analizi ilə yetkin mikroRNT-lərin aşkarlanmasında həssaslığın əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşması ilə nəticələnir, eyni zamanda yüksək spesifikdir. Çünki LNT zondlarının elektrostatik xüsusiyyətləri DNT və RNT oliqonukleotidlərinə bənzəyir və LNT kimyasının DNT fosforamidit kimyası ilə tam uyğunluğu standart fosforamidit kimyası və oliqonukleotidlərin təmizlənməsi üsullarından istifadə edərək LNT oliqonukleotid zondlarının sintezini asanlaşdırır. Digər mühüm praktik üstünlük ondan ibarətdir ki, LNT ilə modifikasiya olunmuş oliqonukleotidlər suda tam həll olunur, bu da onların etiketlənməsini və nuklein turşularının hibridləşdirilməsi təcrübələrində istifadəsini sadə edir (16, 17). Hər üçüncü nukleotidin mövqeyinin müvafiq LNA nukleotidi ilə dəyişdirildiyi LNA3 əvəzetmə modelindən istifadə edərək DNT oliqonukleotidlərini LNA-larla dəyişdirərək, standart son etiketləmə üsullarından və hibridləşmə şərtlərindən istifadə edərək şimal ləkə analizində zondlardan istifadə edə bildik. Şimal ləkələri ilə yetkin mikroRNA-ların aşkarlanmasında həssaslıq DNT zondları ilə müqayisədə ən azı 10 dəfə artdı, eyni zamanda uyğunsuzluq LNA3 zondlarının istifadəsi ilə nümayiş etdirildiyi kimi yüksək spesifiklik oldu. Şimal zondları kimi yüksək səmərəli olmaqla yanaşı, eyni LNA3 ilə dəyişdirilmiş oliqonukleotid zondları mikroRNT-lərin məkan ifadəsini həll etmək üçün də faydalı ola bilər. yerində hibridləşmə, eləcə də yetkin və prekursor mikroRNT-ləri aşkar etmək üçün nəzərdə tutulmuş müxtəlif LNA-dəyişdirilmiş tutma zondlarından istifadə edərək ləkəli mikroarraylarla ifadə profilinin yaradılması.

Exiqon-da əla texniki yardıma görə Marianne Bonde Mogensen və Mette Bjørn-a təşəkkür etmək istərdik. Bu tədqiqat Macarıstan Elmi Tədqiqat Fondunun qrantı (OTKA T038313) və RIBOREG EU FP6 layihəsinin (LSHG-CT-2003503022) bir hissəsi kimi Avropa Komissiyasının qrantı ilə dəstəklənib.


Eksperimental prosedurlar

Binar RNAi hairpin vektorunun qurulması və düyü çevrilməsi

Üçün müdaxilə edən ardıcıllıqlar MsChi1 (qoşulma No AY508698.1) və MsChi2 (qoşulma No. AB201283.1) -dən gücləndirilmişdir M. separata bağırsağın toxuma cDNA-sı və pCB2004B ikili vektoruna ters çevrilmiş təkrarlar kimi daxil edilir və bir saç sancağı RNAi vektoru yaratmaq üçün şlüz klonlanır. Bu tədqiqatda istifadə olunan bütün primerlər Cədvəl S3-də verilmişdir. Rekombinant vektorlar daxil edilmişdir Agrobacterium tumefaciens süzün EHA105 və düyü (Oryza sativa L. spp. japonica) çevrilmə və seçim Wuriyanghana görə həyata keçirilmişdir və b., 2009. Müsbət transformantlar Basta seleksiyası (20mg/mL BlpR) ilə yoxlanılmış və transgenik şitillər hədəfdə genomik DNT PCR analizi ilə təsdiq edilmişdir. MsChi1 və ya MsChi2 gen və 35S promotoru. Southern blots üçün, beş µg genomik DNT məhdudlaşdırma fermenti ilə həzm olundu. EkoRI və 0,8% (w/v) agaroz gel elektroforezi ilə ayrılır. The DNA was denatured and transferred to nylon membranes in 20 X SSC solution by capillary transfer and fixed with UV cross-linker. Digoxin (DIG) labelled probes for MsChi1MsChi2 were used for hybridization, and the hybridization signal was detected by chemiluminescence method according to Ganbaatar və b., 2017 . The fresh leaves of transgenic rice and control wild-type rice were collected and used for feeding assays.

Insect feeding and bioassays

Laboratory-adapted M. separata eggs were provided by The Institute of Plant Protection (IPP), Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS). Synchronous third-instar larvae were used in feeding bioassays. The number of surviving larvae was recorded at every other day. After seven days’ feeding, surviving larvae were collected and the body weight and body length were measured. For RT-qPCR experiments on target gene expression and siRNA sequencing, larvae were collected after three days’ feeding and total RNAs were extracted from dissected gut tissues. RNA isolation, RT-PCR, RT-qPCR and northern blot for siRNA detection were performed as Ganbaatar və b., 2017 . Ratio of mRNA abundance between M. separata gene silenced and control sample was calculated by 2 -ΔΔCT method for RT-qPCR. Three biological replicates were performed, and statistical analysis was performed between treated and the control group.

DsRNA/siRNA synthesis, labelling, larvae feeding and bioassays

Interfering sequences for MsActin (accession No. GQ856238.1) were amplified using gene-specific primers containing the T7 promoter sequence 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3' at the 5' end. Three fragments of 241 bp (100–340), 231 bp (1060–1290) and 475 bp (893–1367) were used as the templates to synthesize dsRNAs, namely ds100, ds1060 and ds893, by the 5 X MEGAscript® T7 kit (Cao və b., 2017 ). SiRNA was produced by treatment of ds893 with ShortCut® RNaseIII and was named si893. 100 ng/μl dsRNA or 50 ng/μl siRNA was mixed with artificial diet for feeding experiments. ds893 was chosen for labelling of dsRNA and siRNA. In dsRNA synthesis reactions, UTP was partly replaced with DIG-UTP or Cy3-UTP to obtain labelled dsRNA. Cy3-labelled dsRNA was digested with ShortCut® RNaseIII to obtain Cy3-labelled siRNA. The labelled dsRNA/siRNAs were fed to the larvae. After feeding of DIG-labelled dsRNA for 4 h and 24 h, gut RNA was extracted, resolved on a 1% agarose gel, transferred to nylon membranes and DIG RNA signals on the membrane were visualized with BCIP/NBT alkaline phosphatase substrate solution. After feeding of Cy3-labelled dsRNA or siRNA for 4 h, gut tissue was sectioned, and Cy3 signals and the nuclei were visualized using a 550 nm (Cy3) and 360 nm (DAPI) for excitation and 570 nm (Cy3) and 460 nm (DAPI) for emission under a laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss, LSM 710).

Small RNA sequencing, bioinformatic analysis and detection with northern blot hybridization

Three μg of total RNA for each sample was used for generation of small RNA libraries. Synthetic oligonucleotide adapters were ligated to the RNA using T4 RNA ligase. Adapter ligated RNA was reverse transcribed and PCR amplified. PCR products were resolved on 8% polyacrylamide gels, and DNA fragments of 140-160bp were recovered from the gel. The library was sequenced on the Illumina Hiseq 2500 platform and 50bp single-end reads were generated. Small RNAs were mapped to reference sequences by Bowtie2 (version 2.4.1) without mismatches to analyse the target-specific sRNAs. The sorted.bam files resulted from Bowtie2 and samtools (version 1.10) were used for analysis of small RNA size distribution. The small RNAs were visualized by the artemis software (version 18.1.0). Target-specific siRNAs were manually checked via local BLAST, and the numbers of siRNAs were comparatively analysed between treatment and control groups. Small RNA northern blot detection was performed as in the literature using DIG-labelled RNA probes (Ganbaatar və b., 2017 ).

Screening of RNAi machinery genes, evolutionary analysis, RT-PCR and northern blot analysis

M. separata unigenes were obtained by transcriptome sequencing in our previous publication (Liu və b., 2016 ). M. separata RNAi machinery genes were identified from transcriptome data by using homologous gene sequences from other insect species as a query. The protein sequences were multiple compared using ClustalW2. MEGA-X was used to build the phylogenetic tree via the maximum likelihood method, and the bootstrap method was used to verify the quality of evolutionary tree with 1000 times of inspection. Regular PCR was performed using M. separata gut cDNA to detect the presence of the mRNAs for RNAi machinery genes. Northern hybridization experiments were carried out using M. separata gut RNA and 32 P-UTP-labelled negative strand probes according to our previous publication (Diao və b., 2019 ).

Synthesis of PTA expression cassette and transient knockdown analysis in N. benthamiana

We modified PTG (polycistronic-tRNA and CRISPR guide RNA) (Xie və b., 2015 ) to obtain PTA (polycistronic-tRNA-amiR) for silencing of multiple target genes. Gene-specific amiR was designed and synthesized according to literature (Diao və b., 2019 ) using Arabidopsis thaliana miR159b as the backbone. Multiple tRNAs and amiRs sequences were assembled by GoldenGate assembly, amplified with border-specific primers and cloned into the pMD19T vector. KpnΙ/XbaΙ digested PTA fragments were subcloned into the pBI121 vector to produce recombinant PTA vectors. For transient silencing assays, two amiRs for the GUS (β-glucuronidase) və GFP (Green fluorescent protein) genes were designed and assembled into one PTA construct. Recombinant vectors were transformed into Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 and infiltrated into N. benthamiana leaves together with GFP expressing TMV-GFP or GUS expressing pBI121-GUS vectors. As a control, single amiR constructs for GFP və ya GUS were used in parallel experiments. Three days post infiltration, target GFP və ya GUS mRNA expression was evaluated by RT-qPCR using NbActin (accession No. NM_102866.3) as an internal control. GFP fluorescence was also detected using a hand held UV lamp (365 nm).

PTA construct for M. separata gene silencing, maize transformation and insect bioassays

For multiple gene silencing, we chose MsChi2, MsActinMsREase (Unigene No., Cluster-3827.32653) as the target genes, and the PTA vector was constructed as described above and transformed into Agrobacterium tumefaciens strain EHA101. Maize transformation was performed on immature embryos from the inbred line maize cultivar B104 according to the literature (Vi və b., 2019 Xiang və b., 2018 ). The complete plantlets with healthy roots were transplanted into soil pots and the transgenic seedlings were confirmed using regular PCR with genomic DNA as template. The fresh leaves of transgenic maize and control wild-type maize were collected and used for feeding assays.

Protein expression, purification and biochemical analysis

Protein expression and purification procedures followed the published methods (Wuriyanghan və b., 2009 ). Briefly, the PAZ domain of MsAGO2, the RNaseIII domain of MsDcr2, N-terminal domain of MsSID1 and the whole ORF of MsChi2 were expressed as GST fusions in E. coli strain BL21 (DE3) by pGEX-4T-1 recombinant vectors via IPTG induction. Recombinant GST-tagged proteins were purified and confirmed by SDS-PAGE or protein gel blotting using a mouse anti-GST monoclonal antibody.

Biochemical analysis was performed according to Rivas və b., 2005 . For RNA labelling, ds100 was treated with CIP to dephosphorylate the 5’ ends, purified by phenol/chloroform extraction and end-labelled by 32 P ATP and T4 polynucleotide kinase to obtain 32 P-labelled dsRNA. For ssRNA, 26nt short RNA 5′-GGGCAUCGCCGACCGUAUGCAGAAGG-3′ was end labelled the same way. Non-labelled RNA was used as competitor. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was performed to investigate the RNA binding ability of MsAGO2 and MsSID1 proteins by using 32 P labelled ssRNA and dsRNA, respectively. The protein/RNA samples were resolved on native TBE polyacrylamide gels and visualized by autoradiography. dsRNA cleavage assays followed the procedures of Li və b, 2015 and Hodgson və b., 2019 . Briefly, 32 P labelled ds100 was mixed with purified MsDcr2, incubated at 37°C for 30 min, and cleavage products were analysed by 15% (v/v) urea PAGE and visualized by phosphorimaging. For chitinase activity assays, 3 mg/ml insect chitin was incubated with purified MsChi2 protein in 20 mM sodium phosphate buffer (pH = 6.0) and incubated at 30°C for different times. The product N-acetylglucosamine was reacted with P-Dimethylaminobenzaldehyde in boiling water for 7 min and centrifuged at 5000 rpm for 10 min, and the supernatant was detected in a microplate at 585 nm (Liu və b., 2017 ).

Accession numbers

MsChi1, AY508698.1 MsChi2, AB201283.1 MsActin, GQ856238.1 NbActin and NM_102866.3. Digər M. separata sequences were obtained from transcriptome data (Liu və b., 2016 ).


Measuring gene expression changes on biomaterial surfaces

In situ hybridization and inflammation

Extraction of mRNA and RT-qPCR could be used to get a screen of the types of genes expressed, but this information by itself will be of limited value, as it will not provide the abundance of each cell type. Neutrophils and macrophages are the main cell types that are present in the inflammatory phase of wound healing ( Walker et al., 2016 ) ( Fig. 6.6 ). The balance of neutrophils to macrophages, and further, presence of specific macrophage subpopulations is more pertinent information. The best method for assessing these genes would be in situ hybridization, which uses a labeled complementary RNA or DNA probe to localize a specific DNA or RNA sequence in a section of tissue ( Zhou et al., 2010 ). Using this technique would demonstrate the influence of a biomaterial on the relative number and location of neutrophils and macrophages in the tissue at each specified time point. The advantage of this technique is that it localizes the signal to the specific cells expressing the mRNA, allowing identification and relative abundance of each cell type. Probes that could be used include neutrophil elastase (neutrophil marker, see Fig. 6.6 ), iNOS, and arginase I (macrophage markers). If sections were labeled for these markers at 1, 3, and 5 days postwounding, a direct measure could be made on the level and maturation of the inflammatory response. In situ hybridization results could be correlated with RT-qPCR for the same results and through immunohistochemistry to detect the active protein, giving a comprehensive analysis of the healing response.


Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues

Investigation of gene expression significantly contributes to our knowledge of the regulation and function of genes in many areas of biology. In this protocol, we describe how northern blot analysis is used to identify gene expression patterns at the RNA level in human cancer cells as well as in cancerous and normal tissues. RNA molecules are separated by gel electrophoresis and are subsequently transferred to a porous membrane by capillary action. Specific sequences in the RNA are detected on the membrane by molecular hybridization with radiolabeled nucleic acid probes. Despite the development of newer methods, such as real-time PCR, nuclease protection assays and microarrays, northern blot analysis is still a standard technique used in the detection and quantification of mRNA levels because it allows a direct comparison of the mRNA abundance between samples on a single membrane. This entire northern blotting protocol takes ∼ 4 d to complete.


Şimal ləkəsi ilə müqayisəsi. Southern Blot Texnikası

Northern və Southern blotting molekulyar biologiyada istifadə edilən və DNT ilə əlaqəli makromolekulyar dəyişiklikləri aşkar etmək üçün istifadə edilən üsullardır. BiologyWise bu texnikaların mahiyyətini və prinsipini izah edir və onlar arasındakı fərqləri müqayisə edir.

Northern və Southern blotting molekulyar biologiyada istifadə edilən və DNT ilə əlaqəli makromolekulyar dəyişiklikləri aşkar etmək üçün istifadə edilən üsullardır. BiologyWise bu texnikaların mahiyyətini və prinsipini izah edir və onlar arasındakı fərqləri müqayisə edir.

Etimologiya

Southern blotting, bu texnikanı inkişaf etdirən İngilis bioloqu Ser E. M. Southern-in adını daşıyır. Eyni prinsipə əsaslanan sonrakı ləkələmə üsulları (Northern blotting, Western blotting və s.) eyniadlı adlandırılır.

Bizim üçün yazmaq istərdinizmi? Yaxşı, biz sözü yaymaq istəyən yaxşı yazıçılar axtarırıq. Bizimlə əlaqə saxlayın, danışarıq.

Molekulyar biologiya və genetikada zülalların, DNT və ya RNT-nin dəyişən səviyyələrini aşkar etmək və öyrənmək, həmçinin onlar arasında baş verən qarşılıqlı əlaqəni öyrənmək üçün müxtəlif ləkələmə üsullarından istifadə olunur. Southern blotting DNT-də, Northern blotting RNT-də, Western blotting zülallarda, Eastern blotting zülalların posttranslational modifikasiyalarında istifadə olunur. Hər bir texnikanın məqsədi fərqli ola bilər, lakin hamısı bir neçə kiçik sapma və dəyişikliklərlə eyni prinsip və metodologiyanı paylaşır.

Prinsip

Bütün ləkələmə üsulları, membranda hərəkətsizləşdirilmiş ardıcıllıqla zond ardıcıllığının xüsusi əsas cütləşməsinin eyni prinsipinə əsaslanır. Nümunə ardıcıllığında hər hansı bir dəyişiklik probların bağlanmamasına və ya qeyri-spesifik olaraq bağlanmasına səbəb olacaqdır. Bağlayıcı yaxınlıqdakı bu dəyişiklik, etiketli bir zond ilə ikincil hibridləşmə zamanı vizuallaşdırılacaq. Yaranan boyanın və ya flüoresansın intensivliyi surət sayı, gen ifadəsi və s. kimi digər xüsusiyyətlərlə birlikdə bağlamanın spesifikliyini göstərəcəkdir.

Şimal və Cənubi Blotting Texnikaları

Şimal ləkəsi Hər biri müəyyən bir toxuma və ya hüceyrə növündən təcrid olunmuş müxtəlif RNT qarışığından xüsusi RNT molekullarını aşkar etmək və öyrənmək üçün istifadə edilən bir texnikadır. Bu, müstəntiqə mRNT-nin molekulyar çəkisini təyin etməyə, həmçinin müxtəlif nümunələr üzrə mRNT-nin (gen ifadəsi) nisbi miqdarını müəyyən etməyə imkan verir.

Cənub ləkəsi xüsusi DNT ardıcıllığını aşkar etmək və öyrənmək üçün istifadə olunur. Bu, məhdud (kəsilmiş) DNT fraqmentlərini, ardıcıllıqdakı dəyişiklikləri və müxtəlif nümunələr üzrə nisbi kəmiyyətini öyrənməyə imkan verir.

Metodologiya

✦ Əvvəlcə təmizlənmiş nümunə agaroza gelə yüklənir və elektroforezlənir, nəticədə nümunə zolaqlara ayrılır. Sonra bantlar kapilyar təsir və ya yönəldilmiş elektrik cərəyanı prinsipi ilə daşıyıcı membrana köçürülür. Köçürülmüş bantları olan membran daha sonra sobada bişirilərək və ya bloklayıcı bir həll ilə müalicə edilərək bağlanır. Bu, köçürmənin daimi olmasını təmin edir və membranın bağlanmamış səthi istənməyən molekulların bağlanmasının və maneə törədilən nəticənin qarşısını almaq üçün bloklanır.

✦ Bloklama tamamlandıqdan sonra, bloklama məhlulunun izlərini təmizləmək üçün membran yumşaq bir şəkildə yuyulur. Daha sonra membran köçürülmüş lentlərə bağlanan xüsusi hədəf zondları ilə müalicə olunur. Zondun hədəf molekula bağlanmasına ilkin hibridləşmə deyilir. Artıq zondları aradan qaldırmaq üçün membran yumşaq bir şəkildə yuyulur və sonra ikincil hibridləşməyə məruz qalır, burada hədəf zond radioaktiv element, flüoresan boya və ya hətta xromogen boya ilə etiketlənir. Artıqlığı yenidən yuyulur.

✦ İstifadə olunan ikincili zondun növündən asılı olaraq, membran müvafiq olaraq vizuallaşdırılır. Radioaktiv etiketləmə və ya flüoresan boyadan istifadə edildikdə, bir neçə saniyə ərzində membrana bir rentgen filmi məruz qalır və inkişaf etdirilir. Xromogen boya istifadə edilərsə, nəticələr membranın özündə görünə bilər. Hal-hazırda, radiasiyaya həddindən artıq məruz qalmanın qarşısını almaq üçün radioaktiv etiketdən daha çox flüoresan boyalara üstünlük verilir. Bununla belə, radioaktiv etiketdən istifadə etmək lazım olan bəzi hallar var.

Northern Blot Vs. Southern Blot

Şimal ləkəsi Southern Blot
İnkişaf
1977-ci ildə James Alwine, David Kemp və George Stark tərəfindən hazırlanmışdır. 1975-ci ildə Ser Edwin Mellor Southern tərəfindən hazırlanmışdır.
Adın mənşəyi
Ad yanlış adlandırmadır - Southern blotting-in eyniadlı törəməsi. Onun ixtiraçısı E. M. Southern adını daşıyır.
Məqsəd
Xüsusi RNT ardıcıllığının mövcudluğunu aşkar edir. Xüsusi DNT ardıcıllığında dəyişiklikləri aşkar edir.
Nümunə Hazırlanması
Nümunə doğma vəziyyətində istifadə olunur. Nümunə denatürasiya edilməlidir.
Membran
İstifadə olunan membran amin benziloksimetil filtr kağızı membranıdır. İstifadə olunan membran nitroselüloz membrandır.
Hibridləşmə növü
RNT-DNT hibridləşməsi DNT-DNT hibridləşməsi
Ərizə
Gen ifadə profillərini öyrənmək. DNT-dəki genetik dəyişiklikləri öyrənmək üçün homologiyaya əsaslanan klonlama üçün də istifadə edilə bilər.
törəmə
RNT və zülallar arasında qarşılıqlı əlaqəni aşkar edən Şimal-Qərb Blotting tədqiqatları. DNT-ni bağlayan zülalları aşkar edən Southwestern blotting tədqiqatları.

İki texnika eyni prinsipdən qaynaqlanır və hədəf aldıqları molekulların tipinə görə fərqlənir. Blotting üsullarının inkişafı alimlərə molekulyar qarşılıqlı təsirləri öyrənmək və əgər varsa, dəyişiklikləri aşkar etmək üçün bir vasitə təqdim etməyə kömək etdi.

Əlaqədar Yazılar

Bitki hüceyrəsi və heyvan hüceyrəsinin müqayisəli tədqiqi bu hüceyrələr arasındakı oxşarlıqları və fərqləri daha yaxşı başa düşmək üçün.

Təkamül biologiyası sahəsində davam edən bir neçə çaşqınlıqdan biri konvergent və divergent təkamül haqqındadır. İkisi arasında dəqiq nə fərq var?

Aşağıdakı məqalə müxtəlif xüsusiyyətlərini nəzərə alaraq monokot və dikot fərqlərini qarşımızda təqdim edir. İki və təkotillilərin təsnifatı haqqında daha çox məlumat əldə etmək üçün oxuyun.


Teaching Notes and Tips

This type of problem exposes students to a new technique in a real context, and helps them gain practice with data interpretation skills. The questions require the students to operate at a high level of thinking (synthesis and analysis) to make the connection between RNA splicing occurring in the nucleus and the bands they observe on the gel. Students often don't intuitively connect the bands on the gel with the idea of exons and introns, even though they have just heard a mini-lecture on RNA processing, including splicing and alternative splicing. They often miss the significance of the nucleus and cytoplasm labels, and need coaching to recognize that the location hints at various processes, i.e. where in the cell mRNA is synthesized and processed versus where in the cell a mature mRNA may be located and translated. As students work this problem and discuss possible answers, misconceptions are frequently uncovered for example, one common misconception is that there must be multiple genes coding for the protein and that is the reason for the multiple bands.

Note: in class we post the actual blot online. Because of copyright issues we include a representation of the blot in the student problem above.

Answer key RNA processing and northern blot technique problem


Videoya baxın: ARAB Squad DNA results. نتائج صادمة لتحليل الحمض النووي (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Dealbert

    Yaxşı istiyə verirlər

  2. Bittan

    Və mən ona inanıram!!!

  3. Moogusar

    Burada radio haqqında kimsə bilir? T2 tranzistoru haqqında qısa izah edən bir həmkarınıza ehtiyacımız var (RV = RV1-i necə yoxlamaq aydın deyil). İnşallah burada radio həvəskarları var. Tamamilə mövzusun varsa, üzr istəyirəm. Yazmalıyam, sadəcə bir çıxış yolu görmürəm. PS: Əgər orfoqrafiya düzgün deyilsə, məni də üzr istəsəydim, cəmi 13 yaşım var.

  4. Alwyn

    Bağışlayın, mən bu ifadəni sildim

  5. Dadal

    like would read carefully, but did not understand



Mesaj yazmaq