Məlumat

Həzm olunan məhsul lentləri yoxdur, lakin markerlər görünür. Səbəblər nə ola bilər?

Həzm olunan məhsul lentləri yoxdur, lakin markerlər görünür. Səbəblər nə ola bilər?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Tərkibində plazmid və insertimin bağlanmalı olduğu başqa vektoru həzm etməli oldum, hər biri BamHI və NotI ilə.

Həzm edildikdən sonra nəticələri yoxlamaq üçün jeli işə saldım. Həzm kifayət qədər yaxşı bantlarla ilk dəfə yaxşı görünürdü. Daha çox konsentrasiyaya ehtiyacım olduğundan, ikinci dəfə eyni reaksiya quruluşu (30microL) ilə gel işlətdim.

Quyu 1 - 100bp marker

Quyu 2 - Vektora daxil edin (820 ng/mikroL, 3mikroL)

Quyu 3- Əlavənin bağlanmalı olduğu plazmid vektoru (1000 ng/mikroL, 2mikroL)

Digər quyularda heç bir zolaq olmadığı halda marker zolaqları zəif idi. İkinci qaçış zamanı uğursuzluğun səbəbi nə ola bilər? Birincidən sonra 40 dəqiqə ərzində ikinci dəfə həzm etdim.


Adətən qarışdırma problemi yoxdur. Mümkün səbəblərdən biri deqradasiyadır. Amma siz markerin zəif olduğunu deyirsiniz (marker korlanmayacaq). Geli əlavə EtBr ilə ləkələyin və yenidən baxın. Əgər geli təkrar istifadə etmisinizsə, onu mütləq yenidən ləkələyin, çünki EtBr katoda doğru miqrasiya edir.

Mənə tənəzzül kimi görünmür, amma növbəti dəfə ehtiyatlı olmaq lazımdır:

  • Təzə avtoklavlanmış su istifadə edin. Əmin deyilsinizsə, şprislə süzün və özünüz üçün 10 ml saxlayın
  • Plastik qabların da düzgün şəkildə avtoklavlandığından əmin olun.
  • Endo istifadə edin - plazmid ekstraksiya dəstləri, əgər varsa
  • Plazmidi TE-də həll edin (yalnız konsentrasiya yüksək olduqda və reaksiya qarışığına çox əlavə etmək lazım deyilsə, əks halda EDTA reaksiyalara müdaxilə edər. Bu halda Tris-Cl pH-7.6 istifadə edin).
  • Çoxlu DNT-ni həzm etməlisinizsə, bir çox boruda kiçik reaksiyalar qurun.
  • Reaksiyanı çox uzun müddət (>6 saat) inkubasiya etməyin.
  • Dərhal gel işlətmirsinizsə, fermenti qızdıraraq təsirsiz hala salın.
  • Gel işləyən tamponların çox köhnə olmadığından əmin olun.

Plazmidlər 101: Məhdudiyyətli Digest Analizindən istifadə edərək Plazmidinizi Necə Doğrulamaq olar

Təbrik edirik, maraq geninizi (YGOI) ifadə edən plazmidiniz var və funksional təcrübələrinizə dalmağa hazırsınız! İstər özünüz plazmidi klonladınız, istərsə də koridordakı həmkarınızdan əldə etmisinizsə, düzgün konstruksiya ilə işlədiyinizi təsdiqləmək və aldığınız plazmidin gözlənilən ardıcıllığa uyğun olduğunu yoxlamaq üçün bir az vaxt ayırmaq həmişə yaxşı fikirdir. . Burada, Addgene-də payladığımız bütün plazmidlərin ardıcıllığını təsdiqləmək üçün NGS əsaslı keyfiyyət nəzarətindən istifadə edirik. Bu üsul çox vaxt tələb edir, ona görə də plazmidlərinizi yoxlamaq və yoxlamaq üçün müxtəlif yolları tövsiyə edirik. Burada məhdudiyyət həzm analizini əhatə edəcəyik.


Tez-tez verilən suallar: Niyə məhdudlaşdırıcı həzmdən sonra agaroz geldə DNT yaxması görürəm?

Məhdudiyyət həzmindən sonra agaroz gelinizdə DNT yaxmasının görünməsinin bir neçə mümkün səbəbi var. Bu mövzuda müzakirə üçün yuxarıdakı videoya baxın.

Məhdudiyyət həzmindən sonra agaroza gel üzərində DNT yaxması aşağıdakılardan bir və ya daha çoxunun nəticəsi ola bilər:
1. həzm reaksiyasında nukleaz çirklənməsi
2. gel qutusunda işləyən buferlə bağlı problemlər və ya
3. məhdudlaşdırıcı fermentin DNT-yə yüksək bağlanma afinitesi var
Nukleaza ilə çirklənmə mənbəyi DNT preparatından, həzm tamponundan və ya həzm qarışığında istifadə olunan sudan ola bilər. Müvafiq nəzarət ilə bu komponentlərin hər biri təyin olunmuş həzm temperaturunda inkubasiyadan sonra müstəqil olaraq yoxlana bilər.
Otaq temperaturunda uzun müddət saxlanılan işləyən tamponlar nəticədə sönə və elektroforezə mənfi təsir göstərə bilər. Gel qutusundakı bufer buludlu görünürsə və gel axını anormal nəticələr göstərirsə, ən yaxşı nəticələr üçün həzm sisteminizi yükləməzdən əvvəl gel qutusunu yuyun və təzə geldən istifadə edin.
DNT-nin bağlanmasından şübhələnirsinizsə, həzm edildikdən sonra 0,1 - 0,5% SDS məhlulunun əlavə edilməsi fermentin DNT-dən ayrılmasına kömək edəcək və gel üzərində işləyərkən müvafiq zolaq nümunəsinin göstərilməsinə imkan verəcək.
Əlavə məlumat üçün lütfən, məhdudlaşdırıcı fermentdən istifadə qaydalarına və ya nasazlıqların aradan qaldırılması təlimatına baxın.


Plazmid DNT və gel elektroforezi haqqında:

Plazmid DNT üç formada mövcud ola bilər: superdolaqlı, açıq dairəvi (oc) və xətti (supercoiled plazmid DNT tez-tez kovalent qapalı dairəvi DNT kimi istinad edilir, ccc).
in vivo, plazmid DNT, hüceyrənin içərisinə sığmasını təmin etmək üçün sıx şəkildə super qıvrılmış bir dairədir. Laboratoriyada diqqətli plazmid hazırlığından sonra DNT-nin çox hissəsi superburulmuş qalacaq, lakin müəyyən bir miqdar tək zəncirli nickləri saxlayacaq. Tellərdən yalnız birində qırılma olduğunu nəzərə alsaq, DNT dairəvi qalacaq, lakin qırılma fosfodiester onurğası ətrafında fırlanmağa imkan verəcək və super sarmallar sərbəst buraxılacaq.
Kiçik, yığcam superburulmuş ccc-DNT düyün, agaroza matrisinə qarşı oc-DNT-nin geniş, disket açıq dairəsindən daha az sürtünmə saxlayır. Buna görə də, eyni ümumi ölçüdə super qıvrılmış DNT açıq dairəvi DNT-dən daha sürətli işləyir. Xətti DNT əvvəlcə gel ucundan keçir və beləliklə, açıq dairəvi DNT-dən daha az sürtünmə qüvvəsini saxlayır, lakin həddindən artıq qıvrılmış DNT-dən daha çox. Beləliklə, kəsilməmiş plazmid bir gel üzərində oc və ccc konformasiyalarını təmsil edən iki zolaq əmələ gətirir. Plazmid bir dəfə məhdudlaşdırıcı fermentlə kəsilərsə, superdolaqlı və açıq dairəvi konformasiyaların hamısı xətti konformasiyaya qədər azalır.
İzolyasiyadan sonra plazmid hazırlığı yaşlandıqca kortəbii nicklər yığılır. Bu, gellərdə aydın şəkildə görünə bilər, çünki iki uyğunluğun nisbəti zamanla dəyişir: dəfələrlə əridilmiş və yenidən dondurulmuş plazmid hazırlayıcıları təzə hazırlıqlardan daha çox oc DNT göstərir.

Bu, üç DNT nümunəsinin elektroforezindən sonra tərkibində etidium bromid olan agaroz gelinin qara-ağ fotoşəkilidir. Şəkil çəkilən zaman gel UV lampada idi. EthBr-nin DNT molekullarına xüsusi bağlanması səbəbindən DNT zolaqları parlaq narıncı rəngə malik olduğu halda, zəif narıncı idi.
Miqrasiya yuxarıdan aşağıya doğru idi: anod (+) bu gelin aşağı tərəfində, katod (-) yuxarıda yerləşirdi. Kiçik DNT molekulları böyüklərdən daha sürətli miqrasiya edir. Bu zolaqlar intensivliyə görə fərqlənir: daha böyük fraqmentlər daha çox EthBr-ni bağlayır. Bu, çox yaxşı görünür Ölçü marker zolağı 1. Bu zolaqdakı bütün fraqmentlər müəyyən bir DNT-nin həzm edilməsi ilə əmələ gəlir, buna görə də fraqmentlər ekvimolyar miqdarlar və lentlərin parlaqlığı onların (məşhur) uzunluqlarına uyğundur.
Aydındır ki, içində zolaq 2 iki fraqment qeyri-ekvimolyar miqdarda mövcuddur (yuxarı zolaq daha uzun DNT molekullarını ehtiva etməlidir, lakin aşağı zolaqdan daha az intensivdir..). Bu xüsusi halda, onlar eyni plazmid DNT-nin iki dairəvi formasını təmsil etdikləri üçün (üstdə oc və aşağıda ccc). Hər iki zolaqdakı DNT miqdarının nisbəti plazmid preparatının yaşından və keyfiyyətindən asılıdır.

Haqqında məlumat üçün SCLResources>Lambda DNA-ya da baxın Lambda DNT həzminin gel bandı nümunəsi.


CRISPR/Cas9 sistemi ilə hibrid toxum istehsalı üçün marker istifadəsi ilə pomidor kişi-steril xətlərinin sürətli nəsli

Tərəvəz bitkilərinin hibridləri yüksək aqrotexniki göstəricilərinə görə hazırda geniş şəkildə tətbiq olunur. Bununla belə, effektiv hibrid istehsalı, effektiv kişi sterilliyi sisteminin olmaması səbəbindən pomidorda hibrid toxumların təmizliyini təmin etmək üçün zəhmətli əl ilə kəsmə tələb edir. Burada, qruplaşdırılmış müntəzəm aralıqlı qısa palindromik təkrarlar (CRISPR)/CRISPR ilə əlaqəli zülal 9 (Cas9) sistemində müxtəlif skrininq markerləri ilə iki növ pomidor nüvəli kişi-steril xətləri yaratdıq. Co-nokautlar steril kişi 10 35 (Ms10 35 ) və glutatyon S-transferaza (GSTAA) yaşıl hipokotillə işarələnmiş kişi-steril xətt yaratmışdır. The Ms10 35 biallelik mutasiya yunlu pomidor fonuna daxil edildi, nəticədə kişi sterilliyi və qeyri-yun fenotipi əlaqəsi yarandı. İki növ erkək-steril xətlər cücərmə mərhələsində hipokotil rənginə və ya trixome sıxlığına görə asanlıqla seçildi və hibrid toxum istehsalı zamanı yüksək toxum təmizliyi göstərdi. Bizim işimiz pomidorda hibrid toxum istehsalına praktiki olaraq tətbiq oluna bilən CRISPR/Cas9 sistemi ilə əlavə modifikasiya edilmədən hibridlərin valideynlərinə kişi-steril fenotipinin sürətlə ötürülməsi prosedurunu müəyyən etmişdir. Bu üsul CRISPR/Cas9 sistemi ilə hibrid istehsal üçün çoxlu məhsulun steril valideyn yaradılması üçün əsas və nümunə olacaqdır.

Bu, abunə məzmununun, qurumunuz vasitəsilə girişin önizləməsidir.


Niyə mən ləkələnmiş və ya gülümsəyən DNT band(lar)ını və ya uyğunsuz DNT miqrasiyasını görürəm?

Bir çox müştərilər rahatlıq üçün GelRed® və ya GelGreen® prefabrik gellərdən istifadə edirlər. Bununla belə, GelRed® və GelGreen® təhlükəsizliyini artırmaq üçün daha böyük boyalar olmaq üçün nəzərdə tutulmuş yüksək yaxınlıqlı boyalar olduğundan, onlar prefabrik gellərdə DNT-nin miqrasiyasına təsir göstərə bilər. Məhdud həzm edilmiş DNT kimi bəzi nümunələr GelRed® və ya GelGreen® prefabrik gellərində anormal şəkildə miqrasiya edə bilər.

İpucu №1: Daha az DNT yükləyin

GelRed® və ya GelGreen® prefabrik gellərində bulaşma və gülümsəmə ən çox DNT-nin həddindən artıq yüklənməsi nəticəsində yaranır. Qrup miqrasiyasının yerdəyişmələrini və ya ləkələməsini və gülümsədiyini görürsünüzsə, yüklənmiş DNT miqdarını azaltmağa çalışın. Nərdivanlar və məlum konsentrasiyalı nümunələr üçün tövsiyə olunan yükləmə miqdarı 50-200 ng/zolaqdır. Naməlum konsentrasiyalı nümunələr üçün adi DNT miqdarının yarısını və ya üçdə birini yükləməyə çalışın. Bu, adətən band miqrasiya problemlərini həll edir.

İpucu №2: Boyanma sonrası protokolu sınayın

Boyanın DNT miqrasiyasında ola biləcək hər hansı müdaxilənin qarşısını almaq üçün boyama sonrası protokoldan istifadə etməyi tövsiyə edirik. Tətbiqiniz tövsiyə olunan DNT miqdarından artıq yükləmə tələb edirsə, boyama sonrası protokoldan istifadə edin. Biz boyama sonrası gelləri 30 dəqiqə ərzində tövsiyə etsək də, nə qədər DNT-nin mövcudluğundan asılı olaraq, siz beş dəqiqə ərzində lentləri görə bilərsiniz. Boyanma sonrası həllər təkrar istifadə edilə bilər. Ətraflı protokollar üçün GelRed® Product Information Sheet və ya GelGreen® Product Information Sheet-ə baxın.


METODKİTAB

Agaroz gel elektroforezi DNT-nin ayrılması və təhlili üçün ən asan və ümumi üsuldur. Gelin məqsədi DNT-yə baxmaq, onun miqdarını təyin etmək və ya müəyyən bir bandı təcrid etmək ola bilər. DNT, mutagen olan etidium bromid və ya GelRed, GelGreen və SYBR Safe kimi daha az zəhərli xüsusi boyaların əlavə edilməsi ilə geldə vizuallaşdırılır. Etidium bromid və xüsusi boyalar DNT-yə bağlanır və flüoresandır, yəni onlar görünməz UV işığını udur və enerjini görünən işıq kimi ötürürlər.

Neçə faiz gel?

Əksər agaroz gelləri 0,7% ilə 2% arasında hazırlanır. 0,7% gel böyük DNT fraqmentlərinin (5󈝶 kb) yaxşı ayrılması (rezolyutsiya) göstərəcək və 2% gel kiçik fraqmentlər (0,2𔂿 kb) üçün yaxşı həlledicilik göstərəcək. Bəzi insanlar çox kiçik fraqmentləri ayırmaq üçün 3%-ə çatır, lakin bu halda şaquli poliakrilamid gel daha uyğundur. Aşağı faizli gellər çox zəifdir və onları qaldırmağa çalışdığınız zaman qırıla bilər. Yüksək faizli gellər tez-tez kövrək olur və bərabər şəkildə qurulmur. Mən adətən 1% gel hazırlayıram.

Hansı gel tankı?

Kiçik 8x10 sm gellər (minigellər) çox populyardır və yaxşı fotoşəkillər verir. Daha böyük gellər Cənubi və Şimal ləkələri kimi tətbiqlər üçün istifadə olunur. Minigel üçün tələb olunan agarozun həcmi təxminən 30󈞞 mL, daha böyük gel üçün isə 250 mL ola bilər. Bu üsul mini-gel hazırladığınızı nəzərdə tutur.

Nə qədər DNT yükləməliyəm?

Böyük sual. DNT-nizə baxmaq üçün analitik gel hazırlaya bilərsiniz. Alternativ olaraq, gələcək müalicə üçün geldən kəsmədən əvvəl DNT fraqmentini ayırmaq üçün hazırlıq geli hazırlaya bilərsiniz. İstənilən halda siz etidium-bromidlə boyanmış geldə UV işığı altında DNT zolaqlarını görmək istəyirsiniz. Tipik olaraq, bir zolaq təxminən 20 ng DNT ehtiva edərsə asanlıqla görünür.

İndi bir nümunə nəzərdən keçirin. Tutaq ki, siz 3 kb vektor və 2 kb insertdən ibarət plazmidi həzm edirsiniz. Siz EcoRI (ümumi məhdudlaşdırıcı ferment) istifadə edirsiniz və siz üç zolaq görəcəyinizi gözləyirsiniz: xətti vektor (3 kb), daxiletmənin 5' ucu (0,5 kb) və əlavənin 3' ucu (1,5 kb). Ən kiçik zolağı (0,5 kb) görmək üçün onun ən azı 20 ng DNT olmasını istəyirsiniz. Ən kiçik zolaq kəsilməmiş plazmidin ölçüsünün 1/10 hissəsidir. Buna görə də 10x20 ng, yəni 200 ng DNT (0,2µg) kəsmək lazımdır. Sonra sizin üç zolağınızda müvafiq olaraq 120 ng, 20 ng və 60 ng DNT olacaq. Hər üç zolaq geldə aydın görünəcək və ən böyük lent ən kiçik bantdan altı dəfə daha parlaq olacaq.

İndi təsəvvür edin ki, eyni plazmidi BamHI (başqa bir məşhur məhdudlaşdırıcı ferment) ilə kəsin və BamHI plazmidi xəttiləşdirmək üçün onu yalnız bir dəfə kəsir. Bu vəziyyətdə 200 ng DNT-ni həzm etsəniz, bant 200 ng DNT ehtiva edəcək və çox parlaq olacaqdır.

Həddindən artıq DNT gel üzərinə yükləmək pis bir şeydir. Qrup sürətlə işləyir (həqiqətən olduğundan daha kiçik olduğunu nəzərdə tutur) və həddindən artıq hallarda digər lentlər üçün elektrik sahəsini poza bilər, bu da onları yanlış ölçüdə göstərə bilər.

Çox az DNT yalnız bir problemdir ki, siz ən kiçik lentləri görə bilməyəcəksiniz, çünki onlar çox zəifdir.

Bütün bunları söylədikdən sonra, DNT gelləri bağışlayıcıdır və DNT yüklərinin geniş diapazonu məqbul nəticələr verəcəkdir. Mən adətən bir dəst miniprepindən əldə edilən 50 µL-dən 2𔃂 µL-ni həzm edirəm və yükləyirəm. PCR reaksiyaları üçün bu, PCR-dən asılıdır, lakin rutin tətbiqlərdə 10󈞀 µL məhsulu geldə görmək üçün kifayət qədər olmalıdır.

Hansı daraq?

Bu, yüklədiyiniz DNT-nin həcmindən və nümunələrin sayından asılıdır. Çox kiçik dişləri olan daraqlar 10 µL tuta bilər. 20 µL məhdudlaşdırıcı həzm və 5 µL yükləmə buferi yükləmək istəyirsinizsə, bu yaxşı deyil. Bir tarağın kifayət qədər dişləri olub-olmadığına qərar verərkən, ən azı bir marker zolağı, tercihen iki yükləməli olduğunuzu unutmayın.

Gelin hazırlanması (1% gel üçün, 50 ml həcm)

0,5 q agarozu 250 ml-lik konusvari kolbaya çəkin. 50 mL 0,5xTBE əlavə edin, qarışdırmaq üçün çevirin.

Mikrodalğalı sobaya sığdığı müddətcə böyük bir qabdan istifadə etmək yaxşıdır, çünki agaroza asanlıqla qaynayır.

Agarozu həll etmək üçün təxminən 1 dəqiqə mikrodalğalı sobaya qoyun.

Agaroza məhlulu çox asanlıqla qaynaya bilər, ona görə də onu yoxlamağa davam edin. 45 saniyədən sonra onu dayandırmaq və bir burulma vermək yaxşıdır. O, həddindən artıq qızdırıla bilər və siz onu çıxarana qədər qaynamaya bilər, bundan sonra əllərinizdə qaynayır. Belə ki əlcək geyin və qol uzunluğunda saxlayın. Mikrodalğalı soba əvəzinə bunsen ocağından istifadə edə bilərsiniz - sadəcə onu izləməyi unutmayın.

Onu skamyada 5 dəqiqə təxminən 60ºC-yə qədər sərinləmək üçün buraxın (yalnız əllərdə saxlamaq üçün çox istidir).

Əgər agarozu həll etmək üçün onu uzun müddət qaynatmalı olsanız, o zaman su buxarına bir qədər su itirmiş ola bilərsiniz. Siz kolbanı qızdırmazdan əvvəl və sonra çəkin və bu itirilmiş həcmi doldurmaq üçün bir az distillə edilmiş su əlavə edə bilərsiniz. Agaroza soyuduqda, gel tankını düz bir səthdə hazırlayın.

1 µL etidium bromid (10 mq/mL) əlavə edin və qarışdırmaq üçün çevirin.

Bu addımdan əvvəl agarozun bir az soyumasına icazə verilməsinin səbəbi etidium bromid buxarının istehsalını minimuma endirməkdir. Etidium Bromide mutagen və son dərəcə ehtiyatlı davranılmalıdır. Çirklənmiş ucunu xüsusi etidium bromid tullantı konteynerinə atın. 10 mg/mL etidium bromid məhlulu tabletlərdən istifadə etməklə hazırlanır (toz çəkməmək üçün) və 4ºC temperaturda qaranlıqda ZƏHƏRLİ yazılarla saxlanılır.

Zəhərli və mutagen etidium bromid istifadə etmək üçün alternativlər var:

Gel yavaş-yavaş tanka tökün. Birdəfəlik istifadə edilə bilən ucdan istifadə edərək hər hansı bir qabarcığı yan tərəfə itələyin. Darağı daxil edin və onun düzgün yerləşdirildiyini iki dəfə yoxlayın.

Yavaş-yavaş tökməyin faydası odur ki, qabarcıqların çoxu kolbada qalsın. Dərhal şüşəni yuyun.

Mümkünsə qapaq bağlı olmaqla ən azı 30 dəqiqə, tercihen 1 saat dəmləmək üçün buraxın.

Gel daha tez qurulmuş kimi görünə bilər, lakin DNT-ni çox tez gelə çevirmək ləkəli diffuz zolaqlarla dəhşətli görünən nəticələr verə bilər.

Jeli 2𔃃 mm dərinliyə batırmaq üçün gel çəninə 0,5x TBE buferi tökün. Bu işləyən buferdir.

Gel hazırlamaq üçün istifadə etdiyiniz tamponu bu mərhələdə istifadə etməlisiniz. yəni. Əgər geldə 0,6xTBE istifadə etmisinizsə, çalışan bufer üçün 0,6xTBE istifadə edin. Gel tankınız istifadə edirsə, metal gel əmələ gətirənləri çıxarmağı unutmayın.

Nümunələrin hazırlanması

Hər bir nümunənin müvafiq miqdarını təzə mikrofuge borusuna köçürün.

Bu, 10 µL 50 µL PCR reaksiyası və ya 5 µL 20 µL məhdudlaşdırıcı ferment həzmi ola bilər. Əgər siz 20 µL PCR reaksiyasının və ya ferment həzminin bütün 20 µL-ni yükləyirsinizsə (tez-tez etdiyim kimi), o zaman təzə borulardan istifadə etməyə ehtiyac yoxdur, sadəcə olaraq PCR borularına yükləmə tamponunu əlavə edin. Laboratoriya kitabınıza boruların fiziki sırasını yazın ki, gel fotoşəkilindəki zolaqları müəyyən edə biləsiniz.

Hər boruya müvafiq miqdarda yükləmə tamponu əlavə edin və ucunu boruda buraxın.

0,2 həcmli yükləmə buferi əlavə edin, məsələn. 10 µL nümunəyə 2 µL. Ucu jeli yükləmək üçün yenidən istifadə ediləcək.

Mən markerləri yükləmə buferi ilə 4°176C-də hazır şəkildə saxlayıram. Mən 2 µL yükləməyi və hər bandda nə qədər DNT olduğunu bilirəm. Bu barədə daha ətraflı məlumat üçün aşağıya baxın.
Mümkünsə, son quyulardan istifadə etməkdən çəkinin. Məsələn, 12 nümunə və 2 markeriniz varsa, cəmi 14 zolaqdan istifadə edəcəksiniz. Əgər tarağınızda 18 quyu əmələ gəlibsə, onda siz 4 quyudan istifadə etməyəcəksiniz. Xarici quyulardan istifadə etməmək daha yaxşıdır, çünki onlar anormal işləmə ehtimalı yüksəkdir.

Nümunələri yükləməyə davam edin və markerin son zolağı ilə bitirin

Mən gelləri sağdan sola yükləyirəm ki, quyular dəzgahın kənarına yaxın olsun və DNT dəzgahın kənarından uzaqlaşsın. Bunun səbəbi, gellərin, ənənəvi olaraq, quyuların yuxarıda olduğu və DNT-nin səhifədən aşağı axdığı kimi nəşr edilməsidir.

Gel çənini bağlayın, enerji mənbəyini yandırın və geli 5 V/sm-də işə salın.

Məsələn, elektrodlar bir-birindən 10 sm məsafədədirsə, o zaman geli 50 V-da işlədin. Jeli bundan daha yavaş işlətmək yaxşıdır, lakin daha sürətli işləməyin. 5 V/sm-dən yuxarı, agaroza istiləşə və gelinizin həllinə fəlakətli təsir göstərərək əriməyə başlaya bilər. Bəzi insanlar DNT-nin gelə yavaş-yavaş və bərabər şəkildə keçməsinə imkan vermək üçün əvvəlcə geli yavaş-yavaş (məsələn, 10 dəqiqə ərzində 2 V/sm) işlədirlər və sonra geli sürətləndirirlər. Bu, daha yaxşı həlli təmin edə bilər. Gecələri çox aşağı gərginliklərdə işlətmək yaxşıdır, məsələn. 0,25𔂾,5 V/sm, əgər siz artıq saat 11-də evə getmək istəyirsinizsə.

Bir cərəyanın axdığını yoxlayın

Siz bunu enerji mənbəyində yoxlaya bilərsiniz, milliamperlər gərginliklə eyni ball-parkda olmalıdır, lakin ən yaxşı yol elektrodlara baxmaq və onların inkişaf edən qaz (yəni, qabarcıqlar) olduğunu yoxlamaqdır. Əgər belə deyilsə, o zaman əlaqələri yoxlayın, enerji mənbəyinin qoşulduğunu və s. Bu, insanlar tampon yerinə su istifadə etdikdə baş verdiyi bilinir.

Marker boyasına istinad edərək gelin gedişatını izləyin.

Bromofenol mavisi gel uzunluğunun 3/4 hissəsinə çatdıqda geli dayandırın.

Gel çənini söndürün və elektrik şəbəkəsindən ayırın və UB işıq qutusuna baxmaq üçün geli (mümkünsə tutucusunda) qaranlıq otağa aparın.

Bəzi gel tutucular UV-şəffaf deyildir, ona görə də geli işıq qutusunun şüşə səthinə diqqətlə yerləşdirməlisiniz. UV-dir kanserogen və çılpaq dəriyə və ya gözlərə parlamasına icazə verilməməlidir. Buna görə üz qoruyucu, əlcəklər və uzun qollu paltarlar geyin.

Yükləmə tamponu quyulara yükləməyi asanlaşdırmaq üçün nümunəyə rəng və sıxlıq verir. Həmçinin, boyalar neytral tamponlarda mənfi yüklənir və beləliklə elektroforez zamanı DNT ilə eyni istiqamətdə hərəkət edirlər. Bu, gelin gedişatını izləməyə imkan verir. Ən çox yayılmış boyalar bromofenol mavisi (Sigma B8026) və ksilen sianoldur (Sigma X4126). Sıxlıq qliserin və ya saxaroza tərəfindən təmin edilir.

Boyanın dəqiq miqdarı vacib deyil
Saxarozada kif əmələ gəlməsinin qarşısını almaq üçün 4ºC temperaturda saxlayın. 10 mL yükləmə tamponu illərlə davam edəcək.

Bromofenol mavisi 200-8211400 bp DNT-yə ekvivalent sürətlə miqrasiya edir. Əgər fraqmentləri bu ölçüyə yaxın yerdə görmək istəyirsinizsə, digər boyadan istifadə edin, çünki bromofenol mavisi kiçik fraqmentlərin görünməsini gizlədəcək. Ksilen sianol təxminən 4kb ekvivalentində miqrasiya edir. Beləliklə, 4 kb-lik fraqmentləri vizuallaşdırmaq istəyirsinizsə, bundan istifadə etməyin.

Çox sayda müxtəlif növ DNT ölçüsü markerləri var. Köhnə günlərdə ən ucuz müəyyən edilmiş DNT bakteriofaqdan idi, buna görə də bir çox marker məhdudlaşdırıcı fermentlərlə kəsilmiş faj DNT-dir. Bunların bir çoxu hələ də çox populyardır, məsələn, lambda HindIII, lambda PstI, PhiX174 HaeIII. Bunlar məlum ölçüləri olan lentlər verir, lakin ölçülər ixtiyaridir. Nümunə zolaqlarınızda görməyi gözlədiyiniz fraqment ölçüsü üçün yaxşı rezolyusiyaya malik marker seçin. Məsələn, kiçik PCR məhsulları üçün PhiX174 HaeIII, lakin 6kb fraqmentlər üçün lambda HindIII seçə bilərsiniz. Bu yaxınlarda şirkətlər müəyyən aralıqlarla lentlərlə nərdivan markerləri istehsal etməyə başladılar, məsələn. 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 kb və s. 10 kb-a qədər. Bir marker zolağına yüklənmiş DNT-nin ümumi miqdarını bilirsinizsə və bütün zolaqların ölçülərini bilirsinizsə, geldə görünən hər bir lentdəki DNT miqdarını hesablaya bilərsiniz. Bu, marker zolaqları ilə müqayisə edərək nümunə zolaqlarınızdakı DNT miqdarını ölçmək üçün çox faydalı ola bilər. Nümunələrin yan tərəfində iki marker zolağı yükləmək yaxşıdır. Bir çox şirkət DNT ölçüsü markerləri satır. Ən ucuza alış-veriş etmək sərfəlidir. Çox vaxt yerli mətbəx lavabo biotexnoloji şirkəti əla markerlər satır.

TBE, Tris Borate EDTA deməkdir.

İnsanlar da TAE (Tris Acetate EDTA) istifadə edirlər. Ucuz reagentlərdən istifadə edərək 10x ehtiyat hazırlayın. Bahalı "analitik dərəcəli" reagentlərdən istifadə etməyin. Ucuz Tris bazası və bor turşusu toplu olaraq alına bilər.

Tərkibləri 1,9 L distillə edilmiş suda həll edin. NaOH istifadə edərək pH-ı təxminən 8,3-ə çatdırın və 2 L-ə qədər edin.


GİRİŞ

DNT klonlaşdırılması ənənəvi olaraq mənbə plazmidini və ya DNT fraqmentini və məhdudlaşdırıcı fermentlərlə alıcı vektoru həzm etməklə, həzm olunmuş fraqmentləri geldən çıxarmaqla və DNT liqazasından istifadə edərək təmizlənmiş fraqmentləri bağlamaq yolu ilə həyata keçirilirdi (bax. Cari Protokollar məqalə Struhl, 1991). Bu yanaşma vektorda bir və ya iki DNT fraqmentini bağlamaq üçün uyğundur, lakin bir vektorda bir neçə fraqmenti bir addımda bağlamaq üçün yaxşı işləmir. Xoşbəxtlikdən, vektorda bir neçə fraqmentin bir addımda yığılmasına imkan verən yeni klonlaşdırma üsulları mövcuddur, o cümlədən homologiyaya əsaslanan klonlama üsulları (məsələn, Gibson montajı) və Qızıl Qapıların klonlaşdırılması (adlandırılmışdır) kimi IIS tipli məhdudlaşdırıcı fermentlərə əsaslanan üsullar Gateway klonlamasına istinad, həm də körpünün adı ilə söz oyunu kimi). Qızıl Qapı bir termal siklonda məhdudlaşdırma-liqasiya reaksiyasından istifadə etməklə həyata keçirilir. Standart Qızıl Qapı montaj reaksiyasını qurmaq və yerinə yetirmək üçün parametrlər Əsas Protokol 1-də təsvir edilmişdir və Şəkil 1-də təsvir edilmişdir. Qızıl Qapıların klonlaşdırılması vektor və əlavələrin xüsusi məhdudlaşdırma sahələrinin mövcudluğu və ya olmaması ilə bağlı xüsusi struktura malik olmasını tələb edir. Adi klonlaşdırma vektorunu Qızıl Qapıya uyğun klonlama vektoruna çevirmək üsulu Əsas Protokol 2-də təqdim olunur. Qızıl Qapı klonlamasına əlavənin yerləşdirilməsi üçün nümunə gücləndirmə və klonlaşdırma üçün primerlərin necə tərtib olunacağını izah edən Əsas Protokol 3-də təqdim olunur. Qızıl Qapı vektoruna maraq geninin.

Ənənəvi klonlaşdırma metodlarından istifadə etməklə müəyyən edilmiş transkripsiya vahidlərinin yaradılması və sonradan transkripsiya vahidlərinin multigen konstruksiyalara yığılması sadə məsələ deyil. Bu, təkcə DNT məclisinin özü ilə deyil, həm də böyük konstruksiyalar üçün klonlaşdırma strategiyalarının hazırlanmasının çətinliyi ilə bağlıdır. Bu məhdudiyyətin bir səbəbi odur ki, hər bir klonlaşdırma mərhələsində istifadə olunan məhdudlaşdırıcı fermentlərin tanınma yerləri ligasyondan sonra konstruksiyalarda hələ də mövcuddur. Buna görə də, çox sayda genlə işləyərkən klonlaşdırma strategiyasının planlaşdırılması son dərəcə çətin və ya qeyri-mümkün olan hər bir ardıcıl addım üçün müxtəlif məhdudlaşdırıcı fermentlərdən istifadə edilməlidir. Bu problemin həlli hissələrin və montaj strategiyasının standartlaşdırılması, hər bir klonlaşdırma mərhələsində DNT yığılması üçün Qızıl Qapı klonlamasının istifadəsi ilə təmin edilir. Bu strategiya MoClo modul klonlama sistemi tərəfindən istifadə olunur (Engler et al., 2014 Weber, Engler, Gruetzner, Werner, & Marillonnet, 2011 Werner, Engler, Weber, Gruetzner, & Marillonnet, 2012). MoClo sistemi PCR ilə hazırlanmış, vektor onurğasına klonlanmış və ardıcıllıqla tərtib edilmiş standart hissələrin istifadəsinə əsaslanır. Standart hissələr promotor, kodlaşdırma ardıcıllığı və ya terminator kimi əsas genetik elementin DNT ardıcıllığını ehtiva edir. Əsas Protokol 4 bir addımda PCR məhsullarından hissələrin klonlanması metodunu təmin edir (Şəkil 1), Alternativ Protokol isə iki ardıcıl addımda daha böyük hissələrin klonlanması metodunu təmin edir. Hissələrin standartlaşdırılmış strukturu onları PCR gücləndirilməsinə ehtiyac olmadan bir çox müxtəlif konstruksiyalarda yenidən istifadə etməyə imkan verir. O, həmçinin montaj prosedurunun standartlaşdırılmasına imkan verir. Multigen konstruksiyalar bir sıra bir qazan montaj addımlarından istifadə edərək əsas hissələrdən yığılır. MoClo sistemi ilə istifadə edilən klonlaşdırma strategiyası və müxtəlif klonlaşdırma addımları Əsas Protokol 5-də təsvir edilmişdir.

1: TİPİK QIZIL QALVAZI KLONLAŞMA REAKSİYASINI GÖRDÜRMƏK

Qızıl Qapıların klonlaşdırılması prinsipi bir addımda vektorda müəyyən edilmiş xətti qaydada bir neçə DNT fraqmentinin yığılması üçün məhdudlaşdırma-liqasiyada tip IIS məhdudlaşdırma fermenti və liqazdan istifadə etməkdən ibarətdir (Şəkil 2A). Tip IIS məhdudlaşdırıcı fermentlər DNT-ni DNT-nin tanınması sahəsinin ardıcıllığından kənarda parçalayır. Məsələn, məhdudiyyət saytı BsaI (GGTCTC N ↓N1N2N3N4) DNT-nin tanınması sahəsi ardıcıllığından (GGTCTC) və 4 nt tək zəncirli DNT çıxmasına (N) aparan DNT parçalanma yerindən (↓) ibarətdir.1N2N3N4) həzm edildikdən sonra. Qızıl Qapıların klonlanmasına uyğun olmaq üçün bütün DNT fraqmentləri həzm mərhələsi zamanı DNT-nin tanınması sahəsinin ardıcıllığı DNT fraqmentlərindən ayrılacaq şəkildə daxilə istiqamətlənmiş IIS tipli məhdudlaşdırıcı ferment üçün məhdudlaşdırma sahələri ilə əhatə olunmalıdır (Şəkil 2B). . Təyinat vektorunda eyni tipli IIS fermenti üçün iki məhdudlaşdırma yeri olmalıdır, lakin xarici oriyentasiyaya malik olmalıdır ki, DNT-nin tanınması yerləri də həzm addımı ilə vektordan ayrılsın. Nəhayət, DNT fraqmentlərinin və vektorunun uclarında yerləşən bütün tək zəncirli 4-nt çıxıntılar (həmçinin birləşmə yerləri adlanır) növbəti fraqmentin və ya vektorun sonuna qədər bağlanmağa imkan vermək üçün unikal və tamamlayıcı olmalıdır. Gözlənilən dairəvi rekombinant DNT molekulunda istifadə olunan ferment üçün məhdudlaşdırıcı yerlər olmadığından, o, yenidən həzm oluna bilməz, bu, eyni reaksiya qarışığında məhdudlaşdırma və bağlamanın həyata keçirilməsinə imkan verir. Bu, ilkin plazmid onurğasında bağlanmış DNT fraqmentlərinin, nəhayət, arzu olunan rekombinant məhsula daxil olana qədər daha çox həzm və ligasyon dövrünə məruz qalmasına imkan verir (Şəkil 2C). Bu, bir fraqmentin bir vektordan digərinə ötürülməsi üçün faydalıdır, lakin bir addımda bir neçə fraqmentin klonlanması lazım olduqda getdikcə daha vacibdir. Bunun səbəbi, mümkün ligasiya hadisələrinin sayının ligasiya qarışığındakı plazmidlərin sayı ilə eksponensial şəkildə artması, bir addımda düzgün bağlanmış məhsulun əldə edilməsi şansının getdikcə daha az olmasıdır (Şəkil 2D). Məhdudlaşdırma-ligasiya yüksək klonlama səmərəliliyinə gətirib çıxarır və bir klonlama reaksiyasında 24-ə qədər fraqmentin bağlanmasına imkan verir (Potapov et al., 2018).

İstifadə olunan DNT fraqmentləri PCR ilə əldə edilən xətti fraqmentlər ola bilər, həm də dairəvi plazmiddə klonlanmış ardıcıllıqlar ola bilər. Bu protokol həm DNT hissələri, həm də təyinat vektoru plazmidlər kimi mövcud olduqda Qızıl Qapı klonlama reaksiyasının necə həyata keçiriləcəyini təsvir edir.

Materiallar

  • Təmizlənmiş plazmid DNT:
    • Golden Gate təyinat vektoru (bax. Əsas Protokol 2 və ya Addgene və ya digər tədqiqatçılardan əldə edilə bilər)
    • Əlavələr (plazmid DNT)
    • 10 U/µl BsaI (New England Biolabs, cat. no. R0535L)
    • 10 U/µl BpiI (Thermo Fisher Scientific, cat. no. ER1012)
    • 10 U/µl BsmBI (New England Biolabs, cat. no. R0580s)
    • Spektrofotometr (məsələn, Nanodrop 1000, Peqlab)
    • 0,2 ml PCR lövhələri (Thermo Fisher Scientific, kat. № AB0600)
    • Yapışqan PCR boşqab möhürləri (Thermo Fisher Scientific, kat. № AB0588)
    • Termal dövrə cihazı (məsələn, C1000 Touch, BioRad)
    • 1,5 ml mikrosentrifuqa boruları
    • 37° və 42°C blok inkubator (məsələn, Eppendorf ThermoMixer)
    • 37°C inkubator və çalkalayıcı inkubator
    • Mədəniyyət şüşələri və ya borular
    • DNT analiz proqramı (məsələn, Vector NTI, Thermo Fisher Scientific)

    QEYD: Parçalanma zamanı 3-nt çıxıntı yaradan IIS tipli fermentlər, məsələn LguI (Thermo Fisher Scientific, cat. no. ER1931) də istifadə edilə bilər.

    Məhdudlaşdırma-ligasyonu həyata keçirin

    1. Spektrofotometrdən istifadə edərək insert və vektor plazmidlərinin DNT konsentrasiyasını ölçün.

    2. Reaksiya qarışığına hər bir əlavə və vektordan bərabər miqdarda əlavə edin. 15 və ya 25 µl ümumi reaksiya həcmində hər plazmiddən 20 fmol aşağıdakı kimi istifadə edin:

    • x1 µl vektor DNT
    • x2 µl daxil edin 1
    • x3 µl daxil edin 2
    • x4 µl daxil edin 3
    • 1,0 µl T4 DNT liqaza
    • 0,5 µl tip IIS fermenti
    • 1,5 µl 10 × bağlama tamponu
    • H2O - 15 µl
    • x1 µl vektor
    • x2 µl daxil edin 1
    • x3 µl daxil edin 2
    • … …
    • xn µl daxil edin n
    • 1,5 µl T4 DNT liqaza
    • 1,0 µl tipli IIS fermenti
    • 2,5 µl 10 × liqasiya tamponu
    • H2O - 25 µl

    Hər bir DNT plazmidinin həcmi düsturla hesablanır: 20 (fmol) × ölçü (bp)/konsentrasiya (ng/µl)/1520. Əgər hesablanmış həcm dəqiq pipetləmə üçün çox aşağıdırsa (<0,3 µl), plazmid suda 10 dəfə seyreltilməlidir və bu seyreltmədən 10 qat daha böyük həcm əlavə edilməlidir.

    3. Qarışığı aşağıdakı şərtlərlə termal siklatorda inkubasiya edin:

    • 50 dövr: 2 dəqiqə üçün 37 ° C, 5 dəqiqə üçün 16 ° C
    • 5 dəqiqə ərzində 50°C
    • 80°C-də 10 dəqiqə
    • 16°C

    BsaI istifadə edildikdə, son 5 dəqiqəlik həzm mərhələsi 50°C-də həyata keçirilir, çünki BsaI həm 37°C, həm də 50°C-də həzm edə bilir. Bunun əksinə olaraq, BpiI istifadə edildikdə, son həzm mərhələsi hələ də 37 ° C-də aparılır, çünki bu ferment üçün optimal həzm temperaturu budur.

    Məhsulu E. coli-yə çevirin

    4. Bütün bağlama qarışığını (15 və ya 25 µl) 50 µl-ə əlavə edin. E. coli hüceyrələri və buz üzərində 30 dəqiqə inkubasiya edin.

    5. 90 s ərzində 42°C-də istilik şoku. Hüceyrələri 2 dəqiqə buz üzərində bərpa edək.

    6. 500 µl LB və ya SOC mühiti əlavə edin və hüceyrələri 37°C-də ThermoMixer-də 45 dəqiqə silkələyin.

    7. Tərkibində müvafiq antibiotik və X-gal olan LB lövhələrində boşqab. Gecədə 37 ° C-də inkubasiya edin.

    Bir-üç əlavə ilə klonlama reaksiyaları üçün 10-20 µl boşqab. Alınan koloniyaların sayı daha az olacağı üçün əlavələrin sayını artırmaq üçün daha böyük həcmdə boşqab qoyun. Məsələn, üçdən çox fraqmentdən ibarət konstruksiyalar üçün 50 µl və ya daha çox boşqab.

    Koloniyaları seçin və klonları qiymətləndirin

    8. Ayrı-ayrı koloniyaları seçin və 5 ml LB mühitini aşılayın. Gecəni 37°C-də çalkalayıcı inkubatorda inkubasiya edin.

    Qızıl Qapı klonlama vektorlarında adətən mavi-ağ skrininq üçün LacZ fraqmenti olur (bəzən qırmızı-ağ skrininq üçün marker kimi karotenoid biosintez operonu istifadə olunur). Ağ koloniyalar seçilir. Parçaların hazırlanması üçün PCR tələb etməyən klonlama reaksiyaları üçün iki koloniyanın seçilməsi ümumiyyətlə kifayətdir. PCR ilə gücləndirilmiş fraqmentlərdən hazırlanmış klonlama reaksiyaları üçün, PCR-induksiya etdiyi mutasiyaları ehtiva etməyən birini tapmaq üçün ikidən çox klon tələb oluna bilər.

    9. Miniprep dəstindən istifadə edərək DNT-ni 50 μl həcmdə elüsyonla hazırlayın.

    10. Müvafiq fermentdən (tez-tez) istifadə edərək 1 µl eluatı 10 µl reaksiyada həzm edin. Bsamən və ya BpiMoClo sistemindən istifadə edərkən DNT barmaq izi ilə düzgün montajı təsdiqləmək üçün Əsas Protokol 4-ə baxın.

    11. Əgər DNT fraqmentlərini hazırlamaq üçün PCR amplifikasiyası istifadə olunubsa, plazmidi sıralayın.

    2: VEKTORUN GOLDEN GATE KLONLAŞMASINA YERLƏŞDİRİLMƏSİ

    Qızıl Qapıların klonlaşdırılması DNT fraqmentlərinin və alıcı vektorunun spesifik tələblərə cavab verməsini tələb edir, məsələn, fraqmentlərin və vektorun uclarında IIS tipli ferment məhdudlaşdırma sahələrinin olması və fraqmentlərin və fraqmentlərin daxili ardıcıllığında eyni məhdudlaşdırma sahələrinin olmaması vektor. Qızıl Qapıların klonlanması üçün uyğun olan bir çox vektor bir neçə tədqiqat qrupunda mövcuddur və mövcud vektorların sayı gələcəkdə çoxalacaq. Buna baxmayaraq, standart klonlama vektorunu Qızıl Qapı klonlama vektoruna çevirmək bəzən istifadəçinin xüsusi ehtiyacları üçün tələb olunur. Bunu etmək üçün bir çox strategiya var, o cümlədən Gibson DNT montajı və ya Qızıl Qapı klonlaması.

    Burada Qızıl Qapı klonlaması ilə istifadə üçün pET-28b (+) vektorunu çevirmək üçün nümunə verilmişdir. Bu misalda a LacZ iki tərəfli alfa parçası BsaI saytlar çox klonlama saytını əvəz edərək vektora daxil edilir (Şəkil 3A). The LacZ fraqment daha sonra mavi-ağ ekranlaşdırma üçün istifadə olunacaq. Burada, iki füzyon saytı civarındadır LacZ fraqment kodlaşdırma ardıcıllığının klonlanması üçün MoClo standartına uyğun gələn AATG və GCTT-dir (bax. Əsas Protokol 4). Bununla belə, onlar bir-birindən fərqli və palindromik olmayan hər hansı digər ardıcıllıq ola bilər. Həqiqətən də, palindromik ardıcıllıqlardan ibarət çıxıntılar eyni fraqmentin əlavə nüsxəsinin digər oriyentasiyada eyni çıxıntısına bağlana bilər, bununla belə, düzgün olmayan sabit bağlama məhsullarına gətirib çıxarır və klonlama səmərəliliyinin əhəmiyyətli dərəcədə azalması ilə nəticələnir. Burada təqdim olunan nümunədə, ilk birləşmə sahəsinin bir hissəsi olan ATG, yuxarı vektor ardıcıllıqlarında mövcud olan His etiketi ilə çərçivədə klonlanan metionin başlanğıc kodonuna uyğundur. Vektor və LacZ fraqment PCR ilə əldə edilir və montaj ikinci tip IIS fermentindən istifadə etməklə həyata keçirilir, BpiI. Çünki dördü var BpiMən vektorda saytlar, onlar DNT-nin tanınması ardıcıllığına tək nukleotid mutasiyalarını daxil etmək üçün nəzərdə tutulmuş primerlərdən istifadə edərək çıxarılır.

    Əlavə materiallar (həmçinin Əsas Protokol 1-ə baxın)

    • Kommersiya satıcısından genə xüsusi primerlər (məsələn, Eurofins Genomics)
    • Gücləndirilməsi üçün plazmid şablonu LacZ kaset (məs., pUC19, New England Biolabs, cat. no. N3041S)
    • Vektor plazmid DNT (məs., pET-28b (+), Novagen, Merck Millipore, kat. № 69418)
    • Yüksək keyfiyyətli PCR gücləndirmə dəsti (məsələn, KOD Hot Start DNT Polimerase, Millipore Sigma, VWR, cat. no. 71086-3)
    • PCR fraqmentinin təmizlənməsi dəsti (məsələn, NucleoSpin Gel və PCR Clean-up, Macherey Nagel, cat. no. 740609.250)

    1. Gücləndirmək üçün primerləri dizayn edin LacZ fraqment.

    Bu nümunə üçün primer yerləri və ardıcıllıqları Şəkil 3-də göstərilmişdir. İlk iki primer, Pr1 və Pr2, gücləndirmək üçün nəzərdə tutulmuşdur. LacZ pUC19-dan fraqment. pUC19 şablon olaraq seçilir, çünki o, alıcı vektordan (Kan R) fərqli antibiotik müqavimət geninə (Amp R) malikdir. Bu, transformasiyadan sonra klonları yoxlayarkən həzm olunmamış şablon vektorunun ötürülməsi ilə yanlış konstruksiyaların əldə edilməsi ehtimalını azaldır. Gücləndirilmiş fraqmentin funksional vahidi var LacZ mavi-ağ ekran üçün marker. Pr1 və Pr2 primerləri var BpiI məhdudlaşdırma saytları (Şəkil 3B-də gaagac) müvafiq olaraq AATG və GCTT ardıcıllığına uyğun gələn 4-nt füzyon saytları ilə. İki primerdəki birləşmə yerləri izlənilir BsaMən əks oriyentasiyada məhdudiyyət saytları (şəkil 3B-də ggtctc = gagacc-ın əks tamamlayıcısı). The BsaI saytları nəticədə vektorun bir hissəsi olacaq və vektor hazırlandıqdan sonra Qızıl Qapıların klonlanması üçün istifadə olunacaq.

    pET-28b vektorunda dörd var BpiTək nükleotid əvəzetmələri etməklə aradan qaldırılmalı olan daxili ardıcıllıqdakı yerləri məhdudlaşdırır (əhliləşdirmə adlanan proses). Bunun üçün səkkiz primer lazımdır (Pr3 və Pr6-14). Səssiz mutasiyalar kodlaşdırma ardıcıllığında yerləşən məhdudlaşdırıcı yerlər üçün edilir (bu halda, ikisi olan Lac I repressoru BpiI saytlar). Son cüt primer (Pr4 və Pr5) 2 kb-dən böyük fraqmentləri gücləndirməmək üçün hazırlanır, bu cüt primer isteğe bağlıdır. Pr3-14 primerlərinin hamısı var BpiMən onun bağlanacağı fraqmentin birləşmə yeri ilə uyğun olmaq üçün seçilmiş bir qaynaşma yeri olan sayt.

    Sifariş verərkən minimum təmizlənmə ilə (duzsuz) mümkün olan ən aşağı miqdarı (yəni, 0,01 µmol) əldə etmək kifayətdir.

    1. Şablon kimi pUC19 istifadə edərək Pr1-2 primer cütü ilə bir 50 μl PCR reaksiyası qurun.
    2. Şablon kimi pET-28b (+) istifadə edərək Pr3-4-dən Pr13-14-ə qədər primer cütləri ilə altı 50 μl reaksiya qurun.

    3. PCR-nin uğurlu olub-olmadığını görmək üçün hər reaksiyadan 5 μl-ni gel üzərində aparın.

    4. Sütun əsaslı dəstdən (yəni, Macherey Nagel NucleoSpin DNT Təmizləmə dəsti) istifadə edərək hər reaksiyadan qalan 45 μl təmizləyin.

    Bu, PCR məhsulunu hər hansı qalan DNT polimeraza və dNTP-lərdən, həmçinin əksər PCR reaksiyalarında müxtəlif səviyyələrdə istehsal olunan primer dimerlərdən ayıracaq.

    5. Nanodrop kimi spektrometrdən istifadə edərək təmizlənmiş PZR məhsullarının kəmiyyətini müəyyənləşdirin.

    6. Fermentdən istifadə edərək Golden Gate klonlama reaksiyasını həyata keçirin (bax. Əsas Protokol 1) BpiI. Məhsulu çevirin E. coli (Bax Əsas Protokol 1) və mavi koloniyaları seçin.

    Bu xüsusi misalda transformantlar kanamisin və X-gal olan LB-yə örtülməlidir. Düzgün koloniyalar ağ deyil, mavi olmalıdır.

    7. Miniprep dəstindən istifadə edərək DNT hazırlayın.

    8. 1 µl ilə həzm edin BsaI 10 µl reaksiyada.

    Bu xüsusi konstruksiya üçün 5,3 kb və 506 bp gücündə iki fraqment gözlənilir.

    Bütün plazmidin plazmid daxilində müxtəlif mövqelərdə hazırlanmış primerlərlə ardıcıllığı arzu edilir, çünki bütün vektorun gücləndirilməsi üçün PCR istifadə edilmişdir. Bununla belə, LacZ markerinin replikasiyası və ya ifadəsi üçün tələb olunan bəzi bölgələr, əgər plazmid təkrarlanırsa və koloniyalar mavidirsə, funksional olmalıdır, bütün plazmidin ardıcıllığına ehtiyac olmaya bilər. Ən azı, genin ifadəsi üçün sonradan tələb olunacaq bütün elementlər, o cümlədən T7 promouterindən terminatora qədər uzanan bölgə sıralanmalıdır. Tətbiq edilmiş iki BsaI sahəsini ehtiva edən bölgənin ardıcıllığı iki birləşmə sahəsinin ardıcıllığının gözlənildiyi kimi olduğundan əmin olmaq üçün vacibdir.

    Klonlaşdırma vektoru artıq Qızıl Qapı klonlaması üçün istifadə edilə bilər.

    3: GOLDEN GATE KLONLAŞMASINA VAXTIN YERLƏŞDİRİLMƏSİ

    Bu protokol Qızıl Qapı klonlamasına maraq ardıcıllığına uyğunlaşmaq üçün primerlərin necə dizayn ediləcəyini və sonra Qızıl Qapı təyinat vektorunda gücləndirilmiş fraqmentlərin klonlaşdırılmasını izah edir. Bir kodlaşdırma ardıcıllığının klonlanması üçün bir nümunə verilmişdir Arabidopsis thaliana izoflavon reduktazadan gücləndirilmişdir Ərəbidopsis cDNA şablonu (Genbank qoşulması NM_106183).

    Əlavə materiallar (həmçinin Əsas Protokollar 1 və 2-yə baxın)

    • PCR üçün cDNA və ya DNT şablonu (burada, cDNA Ərəbidopsis)
    • Golden Gate təyinat vektorunun plazmid DNT

    1. Maraq ardıcıllığının açıq oxu çərçivəsində səssiz mutasiyalar tərtib edin silisiumda klonlama proqramından istifadə etməklə (məsələn, Vector NTI).

    Bu nümunədə kodlaşdırma ardıcıllığı birdən ibarətdir BsaI sayt (Şəkil 4A). Silisiumda tək nükleotid əvəzetməsi ilə çıxarılır, nəticədə səssiz mutasiya yaranır (Şəkil 4B-də qırmızı rənglə göstərilmişdir).

    2. Vektor ilə uyğunluq üçün kodlaşdırma ardıcıllığına iki yan birləşmə yerini əlavə edin.

    Bu halda, AATG vermək üçün başlanğıc kodundan əvvəl bir A əlavə edin və dayanma kodonundan sonra GCTT əlavə edin.

    Əlavə edilmiş ardıcıllıq Şəkil 4B-də qırmızı rəngdə, birləşmə yerləri isə mavi rəngdə göstərilmişdir.

    3. Mutasiya yerində birləşmə yerini seçin.

    İki PCR fraqmenti gücləndiriləcək, biri mutasiyanın hər tərəfində (Şəkil 4A-da I və FR) və sonra mutasiyaya uğramış nukleotidlə üst-üstə düşən və ya onun yaxınlığında olan birləşmə yeri vasitəsilə yığılacaq. Füzyon yeri digər birləşmə yerlərindən (AATG və GCTT) fərqli olmalıdır və palindromik olmamalıdır. O, ən azı bir G və ya C (mümkünsə, daha çox) ehtiva etməlidir, çünki yalnız As və ya T ehtiva edən saytlar DNT yığılması üçün daha az yaxşı işləyə bilər (Potapov et al., 2018). Çoxlu birləşmə saytlarına ehtiyac olduqda, bütün saytların uyğunluğunu yoxlamaq üçün Ligase Fidelity Viewer proqramı (New England Biolabs, http://ggtools.neb.com/viewset/run.cgi) istifadə edilə bilər. Hazırkı nümunədə tək ardıcıllıq, GGAC seçilmişdir (şəkil 4B-də sarı rənglə göstərilmişdir).

    4. Bütün füzyon yerlərindən başlayaraq astarların layihələndirilməsi. Hər mutasiyaya uğramış sayt üçün əks oriyentasiyada iki primer seçin (bu halda yalnız bir sayt). PZR gücləndirilməsi üçün müvafiq ərimə temperaturu vermək üçün primerləri kifayət qədər uzun edin.

    5. Ardıcıllığı əlavə edin BsaMən tanınma saytı (tt ggtctc a) bütün astarların əvvəlinə.

    Astarların yekun siyahısı Şəkil 4C-də göstərilmişdir.

    6. Müvafiq primer cütlərindən (Isof1-2 və Isof3-4 Şəkil 4A) istifadə edərək iki PCR fraqmentini gücləndirin. Ərəbidopsis 50 µl reaksiyada cDNA şablonu. Düzgün fraqmentin gücləndirildiyini yoxlamaq üçün gel üzərində 5 µl keçirin. Qalan 45 µl-ni istehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq sütun əsaslı dəstdən istifadə edərək təmizləyin.

    7. Quraşdırma reaksiyasını təsvir olunduğu kimi qurun və yerinə yetirin (bax. Əsas Protokol 1).

    Bu nümunə vektora klonlanmış yalnız iki fraqmentlə sadə klonlaşdırmanı təsvir etdiyi üçün 37°C-də 2 saat, 50°C-də 5 dəqiqə və 80°C-də 10 dəqiqə ərzində sadə inkubasiya kifayət etməlidir.

    8. Bağlama qarışığını səlahiyyətliyə çevirin E. coli, kanamisin və X-gal olan LB-də lövhə və nəticədə koloniyaları ekranlaşdırın.

    Minipreplər insertin yanında məhdudlaşdırıcı yerləri olan iki fermentlə və ya insertdə vektorda yerləri olan fermentlərlə həzm olunur. Klonlama üçün PCR istifadə edildiyinə görə, klonlanmış əlavə əlavənin yan tərəfində olan vektorda ardıcıllıqlar üçün primerlərdən istifadə edilərək ardıcıllaşdırılmalıdır.

    4: SƏVİYYƏ 0 VEKTORLARINDAN İSTİFADƏ EDİLƏN HİERARXİK MODULL KLONLAŞMA (MoClo) İLƏ UYĞUN OLAN KİÇİK STANDARDIŞLI HİSSƏLƏRİN YARALANMASI

    Qızıl Qapı klonlamasından istifadə edərək plazmidlərdən DNT fraqmentlərinin yığılması tez və səmərəli şəkildə həyata keçirilə bilər. Bunun əksinə olaraq, PZR məhsullarından montaj daha çox iş tələb edir, çünki PCR məhsulları çox vaxt PCR gücləndirilməsi zamanı primerlərin yanlış tavlanması nəticəsində əmələ gələn primer dimerləri ehtiva edir. Primer dimerləri PCR məhsulları ilə eyni tipli IIS məhdudlaşdırma sahələri ilə əhatə olunduğundan, onlar klonlaşdırıla bilər, nəticədə yanlış konstruksiyalar yaranır və klonlaşdırma səmərəliliyi aşağı düşür (Şəkil 5). Heç bir primer dimerləri hazırlanmasa belə, klonlanmış konstruksiyalar onların PCR-induksiya etdiyi mutasiyaların olmadığına əmin olmaq üçün ardıcıllıqla aparılmalıdır. Buna görə də, klonlanmış və ardıcıl DNT hissələrinin müxtəlif konstruksiyalarda təkrar istifadə oluna biləcəyi bir sistemə sahib olmaq çox məntiqlidir. Məsələn, promouterlər və terminatorlar kimi tənzimləyici ardıcıllıqları ehtiva edən hissələr bir çox müxtəlif konstruksiyalarda təkrar istifadə edilə bilər.

    MoClo modul klonlama sistemi müxtəlif konstruksiyalarda klonlanmış hissələrin təkrar istifadəsini asanlaşdırmaq üçün nəzərdə tutulmuşdur (Şəkil 6). Bu, Golden Gate klonlaşdırmasından istifadə edərək birləşdirilmiş əsas hissələrin istifadəsinə əsaslanır. Əsas hissələr səviyyə 0 modulları kimi klonlanır və transkripsiya vahidləri yaratmaq üçün səviyyə 1 klonlama vektorlarında yığılır. Səviyyə 1 konstruksiyaları daha sonra M və P səviyyəli multigen konstruksiyaları yaratmaq üçün yığılır. Əsas hissələr iki ilə əhatə olunmuş əsas genetik elementin kodlaşdırma ardıcıllığını ehtiva edir BsaMən əks oriyentasiyada saytların məhdudlaşdırılması (Şəkil 7). Əsas hissələrin klonlaşdırılması şablon olaraq DNT və ya cDNA-dan gücləndirmə tələb edir. Gücləndirilmiş məhsul Qızıl Qapı klonlamasından istifadə edərək alıcı vektorunda klonlanır. Klonlaşdırma addımları hissənin növünü, dizayn primerlərini ehtiva edən müəyyən etməkdən ibarətdir BsaMən fraqmentlərin uclarında saytları məhdudlaşdırıram, saytları daxili ardıcıllıqlardan çıxarıram və vektorda gücləndirilmiş fraqmentləri klonlayıram.

    Əlavə materiallar (həmçinin Əsas Protokollar 1 və 2-yə baxın)

    • PCR üçün cDNA və ya DNT şablonu (burada cDNA Ərəbidopsis)
    • Universal səviyyə 0 klonlama vektoru pAGM9121 (Addgene, plazmid #51833)

    1. Səviyyə 0 modulunun (hissəsinin) növünü müəyyən edin.

    Hissələr promotorlardan, dayanma kodonu olan və ya olmayan kodlaşdırma ardıcıllığından, C- və ya N-terminal birləşmə teqlərindən və terminatorlardan ibarət ola bilər (şək. 7A). Hər bir hissə iki ilə əhatə olunmuşdur BsaMən əks istiqamətli saytlar (Şəkil 7B). 4-bp ardıcıllığı BsaI parçalanma yerləri (füzyon yerləri) hər bir modul növü üçün spesifikdir və hansı hissələrin bir-birinə birləşdirilə biləcəyini müəyyənləşdirir. Məsələn, 3′ füzyon yeri olaraq TACT olan promouter modulu (Şəkil 7A-da Pro) yalnız 5′ sonunda eyni birləşmə sahəsi olan tərcümə olunmamış lider ardıcıllığına birləşdirilə bilər (Şəkil 7A-da 5UTR2). Hər bir hissə növü üçün uyğun birləşmə saytları ilə xüsusi klonlama vektoru mövcuddur. Alternativ olaraq, bütün hissə növləri bu protokolda təsvir olunduğu kimi universal səviyyəli 0 klonlama vektoru pAGM9121 (şək. 7D və 8) klonlana bilər. Səviyyə 0 modulları həmçinin bir neçə əsas hissədən ibarət birləşmələr ola bilər. Məsələn, tam transkripsiya vahidi olan konstruksiyalar GGAG və CGCT birləşmələri arasında birbaşa 0 səviyyə modulları kimi klonlaşdırıla bilər. Digər növ genetik elementlər, məsələn, fag rekombinasiya sahəsi və ya matrisin birləşməsi bölgəsi də birləşmə sahələri GGAG və CGCT arasında səviyyə 0 modulları kimi klonlaşdırıla bilər.

    2. Gen ardıcıllığında səssiz mutasiyaları təqdim edin silisiumda.

    Əsas hissələrdə MoClo sistemi ilə istifadə olunan IIS tipli fermentlər üçün məhdudlaşdırıcı yerlər olmamalıdır (Bsamən, BpiMən və istəyə görə BsmBI). Məhdudiyyət yerləri ilk dəfə həyata keçirilən tək nükleotid mutasiyaları tətbiq etməklə aradan qaldırılır silisiumda. Kodlaşdırma ardıcıllığında daxili saytların çıxarılması həmişə səssiz mutasiya ilə həyata keçirilə bilər. Promotor bölgələrində ardıcıllığın çıxarılması daha çətindir, çünki promotor funksiyası üçün vacib olan ardıcıllıqlar həmişə məlum deyil. Buna görə də, promotor ardıcıllıqlarını əhliləşdirdikdən sonra, promotorun hələ də nəzərdə tutulduğu kimi işlədiyini ev sahibi orqanizmdə eksperimental olaraq təsdiqləmək lazımdır. evləşdirilməsi Ərəbidopsis UGT78D2 geni (GenBank girişi NM_121711) burada nümunə kimi təqdim olunur. Bu gen birdən ibarətdir BsaMən sayt, iki BpiMən saytlar və bir BsmDörd səssiz mutasiyaların tətbiqi ilə çıxarılan BI saytı (Şəkil 9A) (Şəkil 10-da qırmızı).

    3. Hissənin yan tərəfinə iki standart birləşmə yerini əlavə edin.

    Bu modul dayanma kodonu (CDS1) ilə kodlaşdırma ardıcıllığı olacağından, AATG vermək üçün başlanğıc kodonundan əvvəl bir A əlavə edilir və dayanma kodonundan sonra əlavə olunan GCTT ardıcıllığı (şəkil 10-da hər iki birləşmə sahəsi mavi rənglə vurğulanır) .

    4. Universal klonlama vektoru ilə uyğunluq üçün ardıcıllıqlar əlavə edin.

    Bu nümunədə hissə universal səviyyəli 0 pAGM9121 klonlama vektoruna klonlaşdırılacaq. Buna görə də, lazımi uyğunluğu təmin etmək üçün fraqmentin əvvəlinə və sonuna CTCA və CGAG əlavə edilir (şəkil 10-da yaşıl rənglə vurğulanır). Bu ardıcıllıqlar bir hissəsi olacaq BsaMən son səviyyə 0 modulunu əhatə edəcək məhdudiyyət saytları.

    5. PCR fraqmentinin yığılması üçün istifadə olunacaq qeyri-standart birləşmə yerlərini seçin.

    Bunlar klonlama zamanı PCR məhsullarını yığmaq üçün istifadə olunacaq 4-nt ardıcıllıqlardır. Onlar bir-birindən və vektorda istifadə olunacaq birləşmə yerlərindən fərqli olmalıdır (universal klonlama vektoru üçün CTCA və CTCG və ya CDS1-ə xüsusi klonlama vektoru üçün AATG və GCTT). Onlar həmçinin fraqmentlərin uyğunsuz bağlanmasının qarşısını almaq üçün seçilmiş birləşmə yerlərindən hər hansı birinin əks tamamlayıcısından fərqli olmalıdırlar. Seçilmiş ardıcıllıqlar Şəkil 10-da sarı rənglə vurğulanmışdır.

    6. Standart və qeyri-standart bütün qaynaşma yerlərindən başlayaraq dizayn astarları.

    Məhdudiyyət yerlərini aradan qaldırmaq üçün mutasiyaya uğramış saytlardakı qaynaşma saytları üçün primerlər hər iki istiqamət üzrə nəzərdə tutulmuşdur. Astarlar uyğun ərimə temperaturuna sahib olmaq üçün kifayət qədər uzun olmalıdır. Bu, onlayn mövcud olan bir çox proqramdan hər hansı biri ilə hesablana bilər və ya əl ilə edilə bilər.

    7. IIS tipli ferment tanınma ardıcıllığını əlavə edin.

    Çünki BpiMən montaj üçün istifadə olunur, ardıcıllıq tt gaagac aa bütün astarlara əlavə edilir. Primer ardıcıllığı və yerləri Şəkil 9-da göstərilmişdir.

    8. PCR fraqmentləri gücləndirir.

    Beş fraqmenti gücləndirin Ərəbidopsis Gtpr1-2-dən Gtpr9-10-a qədər primer cütləri və korrektor polimerazdan istifadə edərək ayrı-ayrı 50 µl reaksiyalarda cDNA. Hər bir fraqmentin gözlənildiyi kimi gücləndirildiyini yoxlamaq üçün gel üzərində 5 µl keçirin.

    9. Sütun parçaları təmizləyin.

    Qalan polimeraza, primerlər və dNTP-ləri və reaksiyada tez-tez mövcud olan primer dimerlərinin əksəriyyətini çıxarmaq üçün gücləndirilmiş fraqmentləri təmizləmək lazımdır. Əgər tək fraqment gücləndirilibsə, DNT təmizləmə dəsti (məsələn, Macherey Nagel DNT təmizləmə dəsti) istifadə etmək kifayətdir. Bir neçə DNT fraqmenti gücləndirilərsə, düzgün ölçülü PCR fraqmentlərinin gel ekstraksiyasına ehtiyac ola bilər.

    10. Təsvir edildiyi kimi universal səviyyəli 0 vektor pAGM9121-də klonlaşdırmanı qurun (bax. Əsas Protokol 1).

    11. Çevirmək E. coli və iki ağ koloniya seçin. Bu klonların ardıcıllığı düzgün ardıcıllığı göstərməzsə, daha sonra daha çox koloniya seçilə bilər.

    12. Miniprep DNT-ni həzm edərək koloniyaları süzün BsaI.

    13. lev0seqf və lev0seqr vektor primerlərindən istifadə edərək klonları ardıcıllıqla sıralayın (Şəkil 9B).

    : SƏVİYYƏ –1 VEKTORLARDAN İSTİFADƏ EDİLƏN İERARXİK MODUL Klonlaşdırma (MoClo) İLƏ UYĞUN OLAN BÖYÜK STANDARDIŞLI HİSSƏLƏRİN YARADILMASI

    Kiçik hissələr (<1,2 kb) cinah vektor ardıcıllıqlarında yerləşən standart primerlərdən istifadə etməklə ardıcıllıqla sıralana bilsə də, böyük hissələr tamamilə vektor primerlərindən ardıcıllıqla sıralana bilməz. Orta hissəsini ardıcıllaşdırmaq üçün hissə daxilində əlavə ardıcıllıq primerləri tərtib edilməlidir. Hər bir hissə üçün xüsusi ardıcıllıq primerlərinə ehtiyac olmadan ardıcıllığı asanlaşdırmaq üçün alternativ strategiya uzunluğu 1-1,2 kb-dən çox olmayan hissə fraqmentlərinin (alt hissələrin) klonlanmasından, alt hissələrin vektor primerlərindən istifadə edərək ardıcıllığından və sonra yığılmasından ibarətdir. son səviyyə 0 modulu etmək üçün ikinci montaj reaksiyasından istifadə edərək ardıcıl alt hissələr (Şəkil 11). Alt hissələr universal səviyyəli –1 klonlama vektorunda klonlanır (pAGM1311, Şəkil 12).

    Əlavə materiallar (həmçinin Baxın Əsas Protokol 4)

    1. Hissə növünü müəyyənləşdirin, səssiz mutasiyaları təqdim edin, standart birləşmə yerlərini əlavə edin və təsvir olunduğu kimi universal klonlaşdırma vektoru ilə uyğunluq üçün ardıcıllıqlar əlavə edin (bax. Əsas Protokol 4, addımlar 1-4).

    2. PCR fraqmentinin yığılması üçün istifadə olunacaq qeyri-standart birləşmə yerlərini seçin.

    Bunlar klonlama zamanı PCR məhsullarını yığmaq üçün istifadə olunacaq 4-nt ardıcıllıqlardır. Onlar bir-birindən və vektorda istifadə olunacaq birləşmə yerlərindən fərqli olmalıdır (bu halda universal səviyyə –1 vektoru üçün ACAT və TTGT aşağıda 5-ci addıma baxın). Onlar həmçinin fraqmentlərin uyğunsuz bağlanmasının qarşısını almaq üçün seçilmiş birləşmə yerlərindən hər hansı birinin əks tamamlayıcısından fərqli olmalıdırlar. Seçilmiş ardıcıllıqlar Əsas Protokol 4-də olanlarla eynidir (şəkil 10-da sarı rənglə vurğulanır).

    3. Təsvir edildiyi kimi, standart və qeyri-standart bütün birləşmə yerlərindən başlayaraq dizayn primerləri (bax. Əsas Protokol 4, addım 6).

    4. Tip IIS ferment tanınma ardıcıllığını əlavə edin.

    -1 səviyyəli vektorların klonlanması üçün, BsaI montaj üçün istifadə olunur və beləliklə, tt ardıcıllığı ggtctc a bütün astarların 5′ ucuna əlavə edilir.

    5. Universal səviyyə –1 klonlama vektoru ilə uyğunluq üçün ardıcıllıqlar əlavə edin.

    Universal klonlama vektorunun iki birləşmə yeri ACAT və TTGT-dir və onlar a-nın bir hissəsini ehtiva edir BpiKlonlamadan sonra alt hissəni cinahlandıracaq I məhdudlaşdırma saytı (Şəkil 12). Buna görə də, ACAT və ACAA (TTGT-nin əks tamamlayıcısı) ardıcıllığı birlikdə klonlaşdırılacaq PCR fraqmentləri qrupunu məhdudlaşdıran iki primerə əlavə edilməlidir. Bu ardıcıllıqlar dərhal 3′-ə əlavə edilir BsaI saytı və universal səviyyədən əvvəl 0 vektor qaynaşma saytı (CTCA və ya CTCG). Bu nümunədə, ilk üç PCR məhsulu universal səviyyədə -1 vektor pAGM1311-də klonlaşdırılacaq və dördüncü və beşinci məhsullar da pAGM1311-də birlikdə klonlaşdırılacaq. Birinci səviyyə –1 konstruksiya (Gtpr1′-dən 6′-a qədər) və ikinci səviyyə –1 konstruksiyasının (Gtpr7′-dən 10′-a qədər) astar ardıcıllığı və yerləri Şəkil 11-də göstərilmişdir.

    6. PCR müvafiq primer cütlərindən (Gtpr1′-2′-dən Gtpr9′-10′a qədər) istifadə edərək fraqmentləri gücləndirin (Əsas Protokol 4, addım 8-ə baxın).

    7. Sütun fraqmentləri təmizləyin (Əsas Protokol 4, addım 9).

    8. Universal səviyyə -1 vektor pAGM1311 istifadə edərək təsvir edildiyi kimi (Əsas Protokol 1-ə baxın) iki Qızıl Qapı klonlama reaksiyasını qurun. İlk üç məhsulu bir reaksiyada, dördüncü və beşinci məhsulu isə ikinci reaksiyada klonlayın (Şəkil 11A-da səviyyə –1 modulları).

    9. Çevirmək E. coli və iki ağ koloniya seçin. Bu klonların ardıcıllığı düzgün ardıcıllığı təmin etmirsə, daha sonra daha çox koloniya seçilə bilər.

    10. Miniprep DNT-ni həzm edərək koloniyaları süzün BpiI.

    11. Levm1seqF və Levm1seqR vektor primerlərindən istifadə edərək klonları ardıcıllıqla tərtib edin (şək. 11B).

    12. Səviyyə -1 alt hissələrindən səviyyə 0 modullarını yığın. Universal səviyyə 0 klonlama vektoru pAGM9121-də iki seçilmiş səviyyə -1 klonu yığmaq üçün Qızıl Qapı klonlama reaksiyasını qurun (bax. Əsas Protokol 1).

    13. Çevirmək E. coli hüceyrələr.

    14. Miniprep DNT-ni həzm edərək koloniyaları süzün BsaI.

    Bu konstruksiyaları hazırlamaq üçün PCR istifadə edilmədiyi üçün ardıcıllıq tələb olunmur.

    5: SƏVİYYƏ 1, M və P MoClo VEKTORLARINDAN İSTİFADƏ İSTİFADƏ EDİLƏN TRANSKRIPSİYON BÖLGELƏRİNİN VƏ MULTIGENLİ KONSTRÜKTLƏRİN YIKILMASI

    MoClo sistemindən istifadə edərək multigen konstruksiyaların yığılması iyerarxik şəkildə aparılır (şək. 6). İlk addım adətən transkripsiya vahidi olan konstruksiyalar yaratmaq üçün səviyyə 1-ci təyinat vektorlarında səviyyə 0 hissələrinin yığılmasıdır. İkincisi, M və P səviyyəli vektorlarından istifadə edərək alternativ mərhələlərlə həyata keçirilən multigen konstruksiyaların yığılmasıdır. M səviyyəli multigen konstruksiyasını yaratmaq üçün M səviyyəli klonlama vektorunda altıya qədər transkripsiya vahidi yığıla bilər. Daha sonra 36-a qədər transkripsiya vahidindən ibarət P səviyyəli konstruksiya etmək üçün altı səviyyəyə qədər M konstruksiyaları P səviyyəli vektora yığıla bilər. Səviyyə P konstruksiyaları daha böyük konstruksiyalar yaratmaq üçün M səviyyəli vektorlara əlavə edilə bilər. Bu proses, konstruksiyalar plazmid kimi klonlaşdırıla bilməyəcək qədər böyük olana qədər qeyri-müəyyən müddətə təkrarlana bilər. E. coli. Səviyyə M və P montaj istifadəsi BsaMən və BpiMən alternativ şəkildə.

    Əlavə materiallar (həmçinin Əsas Protokol 1-ə baxın)

    • Səviyyə 0 hissələri
    • MoClo Alətlər dəstindən Səviyyə 1, M və P təyinat vektorları (Addgene, dəst #1000000044)

    1-ci səviyyə vektorlarında transkripsiya vahidlərini yığın

    1. Standart səviyyə 0 hissələrini seçin.

    Multigen konstruksiyasının yığılmasını planlaşdırmaq üçün ilk addım hər bir transkripsiya vahidi üçün tələb olunan bütün əsas hissələri müəyyən etməkdir. Məsələn, 5′-UTR (pro + 5U), kodlaşdırma ardıcıllığı (CDS1) və terminatoru olan 3′-UTR (3U +) olan promouter daxil olmaqla, hər biri üç hissədən ibarət olan dörd transkripsiya vahidindən ibarət konstruksiya yaratmaq üçün. Ter) - cəmi on iki hissə tələb olunur.

    Bütün hissələrin növlərinin siyahısı Şəkil 7-də göstərilmişdir. Artıq mövcud olmayan hissələr təsvir olunduğu kimi klonlanır (bax. Əsas Protokol 4). Bəziləri artıq bitkilər üçün mövcuddur (MoClo Bitki Hissələri Dəsti, Addgene, dəst #1000000047), Xlamidomonas (https://www.chlamycollection.org/product/moclo-toolkit/ Crozet et al., 2018) və siyanobakteriyalar (http://www.addgene.org/browse/article/28196941/ Vasudevan et al., 2019 ).

    2. Səviyyə 1 təyinat vektorlarını seçin.

    On dörd səviyyəli 1 vektor mövcuddur: transkripsiya vahidinin irəli oriyentasiyada yeddi fərqli mövqedə son konstruksiyada klonlanması üçün yeddi və tərs oriyentasiya üçün yeddisi (Şəkil 13A). Hamısı ikidən ibarətdir BsaSəviyyə 0 modulları ilə uyğunluğu təmin etmək üçün I saytları və birləşmə saytları GGAG və CGCT. Onların tərkibində iki də var BpiI montajın növbəti addımında yığılmış transkripsiya vahidinin kəsilməsi üçün yerlər. The BpiI füzyon saytları bir vektordan digərinə uyğunluğu təmin etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur. İrəli oriyentasiyada dörd transkripsiya vahidinin klonlaşdırıldığı bir nümunədə irəli oriyentasiya üçün 1-4 mövqeləri üçün vektorlar (pL1F-1, pL1F-2, pL1F-3 və pL1F-4) seçilir.

    The Bpi7-ci vektorun sonundakı I birləşmə yeri (TGCC) vektor 1-in əvvəlindəki saytla eynidir və eyni yeddi vektordan qeyri-müəyyən müddətə təkrar istifadə etməklə multigen konstruksiyasında yeddidən çox geni klonlamağa imkan verir. Beləliklə, səkkizinci transkripsiya vahidi vektor 1-dən istifadə etməklə, doqquzuncu transkripsiya vahidi 2-ci vektordan istifadə etməklə klonlanır və s. (Şəkil 13C).

    Şəkil 13C-dəki nümunədə iki transkripsiya vahidi tərs oriyentasiyada klonlanır və buna görə də tərs oriyentasiyada klonlama üçün vektorlar seçilir. Transkripsiya vahidinin bir oriyentasiyada və ya digərində klonlaşdırılıb-klonlaşdırılmaması seçimi yalnız istifadəçi ehtiyacları ilə müəyyən edilir.

    3. 1-ci səviyyəli konstruksiyaları yığın.

    Konstruksiyalar hər biri seçilmiş üç əsas hissədən və səviyyə 1 vektorundan ibarət dörd Qızıl Qapı klonlama reaksiyasından istifadə etməklə yığılır. Birinci transkripsiya vahidinin klonlaşdırılması üçün nümunə Şəkil 14-də göstərilmişdir. Klonlama reaksiyası təsvir edildiyi kimi həyata keçirilir (bax. Əsas Protokol 1). Çünki 1-ci səviyyə vektorlarında a var LacZ mavi-ağ tarama üçün fraqment, iki ağ koloniya seçilir. Yığılmış kimi transkripsiya vahidləri yan tərəfdədir BpiMən saytlar, miniprep DNT tərəfindən yoxlanılır Bpihəzm edirəm.


    Gel elektroforez bantlarını necə oxumaq olar

    Bu məqalə bizim təlim keçmiş redaktorlarımız və tədqiqatçılar komandamız tərəfindən onun dəqiqliyi və hərtərəfliliyi üçün təsdiq edilmişdir. wikiHow-un Məzmun İdarəetmə Qrupu hər bir məqalənin etibarlı tədqiqatlarla dəstəklənməsini və yüksək keyfiyyət standartlarımıza cavab verməsini təmin etmək üçün redaksiyamızın işinə diqqətlə nəzarət edir.

    Bu məqalədə istinad edilən 12 istinad var, onları səhifənin altında tapa bilərsiniz.

    Bu məqalə 7319 dəfə oxunub.

    Gel elektroforezi, orqanizmin DNT-sini şərh etmək üçün molekulları ölçülərinə görə ayıran biotexnologiya növüdür. DNT zəncirini mənbədən ayırmaq üçün fermentdən istifadə edilir və DNT boyada dayandırılır. Sonra boya vərəqin bir tərəfində mənfi yüklü gelə tətbiq olunur. DNT digər tərəfdən müsbət yüklü gelə çatmaq üçün vərəqdəki üfüqi zolaqlar dəstindən avtomatik olaraq keçir. Gel elektroforezi iki və ya daha çox növ və ya fərdi nümunələr arasında əlaqəni təyin edərkən faydalıdır. O, həmçinin DNT barmaq izini yaratmağa kömək edə bilər.


    Materiallar və metodlar

    Reagent növü (növ) və ya resursTəyinatMənbə və ya istinadİdentifikatorlarƏlavə informasiya
    Proqram təminatı, alqoritmMATLAB Release 2015a və 2018a Siqnal Emalı Alətlər qutusu, Əyri Uydurma Alətlər qutusu, Statistika və Maşın Öyrənmə Alətlər qutusuThe MathWorks Inc, 2020, Natick, Massaçusets, ABŞID_mənbə: SCR_001622
    Proqram təminatı, alqoritmAdobe Illustrator CS6 və CC 2018 Adobe Inc, 2020, Dublin, İrlandiya RespublikasıID_mənbə: SCR_010279
    Proqram təminatı, alqoritmFieldTrip 20170829Oostenveld et al., 2011 Stolk et al., 2018ID_mənbə: SCR_004849http://www.fieldtriptoolbox.org/
    Proqram təminatı, alqoritmEEGLAB_14_0_0bDelorme və Makeig, 2004ID_mənbə: SCR_007292https://sccn.ucsd.edu/eeglab/index.php
    Proqram təminatı, alqoritmFreeSurfer 5.3.0Dale və başqaları, 1999 Fischl, 2012ID_mənbə: SCR_001847https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/
    Proqram təminatı, alqoritmLCMV şüa formalaşdıranVan Veen və başqaları, 1997
    Proqram təminatı, alqoritmIRASA (Qeyri-müntəzəm Yenidən Nümunələmə Avto-Spektral Analiz)Wen və Liu, 2016b
    Proqram təminatı, alqoritmÇoxtərəfli Spektral AnalizPrerau və başqaları, 2017
    Proqram təminatı, alqoritmFOOOF (Uyğun rəqslər və birdən çox F)Haller və başqaları, 2018https://pypi.org/project/fooof/
    Proqram təminatı, alqoritmeBOSC (genişlənmiş Daha yaxşı OSCillation aşkarlanması)Kosciessa və başqaları, 2020bhttps://github.com/jkosciessa/eBOSC
    Proqram təminatı, alqoritmQarşılıqlı MəlumatQuian Quiroga və Panzeri, 2009http://prerau.bwh.harvard.edu/multitaper/
    Proqram təminatı, alqoritmBioSig Toolbox - Logit transformasiyasıSchlogl və Brunner, 2008 ID_mənbə: SCR_008428
    Proqram təminatı, alqoritmÜmumi xətti modelSiegel və başqaları, 2015
    Proqram təminatı, alqoritmYavaş dalğa aşkarlanmasıHelfrich et al., 2018 Staresina et al., 2015
    Proqram təminatı, alqoritmTəsadüfi Blok Dəyişdirmə (statistika)Canolty et al., 2006 Aru et al., 2015
    Proqram təminatı, alqoritmBağlantıiPLV (xəyali Faza Kilidi Dəyəri) - Nolte və digərləri, 2004 rhoortho (orhtoqonallaşdırılmış güc korrelyasiyası) - Hipp et al., 2012
    DigərNA

    İştirakçılar

    Azaldılmış həyəcan vəziyyətlərinin, yəni ümumi anesteziya və yuxunun neyrofizioloji əsaslarını qiymətləndirmək üçün bu tədqiqat üçün dörd müstəqil məlumat dəsti topladıq. Subdural şəbəkə və zolaq elektrodları və stereotaktik şəkildə yerləşdirilmiş dərinlik elektrodlarından istifadə edərək ya qeyri-invaziv baş dərisinin elektroensefaloqrafiyasını (EEQ) və ya kəllədaxili EEG-ni (elektrokortikoqrafiya ECoG) qeyd etdik (əhatə üçün SEEG Şəkil 1-şəkil 1-ə baxın).

    Anesteziya

    EEG və kəllədaxili anesteziya tədqiqatları Oslo Universitet Xəstəxanasında aparılıb. Bütün iştirakçılar və ya onların valideynləri yerli etika komitəsinin təlimatlarına (Osloda Tibb və Sağlamlıq Araşdırmaları Etikası üzrə Regional Komitələr 2012/2015 və uzadılması 2012/2015–8) və Helsinki Bəyannaməsinə uyğun olaraq məlumatlandırılmış yazılı razılıq verdilər.

    Tədqiqat 1 - Anesteziya baş dərisi EEG

    Anterior servikal diskektomiya və füzyon keçirən on xəstə (iki qadın) birinci tədqiqatda iştirak etdi və remifentanil və propofol ilə total venadaxili anesteziya aldı. Onlar Amerika Anesteziya Cəmiyyətinin I - III statusuna malik idilər, 46 ilə 64 yaş arasında (ortalama 53,3 ± 5,7 il ± SD) və başqa cəhətdən sağlam idilər. Anesteziyanın induksiyasından əlavə elektrodlar (F9, F10, T9, T10, P9, P10) ilə 10-20 sxeminə (EEG Gücləndirici, Pleasanton, Kaliforniya, ABŞ) uyğun olaraq 25 kanallı EEG-dən bərpaya qədər məlumatlar qeyd edildi. ) 512 Hz rəqəmsallaşdırma sürətində və ya bir xəstə üçün 256 Hz. İstinad üçün elektrod CP1-ə yerləşdirildi. Planlaşdırılan bütün müddət ərzində üç xəstə qeydə alınmadı - bir qeyd yalnız induksiyadan sonra başladı, ikisi isə sağalmadan əvvəl dayandırıldı (Juel et al., 2018).

    Study 2 - Anesteziya kəllədaxili EEG

    Tədqiqat 2-də müalicə oluna bilməyən epilepsiya xəstəsi olan cəmi 12 xəstə (üç qadın) iştirak etdi. Onlar 8 ilə 52 yaş arasında idi (ortalama ± SD 26.6 ± 13.2 il). İntrakranial elektrodların eksplantasiyası zamanı anesteziyanın induksiyasından onların çıxarılmasına qədər məlumatlar toplanmışdır. Bütün xəstələr Oslo Universitet Xəstəxanasında propofol və remifentanil ilə total venadaxili anesteziya aldılar. Prosedurdan əvvəl bütün xəstələr adi antiepileptik dərmanları qəbul etdilər. Məlumatlar 128 kanal tutumlu və 64 və ya 512 Hz-ə qədər 128 kanal üçün 1024 Hz rəqəmsallaşdırma sürətinə malik Natus NicoletOne sistemində qeydə alınıb.

    Anestezik idarəetmə

    Bütün xəstələr 3,75-7,5 mq midazolam (Dormicum, Basel, İsveçrə) ilə premedikasiya aldılar, baş dərisi üçün anesteziya EEG qrupu (Tədqiqat 1) əlavə olaraq 1 q oral parasetamol (Paraset, Weifa, Oslo, Norveç) və həmçinin 10 mq davamlı oksikodon aldılar. əməliyyatdan sonrakı ağrıların idarə edilməsi üçün tablet (OxyContin, Dublin, İrlandiya). Propofol (Propolipid, Fresenius Kabi, Uppsala, İsveç) və remifentanil (Ultiva, GlaxoSmithKline, Parma, İtaliya) kompüterlə idarə olunan infuziya nasosları (B Braun Perfusor Space, Melsungen, Almaniya) tərəfindən hədəflə idarə olunan infuziya (TCI) proqramı ilə idarə edilmişdir. (Propofol üçün Schnider və remifentanil üçün Minto) anesteziya və analjeziya üçün kifayət qədər plazma konsentrasiyasına nail olmaq üçün. Anesteziya başlamazdan əvvəl bütün xəstələr anesteziya induksiyası zamanı hipotansiyonun qarşısını almaq üçün Ringer-Asetat (5 ml / kq), həmçinin propofol yeridilməsi zamanı ağrının qarşısını almaq üçün venadaxili 3-5 ml 1% lidokain infuziyası qəbul etdilər. Bütün xəstələr 100% oksigenlə əvvəlcədən oksigenləşdirilib və intubasiya üçün depolarizasiya etməyən əzələ gevşetici sisatrakurium qəbul ediblər (Nimbex, GlaxoSmithKline, Oslo, Norveç). İntubasiyadan sonra inspirator oksigen fraksiyası 40%-ə endirildi, azot oksidi istifadə edilmədi.

    Yatmaq

    Tədqiqat 3 - Yuxu baş dərisi EEG

    Üçüncü tədqiqat Berklidəki Kaliforniya Universitetində aparıldı. Yerli etika komitəsinə (Berkli İnsan Subyektlərinin Müdafiəsi Komitəsi Protokol Nömrəsi 2010-01-595) uyğun olaraq bütün iştirakçılar məlumatlandırıldı və yazılı razılıq verildi. 20 gənc sağlam iştirakçının qeydlərini təhlil etdik (20.4 ± 2.0 il, orta ± SD 12 qadın). Polisomnoqrafiya 8 saatlıq müddət ərzində, eləcə də yuxudan əvvəl və sonra gözləri bağlı 5 dəqiqəlik sakit istirahət zamanı qeydə alınıb. Məlumatlar standart 10-20 quraşdırma, həmçinin üç elektromiyoqrafiya (EMG) və dörd elektro-okuloqrafiya (EOG) istifadə edərək 19 kanallı EEG ilə Grass Technologies Comet XL sistemində (Astro-Med, Inc, West Warwick, RI) qeydə alınıb. ) xarici kanthidə elektrodlar. EEG ikitərəfli əlaqəli mastoidlərə istinad edildi və 400 Hz-də rəqəmləşdirildi (0.1 - 100 Hz Helfrich et al., 2018 Mander et al., 2015 Mander et al., 2014 Mander et al., 2013). Yuxu quruluşu təlim keçmiş işçilər (B.A.M.) tərəfindən və son təlimatlara uyğun olaraq həyata keçirilmişdir (Iber et al., 2007).

    Tədqiqat 4 - Yuxu kəllədaxili EEG

    Dördüncü araşdırma Kaliforniya Universitetində, İrvine Tibb Mərkəzində aparılmışdır. Bu tədqiqata tutma fokusunun əməliyyatdan əvvəl invaziv lokalizasiyasından keçən on epilepsiya xəstəsi (altı qadın) daxil edilmişdir. Bütün xəstələr Berklidəki Kaliforniya Universitetinin və İrvinedəki yerli etika komitələrinə (Kaliforniya Universiteti Berkli İnsan Subyektlərinin Mühafizəsi Komitəsi Protokol Nömrəsi 2010-01-520 Kaliforniya Universitetinin İrvine İnstitusional Nəzarət Şurasının Protokolu) uyğun olaraq məlumatlı razılıq verdilər. Nömrə 2014–1522, UCB UCI Reliance Number 1817-ə əsaslanır) və məlumatların toplanmasından əvvəl onların yazılı razılığını verdi. Onlar 22 ilə 55 yaş arasında idi (ortalama 33.1 ± 11.5 yaş ± SD). Elektrodların yerləşdirilməsi yalnız klinik meyarlarla diktə edilmişdir (Ad-Tech, SEEG: 5 mm elektrodlar arası interval Integra, Grids: 1 sm, 5 və ya 4 mm aralıq). Məlumatlar Nihon Kohden qeyd sistemi (256 kanal gücləndirici, model JE120A) ilə qeydə alınıb, 0,01 Hz-dən yuxarı analoq süzülüb və 5 kHz-də rəqəmsal nümunə götürülüb. Qızıl standart yuxu mərhələlərini asanlaşdırmaq üçün eyni vaxtda EOG, beş aparıcıdan elektrokardioqrafiya (EKQ) və EEQ intrakranial elektrodların lokalizasiyasından asılı olaraq 10-20 quraşdırmanın nümunəvi elektrodları ilə qeyd edildi, lakin əsasən Fz, Cz, C3, C4-dən ibarətdir. və Oz. EKQ və EEG-dən 40 Hz-dən yuxarı yüksək keçidli filtrasiya ilə surroqat EMQ siqnalı əldə edilmişdir. Yuxu quruluşu son təlimatlara uyğun olaraq təlim keçmiş işçilər (B.A.M.) tərəfindən həyata keçirilmişdir (Iber et al., 2007).

    Məlumatların əvvəlcədən işlənməsi

    Tədqiqat 1 - Anesteziya baş dərisi EEG

    Məlumatlar FieldTrip-ə idxal edildi (Oostenveld et al., 2011) və 10 saniyəlik seqmentlərə bölündü. Müstəqil Komponent Təhlili (fastika Hyvärinen, 1999) EKQ kimi sistematik artefaktlardan məlumatları təmizləmək üçün istifadə edilmişdir. Əlavə məlumatların təmizlənməsi nevroloq (R.T.K.) və anestezioloq (J.D.L) tərəfindən yoxlanıldıqdan sonra əl ilə aparıldı. Orta hesabla, xəstələrdə 1183 ± 81,42 on saniyəlik dövrlər var idi, onlardan 196 ± 103,19 səs-küylü (15,81 ± 3,15%) qeyd edildi. Heç bir kanal xaric edilmədi və ya interpolyasiya edilmədi. Verilənlərə ümumi orta göstəricidən istifadə edilərək istinad edilib, alçaldılıb və aşağı salınıb. Oyanma dövrləri xəstələrin tədqiqat heyətinin şifahi əmrlərinə etibarlı şəkildə cavab verdiyi zaman induksiyadan əvvəl və anesteziyadan sonrakı vaxt kimi müəyyən edilmişdir. Anesteziya dövrləri induksiyadan sonra propofolun tətbiqinin dayandırılmasına qədər olan vaxt kimi müəyyən edilmişdir.

    Tədqiqat 2 – Anesteziya kəllədaxili EEG

    Məlumatlar səkkiz xəstədə 512 Hz rəqəmsallaşdırma dərəcəsi ilə qeydə alınıb. Dörd əlavə xəstə 1024 Hz rəqəmsallaşdırma dərəcəsi ilə qeydə alınıb və bu məlumat dəstləri 512 Hz-ə endirilib. Daha sonra məlumatlar FieldTrip-ə idxal edildi (Oostenveld et al., 2011), on saniyəlik seqmentlərə bölündü və epileptik fəaliyyət üçün bir nevroloq (R.T.K.) tərəfindən yoxlanıldı və sonra epileptik və digər sinir olmayan artefaktlardan əl ilə təmizləndi. Oyanıq vəziyyət propofolun başlamasından əvvəl, anesteziya şüurun itirilməsindən sonrakı vaxt (tədqiqat personalı və iştirak edən anestezioloq tərəfindən qiymətləndirilən şifahi əmrlərə cavab verməmə) kimi müəyyən edilmişdir. İmplantasiyadan əvvəl T1-çəkili MRT və implantasiya sonrası Kompüter Tomoqrafiyası (CT) skanları birləşdirildikdən sonra elektrodlar FieldTrip alətlər qutusundan (Stolk et al., 2018) istifadə edərək açıq şəkildə mövcud beyin atlası (Freesurfer Fischl, 2012) ilə avtomatik olaraq lokallaşdırıldı. və iki nevroloq (RTKRFH) tərəfindən müstəqil əl yoxlaması ilə çarpaz təsdiq edilmişdir. Ağ maddə və ya lezyonlardakı kontaktlar atıldı. Qalan siqnallar daha sonra yan qonşularına istinad edilən bipolyar idi, alçaldılmış və aşağı salınmışdır.

    Tədqiqat 3 - Yuxu baş dərisi EEG

    EEG ikitərəfli əlaqəli mastoidlərə istinad edildi və məlumatlar EEGLAB-a (Delorme və Makeig, 2004) idxal edildi və 5 saniyəlik seqmentlərə bölündü. Tərkibində artefaktlar olan dövrlər (məsələn, göz qırpması və ya hərəkət) əl ilə yoxlanıldı və təlim keçmiş hesabçı (B.A.M.) tərəfindən rədd edildi. Kanalların heç biri atılmadı və ya interpolyasiya edilmədi. Orta hesabla, iştirakçılar bu beş ikinci dövrün 5748.9 ± 10.01-ə sahib idi və onlardan 946.95 ± 542.68-i rədd edildi (16.44 ± 2.98%), anesteziya baş dərisi EEG qeydləri ilə müqayisə edilə bilər. Sağlam yuxu iştirakçılarından alınan məlumatlar daha əvvəl bildirilmiş və müqayisə edilə bilən bir yanaşma ilə təmizlənmişdir (Helfrich et al., 2018 Mander et al., 2015 Mander et al., 2014 Mander et al., 2013). MATLAB-da əlavə təhlil üçün (MATLAB Release R2018b, The MathWorks, Inc, Natick, Massachusetts, Amerika Birləşmiş Ştatları) məlumatlar daha sonra FieldTrip-ə idxal edildi (Oostenveld et al., 2011).

    Tədqiqat 4 – Yuxu kəllədaxili EEG

    Məlumatlar FieldTrip-ə idxal edildi (Oostenveld et al., 2011), 500 Hz-ə endirildi və sonrakı məlumatların təhlili üçün 30 saniyəlik seqmentlərə bölündü. Anatomik lokalizasiya, implantasiyadan əvvəl T1-çəkili Maqnetik Rezonans Görüntülemə (MRT) skanlarını implantasiya sonrası MRT və elektrod mövqeyinin həm avtomatik, həm də əl ilə etiketlənməsi ilə birləşdirilərək həyata keçirildi (Stolk et al., 2018). Yuxarıda göstərildiyi kimi, epilepsiya, ağ maddə və digər artefaktlarla kanallar atıldı. Məlumatlar bipolyar istinad edilmiş, aşağılanmış və aşağılanmışdır.

    Spektral analiz

    (1) Orta güc spektrlərini əldə etmək üçün, artefakt çıxarıldıqdan sonra məlumatlar anesteziya üçün on saniyəlik seqmentlərə və yuxu üçün 30 saniyəlik seqmentlərə bölündü. (2) Zaman-tezlik parçalanması Sürətli Furye Transformasiyasından istifadə etməklə həyata keçirilmişdir (mtmfft, FieldTrip (Oostenveld et al., 2011) 0,5 Hz-dən 45 Hz-ə qədər 0,5 Hz addımlarla. Oslo qeydlərindəki 50 Hz-də xətt səs-küyünə görə təhlil 45 Hz ilə məhdudlaşdırıldı və sonra ardıcıllıq üçün bütün ardıcıl tədqiqatlara qəbul edildi. Etibarlı spektral təxminlər əldə etmək üçün diskret prolat slepian ardıcıllığına əsaslanan Multitaper yanaşmasından (Prerau et al., 2017) istifadə etdik.dpss anesteziya: 10 s seqmentlər üçün 9 daralma, üst-üstə düşmə yoxdur, ± 0,5 Hz yuxu tezliyinin hamarlanması: 30 s seqmentlər üçün 29 daralma, üst-üstə düşmə, ± 0,5 Hz tezlik hamarlanması). (3) Hər bir vəziyyətin güc spektri dövlətin bütün nümunələri (oyanma və anesteziya və ya istirahət, oyanma, sürətli olmayan göz hərəkəti yuxu mərhələsi 3 (N3) və sürətli göz hərəkəti yuxusu (REM)), kanallar və subyektlər üzrə orta hesablanmışdır. (Şəkil 1b,c və Şəkil 2b,c). Daha yaxşı müqayisə üçün biz baş dərisi səviyyəsində təsiri vizuallaşdırdıq. Tədqiqat 2 üçün eyni vaxtda EEG qeydləri mövcud deyildi.

    Seqment uzunluğunun və daralmaların sayının spektral yamacın qiymətləndirilməsinə təsirinin nəzarət təhlili üçün anesteziya EEG qeydləri 30 saniyəlik seqmentlərə, yuxu isə 10 saniyəlik seqmentlərə bölündü. Vaxt tezliyinin parçalanması yenidən FieldTrip's ilə edildi mtmfft ± 0,5 Hz tezlikli hamarlama ilə və dpss anesteziya üçün 29 və yuxu üçün doqquzla nəticələnir. Qeyd edək ki, daralmaların sayı seqment uzunluğu və tezliyin hamarlanması seçiminin birbaşa nəticəsidir (Prerau et al., 2017):

    Multitaper, Single-taper, Periodogram və Welch Metodunun müqayisəsi

    Müxtəlif güc hesablamalarının siqnal-küy nisbətlərinin müqayisəsi üçün (Şəkil 2—şəkil əlavəsi 6) Çoxbucaqlı spektral parçalanma (Prerau et al., 2017) yuxarıda göstərildiyi kimi hesablanmışdır. Bütün sonrakı hesablamalar üçün yuxu məlumatları 30 saniyəlik seqmentlərə bölündü.

    Tək kontur analizi üçün güc Sürətli Furye Çevrilməsindən istifadə edərək hesablanmışdır mtmfft FieldTrip (Oostenveld et al., 2011) Hanning konik tətbiqindən sonra heç bir üst-üstə düşmür. Spektral qiymətləndirmələr 0,5 Hz addımlarla 0,5 və 45 Hz arasında əldə edilmişdir.

    Periodoqramın hesablanması üçün MATLAB-dan istifadə etdik periodogram.m funksiyası (MATLAB və Signal Processing Toolbox Release R2018b, MathWorks, Inc, ABŞ) və standart düzbucaqlı pəncərə və 400 Hz seçmə tezliyi ilə müəyyən edilən nöqtələrin sayı. Çox və Tək konturlu yanaşmalarda olduğu kimi eyni sayda müşahidə əldə etmək üçün yuxarıdakı Çox və Tək konturlu yanaşmada seçilmişlərə ən yaxın tezliklər (0,5 Hz addımlarda 0,5-45 Hz) sonrakı təhlil üçün seçildi. .

    Welch metodu üçün güc 30 saniyəlik bir pəncərə ölçüsü ilə hesablanmış və heç bir üst-üstə düşməyəcək, nəticədə MATLAB-dan istifadə edən bir Hamming pəncərəsi yaranmışdır. pwelch.m funksiyası (MATLAB və Signal Processing Toolbox Release R2018b, MathWorks, Inc, ABŞ). Nöqtələrin sayı seçmə sürəti ilə müəyyən edilmişdir. Yenə də, siqnalın səs-küy nisbətlərinin (SNR) birbaşa müqayisəsini təmin etmək üçün əlavə təhlil üçün Multi-/Tək konturlu yanaşmaya ən yaxın tezliklər seçilmişdir.

    SNR, hər bir kanalda hər bir tezlikin orta gücünü bu tezlik və kanalın standart sapmasına bölmək yolu ilə hesablanmışdır.

    Spektral yamacın qiymətləndirilməsi

    Qüvvət spektrinə xətti reqressiya xəttini yerləşdirməklə spektral yamacı hesabladıq log-log 30 və 45 Hz arasında boşluq, çünki əvvəllər göstərilmişdi ki, bu diapazon gəmiricilər və meymunlardakı oyanma dəyişiklikləri, eləcə də simulyasiyalarda müxtəlif həyəcan-inhibisyon nisbətləri ilə ən yaxşı şəkildə əlaqələndirilir (Gao et al., 2017). Əvvəlki hesabatlara uyğun olaraq, xətti uyğunluğu təhrif edə bilən güclü salınım aktivliyi olan aşağı tezlikləri, eləcə də hər iki xətt səs-küyü ilə qarışdırılan 50 Hz-dən yuxarı diapazonu (Avropada 50 Hz, ABŞ-da 60 Hz) istisna etdik. ) həmçinin geniş zolaqlı əzələ artefaktları.

    Daha sonra ardıcıllıq səbəbindən bu diapazonu digər tədqiqatlarda yamacın hesablanmasına uyğunlaşdırdıq. Spektral yamacın zamanla həll edilmiş təxmini hesablamasını hesablamaq üçün biz çoxbucaqlı güc spektrlərinin (yuxarıya bax) 10 (anesteziya) və ya 30 (yuxu) ikinci seqmentlərinə uyğun olan ən yaxşı xətti hesabladıq. log-log polinom əyri fitinqindən istifadə edərək boşluq (polyfit.m, MATLAB və Curve Fitting Toolbox Release R2015a, The MathWorks, Inc, Natick, Massachusetts, Amerika Birləşmiş Ştatları). Tədqiqat 3-də (yuxu EEG) bir subyekt oyaqlıq zamanı həddindən artıq səs-küy səviyyəsini nümayiş etdirdi, buna görə də onun məlumatları oyaqlıqla bütün yamac müqayisələrindən xaric edilməli idi.

    Spektral yamacın qiymətləndirilməsinin nəzarət analizləri

    Xətti reqressiya üçün müxtəlif mərkəz tezliklərinin qiymətləndirilməsi üçün, spektral yamac müxtəlif mərkəz tezliklərinin (20-dən 150 Hz-dək başlayan mərkəz tezliyi ətrafında ±10 Hz) və fərqli uyğunluğun funksiyası kimi kəllədaxili yuxu qeydlərindən (Tədqiqat 4) təxmin edilmişdir. uzunluqları (30 Hz-dən 10 Hz-ə qədər artırma ilə 100 Hz-ə qədər) yuxarıda göstərilən prosedurdan istifadə edərək (Şəkil 2 - şəkil əlavəsi 5).

    Bundan əlavə, spektral yamac müxtəlif qeydlərdə aşağı tezliklərdən təxmin edilmişdir: (1) Anesteziya baş dərisi EEG (Tədqiqat 1) əvvəllər bildirildiyi kimi 1 ilə 40 Hz diapazonunda (Colombo və digərləri, 2019) və (2) Yuxu baş dərisi EEG-də (2) Tədqiqat 3) qeyri-müntəzəm yenidən nümunə götürmə yolu ilə güc spektrindən salınan komponentləri diskont etdikdən sonra hər uyğunluq üçün əlavə 5 Hz artan uzunluqla 1-dən 5 Hz-ə qədər (IRASA Wen və Liu, 2016a Şəkil 2—şəkil əlavəsi 5c). Bu metoddan istifadənin əsas səbəbi, yamacın təxminini təhrif edə biləcək yavaş dalğalar kimi güclü aşağı tezlikli salınımları istisna etmək idi.

    Bundan əlavə, biz iki əlavə alqoritmdən, FOOOF paketindən (Haller et al., 2018) və eBOSC alqoritmindən (Kosciessa et al., 2020a) həm anesteziya, həm də yuxu baş dərisi EEG (Stu) istifadə edərək spektral yamacın 30-45 Hz diapazonundan təxmin etdik. 1 və 3). eBOSC xətti reqressiya həyata keçirərkən log-log MATLAB-dan istifadə edərək boşluq robustfit.m, FOOOF model uyğunluğu ilə güc spektrinin həm salınım, həm də aperiodik hissəsini təxmin edir: Əvvəlcə güc spektrinə eksponensial uyğunluq həyata keçirilir. yarı log boşluq, sonra bu uyğunluq güc spektral sıxlığından (PSD) çıxarılır. Qalıq siqnal rəqslərin və səs-küyün birləşməsi kimi qəbul edilir və səs-küy səviyyəsinə çatana qədər mümkün salınım zirvələrini aşkar etmək üçün çoxsaylı Qauss uyğunluğu ilə təkrar-təkrar uyğunlaşdırılır. Aşkar edilmiş zirvələr daha sonra qarışıq salınım/səs siqnalına qarşı təsdiqlənir və orijinal PSD-dən çıxarılır. Sonra yeni qalıq siqnal aperiodik siqnalın daha yaxşı qiymətləndirilməsi üçün yenidən uyğunlaşdırılır. Hər iki Multi-Gaussian uyğunluğu və təkmilləşdirilmiş aperiodik uyğunluq daha sonra bir modeldə birləşdirilir (Şəkil 3 ilə müqayisə edin (Haller et al., 2018). PSD-də aperiodik siqnalda diz də adlandırılan əyilmə yoxdursa, onda alqoritm xəttin uyğunlaşdırılmasına bərabərdir log-log boşluq (Haller et al., 2018).

    Qarşılıqlı Məlumat

    Qarşılıqlı Məlumat (Mİ) iki siqnalın qarşılıqlı asılılığını, xüsusən də digərini müşahidə edərkən bir dəyişən haqqında əldə edilən məlumatın miqdarını kəmiyyətlə ifadə edən informasiya nəzəri metrikasıdır (Quian Quiroga və Panzeri, 2009). Bu, qeyri-xətti, birləşdirilmiş siqnallar üçün xüsusilə faydalıdır. X və Y siqnalları arasındakı qarşılıqlı məlumat olaraq təyin olundu

    burada p(x,y) birgə ehtimal funksiyasını, p(x) və p(y) isə sinif ehtimallarını göstərir. Ehtimallar onların cəmi ilə normallaşdırıldı. MI təhlili üçün (Şəkil 2b, Şəkil 2—şəkil əlavələri 2, 5, 8 və 10) biz vaxtla həll olunan yamacı 30 saniyəlik seqmentlərə ayırdıq (hipnoqramma 30 saniyəlik dövrlərdə səhnələşdirilib) və onu beş qutuya (Oyanış) ayırdıq. , REM, N1, N2, N3) istifadə edərək diskretləşdirmək.m MATLAB Signal Processing Toolbox Release R2015a funksiyası (MathWorks Inc, ABŞ). Qarşılıqlı Məlumat istifadə edərək hesablanmışdır MutualInformation.m funksiyası MATLAB Mərkəzi Fayl Mübadiləsi (Dwinell, 2010).

    Beamformer təhlili

    Baş dərisi EEG-də oyaqlıq və yuxu arasındakı yamac fərqini mənbə ilə lokallaşdırdıq (Tədqiqat 3, n = 19 bir xəstə kifayət qədər oyanma sınaqları səbəbindən xaric edilməli idi Şəkil 2 - şəkil əlavəsi 3). Sensor səviyyəli EEG məlumatlarının kortikal mənbələri şəbəkədəki hər bir voksel üçün vaxt seriyasını qiymətləndirmək üçün LCMV (xətti məhdudlaşdırıcı minimum variasiya) şüa formalaşdıran yanaşma (Van Veen et al., 1997) istifadə edilərək yenidən quruldu. Standart T1 MHİ şablonu və FieldTrip alətlər qutusundan (Oostenveld et al., 2011) BEM (sərhəd element metodu) baş modeli standart MNI məkanında 1 sm məsafədə 3D şablon şəbəkəsini qurmaq üçün istifadə edilmişdir. Elektrod yeri FieldTrip alətlər qutusundan standart 10/20 şablonundan əldə edilmişdir (Oostenveld et al., 2011). Mənbə proyeksiyasından əvvəl sensor səviyyəli məlumatlar ümumi orta hesabla istinad edilir və 30 saniyəlik seqmentlərə bölünürdü. Hesablama yükünü minimuma endirmək üçün kovariasiya matrisini qurmaq üçün hər dövrün mərkəzindən iki ikinci məlumat seqmentini seçdik. LCMV məkan filtri daha sonra 5% nizamlama ilə sensor səviyyəli EEG məlumatlarının kovariasiya matrisindən istifadə etməklə hesablanmışdır. Məkan filtrləri bütün digər mənbələrdən aktivliyi maksimum dərəcədə sıxışdırmaq üçün şəbəkə mövqelərinin hər biri üçün ayrıca qurulmuşdur. Mənbə məkanında yaranan zaman kursları daha sonra Hanning pəncərəsini tətbiq etdikdən sonra Furye transformasiyasından istifadə edərək spektral analizdən keçdi. Daha sonra hər bir seqmentin PSD yamacı əvvəllər qeyd edildiyi kimi 30 ilə 45 Hz diapazonunda xətti reqressiyadan istifadə etməklə hesablanmışdır. Yuxu zamanı orta yamac dəyərləri mənbə məkanındakı hər bir vokseldə oyaqlıq zamanı orta yamacdan çıxarıldı və sonra MNI məkanında standart şablon beyinə mənbə ilə interpolyasiya edildi.

    19 kanallı EEG-dən istifadə edərək medial temporal lob (MTL) fəaliyyətinin etibarlı mənbə lokalizasiyası çətin olaraq qaldığından, biz prefrontal korteks (PFC) subregionlarına diqqət yetirən maraq bölgələrinə (ROI) əsaslanan yanaşma tətbiq etdik. İntrakranial yuxu tədqiqatından əldə etdiyimiz nəticələrə uyğun olaraq (Tədqiqat 4, Şəkil 2C və Şəkil 2-şəkil əlavəsi 4), biz mPFC və dorsolateral PFC (dlPFC) ROI olaraq təyin etdik. Mənbə səviyyəsində ROI müəyyən etmək üçün biz FieldTrip-də tətbiq olunan Avtomatlaşdırılmış Anatomik Etiketləmə (AAL) atlasından istifadə etdik (Oostenveld et al., 2011). ROI mPFC aşağıdakı bölgələri əhatə etdi: 23 və 24 - 'Frontal_Sup_Medial_L və R', 25 və 26 - 'Frontal_Med_Orb_L və R', 27 və 28 - 'Rectus_L və R', 31 və R_Lulum'. ROI dlPFC aşağıdakı atlas toxuma etiketlərindən ibarət idi: 3 və 4 – 'Frontal_Sup_L və R', 7 və 8 - 'Frontal_Mid_L və R', 11 və 12 - 'Frontal_Inf_Oper_L və R', 13 və 14 - '_T_Rtal' və və 15 və 16 'Frontal_Inf_Orb_L və R'.

    Təsnifat təhlili

    Yavaş dalğa gücünün və ya spektral yamacın oyaqlıq və ya yuxunun daha yaxşı proqnozlaşdırıcısı olub-olmadığını qiymətləndirmək üçün xətti diskriminant analizindən (LDA) istifadə etdik (Şəkil 1-şəkil əlavəsi 4, Şəkil 3a-c). Nümunələrin sayını bərabərləşdirmək üçün bərabər sayda yuxu və REM sınaqlarını təsadüfi seçdikdən sonra 50 dəfə təkrarlanan bir-bir nümunə-çıxarılan çarpaz doğrulama yanaşmasından istifadə etdik (təsnifat.m, MATLAB və Statistika və Maşın Öyrənmə Toolbox Release R2015a, MathWorks Inc, ABŞ). Sonra alt seçmə paylamanın hər bir nümunəsi bir dəfə təlim məlumat dəstindən çıxarıldı. LDA klassifikatoru qalan nümunələr üzrə təlim keçmiş və saxlanılan sınaq nümunəsində sınaqdan keçirilmişdir. Təsnifatın performansı daha sonra düzgün faizlə qiymətləndirildi. Yuxu EEG-nin 20 iştirakçısından ikisi kifayət qədər oyanma sınaqlarının olmaması səbəbindən xaric edilməli idi. LDA performansları logit-çevrildi (logit.m BioSig alətlər qutusundan (Schlogl və Brunner, 2008) və statistik müqayisədən əvvəl kanallar üzrə orta hesabla.

    Çoxdəyişənli Ümumi Xətti Model

    Oyanma vəziyyətlərinin proqnozlaşdırılmasında unikal töhfələri, eləcə də yavaş dalğa gücü (<1.25 Hz) və spektral yamac arasındakı qarşılıqlı əlaqəni modelləşdirmək üçün biz əvvəlcə hər iki parametri z-hesab vasitəsilə ölçdük və sonra ümumi xətti hesabladıq. MATLAB istifadə edərək model fitlm.m funksiyası (MATLAB və Statistika və Machine Learning Toolbox Release R2018b, MathWorks Inc, ABŞ). Bu üsul həm əsas effektləri, həm də iki proqnozlaşdırıcı arasında qarşılıqlı əlaqəni modelləşdirməyə imkan verirdi (Şəkil 3d-f). Tənqidi olaraq, müxtəlif amillərin töhfəsini dolayısı ilə ortoqonallaşdıran və beləliklə, sonradan təsir ölçüsü (eta kvadratı) ilə kəmiyyətləşdirilən üst-üstə düşməyən unikal izah edilmiş distilasiyanı distillə edən balanssız dizayndan istifadə etdik (Siegel et al., 2015).

    Yavaş dalğa zamanı spektral yamacın qiymətləndirilməsi

    Yavaş dalğa hadisələri (Şəkil 4, Şəkil 2—şəkil əlavəsi 10) müəyyən edilmiş alqoritmlərə əsaslanaraq hər bir kanal üçün aşkar edilmişdir (Helfrich et al., 2018 Staresina et al., 2015): Xam siqnal 0,16 və 1,25 Hz arasında bant keçidi ilə süzülmüşdür. və sıfır keçidlər aşkar edilmişdir. Hadisələr daha sonra vaxt (0,8-2 s müddət) və amplituda meyarından (75% persentil) istifadə edilməklə seçildi. Xam məlumatlar daha sonra yavaş dalğanın çuxuruna (±2,5 s) nisbətən epochlaşdırıldı. FieldTrip istifadə edərək 250 ms üst-üstə düşmə ilə 500 ms vaxt pəncərələrində vaxt tezliyinin parçalanması hesablanmışdır (Oostenveld et al., 2011) (mtmfft, ±2 Hz tezlik hamarlanması və bir dpss konik). Spektral yamac bu zaman pəncərələrində ən yaxşı uyğunluq xətti ilə hesablanmışdır log-log polinom əyri fitinqindən istifadə edərək 30 və 45 Hz arasında boşluq (polyfit.m, MATLAB və Curve Fitting Toolbox Release R2015a, MathWorks Inc, ABŞ).

    Statistik sınaq

    Cütlənmiş nümunələr üçün Student t-testindən istifadə etməklə oyaq və anesteziya edilmiş vəziyyətin spektral meyli müqayisə edildi (Şəkil 1b,c). Müşahidə olunan t-dəyərləri təsadüfi qarışdırılmış etiketlərlə (adlandırılır) test statistikası 10.000 dəfə yenidən hesablandıqdan sonra surroqat paylanma ilə müqayisə edildi. permutasiya t-testi əlyazmada). Post hoc t-testləri çoxlu müqayisələr üçün Bonferroni tərəfindən düzəldilmişdir.

    Üç vəziyyəti (oyanıq, NREM və REM) müqayisə etmək üçün biz Greenhouse-Geisser korreksiyalı 1 tərəfli təkrar ölçmə dispersiya təhlilindən istifadə etdik (Şəkil 2b və c RM-ANOVA). Biz buna bənzər bir yanaşma qəbul etdik permutasiya t-testi, burada orijinal RM-ANOVA çıxışı şərti etiketləri 10.000 dəfə təsadüfi çevirdikdən sonra qarışdırılmış paylama ilə müqayisə edildi (təkrar tədbirlər ANOVA permutasiya testi). Təsir ölçüsü Cohen d istifadə edərək hesablanmışdır.

    EEG-də müşahidə olunan təsirlərin məkan dərəcəsini qiymətləndirmək üçün FieldTrip-də (Oostenveld və digərləri, 2011) həyata keçirildiyi kimi çoxsaylı müqayisələri düzəltmək üçün klaster əsaslı permutasiya testlərini hesabladıq (Monte-Karlo metodu maksimum ölçü meyarı 1000 iterasiya). Vəziyyət etiketlərini təsadüfi qarışdırmaqla permutasiya paylanması əldə edildi və sonra əhəmiyyətin qiymətləndirilməsini əldə etmək üçün faktiki paylanma ilə müqayisə edildi. Məkan çoxluqları oyanma və anesteziya (Şəkil 1b) və ya oyanma və yuxu (Şəkil 2b) arasında p dəyəri < 0.05 arasında yamac fərqlərinin müstəqil t-testlərinin eşidilməsi ilə formalaşır. Bütün nəticələr Bonferroni tərəfindən çoxsaylı müqayisələr üçün düzəldilmişdir. Yuxu EEG-də potensial qarışıqlıq kimi EMQ-yə nəzarət etmək üçün (Tədqiqat 3), klaster əsaslı permutasiya testini hesablamadan əvvəl EMQ-nin yamacını qismən korrelyasiyadan çıxaran qismən korrelyasiyadan (Spearman) istifadə etdik (Şəkil 2-). Şəkil əlavəsi 2b). Korrelyasiya əmsalları (r-dəyərləri) aşağıdakı düsturdan istifadə etməklə t-dəyərlərinə çevrildi (N = subyektlərin sayı):

    Qarşılıqlı Məlumatın (MI) statistik qiymətləndirilməsi üçün biz surroqat testindən istifadə etdik (Şəkil 2b, Şəkil 2 - şəkil əlavəsi 2a). Müşahidə olunan məlumatlardan surroqat paylanması əldə etmək üçün biz təsadüfi blok dəyişdirmə prosedurundan istifadə etdik (Aru və digərləri, 2015 Canolty et al., 2006). Təkrarların sayı mövcud yuxu mərhələlərinin sayına bərabər idi. Hər bir iterasiyada biz ilkin müşahidəmizi müqayisə edə biləcəyimiz surroqat paylanma yaratmaq üçün bu blokun dəyişdirilmiş hipnoqramlarının MI-ni diskretləşdirilmiş zamanla həll edilmiş yamacla yenidən hesabladıq. Nəticələri subyektlər arasında müqayisə etmək üçün, müşahidə edilən MI-dən surroqat paylanmasının ortasını çıxararaq və surroqat paylanmasının standart sapmasına bölmək yolu ilə dəyərləri z-balı etdik. Qeyd edək ki, z = 1.96 0.05-lik düzəldilməyən iki quyruqlu p-dəyərini, >2.8-lik z-balı isə Bonferroni tərəfindən düzəldilmiş əhəmiyyətli p-dəyərini göstərir (p<0.05/19 kanal=0.0026). Z-qiymətləri topoqrafik təsvir üçün p-dəyərlərinə çevrildi (Şəkil 2b Şəkil 2—şəkil 2a) normal kumulyativ paylanma funksiyasına (iki quyruqlu) əsaslanaraq.

    Bağlantı

    Fronto-parietal əlaqənin təhlili üçün (Şəkil 2—şəkil əlavəsi 10), biz yuxu EEG qeydlərimizdə Fz və Pz elektrodunu seçirik (3-cü iş n = 20) 0,1-də 0,1-dən 64 Hz-ə qədər tezliklərdən böyüklüyün kvadrat koherentliyini hesablamaq üçün. Hz istifadə edərək addımlar mscohere.m funksiyası MATLAB Signal Processing Toolbox-dan (Release R2015a, MathWorks, Inc, ABŞ) əvvəllər təsvir edildiyi kimi (Pal et al., 2016 Pal et al., 2015). Nəzərə alın ki, uyğunluq təxminləri həm güc dəyişikliklərini, həm də faza sinxronizasiyasındakı dəyişiklikləri əks etdirir. Buna görə də, müvafiq olaraq faza və gücün təsirlərini ayırmaq üçün Faza Kilidləmə Dəyərini (PLV) və amplituda korrelyasiyasını (rho) hesabladıq. Həcm yayılmasının təsirlərini azaltmaq üçün biz xəyali PLV ​​(Nolte et al., 2004) (iPLV) və ortoqonallaşdırılmış güc korrelyasiyasını (Hipp və digərləri, 2012) hesabladıq (rhoortho).

    Daha sonra nəticələrin gecə ərzində müxtəlif yuxu mərhələləri arasında dəyişiklikləri nə qədər yaxşı tutduğunu müqayisə etmək üçün Qarşılıqlı Məlumatı (MI yuxarıya bax) kəmiyyətini müəyyənləşdirdik (Quian Quiroga və Panzeri, 2009). Bu analiz üçün biz yalnız Fz elektrodunun yamac dəyərlərindən istifadə etdik (digər ölçüləri Fz-Pz-də hesablayarkən) və Pal et al., 2016 Pal et al., 2015-in analoqu ilə 4 ilə 10 Hz arasında teta təyin etdik.


    Videoya baxın: Mədəmiz niyə köpür - Bu yolla aradan qaldırın (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Meztisar

    Heyranedici fikriniz olmadan nə edək

  2. Saelac

    Əla, əla ideya sizi ziyarət etdi

  3. Cynerik

    Comrades soldiers, the song must be shouted so that the muscles on the ass tremble. Sleep faster - you need a pillow. Better to do and regret than to regret not doing. I didn’t love you as much as you moaned! ..

  4. Jonn

    Your thought will come in handy

  5. Kazuru

    I am ready to help you, ask questions. Together we can come up with a correct answer.

  6. Aracage

    təsdiq edirəm. Yuxarıda deyilənlərin hamısı ilə razıyam. Bu mövzuda ünsiyyət qura bilərik.

  7. Pepillo

    Verilmiş, faydalı məlumatlar



Mesaj yazmaq