Məlumat

$ heta = 4N_{e}mu$ dəyəri ilə R-də DNT ardıcıllığının simulyasiyası

$	heta = 4N_{e}mu$ dəyəri ilə R-də DNT ardıcıllığının simulyasiyası


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Bu, belə bir sual vermək üçün ən uyğun sayt olmaya bilər, amma bəlkə də kiminsə həlli var.

sualım budur: populyasiya mutasiya dərəcəsinin əvvəlcədən müəyyən edilmiş dəyərinə uyğun olaraq yaradılan verilmiş baza cüt uzunluğunun DNT ardıcıllığının simulyasiyası üçün R paketi və ya funksiyası varmı $ heta = 4N_{e}mu$, burada $N_{e}$ effektiv populyasiya ölçüsü və $mu$ hər nəsil mutasiya dərəcəsidir

GenBank-dan real ardıcıllıq məlumatlarım var, lakin mən eyni zamanda birləşən prosesə uyğun olaraq bəzi təsadüfi DNT ardıcıllığını simulyasiya etmək istərdim.

Əslində funksiya yaradılan düzülmüş DNT ardıcıllıqlarını FASTA faylı kimi çıxaracaq.

Mən uyğun bir paketi izləməkdə kifayət qədər uğursuz oldum, çünki əksəriyyəti yalnız filogeniyalar yaradır.


Bir sıra alətlər var, lakin mən R kitabxanası ilə gələn heç birini bilmirəm. Onların hamısı adətən əmr satırından çağırılır. FASTA faylı yaradanların heç biri məndə yoxdur. SimBit (öz proqramım) istehsal edə bilərvcfPGDspider ilə asanlıqla FASTA-ya çevrilə bilən fayllar.

Bununla belə, əgər simulyasiyalarınız çox asandırsa, bu fərdi əsaslı proqramlara ehtiyacınız olmaya bilər. Sadəcə kodu özünüz yazın. Bu, yalnız bir neçə on sətir çəkə bilər. Budur sadə bir nümunə

freq = 0.1 # ilkin tezlik N = 1000 # Sabit populyasiya ölçüsü mu = 1e-7 # üçün mutasiya dərəcəsi (1:nbNəsillərdə nəsil) { # Drift freq = rbinom(1,N,tezlik) / N # Mutasiyalar oneWayMutations = rbinom( 1,N*tezlik,mu) / N otherWayMutations = rbinom(1,N*(1-freq),mu) / N freq = tezlik - oneWayMutations + otherWayMutations }

Əgər sizə daha mürəkkəb bir şey lazımdırsa (məsələn, bir neçə yer), onda çox güman ki, mövcud fərdi əsaslı proqram təminatından birini istifadə etməlisiniz. Ardıcıllığın təkamül simulyasiya alətinə baxın


1 Diskret verilənlər üçün generativ modellər

Molekulyar biologiyada bir çox situasiya hadisələrin sayılmasını nəzərdə tutur: neçə kodon müəyyən bir yazımdan istifadə edir, DNT-nin neçə oxunuşu istinadla uyğun gəlir, DNT ardıcıllığında neçə CG diqramı müşahidə olunur. Bu saylar bizə verir diskret ölçülən kütlə və intensivlik kimi kəmiyyətlərdən fərqli olaraq dəyişənlər davamlı tərəzi.

Tədqiq olunan mexanizmlərin əməl etdiyi qaydaları bilsək, nəticələr təsadüfi olsa belə, hesablamalar və standart ehtimal qanunları ilə maraqlandığımız hər hansı hadisənin ehtimalını yarada bilərik. Bu yuxarıdan aşağı deduksiyaya və ehtimalları necə manipulyasiya etmək barədə biliklərimizə əsaslanan yanaşma. 2-ci Fəsildə siz bunu dataya əsaslanan ilə necə birləşdirəcəyinizi görəcəksiniz (aşağıdan yuxarıya, altüst olmaq) statistik modelləşdirmə.


Fon

Ekoloji icmaların tədqiqatlarında empirik tədqiqatçıların qarşılaşdıqları ümumi problem orqanizmlərin geniş taksonomik diapazonundan toplanmış məhdud məlumatlardan növlər səviyyəsində fərdləri müəyyən etməkdir. Bir çox hallarda, müəyyən qruplar və ya bölgələr üçün faydalı taksonomik açarlar mövcud deyil. Bunun səbəbi, bir çox müxtəlif qrupların morfoloji cəhətdən sirli olması, çoxlu təsvir edilməmiş taksonları ehtiva etməsi və ya mövcud taksonomik ədəbiyyatın ziddiyyətli olması, bu məsələnin “taksonomik maneə” [1] kimi qeyd edilməsidir. Bu hallarda, qısa DNT ardıcıllığı etiketləri (mitoxondrial gen COI-nin DNT barkod bölgəsi və ya mikrob 16S rRNA geninin hiperdəyişən bölgəsi) tez və ucuz toplana bildiyi üçün tez-tez tədqiq edilir [2, 3]. DNT ştrix kodlaşdırma təşəbbüsləri bu ardıcıllıq etiketlərini ekspert taksonomistlər tərəfindən təsdiq edilmiş taksonlarla əlaqələndirməyi hədəfləyir [4, 5], lakin hazırda bu, əksər qruplar üçün mümkün deyil. Nəticədə, aşağı səviyyəli taksonomik çərçivə olmadığı halda müxtəliflik tez-tez ölçülməlidir. Bunu həyata keçirmək üçün müşahidə edilən DNT ardıcıllıqları ehtimal olunan növlərə qruplaşdırılmalıdır. Növlərin sərhədlərinin müəyyən edilməsi mürəkkəb fəlsəfi və bioloji problem [6] olsa da, növ anlayışları növlərin müstəqil şəkildə inkişaf edən metapopulyasiya nəsilləri olması fikrini geniş şəkildə bölüşürlər [7]. Bu, genetik məlumatların (məsələn, DNT barkodları) bu nəsillərin diaqnostikası üçün ilkin məlumat kimi istifadə edilməsinə əsas verir, çünki onlar nəsil divergensiyasında iştirak edən tarixi proseslərin siqnalını ehtiva edir [8]. Xəbərdarlıq olaraq, bu şəkildə müəyyən edilmiş nəsillər, məsələn, digər belə nəsillərdən reproduktiv təcrid kimi hər hansı bir növ konsepsiyası altında növ statusu meyarlarına mütləq cavab verməyəcək və ya morfoloji, ekoloji və ya davranış fərqi nümayiş etdirməyəcək.

Barkod məlumatlarından növlərin delimitasiyası üçün istifadə edilən üsullar növlərin delimitasiyası ilə bağlı daha böyük problem üçün işlənib hazırlanmış metodların bir hissəsidir. Onları növlərin kəşfi üsulları hesab etmək olar, çünki onlar yaxşılıq olmadıqda funksional olmalıdırlar a priori taksonomik məlumat [9-11]. Bu, növlərin statusunun spesifik fərziyyələrini sınaqdan keçirən doğrulama metodları (məsələn, [9, 12]) və naməlum fərdləri mövcud növlərə təyin edən təyinetmə üsulları ilə (məsələn, [13-16]) ziddiyyət təşkil edir. Genetik məlumatlardan istifadə edərək növ məhdudiyyətlərini aşkar etmək üçün adətən istifadə edilən bir neçə yanaşmadan fərdlər arasında cüt ardıcıllıq məsafələrinə əsaslanan həddlər bəlkə də ən çox ehtimal olunan növlərə klaster ardıcıllığına tətbiq edilir [5, 17]. Bu üsullar ardıcıllıq fərqinin bəzi səviyyəsini müəyyən edir, ondan kənarda iki fərd eyni növ hesab edilə bilməz. Məsafə həddi üsulları təkamül proseslərini [18] və cüt-cüt növ daxili və növlərarası DNT ardıcıllığı məsafələri arasında müşahidə edilə bilən “barkod boşluğuna” əsaslanan müvafiq hədd seçimində qeyri-müəyyənlik [15] hesab etmədiyi üçün tənqid edilmişdir ([19]. –22] lakin bax [23]).

Pons və başqaları. [24] məsafə həddi metodlarına model əsaslı alternativ təqdim etdi. Model, ümumi qarışıq Yule-coalescent (GMYC), DNT ardıcıllığı məlumatlarından təxmin edilən filogenetik ağacı götürür və ağacdakı budaqlanma nöqtələrinin iki hadisədən birinə uyğun olduğunu güman edir: növlər səviyyəsindəki taksonlar arasında fərq hadisələri (Yul prosesi ilə modelləşdirilmişdir) [25]) və ya növlər arasından nümunə götürülmüş nəsillər arasında birləşmə hadisələri (birləşən [26] tərəfindən modelləşdirilmiş). Növlər daxilində birləşmə sürətinin kladogenez sürətindən dramatik şəkildə daha çox olacağı gözlənildiyi üçün GMYC bu şaxələnmə növləri arasında sərhədi tapmağı hədəfləyir. Bu modelin bir sıra empirik tədqiqatlarda faydalı olduğu göstərilmişdir [24, 27-31]. O, maraqların təkamül proseslərini birbaşa modelləşdirən Ehtimal funksiyasına əsaslandığından, hədd metodlarında səslənən bəzi tənqidləri yaxşılaşdırmaq üçün bir vasitə təmin edir. Xüsusilə, o, növlərin delimitasiyası zamanı qeyri-müəyyənliyin kəmiyyətini müəyyən etməyə imkan verir [32] və məlumat kimi müstəqil olmayan cüt ardıcıllıq məsafələrinin (məsələn, [23]-də) istifadəsindən yayınır.

Hal-hazırda tətbiq olunan GMYC modeli, lakin üç potensial böyük səhv mənbəyini nəzərə almır. Birincisi, geniş şəkildə qəbul edilir ki, müxtəlif amillər müəyyən bir lokusdan olan şəcərənin növləşmənin həqiqi tarixi ilə ziddiyyət təşkil edə bilər [33] və GMYC, tək bir lokusa əsaslanan bütün üsullar kimi, bu yolla yanlış istiqamətə yönəldə bilər. uyğunsuzluq. İkincisi, model qiymətləndirmələrində səhv ola bilər. Müəyyən şəraitdə növləşmə hadisələrindən birləşən hadisələrə keçid qeyri-müəyyən ola bilər (məsələn, sürətli spesifikasiya hadisələrinin və böyük effektiv populyasiya ölçülərinin birləşməsi) modelin geniş etimad intervalına malik olmasına səbəb olur. Pauell [32] tərəfindən bu yaxınlarda həyata keçirilən tətbiq həddi parametrdə qeyri-müəyyənliyi hesablayır və model üzrə orta hesablanmış növ limitləri yaradır, lakin digər parametrlər üçün nöqtə təxminlərindən istifadə edir. Nəhayət, filogenetik xəta delimitasiya nəticələrinin dəqiqliyini azalda bilər. GMYC modeli istifadəçidən filogenetik ağacın nöqtə təxminini daxil etməyi tələb edir və nəticə bu nöqtənin qiymətləndirilməsinin düzgünlüyünə əsaslanır. Ardıcıllıq etiketlərindən istifadə edən müxtəliflik tədqiqatları adətən yüksək qeyri-müəyyənlik səviyyəsinə malik ola bilən topologiya və budaq uzunluqlarının təxminlərini verən nisbətən qısa lokuslardan istifadə edir. Bu qeyri-müəyyənlik modelin düzgünlüyünə təsir edə bilər.

İkinci və üçüncü potensial xəta mənbələrini həll etmək üçün biz R statistik skript dilində çevik əvvəlki paylamalarla bu modelin Bayesian tətbiqini təqdim edirik [34]. O, Markov Zənciri Monte Karlo simulyasiyası (MCMC) vasitəsilə ağac topologiyası və budaq uzunluğundakı qeyri-müəyyənliyi və modelin parametrlərinə inteqrasiya edərək, filogenetik qiymətləndirmədə səhvi və model parametrlərində qeyri-müəyyənliyi hesablayır [35]. O, Picante [36], Vegan [37] kimi R paketlərindən istifadə edərək növ limitləri və filogeniyadakı qeyri-müəyyənliyi uçota alan icma strukturunun aşağı axını təhlili üçün uyğun olan posterior paylanmanı xarakterizə edən çıxışla yanaşı, bu amillərdən asılı olmayan növlər üçün marjinal arxa ehtimallar yaradır. ] və APE [38]. Biz həmçinin modelin performansını qiymətləndirmək üçün simulyasiya testləri keçiririk və əvvəllər modelin Ehtimal versiyası ilə təhlil edilmiş verilənlər toplusunu yenidən təhlil edirik.


2.2 Statistik və ehtimal modelləri arasındakı fərq

Verilənlərin təsadüfiliyi üçün yaxşı bir generativ model bildiyimiz zaman ehtimal analizi mümkündür. parametrlərin faktiki dəyərləri ilə təmin olunuruq.

Şəkil 2.1: 1-ci fəsildə əldə etdiyimiz ehtimal modeli. Məlumatlar yaşıl rəngdə (x) kimi təqdim olunur. Biz ( eta) nin həqiqi dəyərini bildiyimiz zaman (x) müşahidə etsək, ehtimalı hesablamaq üçün müşahidə edilən məlumatlardan istifadə edə bilərik.

Epitop nümunəsində, hər mövqeyə görə Bernoulli (0,01) kimi yanlış pozitivlərin meydana gəldiyini bilməklə, təhlil edilən xəstələrin sayı və zülalın uzunluğu onların mövcudluğunu təmin etdi. naməlum parametrlər yoxdur.

Belə bir vəziyyətdə riyaziyyatdan istifadə edə bilərik çıxılma Şəkil 2.1-də sxematik şəkildə göstərildiyi kimi hadisənin baş vermə ehtimalını hesablamaq. Epitop nümunələrində biz özümüz kimi Puasson ehtimalından istifadə etdik null modeli verilmiş parametr ilə (lambda=0.5) . Biz riyazi çıxılma nəticəsində belə nəticəyə gələ bildik ki, maksimum 7 və ya daha böyük dəyəri görmə şansı (10^<-4>) ətrafındadır və beləliklə, əslində müşahidə edilən məlumatların bu model (və ya “null”) altında çox az ehtimalı var. fərziyyə").

İndi fərz edək ki, biz xəstələrin sayını və zülalların uzunluğunu bilirik (bunlar eksperimental dizayn tərəfindən verilir), lakin paylanmanın özünü və yanlış müsbət nisbəti deyil. Məlumatları müşahidə etdikdən sonra getməliyik yuxarı Məlumatlardan həm ehtimal modelini (F) (Puason, normal, binomial) və nəticədə həmin model üçün çatışmayan parametr(lər)i qiymətləndirmək üçün. Bu statistik növüdür nəticə çıxarmaq bu fəsildə izah edəcəyik.


Nəticə

Bu işdə ardıcıllıqla asılı nukleosom əmələ gəlməsinin, nukleosomun açılmasının və nukleosomun yenidən yerləşdirilməsinin sərbəst enerjilərini eyni vaxtda təkrarlaya bilən qaba dənəli molekulyar model təqdim edirik. Bu modellə biz nükleosomda həm döngənin yayılması, həm də bükülmə diffuziya mexanizmlərinin baş verə biləcəyinə dair silisium sübutları təqdim edirik. Nəticələrimiz göstərir ki, bu cür mexanizmlər DNT ardıcıllığından asılıdır və müəyyən bir DNT ardıcıllığının sərbəst bağlanma enerjisi dominant repozisiya mexanizmi olan əla proqnozlaşdırıcıdır. Sərbəst enerji, həmçinin xüsusi yerləşdirmə hadisəsinə uyğun gələn xarakterik vaxt şkalası ilə əlaqələndirilir. Müəyyən edilmişdir ki, orta dərəcədə bağlanma enerjisi nümayiş etdirən təbii olaraq yaranan DNT sekanslarının əksəriyyətində həm döngə, həm də burulma yerinin dəyişdirilməsi mexanizmləri birlikdə mövcuddur. Əhəmiyyətli odur ki, nükleosomun yerləşdiyi yerdə əvvəllər məlum olmayan bir sıra xüsusiyyətlər müəyyən edilmişdir. Bunlara DNT ilgəklərinin asimmetrik paylanması, onların formalaşmasında H4 quyruğunun güclü təsiri və nukleosomların səfərbərliyində torkların dominant təsiri daxildir.

Bu işin mərkəzi tapıntılarından biri odur ki, DNT ardıcıllığı nukleosomların yerləşdirilməsinin geniş mexanizm və dinamikasına səbəb ola bilər. Bununla belə, biz müəyyən xüsusiyyətlərə DNT ardıcıllığından, o cümlədən DNT dövrələrinin yerlərindən və fırlanma momentinin nukleosomların hərəkətliliyinə təsirindən təsirlənmədiyini də göstərdik. Bu tapıntılara əsaslanaraq, 601 yerləşdirmə ardıcıllığından kənara çıxan və təbii olaraq meydana gələn, orta dərəcədə bağlanan DNT ardıcıllığına doğru eksperimental tədqiqatların aparılması vacib olacaqdır. Genomik DNT sekansları ilə tək molekullu təcrübələr aparmaq mümkün olmadığı hallarda, burada təqdim olunan 3SPN-AICG modeli ardıcıllıq asılılığının vacib ola biləcəyi vəziyyətləri proqnozlaşdırmaq üçün tamamlayıcı vasitə kimi xidmət edə bilər.


Nəticələr

Bu simulyasiyalar göstərir ki, bütün növlər istinad məlumat dəstlərində adekvat şəkildə təmsil olunduqda, genetik üsullar etibarlı növ identifikasiyası verə bilər. Növlərin genetik cəhətdən fərqlənmə dərəcəsi müvəffəqiyyətin kritik təyinedicisi kimi görünür. Bütün növlər istinad məlumat dəstində təmsil olunduqda, BLAST, məsafə və liberal ağac əsaslı üsullar eyni dərəcədə uğurlu olacaq və sorğu ardıcıllığının daxil olmamasını tələb edən ciddi ağac əsaslı metoddan daha düzgün identifikasiya edəcəklər. bacısı, tək-növ cins. Ciddi ağaca əsaslanan metod mühafizəkardır, növlər üzrə istinad ardıcıllığının sayına tərs mütənasib sürətlə qeyri-müəyyən və ya yalan-mənfi identifikasiyalar edir.

İstinad məlumat dəstinə düzgün növlər daxil edilmədikdə, yalnız ağaca əsaslanan metodlar, xüsusən də məsafə həddinlə birləşən ciddi metod yanlış pozitivlərdən qoruyacaq. Digər üsullar hər yerdə zəifdir və ya empirik həddlərlə müəyyən edilmiş xəta dərəcəsinə malikdir.

Genetik metodların inkişafı üçün əsas motivlərdən biri onların növlərin identifikasiyası üçün geniş miqyaslı tətbiqidir. Bu metodların əsas tənqidi, genetik variasiyanın qeyri-adekvat seçilməsi və yanlış taksonomiya səbəbindən etibarsız olacağıdır. Bu narahatlıqlar mühafizəkar bir yanaşma tətbiq etməklə, ciddi ağac əsaslı metoddan istifadə etməklə azalda bilər. Bununla belə, xüsusi taksonomik qrup yaxşı başa düşüldükdən və onun genetik müxtəlifliyi tam nümunə götürüldükdən sonra bu konservativ yanaşmaya artıq zəmanət verilmir. Hesablama baxımından ən səmərəli və ən böyük sürəti təmin edən digər üsullardan hansına, BLAST, məsafə və ya daha liberal ağac əsaslı yanaşmaya keçmək məqsədəuyğun olardı. Müvəffəqiyyətli identifikasiyaların məqbul səviyyəsinə nail olmaq üçün həm yaxşı diferensiallaşdırılmış növlərə, həm də növlər üzrə çoxsaylı istinad ardıcıllığına tələb bəzi hallarda bu üsulları qeyri-münasib edə bilər. Sonlu bir dünyada, növlərin eyniləşdirilməsinin həm vaxt, həm də pulla ölçülən dəqiqliyi və dəyəri arasında hər zaman mübadilə olacaq. Fərqli yanaşmaların etibarlılığının tam başa düşülməsi vacibdir ki, məlumatlı qərar qəbul oluna bilsin.


XÜLASƏ: PLAZMİDİN TOPRAĞI MEXANİZMİNDƏ FƏRQLƏR VƏ OXŞARLIQLAR

Plazmid replikasiyası və ona nəzarətin öyrənilməsində əldə edilmiş irəliləyişlərə baxmayaraq, müxtəlif replikasiya sistemləri haqqında biliklərimizdə böyük boşluqlar mövcuddur. Replikasiyanın başlanması mənşəyin əriməsini və plazmidlə kodlanmış və host tərəfindən kodlanmış amillər arasında qarşılıqlı əlaqəni tələb edir, bunlar ümumiyyətlə zəif başa düşülür. Mənşəyin əriməsi ya başlanğıc zülallarının (DnaA və R6K-π) sirli ssDNA-ya bağlanma fəaliyyətinin təzahürü ilə, ya da molekuldaxili ikincil strukturların əmələ gəlməsi ilə (məsələn, xaç şəklində ekstruziya) sabitləşdirilə bilər. Plazmid mənşələrinin konfiqurasiyası göstərir ki, DNT əyriliyi və Rep-gücləndirilmiş mənşəli əyilmə ümumi, lakin hələ də tam öyrənilməmiş xüsusiyyət kimi görünür (81, 156c, 205, 206, 283). Başlanğıcda DNT deformasiyaları başlanğıc hadisəsi üçün uyğun konfiqurasiya təmin edə bilər: başlanğıc kompleksinin yığılması və digər replikonlar üçün RNT primerinin sintezi ilə müqayisədə RC-replikasiya edən plazmidlər üçün təşəbbüskar tərəfindən xaç şəklində ekstruziya və nicking. Başlanğıc kompleksinin yaranmasında host tərəfindən kodlanmış zülalların rolu teta mexanizmi ilə təkrarlanan bir neçə plazmid üçün nisbətən yaxşı müəyyən edilmişdir, lakin RC rejimindən istifadə edən plazmidlər üçün çox az şey məlumdur (PcrA helikazından başqa). S. aureus pT181 replikasiyasında) (135�). Rep zülalları və ana replikasiya faktorları arasında qarşılıqlı təsirlərin spesifikliyinin tərifi plazmidlərin müxtəlif hostları kolonizasiya etmək qabiliyyətini başa düşməyimiz üçün aktualdır. Struktur tədqiqatların DNT replikasiyasının təşəbbüskarları və inhibitorlarının funksional təhlili ilə yaxınlaşması gələcək inkişafın mühüm sahəsidir. Host replikasiya faktorları və plazmid təşəbbüskarları plazmid replikasiyasını başlatan nukleoprotein kompleksinin bir hissəsini təşkil edir. Bu makromolekulyar birləşmələrin struktur tərifi plazmid replikasiyasının başlaması və plazmidlər və onların sahibləri arasında qarşılıqlı əlaqə haqqında anlayışımıza uyğun mexaniki məlumat verəcəkdir. Valideynlərin DNT zəncirlərinin davamlılığı teta və zəncirlə yerdəyişmə mexanizmləri ilə təkrarlanan plazmidlərdə saxlandığından, uzanma mərhələsində super sarmal gərginliklər toplanır. Topoizomerazların DNT sintezinin uzanmasında və hər iki katenləşdirilmiş qız molekulunun ayrılmasında rolu sənədləşdirilmişdir (8, 9, 117, 245, 246, 327). RC mexanizmi ilə replikasiya olunan plazmidlər üçün belə bir rol tələb olunmaya bilər, baxmayaraq ki, rahatlaşmış DNT molekulları (RC replikasiyasının məhsullarıdır) yeni replikasiya raundu üçün substrata çevrilməzdən əvvəl DNT girazı tərəfindən superburulmalıdır. Nəhayət, üç mühüm plazmid replikasiya hadisəsi haqqında məlumat azdır: (i) super qıvrılma dalğalarını yaratmaq üçün mənşələr vasitəsilə transkripsiyanın rolu, (ii) Rep zülallarının aktivləşməsi ilə nəticələnən şaperonların təqdim etdiyi struktur dəyişiklikləri və (iii) mexanizmlər. bir neçə RC-replikasiya edən plazmidlər (255, 256) istisna olmaqla, mümkün Rep inaktivasiyasının.

Teta tipli plazmid replikonlarının təkrarlanmasının dayandırılmasında iştirak edən xüsusi siqnalların öyrənilməsi artan maraq məsələsidir. Xüsusi sonlanma yerlərində fəaliyyət göstərən son zülalların (RTP və Tus) strukturunun aydınlaşdırılması replikasiyanın bu mərhələsinin ətraflı mexaniki təhlilini aparmaq üçün yeni imkanlar açmışdır (19).

Lagging-strand sintezinə gəldikdə, RC və teta rejimləri ilə təkrarlanan plazmidlərdə yalnız host faktorlarının tələb olunduğu düşünülür. Bu, eyni plazmidlə kodlanmış primaz və helikaz zülallarının iki simmetrik mənşədən başlayan və əks istiqamətlərdə davam edən fasiləsiz prosesdə hər iki zəncirinin təkrarlanmasında iştirak etdiyi zəncirlə yerdəyişmə mexanizmi ilə təkrarlanan plazmidlər üçün vəziyyətlə ziddiyyət təşkil edir (263). , 266). Bu sonuncu plazmid kateqoriyasında hər iki DNT zəncirinin ayrılmaz sintezi baş verə bilər ki, bu da ssDNA plazmid ara məhsullarının yaranmasına səbəb olur. Bununla belə, RC mexanizmi ilə təkrarlanan plazmidlərdən fərqli olaraq, zəncir yerinin dəyişdirilməsi replikasiyası zamanı əmələ gələn ssDNA ara məhsullarında zəncir spesifikliyi yoxdur.

Plazmid replikasiyasına nəzarət bu ekstraxromosom elementlərinin əsas xüsusiyyətlərindən biridir. Bu cür nəzarət həmişə başlanğıc mərhələsində həyata keçirilir, ola bilsin ki, başlanğıc hadisələri uzanma və bitirmə mərhələlərindən fərqli olaraq, daim replikona xasdır. Replikasiyaya nəzarətdə RNT inhibitorlarının rolu nisbətən yaxşı başa düşülür (226, 309). Bununla belə, iteronlar tərəfindən modulyasiya edilən replikasiya nəzarəti daha az məlumdur və intensiv tədqiqat obyektidir (51, 155). İteronlara bağlanan bir çox təşəbbüskar öz sintezini avtorequlyasiya edir. Bu avtoregulyasiyanın başlama tezliyinə necə təsir etməsi bu plazmidlərdə replikasiyaya nəzarətin tam başa düşülməsi üçün vacibdir. Maraqlıdır ki, plazmid replikasiyasını idarə etmək üçün istifadə edilən strategiyalar plazmid replikasiyasının başladığı mexanizmlə əlaqəli deyil: müxtəlif mexanizmlər tərəfindən təkrarlanmanın başlanması idarəetmə sxemlərində oxşarlıqlara malik ola bilər (pIP501 və pMV158 pIP501 və pT181 və R1162 və pMV158). Nəhayət, replikasiyaya nəzarət edən elementlər bir çox hallarda müəyyən edilmiş və onların fəaliyyət üsulları təsvir edilmiş olsa da, bir neçə hal istisna olmaqla, kinetik baxımından nəzarəti başa düşmək üçün çox səy göstərilməmişdir (12, 223).


MATERİALLAR VƏ METODLAR

A-traktların DNT-nin seçilməsi və klonlanması C. elegans genom

A-traktlarının mexaniki xassələrini tək molekullu səviyyədə öyrənmək üçün biz 856 bp-lik hiperperiodik ardıcıllığı nəzərdən keçirdik. C. elegans genom (4). Bu seqment F54C4.1 genini kodlayan dördüncü introna uyğundur C. elegans insan mitoxondrial ribosom zülalının L40 ortoloqu. Biz bu ardıcıllığa istinad edəcəyik intron (Şəkil 1A). İntron 58.F Bam-Xho-Psi intron4 və 59.R Apa-Eko-Sal intron4 oliqonukleotidləri ilə pPD167.57 plazmidindən PCR gücləndirildi (Əlavə Cədvəl S1). Həzm olunduqdan sonra, PCR məhsulu 1% agaroza geldə elektrofore edilmiş, ekstraksiya edilmiş (QIAGEN Gel Ekstraksiya Kiti) və pNLrep plazmidinə klonlaşdırılmışdır. Bu proses bir-altı intronun nüsxəsi olan plazmidləri əldə etmək üçün bir neçə dəfə həyata keçirilmişdir və tək molekullu tədqiqatlar üçün lazım olan molekulların qurulması üçün əsas təşkil edir (Şəkil 1B, C). Bütün plazmidlər DNT ardıcıllığı analizi ilə yoxlanıldı.

Tədqiq olunan DNT molekullarının ardıcıllığı və ümumi təşkili. (A) ( 34) və Metodlar bölməsində bildirildiyi kimi bu işdə tədqiq olunmuş mərhələli A-trakt ardıcıllığı (intron). A-traktları (TA addımı olmayan dörd və ya daha çox ardıcıl A və T bölgələri) mavi rənglə işarələnmişdir. Ardıcıllıq ~10 bp dövriliyini vurğulamaq üçün 10 hərfdən ibarət sütunlarda 5′-dən 3′- sonuna qədər yazılmışdır. (B) Üst, AFM təsviri üçün A-traktının substratı kiçik mavi bloklarla təsvir edilmiş intronun üç təkrarından ibarət idi. Nəzarət kimi heterojen ardıcıllıqla və oxşar sayda bp olan DNT molekulundan istifadə edilmişdir (qırmızı). Aşağıda, A-traktının və nəzarət substratlarının GC məzmunu evdə qurulmuş proqram təminatından istifadə etməklə və 300 bp-lik işləyən pəncərə seçilməklə hesablanmışdır. (C) Üst, MT və OT üçün DNT substratları intronun altı təkrarını ehtiva edir və biotin və digoksigenin ilə etiketlənmiş iki oliqonukleotidlə əhatə olunurdu. Nəzarət olaraq, biz heterojen ardıcıllıqla və oxşar sayda bp (qırmızı) olan DNT molekulunu nəzərdən keçirdik. Maqqaş təcrübələri üçün A-traktının alt, GC-məzmunu və nəzarət molekulları (B) bəndində təsvir olunduğu kimi hesablanmışdır.

Tədqiq olunan DNT molekullarının ardıcıllığı və ümumi təşkili. (A) ( 34) və Metodlar bölməsində bildirildiyi kimi bu işdə tədqiq olunmuş mərhələli A-trakt ardıcıllığı (intron). A-traktları (TA addımı olmayan dörd və ya daha çox ardıcıl A və T bölgələri) mavi rənglə işarələnmişdir. Ardıcıllıq ~10 bp dövriliyini vurğulamaq üçün 10 hərfdən ibarət sütunlarda 5′-dən 3′- sonuna qədər yazılmışdır. (B) Üst, AFM təsviri üçün A-traktının substratı kiçik mavi bloklarla təsvir edilmiş intronun üç təkrarından ibarət idi. Nəzarət (qırmızı) kimi heterojen ardıcıllıqla və oxşar sayda bp olan DNT molekulundan istifadə edilmişdir. Aşağıda, A-traktının və nəzarət substratlarının GC məzmunu evdə qurulmuş proqram təminatından istifadə etməklə və 300 bp-lik işləyən pəncərə seçilməklə hesablanmışdır. (C) Üst, MT və OT üçün DNT substratları intronun altı təkrarını ehtiva edir və biotin və digoksigenin ilə etiketlənmiş iki oliqonukleotidlə əhatə olunurdu. Nəzarət olaraq, biz heterojen ardıcıllıqla və oxşar sayda bp (qırmızı) olan DNT molekulunu nəzərdən keçirdik. Maqqaş təcrübələri üçün A-traktının alt, GC məzmunu və nəzarət molekulları (B)-də təsvir olunduğu kimi hesablanmışdır.

AFM təcrübələri üçün DNT molekullarının sintezi

AFM ölçmələri üçün A-trakt substratı intronun üç nüsxəsindən hazırlanmışdır və nəticədə 2636 bp molekul əldə edilmişdir (A-trakt AFM substratı, Əlavə Cədvəl S2). Bu fraqment müvafiq plazmidin XhoI və EcoRV fermentləri ilə həzm edilməsi yolu ilə əldə edilmişdir. Nəzarət olaraq, 54% GC məzmunlu 2645 bp (nəzarət AFM substratı, Əlavə Cədvəl S2) DNT fraqmenti (Şəkil 1B) pNLrep-0BspQI yer plazmidinin (əvvəllər pNLrep plaslarından laboratoriyada klonlanmış) həzm edilməsi yolu ilə əldə edilmişdir. ) SalI və ScaI fermentləri ilə. Həzmdən və ya PCR-dən gələn fraqmentlər 1% agaroz geldə elektrofore edilmiş və ekstraksiya edilmişdir. DNT-lər istehsal zamanı heç vaxt interkalant boyalara və ya ultrabənövşəyi radiasiyaya məruz qalmadılar və 4°C temperaturda saxlanıldılar.

MT və OT təcrübələri üçün DNT molekullarının sintezi

Biz intronun altı nüsxəsini ehtiva edən 5316 bp DNT molekullarını hazırladıq (A-trakt maqqaş substratı, Əlavə Cədvəl S2). Molekulun mərkəzi fraqmenti ya diqoksigenin (3′ ucu) və ya biotin (5′ ucu) ilə etiketlənmiş oliqonukleotidlərlə əhatə olunmuşdur ki, bunlar ya xüsusi olaraq Anti-diqoksigenin (Roche) ilə örtülmüş şüşə səthə və ya superparamaqnit muncuqlara (MyOne, Dynabeads) bağlanır. ) streptavidinlə örtülmüşdür (Şəkil 1C). Etiketli oliqonukleotidlər əvvəllər dərc edilmiş metod əsasında hazırlanmışdır (33). Qısaca olaraq, 27P-XhoI-A və XbaI-A oliqonukleotidləri (Əlavə Cədvəl S1) müvafiq olaraq Terminal Transferaz (NEB) və ya BIO-dUTP və ya DIG-dUTP istifadə edərək biotin və ya diqoksigenin quyruqlu idi. Dəyişdirilmiş oliqonukleotidlər Qiaquick nukleotid çıxarma dəsti (Qiagen) istifadə edərək təmizləndi və müvafiq olaraq 26XhoI-B və ya 88.XbaI C ApaI ilə hibridləşdirildi (Əlavə Cədvəl S1). Mərkəzi fraqment XhoI və ApaI fermentləri ilə həzm olundu və T4 DNT liqazından (NEB) istifadə edərək bir gecədə iki hibridləşdirilmiş quyruqlu oliqonukleotidlərə bağlandı. Həddindən artıq oliqonukleotidlər Microspin S-400 sütunlarından istifadə edərək çıxarıldı. Nəzarət molekulu olaraq (Əlavə Cədvəl S2), eyni uzunluqda homojen GC məzmunlu DNT fraqmentini seçdik (Şəkil 1C). Bu fraqment şablon kimi Lambda DNT (NEB) istifadə edərək 89.F lambda 40002 XhoI və 90.R lambda 45263 ApaI oliqonukleotidləri ilə PCR gücləndirilmişdir. Bu bölgə, verilmiş ardıcıllığın GC məzmununu hesablayan evdə hazırlanmış proqram təminatının işə salınması və 300 bp-lik işləyən pəncərənin seçilməsi ilə seçilmişdir. PCR məhsulu həzm olundu, 1% agaroza geldə elektroforez edildi, ekstraksiya edildi və A-traktları molekulunu istehsal etmək üçün istifadə edilən eyni quyruqlu oliqonukleotidlərlə bağlandı.

A-trakt molekulları, müvafiq olaraq AFM və Cımbızların substratlarında mövcud olan intronun üç və altı təkrarlanmasından yaranan dövri nümunələrlə aşağı GC məzmunu (~ 20%) təqdim etdi. Bunun əksinə olaraq, nəzarət molekullarının GC məzmunu ~50% təşkil edir (Şəkil 1B, C). Əhəmiyyətli odur ki, bütün A traktları konstruksiyaları mərhələli A traktları üçün gözlənildiyi kimi anomal gel miqrasiyasını göstərdi (Əlavə Şəkil S1) (34).

Atom qüvvəsi mikroskopiyasının ölçülməsi

Hava təsviri

100 mM NaCl, 10 mM Tris–HCl pH 8 və 15 mM MgCl-də 0,3 nM DNT ehtiva edən 20 μl məhlul2 təzə parçalanmış slyuda (SPI-dən V-4 dərəcəli slyuda) üzərinə çökdürülmüş və 30 s inkubasiya edilmişdir. Sonra nümunə 4 ml Milli-Q su ilə yuyuldu və azot hava axını altında qurudulub. Şəkil çəkmə şərtləri əvvəlki işdə təsvir olunanlara bənzəyirdi (35). Şəkillər Nanotec Electronica S.L.-dən AFM ilə çəkilib. PointProbePlus ucları ilə (PPP-NCH Nanosensorlar, ucun sərtliyi 42 N/m, uc radiusu ~10 nm) havada amplituda modulyasiya görüntüləmə rejimindən istifadə edərək ~4,2 nm sərbəst amplituda və ~3,6 nm təyin edilmiş nöqtə ilə. Aşağı MgCl-də havada əlavə təcrübələr2 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8, 2,5 mM MgAc və 1,5 mM NiCl-də 0,3 nM DNT istifadə edərək həyata keçirilmişdir.2 (Cədvəl 1).

Bu işdə alınan A-traktların və nəzarət molekullarının mexaniki parametrləri. AFM məlumatlarından mexaniki parametrlər |$langle uyğunluqlarından hesablanmışdır >> angle$| Şəkil 2D və Əlavə Şəkil S5-də təqdim olunan məlumatlar. Səhvlər uyğunlaşma xətasıdır. AFM görüntüləmə şərtləri Materiallar və Metodlar bölməsində təsvir edilmişdir. MT və OT məlumatlarından mexaniki parametrlər hər bir molekul üçün alınan parametrlərin ortasıdır və xətalar orta göstəricinin standart kənarlaşmasıdır. MT ölçmələri üçün |$$| və |$<>>$| verilənlərin (7) tənliyinə uyğunlaşdırılması ilə əldə edilmişdir F < 1 pN rejimi. OT ölçmələri üçün |$$| və |$<>>$| 1 pN < |$F$|-da (8) tənliyinə uyğunlaşdırılmaqla çıxarılmışdır < 10 pN güc diapazonu. |$<>>$| və |$S$| OT məlumatlarını 10-45 pN qüvvə diapazonunda (9) tənliyinə uyğunlaşdırmaqla hesablanmışdır. N molekulların sayını bildirir

Atom qüvvəsi mikroskopiyası .
Şəkil çəkmə şərtləri . Molekul . |$$| (nm) . |$<>>$| (nm) . |$<>>$| (nm) . |$a$| (μm −1 ) . # İzlər .
Hava görüntüləmə Mg 2+ A-trakt 871 ± 27 (N = 43) 23 ± 1 55 ± 1 17 ± 1 178
Nəzarət 898 ± 21 (N = 44) 54 ± 1 122
Hava görüntüləmə Mg 2+ və Ni 2+ A-trakt 889 ± 28 (N = 41) 24 ± 1 53 ± 1 17 ± 1 141
Nəzarət 902 ± 24 (N = 38) 47 ± 1 89
Maye görüntüləmə Mg 2+ və Ni 2+ A-trakt 858 ± 46 (N = 40) 18 ± 4 47 ± 3 18 ± 1 180
Nəzarət 886 ± 53 (N = 43) 50 ± 1 163
Maqnit cımbızlar
[NaCl] (mM)Molekul |$$| (nm) |$<>>$| (nm) |$<>>$| (nm) |$S$| (pN)N
1 A-trakt 1921 ± 31 22 ± 1 14
Nəzarət 1945 ± 31 49 ± 1 15
10 A-trakt 1910 ± 14 19 ± 1 25
Nəzarət 1940 ± 22 45 ± 1 18
100 A-trakt 1946 ± 16 15 ± 1 28
Nəzarət 1866 ± 20 44 ± 1 20
500 A-trakt 2039 ± 20 12 ± 1 29
Nəzarət 1923 ± 19 41 ± 1 19
Optik cımbızlar
[NaCl] (mM)Molekul |$$| (nm) |$<>>$| (nm) |$<>>$| (nm) |$S$| (pN)N
50 A-trakt 1890 ± 7 20 ±1 38 ± 3 2560 ± 260 9
Nəzarət 1833 ± 7 42 ± 2 49 ± 5 1680 ± 80 10
100 A-trakt 1872 ± 16 20 ± 2 44 ± 3 2400 ± 220 15
Nəzarət 1836 ± 3 42 ± 2 47 ± 4 1540 ± 90 17
500 A-trakt 1839 ± 3 21 ± 1 37 ± 3 2390 ± 190 17
Nəzarət 1830 ± 3 41 ± 3 49 ± 4 1560 ± 100 13
Atom qüvvəsi mikroskopiyası .
Şəkil çəkmə şərtləri . Molekul . |$$| (nm) . |$<>>$| (nm) . |$<>>$| (nm) . |$a$| (μm −1 ) . # İzlər .
Hava görüntüləmə Mg 2+ A-trakt 871 ± 27 (N = 43) 23 ± 1 55 ± 1 17 ± 1 178
Nəzarət 898 ± 21 (N = 44) 54 ± 1 122
Hava görüntüləmə Mg 2+ və Ni 2+ A-trakt 889 ± 28 (N = 41) 24 ± 1 53 ± 1 17 ± 1 141
Nəzarət 902 ± 24 (N = 38) 47 ± 1 89
Maye görüntüləmə Mg 2+ və Ni 2+ A-trakt 858 ± 46 (N = 40) 18 ± 4 47 ± 3 18 ± 1 180
Nəzarət 886 ± 53 (N = 43) 50 ± 1 163
Maqnit cımbızlar
[NaCl] (mM)Molekul |$$| (nm) |$<>>$| (nm) |$<>>$| (nm) |$S$| (pN)N
1 A-trakt 1921 ± 31 22 ± 1 14
Nəzarət 1945 ± 31 49 ± 1 15
10 A-trakt 1910 ± 14 19 ± 1 25
Nəzarət 1940 ± 22 45 ± 1 18
100 A-trakt 1946 ± 16 15 ± 1 28
Nəzarət 1866 ± 20 44 ± 1 20
500 A-trakt 2039 ± 20 12 ± 1 29
Nəzarət 1923 ± 19 41 ± 1 19
Optik cımbızlar
[NaCl] (mM)Molekul |$$| (nm) |$<>>$| (nm) |$<>>$| (nm) |$S$| (pN)N
50 A-trakt 1890 ± 7 20 ±1 38 ± 3 2560 ± 260 9
Nəzarət 1833 ± 7 42 ± 2 49 ± 5 1680 ± 80 10
100 A-trakt 1872 ± 16 20 ± 2 44 ± 3 2400 ± 220 15
Nəzarət 1836 ± 3 42 ± 2 47 ± 4 1540 ± 90 17
500 A-trakt 1839 ± 3 21 ± 1 37 ± 3 2390 ± 190 17
Nəzarət 1830 ± 3 41 ± 3 49 ± 4 1560 ± 100 13

Bu işdə alınmış A-traktların və nəzarət molekullarının mexaniki parametrləri. AFM məlumatlarından mexaniki parametrlər |$langle uyğunluqlarından hesablanmışdır >> angle$| Şəkil 2D və Əlavə Şəkil S5-də təqdim olunan məlumatlar. Səhvlər uyğunlaşma xətasıdır. AFM görüntüləmə şərtləri Materiallar və Metodlar bölməsində təsvir edilmişdir. MT və OT məlumatlarından mexaniki parametrlər hər bir molekul üçün alınan parametrlərin ortasıdır və xətalar orta göstəricinin standart kənarlaşmasıdır. MT ölçmələri üçün |$$| və |$<>>$| verilənlərin (7) tənliyinə uyğunlaşdırılması ilə əldə edilmişdir F < 1 pN rejimi. OT ölçmələri üçün |$$| və |$<>>$| 1 pN < |$F$|-da (8) tənliyinə uyğunlaşdırılmaqla çıxarılmışdır < 10 pN güc diapazonu. |$<>>$| və |$S$| OT məlumatlarını 10-45 pN qüvvə diapazonunda (9) tənliyinə uyğunlaşdırmaqla hesablanmışdır. N molekulların sayını bildirir

Atom qüvvəsi mikroskopiyası .
Şəkil çəkmə şərtləri . Molekul . |$$| (nm) . |$<>>$| (nm) . |$<>>$| (nm) . |$a$| (μm −1 ) . # İzlər .
Hava görüntüləmə Mg 2+ A-trakt 871 ± 27 (N = 43) 23 ± 1 55 ± 1 17 ± 1 178
Nəzarət 898 ± 21 (N = 44) 54 ± 1 122
Hava görüntüləmə Mg 2+ və Ni 2+ A-trakt 889 ± 28 (N = 41) 24 ± 1 53 ± 1 17 ± 1 141
Nəzarət 902 ± 24 (N = 38) 47 ± 1 89
Maye görüntüləmə Mg 2+ və Ni 2+ A-trakt 858 ± 46 (N = 40) 18 ± 4 47 ± 3 18 ± 1 180
Nəzarət 886 ± 53 (N = 43) 50 ± 1 163
Maqnetik cımbızlar
[NaCl] (mM)Molekul |$$| (nm) |$<>>$| (nm) |$<>>$| (nm) |$S$| (pN)N
1 A-trakt 1921 ± 31 22 ± 1 14
Nəzarət 1945 ± 31 49 ± 1 15
10 A-trakt 1910 ± 14 19 ± 1 25
Nəzarət 1940 ± 22 45 ± 1 18
100 A-trakt 1946 ± 16 15 ± 1 28
Nəzarət 1866 ± 20 44 ± 1 20
500 A-trakt 2039 ± 20 12 ± 1 29
Nəzarət 1923 ± 19 41 ± 1 19
Optik cımbızlar
[NaCl] (mM)Molekul |$$| (nm) |$<>>$| (nm) |$<>>$| (nm) |$S$| (pN)N
50 A-trakt 1890 ± 7 20 ±1 38 ± 3 2560 ± 260 9
Nəzarət 1833 ± 7 42 ± 2 49 ± 5 1680 ± 80 10
100 A-trakt 1872 ± 16 20 ± 2 44 ± 3 2400 ± 220 15
Nəzarət 1836 ± 3 42 ± 2 47 ± 4 1540 ± 90 17
500 A-trakt 1839 ± 3 21 ± 1 37 ± 3 2390 ± 190 17
Nəzarət 1830 ± 3 41 ± 3 49 ± 4 1560 ± 100 13
Atom qüvvəsi mikroskopiyası .
Şəkil çəkmə şərtləri . Molekul . |$$| (nm) . |$<>>$| (nm) . |$<>>$| (nm) . |$a$| (μm −1 ) . # İzlər .
Hava görüntüləmə Mg 2+ A-trakt 871 ± 27 (N = 43) 23 ± 1 55 ± 1 17 ± 1 178
Nəzarət 898 ± 21 (N = 44) 54 ± 1 122
Hava görüntüləmə Mg 2+ və Ni 2+ A-trakt 889 ± 28 (N = 41) 24 ± 1 53 ± 1 17 ± 1 141
Nəzarət 902 ± 24 (N = 38) 47 ± 1 89
Maye görüntüləmə Mg 2+ və Ni 2+ A-trakt 858 ± 46 (N = 40) 18 ± 4 47 ± 3 18 ± 1 180
Nəzarət 886 ± 53 (N = 43) 50 ± 1 163
Maqnetik cımbızlar
[NaCl] (mM)Molekul |$$| (nm) |$<>>$| (nm) |$<>>$| (nm) |$S$| (pN)N
1 A-trakt 1921 ± 31 22 ± 1 14
Nəzarət 1945 ± 31 49 ± 1 15
10 A-trakt 1910 ± 14 19 ± 1 25
Nəzarət 1940 ± 22 45 ± 1 18
100 A-trakt 1946 ± 16 15 ± 1 28
Nəzarət 1866 ± 20 44 ± 1 20
500 A-trakt 2039 ± 20 12 ± 1 29
Nəzarət 1923 ± 19 41 ± 1 19
Optik cımbızlar
[NaCl] (mM)Molekul |$$| (nm) |$<>>$| (nm) |$<>>$| (nm) |$S$| (pN)N
50 A-trakt 1890 ± 7 20 ±1 38 ± 3 2560 ± 260 9
Nəzarət 1833 ± 7 42 ± 2 49 ± 5 1680 ± 80 10
100 A-trakt 1872 ± 16 20 ± 2 44 ± 3 2400 ± 220 15
Nəzarət 1836 ± 3 42 ± 2 47 ± 4 1540 ± 90 17
500 A-trakt 1839 ± 3 21 ± 1 37 ± 3 2390 ± 190 17
Nəzarət 1830 ± 3 41 ± 3 49 ± 4 1560 ± 100 13

Maye görüntüləmə

DNT molekulları daha əvvəl bildirildiyi kimi Ni 2+ istifadə edərək maye görüntüləmə üçün immobilizasiya edildi (36, 37). 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8 və 7,5 mM MgCl-də 0,3 nM DNT ehtiva edən 20 μl məhlul2 ilk dəfə təzə parçalanmış mika (SPI-dən V-4 dərəcəli slyuda) üzərinə çökdürülmüş və molekulların tarazlaşmasına imkan vermək üçün 60 s inkubasiya edilmişdir. Sonra 2 μl 2,5 mM NiCl2 məhlula əlavə edildi və molekulları slyuda səthinə bərkitmək üçün əlavə 60 s inkubasiya edildi. The sample was then rinsed four times with 80 μl imaging buffer 10 mM Tris–HCl pH 8 and 10 mM KCl. Images were obtained in a final volume of 80 μl. Images were taken with an AFM from Nanotec Electronica S.L. with Biolever mini tips (AC-40TS Olympus, tip stiffness 0.02–0.1 N/m, tip radius ∼10 nm) using amplitude modulation imaging mode with a free amplitude of 1–2 nm and a set point of ∼0.8 nm.

Images obtained in air and in liquid were taken at a resolution of 1.46 nm/pixel and processed using the ‘Flatten plus’ utility of the WSxM freeware ( 38, 39). Contour lengths were computed by manually tracing the molecules using WSxM. Persistence length of molecules imaged in air were calculated using the tracing routine described in ( 34, 40) by taking 290 nm traces with 2.5 nm point-to-point (l) separation. Persistence length of molecules imaged in liquid were obtained by taking 292 nm traces with l = 4.0 nm.

Magnetic tweezers measurements

We used a magnetic tweezers setup based on an inverted optical microscope illuminated by nearly monochromatic LED light to track micrometer-sized superparamagnetic beads tethered to the surface by the DNA molecule of interest ( 41, 42). The spatial coordinates of the beads are extracted by videomicroscopy analysis of 2D correlation (xy coordinates) and by the analysis of the pattern of diffraction rings (z coordinate). Forces in the range of 0.03–6.5 pN are applied by approximating two vertically-aligned magnets (Supermagnete, W-05-N50-G) separated by a gap of 1 mm. The force applied at a given magnet position was determined from the average extension of the molecule and from the analysis of the Brownian excursions in Fourier space. In addition, motion blur and the ensuing overrating of the force was minimized by tracking at high frequencies (400 Hz). Force-extension curves were obtained by sampling the average extension at a constant force. Molecular extensions were corrected by subtracting the extension at zero force. Double-tethered beads were discarded from our measurement attending to their characteristic rotations-extension response. In addition, we discarded DNA-beads showing large off-center attachment to prevent underrating the persistence length, an artifact previously reported ( 43, 44). Beads with large off-center attachment were identified from the projected circle in the xy plane when magnet turns are applied. All the experiments were performed in a buffer composed of 10 mM Tris–HCl pH 8.0, 1 mM EDTA and supplemented with NaCl at the quoted concentration. The 10 mM Tris–HCl pH 8.0 buffer was prepared from a 1 M Tris–HCl pH 8.0 stock using Trizma ® base and adjusting the pH with HCl. The ionic strength (c) was calculated attending to the concentrations of all the ionic species in the solution, assuming ideal conditions. The concentration of ionized Tris was determined from the Henderson-Hasselbalch equation, whereas EDTA was assumed to possess charge –3 at pH 8. In addition to the Tris, HCl and EDTA species, we considered the sodium ions from the EDTA disodium salt employed to prepare the EDTA stock solution as well as the NaOH added to correct its pH. We obtained c0 = 11.67 mM for the EDTA–Tris buffer. Quoted concentrations of supplemented NaCl were added to c0 for each different experiment.

Optical tweezers measurements

Optical tweezers experiments were performed with a highly stable miniaturized counter-propagating dual-beam setup that operates by direct measurement of light momentum ( 45). Force was determined directly by measuring the deflection of the scattered laser beam with a position sensitive detector using an under-filled microscope objective. Individual DNA constructs labeled with biotin at one end and digoxigenin at the other (see above) were attached between a streptavidin-covered bead (2.1 μm diameter, Kisker Biotech PC-S-2.0) held by suction on top of a micropipette and an anti-digoxigenin-covered bead located at the optical trap (force sensor). Anti-digoxigenin antibody (Roche 11 333 089 001) was immobilized by crosslinking on protein G covered beads with nominal size 3.0 μm (Kisker Biotech PC-PG-3.0). Axial forces were applied to single DNA molecules by displacing the pipette relative to the optical trap. Force–extension curves were obtained at 500 Hz of sampling frequency by moving the optical trap at a pulling rate of 200 nm s −1 with a spatial and force resolution of 1 nm and 1 pN respectively. Our optical tweezers setup controls the distance between the trap center and the pipette (Xümumi), which is different from the end-to-end distance of the DNA molecule (Xend-end). The end-to-end distance was calculated as Xend−end = XTot − (F/k), where F is the force applied to the system, k the stiffness of the trap, and F/k corresponds to the distance (nm) moved by the bead out of the trap center (bead position). The trap stiffness was calibrated by measuring the displacement of the optical trap, while a bead fixed on top of the micropipette is gradually moved in/out of the trap ( 45). The trap stiffness calibrated for 3.0 μm beads was |$k =$| 0.135 ± 0.0043 pN nm −1 , with a linear spring restoring force up to 80 pN (data not shown). Experiments were done in a buffer of 10 mM Tris–HCl pH 8.0, 1 mM EDTA with the concentration of NaCl specified in the text. Raw data was processed by computing a running average in windows of 100 points. WLC and eWLC fitting parameters were obtained for each molecule and were then averaged. The errors in the parameters are the standard error of this mean.


Part 1 [15 pts]: git Remotes¶

Problem 1 [15 pts]: Understanding Remotes¶

Remotes are an important concept in git . Being a decentralized version control system, git allows each user to have the entire history of the project locally. This means that you can develop anywhere you want (e.g. an airplane over the ocean!). It also means that you have to be comfortable working with repos from other people not just a central repository.

The key idea here is that of remote repositories. You have probably noticed by now that git has names such as origin and master . The name origin refers to the name of the remote repository while the name master refers to the name of the branch . Repositories can have many branches. You can create references to other repositories (called remotes) within your current repository and customize the names.

You will complete this problem in your course repo in the HW2/ directory on the HW2-dev branch.

Complete the following steps:

  1. Type git remote -v and take a screenshot. Save it as P1_1.png , put it in your HW2-final/ directory, commit the changes to your local repo, and push the changes to origin .
  2. Add your playground repository as a remote. Use the command git remote add remote_name remote_url where remote_name should be replaced with the alias of the remote repo and remote_url should be replaced with the url to the remote repo. You can name the remote whatever you want. In the rest of this exercise, we will refer to the playground remote name as my_name .
  3. Type git remote -v and take a screenshot. Save it as P1_3.png and put it in your HW2-final/ directory, commit the changes to your local repo, and push the changes to origin .
  4. Now create a remote to the course playground ( cs107-sys-dev/playground ). No need to take a screenshot this time.
  5. Next fetch the changes from the remote course playground.
  6. Try out the git remote show my_name command. How useful! This is a good thing to check before blindly merging.
  7. Now merge the changes into your local cs107 repo on the HW2-dev branch (this should go smoothly because you shouldn't have any of the files yet so there's really nothing to merge).
    • Note that Steps 5 and 7 could have been combined with a git pull remote_name branch_name command, where branch_name should be replaced with the branch that you want to pull from. It's good to get in the habit of first fetching and then merging this helps enforce good practices.
    • Hint: Because your playground and course repos are not related, they have different git histories. git automatically rejects merges of repos with different histories. However, for this problem we will override that behavior. Try using the option --allow-unrelated-histories .
    • Hint: Sən may need to resolve a merge conflict. In case you do, it's best to retain whatever was in your course repo (instead of what was in the playground).
  8. Show the status of your repo with the appropriate git command. Take a screenshot, save it as P1_8.png , and put it in your HW2-final/ directory.
  9. Move the files and directories that were merged from the playground repo into your HW2-final/ directory.
  10. Commit the changes to your local repo.
  11. Push the changes to your remote course repo (probably named origin ).
  12. Optional Rename the remote with the command git remote rename my_name new_name , where new_name should be replaced by the new alias that you want to use. Remove the remote with git remote remove my_name .

Final Deliverables (expected in your HW2-final/ directory)¶

  • P1_1.png
  • P1_3.png
  • P1_8.png
  • From playground merge
    • src/
    • tests/
    • README.md
    • environment.yml

    PrioriTree: Setting up BEAST Discrete-Biogeographic Analyses with Visualized Priors and Assessing Their Impact

    BEAST provides two options to infer biogeographic history. By default in BEAST, when users choose to estimate the overall number of dispersal events and/or between each pair of areas, a “fast stochastic mapping” algorithm (Minin and Suchard 2008a, 2008b O’Brien, Minin, and Suchard 2009) will be used to compute the expected number of events on each branch by analytical integration over the branch. This is the first option in the dropdown menu of PrioriTree, Fast stochastic mapping (incomplete history, simulation-free) .

    Figure 2.3: Biogeographic History Inference

    Note that as only the expected numbers of events are computed under this algorithm, we won’t be able to estimate the full biogeographic history (yəni., no estimates on when exactly the dispersal event occurred) using it.

    Alternatively, if users are interested in estimating the entire biogeographic history, simulation-based “stochastic mapping” algorithm should be used (Nielsen 2002 Rodrigue, Philippe, and Lartillot 2007 Hobolth and Stone 2009) . BEAST also allows us to pursue this approach it will be used when users select the second option in the dropdown menu of PrioriTree, Stochastic mapping (complete history, simulation-based) .

    Under either approach, users may choose to estimate the overall number of dispersal events and/or the number of dispersal events between each pair of areas. If none of them are chosen and the fast stochastic mapping algorithm (first option) is selected, PrioriTree won’t do anything (yəni., the part of XML script that tells BEAST to perform the computation for the expected number of dispersal events won’t be produced) if the stochastic mapping algorithm (second option) is selected, PrioriTree will still produce an XML script that tells BEAST to infer the full biogeographic history (which will be recorded in the output tree file the number of dispersal events won’t be written to the parameter log file, but they can still be retrieved from the tree log file).

    2.4.2 Evaluate Model and Priors

    Figure 2.4: Model Exploration Analyses

    2.4.2.1 Run Under Prior

    PrioriTree visualizes the prior distributions specified on the two focal parameters, as well as the resulting prior distribution on the expected number of dispersal events across the entire biogeographic history. Users may run MCMC simulations in BEAST to confirm that the induced prior distributions are consistent with expectation by selecting the Under prior option in the dropdown menu in the further model exploration analysis panel. (PrioriTree achieve this type of analysis by setting all the geographic-area data to "?" in the XML script.)

    2.4.2.2 Marginal Likelihood Estimation

    Users can choose to estimate marginal likelihood of their specified (prior)models. PrioriTree sets up the analysis in BEAST by appending a marginalLikelihoodEstimator section in the XML, after the analysis configuration section of the MCMC that approximates the joint posterior distribution. This will allow us to estimate marginal likelihood through both thermodynamic integration (Lartillot and Philippe 2006) and stepping-stone sampling (Xie et al. 2011 Baele et al. 2012) .

    The workhorse of marginal likelihood estimation is a sequence of power-posterior inferences, where for each individual inference (i) , the likelihood is raised to a power, (eta_i) , between 0 and 1. The allocation of (eta) values may affect the accuracy of the estimates. Following the BEAST default, PrioriTree specifies the sequence of (eta) values following evenly-spaced quantiles of a Beta ((0.3, 1.0)) distribution, so that more values of (eta) are put near 0 than near 1 (originally recommended by Xie et al. 2011) .

    Figure 2.5: Marginal Likelihood Estimation Analyses

    The number of powers and how many MCMC generations under each power may also strongly impact the accuracy of the estimates. Default values are probably enough for most empirical datasets and models. However, the most straightforward way to check the convergence of marginal likelihood estimates is to run multiple replicates of the analyses to see if we get stable estimates across replicates. If the estimates differ significantly among replicates (say greater than a few log-likelihood units), users may consider to increase the number of powers and/or the MCMC chain length under each power.

    2.4.2.3 Robust Bayesian

    Robust Bayesian inference can be used to explore the impact of prior specification on posterior estimates it assesses the “robustness” of our posterior estimates to prior specification. To achieve this, we need to run multiple Bayesian analyses using identical model but different priors, and then we can compare the estimated joint posterior distribution to assess the robustness. If the posterior distributions are (mostly) identical across prior models, then we may conclude that the posterior estimates are rather robust to alternative priors. Conversely, if the estimated posterior distributions differ drastically (yəni., largely non-overlapping) among the priors, and so do the corresponding prior distributions (especially when the posteriors exhibit similar non-overlapping patterns as the priors), then we may conclude that the posterior estimates are sensitive to the specified prior (yəni., the prior is relatively too informative comparing with the data).

    2.4.2.4 Data Cloning

    A computational technique called data cloning may help us understand the sensitivity of posterior estimates to the choice of prior. Originally developed as a tool for using MCMC to perform maximum-likelihood inference (Robert 1993) , and later used as a tool for understanding model identifiability for complex Bayesian models (Lele, Dennis, and Lutscher 2007 Ponciano et al. 2009, 2012) , data cloning involves performing a sequence of MCMC analyses with an increasing number of duplicates of the observed data. A particular MCMC in the sequence is defined by the number of duplicated datasets, (<eta_i geq 1>) , with the resulting posterior distribution being: [egin P( heta mid X)_ <eta_i>propto P(X mid heta)^ <eta_i>P( heta). end] As (eta_i ightarrow infty) (and assuming the model is identifiable), the joint posterior distribution should converge to a point that is identical to the joint maximum-likelihood estimate (MLE) if the joint posterior distribution does not converge to a point, then the model is nonidentifiable (yəni., the MLE may not be unique). When the model is identifiable, the rate at which the joint posterior distribution converges to the MLE is related to the amount of information available in the data relative to the strength of the prior, yəni., when the prior is strong, convergence to the MLE will be slow.

    Figure 2.6: Data Cloning Analyses

    You can specify the number of clones to use in PrioriTree. Effectively, PrioriTree duplicates the geographic-area data into an alignment, where all the sites in the alignment are identical and the number of sites is the number clones. To assess how the posterior estimates may change under more information in the data, you may generate a sequence of data-cloning analyses with increasing number of clones (məs. 5, 10, 20).

    2.4.2.5 Posterior-Predictive Checking

    Posterior-predictive simulations can be used to evaluate the absolute fit of model to the data (Gelman, Meng, and Stern 1996 Bollback 2002) . Each individual simulation is performed by drawing a vector of parameters, (< heta_i = , oldsymbol, mu_i >>) , at random from the MCMC samples approximating the joint posterior distribution, and then simulating a predictive dataset, (G^ ext_i) , conditional on those parameters using the sim.history() function in the R (R Core Team 2020) package fitollar (Revell 2012) . Repeating this simulation procedure (m) times, we obtain (m) predictive datasets.

    A difference statistic can then be calculated for the (i^ ext) simulated dataset as: [egin D_i = T(G^ ext_i mid heta_i) - T(G^ ext mid heta_i), end] where (G^ ext) is the observed biogeographic dataset, and (T( cdot mid heta_i)) is a summary statistic (detailed below).

    For the (m) predictive datasets, the posterior-predictive (p) -value is calculated as: [egin P = frac<1> sum_^m D_i geq 0, end] with values between (0.025) and (0.975) indicating that the model is adequate and cannot be rejected (yəni., the observed statistic is within the 95% posterior-predictive interval).

    Two summary statistics can be used to assess model adequacy: (1) the parsimony statistic, and (2) the tip-wise multinomial statistic. For the parsimony statistic, we simply calculated the parsimony score for the given simulated or observed dataset, conditional on the sampled tree, (Psi_i) , using the parsimony() function in R package phangorn (Schliep 2010) .

    The tip-wise multinomial statistic is similar to the multinomial statistic introduced by Goldman (1993) and used in posterior-predictive simulation by Bollback (2002) , which treats the sites (columns) in a molecular alignment as outcomes of a multinomial trial. The tip-wise statistic is similar, but treats the states at the tips of the tree for the single geographic character (yəni., site) as the outcomes of the multinomial trial. For the tip-wise multinomial statistic, we calculated: [egin T(G mid heta_i) = sum_^k n_i ln(n_i / n), end] where (n) is the number of tips, and (n_i) is the number of tips in state (i) .

    İstinadlar

    Baele, Guy, Philippe Lemey, Trevor Bedford, Andrew Rambaut, Marc A Suchard, and Alexander V Alekseyenko. 2012. “Improving the Accuracy of Demographic and Molecular Clock Model Comparison While Accommodating Phylogenetic Uncertainty.” Molecular Biology and Evolution 29 (9): 2157–67.

    Bollback, Jonathan P. 2002. “Bayesian Model Adequacy and Choice in Phylogenetics.” Molecular Biology and Evolution 19 (7): 1171–80.

    Gelman, Andrew, Xiao-Li Meng, and Hal Stern. 1996. “Posterior Predictive Assessment of Model Fitness via Realized Discrepancies.” Statistica Sinica, 733–60.

    Goldman, Nick. 1993. “Statistical tests of models of DNA substitution.” Molekulyar Təkamül Jurnalı 36 (2): 182–98.

    Hobolth, Asger, and Eric A Stone. 2009. “Simulation from Endpoint-Conditioned, Continuous-Time Markov Chains on a Finite State Space, with Applications to Molecular Evolution.” The Annals of Applied Statistics 3 (3): 1204.

    Lartillot, N., and H. Philippe. 2006. “Computing Bayes Factors Using Theromodynamic Integration.” Sistematik Biologiya 55: 195–207.

    Lele, Subhash R, Brian Dennis, and Frithjof Lutscher. 2007. “Data Cloning: Easy Maximum Likelihood Estimation for Complex Ecological Models Using Bayesian Markov Chain Monte Carlo Methods.” Ekologiya məktubları 10 (7): 551–63.

    Minin, Vladimir N, and Marc A Suchard. 2008a. “Counting labeled transitions in continuous-time Markov models of evolution.” Journal of Mathematical Biology 56 (3): 391–412.

    Minin, Vladimir N, and Marc A Suchard. 2008b. “Fast, Accurate and Simulation-Free Stochastic Mapping.” Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 363 (1512): 3985–95.

    Nielsen, Rasmus. 2002. “Mapping Mutations on Phylogenies.” Sistematik Biologiya 51 (5): 729–39.

    O’Brien, John D, Vladimir N Minin, and Marc A Suchard. 2009. “Learning to Count: Robust Estimates for Labeled Distances Between Molecular Sequences.” Molecular Biology and Evolution 26 (4): 801–14.

    Ponciano, Jose Miguel, Mark L Taper, Brian Dennis, and Subhash R Lele. 2009. “Hierarchical Models in Ecology: Confidence Intervals, Hypothesis Testing, and Model Selection Using Data Cloning.” Ekologiya 90 (2): 356–62.

    Ponciano, José Miguel, J Gordon Burleigh, Edward L Braun, and Mark L Taper. 2012. “Assessing Parameter Identifiability in Phylogenetic Models Using Data Cloning.” Sistematik Biologiya 61 (6): 955–72.

    R Core Team. 2020. R: A Language and Environment for Statistical Computing. Vienna, Austria: R Foundation for Statistical Computing. https://www.R-project.org/.

    Revell, Liam J. 2012. “Phytools: An R Package for Phylogenetic Comparative Biology (and Other Things).” Methods in Ecology and Evolution 3 (2): 217–23.

    Robert, Christian P. 1993. “Prior Feedback: A Bayesian Approach to Maximum Likelihood Estimation.” Computational Statistics 8: 279–94.

    Rodrigue, Nicolas, Hervé Philippe, and Nicolas Lartillot. 2007. “Uniformization for Sampling Realizations of Markov Processes: Applications to Bayesian Implementations of Codon Substitution Models.” Bioinformatika 24 (1): 56–62.

    Schliep, Klaus Peter. 2010. “Phangorn: Phylogenetic Analysis in R.” Bioinformatika 27 (4): 592–93.

    Xie, W., P. O. Lewis, Y. Fan, L. Kuo, and M.-H. Chen. 2011. “Improving Marginal Likelihood Estimation for Bayesian Phylogenetic Model Selection.” Sistematik Biologiya 60: 150—160.


    Videoya baxın: Вся правда об осциллографе FNIRSI-1014D (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Kajinn

    I believe this is your mistake.

  2. Vujinn

    Bu əlamətdar fikir yalnız təxminən

  3. Yvet

    Hesab edirəm ki, siz səhv edirsiniz. Mən bunu sübut edə bilərəm. Mənə pm-də yazın.

  4. Basil

    You have thought up such matchless phrase?

  5. Bemossed

    Məncə siz haqlı deyilsiniz. Mən əminəm. PM-ə yazın, danışarıq.



Mesaj yazmaq