Məlumat

Hüceyrədəki RNT tərkibinin RT-PCR nümayəndəsi necədir?

Hüceyrədəki RNT tərkibinin RT-PCR nümayəndəsi necədir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Məsələn, biz əvvəlcə bir məməli hüceyrə xəttinin bütün RNT məzmununu toplayırıq. Məsələn, biz 150 ng/uL konsentrasiyası olan 80 uL RNT toplayırıq. Sonra cDNT yaratmaq üçün 1000 ng RNT alırıq. Bununla belə, bu 1000 ng, sahib olduğumuz ümumi RNT-nin tamamilə təsadüfi bir nümunəsidir. Hüceyrələrimizdəki RNT məzmununu təmsil edən təsadüfi RNT nümunəsi necədir?


Sual verənin tam olaraq nə soruşduğu aydın deyil, amma…

… bu barədə düşünməyin bir yolu, RNT-nin hazırlanmasından götürülmüş nümunədə az miqdarda RNT-nin olma ehtimalının nə qədər olduğunu soruşmaqdır. Bu, nümunəni keyfiyyət səviyyəsində qeyri-təmsilçi edəcək.

Sualda deyilir ki, 12.000 ng RNT təcrid olunub. Başqa heç nə göstərilmədiyi üçün bunun ümumi RNT olduğunu düşünürəm. Bir eukaryotik hüceyrə üçün ümumi RNT-nin təxmini təxmini 20 pg təşkil edir.

Bu o deməkdir ki, hazırlıq 6 x 10-dan gəldi5 hüceyrələr. (Mən 100% məhsuldarlığı güman edirəm, lakin bu, nəticəyə həqiqətən təsir etməyəcək.)

İndi fərz edək ki, az miqdarda mRNT hər hüceyrədə 10 nüsxədə mövcuddur. Beləliklə, ümumi RNT preparatı 6 x 10 ehtiva edir6 aşağı bolluqlu mRNT-nin surətləri.

Ümumi 12.000 ng-dan 1000 ng nümunə götürürük. Başqa sözlə, biz RNT hazırlığının 1/12 hissəsini alırıq. Əgər həmin RNT preparatının tərkibində 106 aşağı bolluqlu mRNT-nin nüsxələri Bu aşağı bolluqlu mRNT-nin nüsxələrini ehtiva etməyən nümunə götürmə ehtimalımız nə qədərdir? Burada mənim riyaziyyatım uğursuz oldu, amma intuitiv olaraq ehtimalın olduğunu söyləyirəm çox çox kiçik.

İndi, əgər hüceyrədə 1000 müxtəlif az miqdarda mRNT varsa, onların hər birinin yox olma ehtimalı çox çox kiçik, lakin onlardan birini əldən vermə ehtimalı 1000 x-dir çox çox kiçik, bəlkə də çox kiçik.

Dəyərini necə hesablamaq barədə düşünməyə davam edəcəyəm çox çox kiçik, lakin kimsə kömək etmək istəyirsə - əvvəlcədən təşəkkür edirəm!


PCR, RT-PCR, qPCR və RT-qPCR arasındakı fərqlər nələrdir?


Polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) DNT və RNT ardıcıllığını gücləndirmək və aşkar etmək üçün nisbətən sadə və geniş istifadə olunan molekulyar biologiya üsuludur. Çox vaxt günlər çəkə bilən DNT klonlaşdırılması və gücləndirilməsinin ənənəvi üsulları ilə müqayisədə PCR yalnız bir neçə saat tələb edir. PCR yüksək həssasdır və xüsusi ardıcıllığın aşkarlanması və gücləndirilməsi üçün minimal şablon tələb edir. Əsas PCR üsulları sadə DNT və RNT aşkarlanmasından daha da inkişaf etmişdir. Aşağıda, tədqiqat ehtiyaclarınız üçün Enzo Life Sciences-da təqdim etdiyimiz müxtəlif PCR üsulları və reagentlər haqqında ümumi məlumat vermişik. Biz alimlərə növbəti tədqiqat layihələrində istifadə etmək üçün PCR reagentlərinə tez daxil olmaqda kömək etməyi hədəfləyirik!

Standart PCR üçün sizə lazım olan tək şey DNT polimeraza, maqnezium, nukleotidlər, primerlər, gücləndiriləcək DNT şablonu və termocyclerdır. PCR mexanizmi məqsədi qədər sadədir: 1) ikiqat zəncirli DNT (dsDNA) istiliklə denatürasiya olunur, 2) primerlər tək DNT zəncirlərinə uyğunlaşır və 3) primerlər DNT polimeraza tərəfindən uzadılır, nəticədə orijinalın iki nüsxəsi yaranır. DNT ipi. Bir sıra temperatur və vaxtlarda denaturasiya, yumşalma və uzanma prosesi bir gücləndirmə dövrü kimi tanınır. Dövrün hər bir addımı istifadə olunan şablon və primer dəsti üçün optimallaşdırılmalıdır. Bu dövr təxminən 20-40 dəfə təkrarlanır və gücləndirilmiş məhsul daha sonra təhlil edilə bilər. PCR, sonrakı eksperimental istifadə üçün DNT-ni gücləndirmək üçün geniş istifadə olunur. PCR, həmçinin genetik testlərdə və ya patogen DNT-nin aşkarlanmasında tətbiqlərə malikdir.

PCR yüksək həssas üsul olduğundan və tək reaksiyalar üçün çox kiçik həcmlər tələb olunduğundan, bir neçə reaksiya üçün əsas qarışığın hazırlanması tövsiyə olunur. Əsas qarışıq yaxşıca qarışdırılmalı və sonra hər reaksiyanın eyni miqdarda ferment, dNTP və primerlərdən ibarət olmasını təmin edərək reaksiyaların sayına görə bölünməlidir. Enzo Life Sciences kimi bir çox təchizatçı, həmçinin primerlərdən və DNT şablonundan başqa hər şeyi ehtiva edən PCR qarışıqları təklif edir.

Guanin/Sitozinlə zəngin (GC-zəngin) bölgələr standart PCR üsullarında problem yaradır. GC ilə zəngin ardıcıllıqlar aşağı GC məzmunlu ardıcıllıqlardan daha sabitdir. Bundan əlavə, GC ilə zəngin ardıcıllıqlar saç tıxacları kimi ikinci dərəcəli strukturlar əmələ gətirir. Nəticədə, denaturasiya fazası zamanı GC ilə zəngin ikiqat telləri tamamilə ayırmaq çətindir. Nəticədə, DNT polimeraza maneəsiz yeni zəncir sintez edə bilməz. Daha yüksək denaturasiya temperaturu bunu yaxşılaşdıra bilər və daha yüksək yumşalma temperaturuna və daha qısa tavlama müddətinə düzəlişlər GC ilə zəngin primerlərin qeyri-spesifik bağlanmasının qarşısını ala bilər. Əlavə reagentlər GC ilə zəngin ardıcıllığın gücləndirilməsini yaxşılaşdıra bilər. DMSO, qliserin və betain, GC qarşılıqlı təsirindən yaranan ikincil strukturları pozmağa kömək edir və bununla da ikiqat iplərin ayrılmasını asanlaşdırır.


RT-PCR və cDNT sintezi

Əks transkripsiya vasitəsilə bir RNT şablonundan DNT sintezi tamamlayıcı DNT (cDNA) yaradır. Əks transkriptazalar (RT) polimeraza zəncirvari reaksiyası (PZR) üçün şablon kimi birbaşa istifadə oluna bilən birinci zəncir cDNA-nın sintezini istiqamətləndirmək üçün RNT şablonundan və RNT-nin 3&əsas ucunu tamamlayan primerdən istifadə edir. Əks transkripsiyanın və PCR-nin (RT-PCR) bu birləşməsi nümunədə az miqdarda RNT-lərin aşkarlanmasına və müvafiq cDNA-nın istehsalına imkan verir və bununla da aşağı surətli genlərin klonlanmasını asanlaşdırır. Alternativ olaraq, birinci zəncirli cDNT DNT Polimerase I və DNT Ligase istifadə edərək ikiqat zəncirli edilə bilər. Bu reaksiya məhsulları gücləndirilmədən birbaşa klonlama üçün istifadə edilə bilər. Bu halda, ya RT-dən, ya da ekzogen yolla təmin edilən RNase H aktivliyi tələb olunur.

Bir çox RT kommersiya təchizatçılarından əldə edilə bilər. Quş Miyeloblastozu Virusu (AMV) Əks Transkriptaza və Moloney Sıçaq Leykemiya Virusu (M-MuLV, MMLV) Əks Transkriptaza molekulyar biologiya iş axınlarında geniş istifadə olunan RT-lərdir. ProtoScript ® II Əks Transkriptaza azalmış RNase H aktivliyi və artan termostabilliyi olan rekombinant M-MuLV tərs transkriptazadır. O, ilk zəncir cDNA-nı vəhşi tipli M-MuLV-dən daha yüksək temperaturda sintez etmək üçün istifadə edilə bilər. Ferment 50°C-ə qədər aktivdir, daha yüksək spesifiklik, daha yüksək cDNA məhsulu və 12 kb-a qədər uzunluqda olan daha tam uzunluqlu cDNA məhsulu təmin edir.

Mühəndisləşdirilmiş RT-lərin istifadəsi tam uzunluqlu məhsulun formalaşmasının səmərəliliyini artırır, mRNT transkriptinin 5&əsas ucunun surətinin çıxarılmasının tamamlanmasını təmin edir və RNT ardıcıllığının etibarlı DNT nüsxəsinin yayılmasına və səciyyələndirilməsinə imkan verir. Reaksiyaların daha yüksək temperaturda aparıldığı daha termostabil RT-lərin istifadəsi ikinci dərəcəli quruluşa malik RNT-nin tərs transkripsiyası üçün faydalı ola bilər.

Mövcud RT və cDNA Sintezi reagentlərini müqayisə etmək üçün RT/cDNA Sintezi seçim cədvəlimizə baxın.

Növü seçin:

Bu məhsul New England Biolabs, Inc (NEB) şirkətinə məxsus və ya nəzarət edilən bir və ya bir neçə patent, ticarət nişanı və/yaxud müəllif hüquqları ilə əhatə olunur.

NEB məhsullarını müxtəlif tətbiqlər üçün inkişaf etdirib təsdiqləyərkən, bu məhsulun istifadəsi alıcıdan müəyyən proqramlar üçün əlavə üçüncü tərəf əqli mülkiyyət hüquqlarını əldə etməyi tələb edə bilər.

Kommersiya hüquqları haqqında ətraflı məlumat üçün [email protected] ünvanında NEB-in Qlobal Biznes İnkişafı komandası ilə əlaqə saxlayın.

Bu məhsul yalnız tədqiqat məqsədləri üçün nəzərdə tutulub. Bu məhsul insanlarda və ya heyvanlarda terapevtik və ya diaqnostik məqsədlər üçün istifadə edilmək üçün nəzərdə tutulmayıb.


QPCR və RT-qPCR-ə ümumi baxış

Kəmiyyət PCR, əks transkripsiya mərhələsini əhatə edir və ya olmasın, müntəzəm olaraq molekulyar biologiya laboratoriyalarında istifadə olunur və nisbətən sadə boru xətti sayəsində tədqiqatın aparılma tərzində inqilab edib (Şəkil 2). Standart PCR ilə müqayisədə onun üstünlükləri, real vaxt rejimində və agaroza gelə ehtiyac olmadan hansı reaksiyaların işlədiyini görmə qabiliyyətini əhatə edir. O, həm də həqiqətən kəmiyyət təhlilinə imkan verir. qPCR-nin ən ümumi istifadələrindən biri maraq doğuran DNT ardıcıllığının surət nömrəsini təyin etməkdir. Mütləq kəmiyyət hesablamalarından istifadə edərək istifadəçi, əvvəlkindən daha dəqiq şəkildə müəyyən edilmiş konsentrasiyanın standart əyrisinə istinad edərək hədəf nüsxə nömrələrini müəyyən edə bilir. Digər tərəfdən RT-qPCR, model sistemlərin inhibitorlar, stimulantlar, kiçik müdaxilə edən RNT-lər (siRNA) və ya nokaut modelləri və s. ilə müalicəsi zamanı gen ifadəsi dəyişikliklərinin araşdırılmasına imkan verir. RNT-Seq təcrübələrindən əvvəl (keyfiyyətə nəzarət kimi) və sonra (dəyişikliyin təsdiqi).

Standart qPCR və RT-qPCR təcrübəsinin iş axını. Nümunələrin təcrid olunmasından sonra bütövlüyü cDNA generasiyasından və interkalasiya edən boyalardan və ya hidroliz zondlarından istifadə edərək qPCR analizinə başlamazdan əvvəl təhlil edilir. Floresensiya PCR dövrləri boyunca aşkar edilir və məlumatların təhlili zamanı hədəf nümunənin miqdarını təyin etmək üçün istifadə olunan gücləndirmə əyrisi yaratmaq üçün istifadə olunur.

Nümunə hazırlığı

qPCR və RT-qPCR boru kəmərində ən vacib addım, şübhəsiz ki, nümunənin izolyasiyasıdır. Təhlil dizaynınızın nə qədər yaxşı olmasından asılı olmayaraq, başlanğıc material çirklənmiş və ya pisləşmişsə, dəqiq nəticələr əldə etməyəcəksiniz. Keyfiyyətli nümunə keyfiyyətli məlumatların başlanğıc blokudur. qPCR üçün DNT-ni təcrid edərkən onun reaksiyaya mane ola biləcək çirkləndiricilərdən azad olması vacibdir. Çox vaxt hasilat kommersiyada mövcud olan dəstlərdən istifadə etməklə həyata keçirilir ki, bu dəstlərin istifadəçi dostu, sadə və sürətli olması üstünlüyü var, xüsusən də robot sistemi ilə inteqrasiya olunduqda. Həyata keçirilən RNT ekstraksiyasının növü tələb olunan RNT növündən asılıdır. Ən çox istifadə edilən ekstraksiya üsulu ümumi RNT ekstraksiya dəstləridir. Bu, xəbərçi RNT-ni (mRNT zülal sintezinin xəbərçisi), transfer RNT-ni (tRNA ribosomla tərcümə zamanı mRNT-ni deşifrə edir) və ribosomal RNT-ni (rRNT tərcümə zamanı amin turşusu sırasını oxuyur və onları ribosomla əlaqələndirir), lakin tez-tez (həmişə deyil) təcrid edir. ) kodlaşdırmayan RNT (ncRNA funksional RNT DNT-dən transkripsiya edilmiş, lakin zülallara çevrilməmişdir) və mikro RNT (miRNA-lar mRNT tərcüməsini maneə törətməklə gen ifadəsini tənzimləyir) kimi daha kiçik RNT-ləri təcrid edə bilmir. Uzunluğu əhəmiyyətli dərəcədə dəyişə bilən gücləndirici RNT-lərə (enhansatorlardan transkripsiya edilmiş kiçik RNT-lər) marağın partlaması ilə əlaqədar RNT-nin təcrid olunmasını təmin etmək üçün çıxarma üsullarının diqqətlə nəzərdən keçirilməsi vacibdir. Ekstraksiya mülahizələrinə əlavə olaraq, RNT-nin DNT ilə çirklənməməsi vacibdir, çünki bunu qPCR reaksiyasında cDNT-dən ayırmaq mümkün deyil. Bunun öhdəsindən gəlmək üçün əksər protokollar hər hansı DNT-ni həzm edən DNase I müalicəsinin istifadəsinə əsaslanır.

İzolyasiya zamanı nümunənin deqradasiyası həmişə mümkündür. Müvafiq olaraq, istənilən yaxşı boru kəməri nümunənin bütövlüyünü qiymətləndirmək üçün keyfiyyətə nəzarət addımını əhatə edəcəkdir. Bu, A260/280 nisbətini (260 ilə 280 nm-də absorbansın müqayisəsi, zülallarla çirklənmənin ölçüsü) və A260/230 nisbətini (260-a qarşı 230 nm, üzvi çirkləndiricilərin mövcudluğunun göstəricisi) qiymətləndirməklə tez həyata keçirilə bilər. lakin bu, çox dəqiq deyil və bir sıra amillərin müdaxiləsinə məruz qalır. Daha dəqiq ölçü, Aligent Bioanalyser kimi virtual gel elektroforez sisteminin istifadəsidir. Bu sistem RNT-ni ölçüsünə görə ayıran və flüoresan boyalarla RNT-ni aşkar edən çipdən istifadə edərək işləyir. Daha sonra bu, bir alqoritmdən istifadə edərək nümunənin keyfiyyətini təmsil edən RNT tamlıq nömrəsini (RIN) istehsal edən kompüterə tərcümə edilir və 10 ən yüksəkdir.

RT-qPCR üçün nümunənin hazırlanmasında son addım cDNA-nın yaradılmasıdır. cDNA əks transkriptazadan istifadə edərək RNT şablonundan cDNA yaratmaq üçün RT-PCR-dən (Şəkil 1) istifadə edir. Bu, RNT-nin poliA quyruğuna bağlanan oliqo(dT) primerlərindən və ya təsadüfi heksamerlərdən (RNT transkripti boyunca bir neçə nöqtədə bağlanan altı-doqquz baza uzunluğunda olan primerlər) istifadə etməklə edilə bilər. Ümumiyyətlə, iki primerin qarışığı ən yaxşı hesab edilir, çünki o, poliA quyruq RNT (əsasən mRNA) və poliA tərkibli olmayan RNT (tRNT, rRNT və s.) gücləndirilməsinə imkan verir. Əsas mülahizələrə əlavə olaraq, cDNT generasiyası qPCR təcrübəsinin bir hissəsi ola bilər (bir addımlı RT-qPCR adlanır) və ya Şəkil 3-də göstərildiyi kimi qPCR-dən (iki addımlı RT-qPCR) ayrıca yaradıla bilər. bir addımlı RT-qPCR ondan ibarətdir ki, daha az eksperimental variasiya və daha az çirklənmə riski var, eləcə də yüksək məhsuldarlıqlı skrininq imkanı verir, bu seçim adətən klinik müayinə üçün istifadə olunur. Bununla belə, bu o deməkdir ki, nümunə yalnız məhdud sayda istifadə edilə bilər, halbuki iki addımlı RT-qPCR hər nümunə üçün daha çox reaksiya və çevik astarlama seçimlərinə imkan verir və adətən geniş miqyaslı gen ifadə analizi üçün üstünlük verilən seçimdir, lakin daha çox optimallaşdırma tələb edir.


İnsan və siçan eozinofilləri paraqrip virusuna qarşı antiviral aktivliyə malikdir

Respirator viruslar astmanın kəskinləşməsinə səbəb olur. Eozinofillər astması olan xəstələrin 60-70%-nin tənəffüs yollarında əsas leykositlər olduğundan, biz eozinofillərin ağciyərdə ümumi bir tənəffüs virusu olan paraqrip 1-ə təsirini qiymətləndirdik. Ovalbumin sensibilizasiyasından sonra vəhşi tipli siçanların tənəffüs yollarına cəlb edilən eozinofillər həssas olmayan heyvanlarla müqayisədə infeksiyadan 4 gün sonra ağciyərlərdə paraqrip virus RNT-ni əhəmiyyətli dərəcədə azaldıb. Bu antiviral təsir çoxlu hava yolu eozinofilləri (NJ.1726) olan IL-5 transgen siçanlarında da görüldü, lakin transgen eozinofil çatışmazlığı olan siçanlarda (PHIL) və eozinofil çatışmazlığı olan siçanlarla (NJ) kəsişən IL-5 transgen siçanlarında itirildi. .1726-PHIL). Eozinofil peroksidaz çatışmazlığı olan transgen siçanlardan istifadə edərək eozinofil qranul proteini eozinofil peroksidazın itirilməsi eozinofillərin antiviral təsirini azaltmadı. Eozinofil antiviral mexanizmləri də tədqiq edilmişdir in vitro. İzolyasiya edilmiş insan eozinofilləri paraqrip virusunun titrlərini əhəmiyyətli dərəcədə azaldır. Bu təsir virus RNT-nin eozinofil qranul RNazları tərəfindən deqradasiyasını əhatə etməmişdir. Bununla belə, bir azot oksid sintaza inhibitoru ilə müalicə olunan eozinofillər antiviral fəaliyyətini itirdilər, bu da eozinofillərin azot oksidi istehsal etməklə virus infeksiyasını zəiflətdiyini göstərir. Nəticədə, eozinofil azot oksidinin istehsalı hüceyrədaxili flüoresan zondu ilə ölçüldü. Eozinofillər virusa və virusu hiss edən fitri immun reseptorun sintetik agonisti olan Toll-bənzər reseptorun (TLR) 7-yə cavab olaraq azot oksidi istehsal etdi. IFNγ eozinofil TLR7-nin ifadəsini artırdı və TLR7-nin yaratdığı azot oksidi istehsalını gücləndirdi. Bu nəticələr göstərir ki, eozinofillər ağciyərdə viral təmizlənməni təşviq edir və insanlarda respirator virus infeksiyalarına qarşı fitri immun reaksiyalara kömək edir.

İnsan və siçan eozinofilləri azot oksidinin istehsalı və virus infeksiyası üçün çıxılmaz ev sahibi kimi xidmət etməklə paraqrip virusuna qarşı antiviral təsir göstərir, lakin eozinofil dənəvər RNazların və ya eozinofil peroksidazanın istehsalı ilə deyil. Eozinofillər insanlarda tənəffüs yollarının infeksiyalarında kifayət qədər qiymətləndirilməmiş antiviral rola malik ola bilər.

Eozinofillər astmalı xəstələrin təqribən üçdə ikisinin tənəffüs yollarına infiltrasiyada tapılır (1) və tənəffüs yollarının hiperreaktivliyi (2) və tənəffüs yollarının yenidən qurulması (3) ilə eksperimental olaraq əlaqələndirilmişdir. Aydındır ki, bu, eozinofillərin astmada yalnız uyğunlaşmaq qabiliyyətinə malik olmadığı fərziyyəsinə gətirib çıxardı və buna görə də bir çox astma müalicəsi eozinofilik iltihabı azaltmaq üçün nəzərdə tutulub (4-7). Bu strategiya dəyişkən nəticələr verdi. Astma xəstəsi olan bir çox xəstələr maksimal müalicəyə baxmayaraq zəif idarə olunur (8). Astma simptomlarının kəskinləşməsi əhəmiyyətli xəstəliyə, səhiyyə xərclərinə və ölümə səbəb olmaqda davam edir (9, 10). Bundan əlavə, astmanın kəskinləşməsinin ən çox yayılmış səbəbi olan respirator virus infeksiyalarının qarşısının alınması və müalicəsi praktiki olaraq mövcud deyildir (11). Bu çatışmazlıqlar eozinofil biologiyası haqqında məhdud anlayışımızı vurğulayır və astmada tənəffüs yoluxucu virus infeksiyaları zamanı eozinofillərin rolunu müəyyən etməyə çalışan tədqiqatlara səbəb olmuşdur. Məsələn, yüksək sistemli eozinofillərə malik IL-5 transgen siçanlarında vəhşi tipli siçanlar (12) ilə müqayisədə tənəffüs sinsitial virusunun (RSV) daha aşağı titrləri olduğu halda, hava yolu eozinofiliyası olan IL-5 transgen siçanları ilə müqayisədə siçanlarda pnevmoniya virusunun titrləri daha aşağı olmuşdur. idarəetmə ilə (13). Eynilə, ovalbumin sensibilizasiyasından sonra tənəffüs yollarına toplanan eozinofillərin qvineya donuzlarının ağciyərlərində daha az paraqrip 1 virusu ilə əlaqəli olduğunu gördük, baxmayaraq ki, bu təcrübələr eozinofillər üçün səbəb-nəticə rolunu müəyyən etmək üçün nəzərdə tutulmayıb (14). Kollektiv olaraq, bu tədqiqatlar eozinofillərin ağciyərlərdə antiviral toxunulmazlığa töhfə verdiyini göstərir.

Eozinofillər işğalçı virusları Toll-bənzər reseptor (TLR)-liqand qarşılıqlı təsirləri də daxil olmaqla bir neçə mexanizm vasitəsilə aşkar edir (15). TLR7 bir çox respirator viruslar üçün ümumi genomik motiv olan tək zəncirli RNT-ni bağlayır (16). TLR7 liqasiyası miyeloid diferensiallaşmanın birincil cavabı 88 (MyD88) adapter zülalından asılı siqnalizasiyanı tetikler ki, bu da eozinofil antiviral cavabı təşviq edir (12). Bununla belə, eozinofillərin antiviral fəaliyyətindən məsul olan vasitəçilər müzakirə olunur. Eozinofillər aktivləşdikdən sonra antiviral ola biləcək müxtəlif qranul zülalları buraxırlar. Eozinofil katyonik zülal və eozinofildən əldə edilən nörotoksin RNase A super ailəsinin üzvləridir və viral RNT genomlarını deqradasiya edərək virusidal təsir göstərməsi təklif edilir (13, 17, 18). Eozinofil peroksidaza da eozinofil qranullarından ayrılır və antimikrobiyal reaktiv oksigen növlərinin yaranmasına kömək edir (19). Eozinofillərin bütün virusları bu zülallarla və ya unikal mexanizmlərlə hədəf alması əlavə araşdırma tələb edir.

Paraqrip virusu astmanın kəskinləşməsinə səbəb olduğu bilinən bir neçə virusdan biridir (20). Kəskin astmanın kəskinləşməsi zamanı böyüklərin 18%-ə qədərində paraqrip tənəffüs yollarında aşkar edilir (21). Onun yayılması qrip və koronavirusa bənzəyir və böyüklərdə RSV-dən əhəmiyyətli dərəcədə çoxdur. Hər il astmanın kəskinləşməsi üçün təqribən 16 milyon təcili tibbi yardım ziyarətinin baş verdiyini nəzərə alsaq (22), paraqripin səbəb olduğu kəskinləşmələr xəstəliyin əhəmiyyətli bir yükünü təşkil edir, lakin paraqrip virusu və eozinofillər arasında qarşılıqlı əlaqə aydın şəkildə müəyyən edilməmişdir.

Bu işdə eozinofillərin ağciyərlərdə paraqrip virusu infeksiyasını maneə törətdiyi fərziyyəsini araşdırdıq. Burada təsvir edilən təcrübələr eozinofillərin paraqrip virusunun təmizlənməsinə təsirini qiymətləndirdi. in vivo və potensial antiviral vasitəçilərin rolunu qiymətləndirdi. Biz həmçinin IFNγ-nın eozinofillərin antiviral reaksiyalarına təsirini eozinofil vasitəçiliyi ilə antiviral fəaliyyəti artırmaq üçün potensial mexanizm kimi araşdırdıq.

Tənəffüs yolu epitelində IL-5-i ifadə edən siçanlar (NJ.1726) (23), eozinofil çatışmazlığı olan siçanlar (PHIL) (24) və eozinofil peroksidaz çatışmazlığı olan siçanlar (25) C57BL/6 fonunda arxa keçidlə saxlanılmışdır. Heyvanlar ABŞ-ın Heyvanların Rifahı Aktına uyğun olaraq rəftar edildi. Protokollar Oreqon Sağlamlıq və Elm Universitetinin (Portland, OR) və Mayo Klinikasının (Scottsdale, AZ) İnstitusional Heyvan Baxımı və İstifadə Komitələri tərəfindən təsdiq edilmişdir.

Paraqrip virusu (Sendai virus ATCC, Manassas, VA) rhesus meymun böyrəyinin (RMK) hüceyrə monolaylarında yetişdirilmiş, saxaroza sıxlığının sentrifuqalanması ilə təmizlənmiş və RMK hüceyrələrində titrlənmişdir (26) (görmək onlayn M materialları və M üsulları). Titrlər 50% toxuma mədəniyyətinin yoluxucu dozasının (TCID50 RMK monolaylarının 50%-ni yoluxdurmaq üçün lazım olan virus miqdarı).

6-8 həftəlik dişi siçanlar 1 və 14-cü günlərdə müvafiq olaraq 0,04 μg və 0,2 μg ovalbumin (Sigma, St. Louis, MO) ilə peritondaxili inyeksiya ilə həssaslaşdırıldı. 24, 26 və 28-ci günlərdə siçanlar ketamin (45 mq/kq) və ksilazin (8 mq/kq) ilə anesteziya edilib və intratrakeal 2% ovalbuminlə sınaqdan keçirilib. Siçanlar parainfluenza (2.8 × 10 4 TCID50 Vahidlər) 27-ci gündə intranazal. 31-ci gündə ağciyərlər yuyuldu və homogenləşdirildi (görmək onlayn M materialları və M üsulları).

Ağciyər homogenatlarında paraqrip matrix protein RNT-si real vaxt rejimində RT-PCR ilə gücləndirilmiş və 18S-ə qədər normallaşdırılmışdır. Nisbi RNT ifadəsi parainfluenza RNT standart əyrisindən istifadə edərək mütləq RNT replikatlarına çevrildi (görmək onlayn M materialları və M üsulları).

Eozinofillər Ficoll-Paque Plus (Sigma) və mənfi seçimdən istifadə edərək sıxlıq sentrifuqasiyası ilə sağlam insan könüllülərinin qanından 99%-dən çox təmizliyə və 99%-dən çox canlılığa qədər təcrid edilmişdir.görmək onlayn M materialları və M üsulları). Protokol İnstitusional Nəzarət Şurası tərəfindən təsdiq edilmişdir. Subyektlər yazılı məlumatlandırılmış razılıq verdilər.

İnsan eozinofilləri gecə ərzində IFNγ (300 U/ml) ilə və ya olmadan inkubasiya edilmişdir. Orta çıxarıldı və parainfluenza (1 × 10 5 TCID50) 2 saat əlavə edildi. Bəzi mədəniyyətlər azot oksid sintaza inhibitoru, Nω-Nitro-L-arginin metil ester hidroxlorid ([ l) ilə əvvəlcədən müalicə edilmişdir. -NAME] 100 μM Sigma) peyvənddən 30 dəqiqə əvvəl. RMK hüceyrələrində virus infeksiyası hemadsorbsiya analizi ilə ölçüldü. Yoluxucu titrlər TCID kimi ifadə edilir50 U/ml mədəniyyət supernatantı.

İnsan eozinofilləri azot oksidi aşkar edən flüoresan zond (Strem, Newburyport, MA) ilə yüklənmiş və paraqrip və ya sintetik TLR7 agonistinə məruz qalmışdır. görmək onlayn M materialları və M üsulları. Floresans 60 dəqiqə sonra boşqab oxuyucusu ilə ölçüldü.

İnsan eozinofilləri parainfluenza (1 × 10 5 TCID) ilə aşılanmışdır.50) 2 saat ərzində yuyulur, bağlanmamış virusu çıxarmaq üçün yuyulur və təzə mühitdə 72 saat saxlanılır. Mədəniyyət supernatantlarında virus RNT-si real vaxt rejimində RT-PCR ilə hər 24 saatdan bir ölçüldü (görmək onlayn M materialları və M üsulları).

Eozinofil TLR7 ifadəsi real vaxt rejimində RT-PCR və immunofluoressensiya ilə qiymətləndirilmişdir (görmək onlayn M materialları və M üsulları).

Məlumatlar Bonferroni ilə birtərəfli ANOVA istifadə edərək müqayisə edildi post hoc test. Məlumatlar orta (±SEM) kimi təqdim olunur. A P 0,05-dən aşağı qiymət əhəmiyyətli hesab edilmişdir.

Həssaslaşdırılan və ovalbuminlə sınaqdan keçirilmiş C57BL/6 siçanları infeksiyadan 4 gün sonra ağciyərlərdə həssas olmayan heyvanlarla müqayisədə paraqrip virus RNT-ni əhəmiyyətli dərəcədə azaldıb (~90%) (Şəkil 1A). Ovalbumin sensibilizasiyası və çağırış bronxoalveolyar yuyulma mayesində eozinofillərin, həmçinin makrofaqların və neytrofillərin əhəmiyyətli dərəcədə artmasına səbəb oldu (Şəkil 1B).

Şəkil 1. Ovalbumin həssaslığı və problem ağciyərlərdə paraqrip virusu infeksiyasının təmizlənməsini artırır in vivo. (A) C57BL/6 siçanları həssaslaşdırıldı (intraperitoneal, 1 və 14-cü günlər) və ovalbuminlə sınaqdan keçirildi (traxeyadaxili, 24, 26 və 28-ci günlər) və paraqrip virusu ilə yoluxdular (intranazal, 27-ci gün). Paraqrip virusunun RNT-si infeksiyadan 4 gün sonra real vaxt rejimində RT-PCR ilə ölçüldü. Həssaslaşdırılmış və problemli siçanlar, həssaslaşmamış, paraqriplə yoluxmuş nəzarət siçanları ilə müqayisədə ağciyərdə paraqrip RNT-ni əhəmiyyətli dərəcədə azaltmışdır. (B) Ovalbumin sensibilizasiyası və çağırış bronxoalveolyar yuyulma mayesində ümumi iltihab hüceyrələrini, makrofaqları (MΦ), eozinofilləri (Eos) və neytrofilləri (Neut) həssaslaşdırılmamış nəzarətlərlə müqayisədə artırdı. Qruplar arasında limfositlərdə (limfa) heç bir fərq yox idi (n = 5). *P < 0.05 qeyri-sensibilizasiya edilmiş, paraqriplə yoluxmuş nəzarət siçanları ilə müqayisədə. Məlumatlar vasitə kimi təqdim olunur (±SEM).

NJ.1726 siçanlar (↑Eos ↑IL-5) konstitutiv olaraq ağciyər epitelində IL-5-i ifadə edir və ağciyərlərdə yüksək sayda eozinofillərə malikdir (23). İnfeksiyadan 4 gün sonra NJ.1726 siçanlarının ağciyərlərində paraqrip RNT-si vəhşi tipli zibil nəzarətləri ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır (Şəkil 2A). NJ.1726 IL-5 transgen siçanları, eozinofillərin təsirini IL-5-dən fərqləndirmək üçün anadangəlmə eozinofillərdən məhrum olan PHIL siçanları (ØEos) ilə çarpazlaşdırılmışdır. IL-5 ifadə edən eozinofil çatışmazlığı olan NJ.1726-PHIL siçanlarının (ØEos ↑IL-5) ağciyərlərində paraqrip RNT tərkibi yoluxmuş vəhşi tipli siçanlarla oxşar idi və bu, IL-5 deyil, eozinofillərin vasitəçilik etdiyini göstərir. antiviral təsir göstərir. Eynilə, yalnız eozinofil çatışmazlığı olan PHIL siçanlarında yoluxmuş vəhşi tipli siçanlarla müqayisə edilə bilən paraqrip RNT səviyyələri var idi (Şəkil 2A). Bronxoalveolyar lavaj NJ.1726 siçanlarının hava yollarında eozinofillərin vəhşi tipli zibil nəzarətləri ilə müqayisədə əhəmiyyətli artımını və PHIL və NJ.1726-PHIL siçanlarında eozinofillərin olmadığını təsdiqlədi (Şəkil 2B). Qruplar arasında bronxoalveolar yuyulmada ümumi leykositlər və ya digər iltihablı hüceyrə alt qruplarında əhəmiyyətli fərqlər yox idi (Şəkil 2C).

Şəkil 2. Eozinofillər fare ağciyərində paraqrip virusunun təmizlənməsini təşviq edir in vivo. Vəhşi tipli (WT) nəzarət siçanları (C57BL/6), ağciyər spesifik promotoru (NJ.1726 ↑Eos ↑IL-5) tərəfindən IL-5-in həddindən artıq ifadəsi səbəbindən yüksək ağciyər eozinofilləri olan transgenik siçanlar, yüksək ağciyərli transgenik siçanlar IL-5, lakin eozinofillərdən məhrum (NJ.1726-PHIL ØEos ↑IL-5) və eozinofil çatışmazlığı olan siçanlar (PHIL transgenik siçanlar ØEos) paraqrip virusu (intranazal) ilə yoluxmuşdur. (A) Ağciyərdə paraqrip RNT tərkibi infeksiyadan 4 gün sonra real vaxt rejimində RT-PCR ilə ölçüldü. NJ.1726 siçanları (↑Eos ↑IL-5) nəzarət siçanları (WT) ilə müqayisədə paraqrip RNT-ni əhəmiyyətli dərəcədə azaltmışdır. NJ.1726-PHIL siçanlarında (ØEos ↑IL-5) və PHIL siçanlarında (ØEos) WT ilə müqayisə edilə bilən paraqrip RNT səviyyələri var idi. (B) Paraqriplə yoluxmuş NJ.1726 siçanlarından bronxoalveolyar yuyulma (↑Eos ↑IL-5) bütün digər qruplarla müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə daha çox eozinofil ehtiva edirdi. PHIL (ØEos) və ya NJ.1726-PHIL siçanlarında (ØEos ↑IL-5) bronxoalveolyar lavajda eozinofillər aşkar edilməmişdir. (C) Qruplar arasında digər iltihab hüceyrə tiplərində heç bir fərq yox idi (n = 7–10). *P < 0,05. Məlumatlar vasitə kimi təqdim olunur (±SEM).

Eozinofil peroksidaza eozinofillər tərəfindən sərbəst buraxılan qranul proteindir. Vəhşi tipli və transgenik eozinofil peroksidaz çatışmazlığı olan siçanlar həssaslaşdırıldı və ovalbuminlə sınaqdan keçirildi və paraqrip virusu ilə yoluxdu. Paraqrip virusunun RNT-si infeksiyadan 4 gün sonra homogenləşdirilmiş ağciyərdən real vaxt rejimində RT-PCR ilə ölçüldü. Ovalbumin sensibilizasiyası və problemi qeyri-sensibilizasiya edilmiş nəzarətlərlə müqayisədə həm yabanı tipli, həm də eozinofil peroksidaza çatışmazlığı olan siçanlarda əhəmiyyətli dərəcədə azalmış paraqrip RNT ilə əlaqələndirilmişdir (Şəkil 3A), eozinofilin vasitəçiliyi ilə antiviral təsirin eozinofil peroksidazın sərbəst buraxılmasından asılı olmadığını göstərir. Həssaslaşdırılmış və problemli vəhşi tip və eozinofil peroksidaza çatışmazlığı olan siçanlar, həssaslaşmamış vəhşi tip və eozinofil peroksidaza çatışmazlığı olan siçanlara nisbətən hava yolu eozinofillərini əhəmiyyətli dərəcədə yüksəltmişdir (Şəkil 3B və 3C).

Şəkil 3. Eozinofillərin antiviral təsiri üçün eozinofil peroksidaza tələb olunmur in vivo. (A) WT siçanları və eozinofil peroksidaz nokaut siçanları (EPX −/− ) həssaslaşdırılıb və ovalbuminlə sınaqdan keçirilib (S/C) və paraqrip virusu ilə yoluxmuşlar. Viral RNT infeksiyadan 4 gün sonra real vaxt rejimində RT-PCR ilə ölçüldü. Həssaslaşdırılan və etiraz edilən WT (WT S/C) və EPX −/− siçanları (EPX −/− S/C) həssaslaşdırılmamış, paraqriplə yoluxmuş nəzarət siçanları ilə müqayisədə ağciyərdə paraqrip RNT-ni əhəmiyyətli dərəcədə azaldıb. (B) Ovalbumin sensibilizasiyası və çağırış WT və EPX −/− siçanlarda bronxoalveolyar yuyucu mayedə eozinofilləri artırdı. (C) Qruplar arasında digər iltihab hüceyrə tiplərində heç bir fərq yox idi (n = 4–5). *P < 0,05. Məlumatlar vasitə kimi təqdim olunur (±SEM).

İzolyasiya edilmiş insan eozinofilləri 2 saat ərzində paraqriplə aşılanmış, sonra bağlanmamış virusu çıxarmaq üçün yuyulmuş və paraqripin birbaşa eozinofillərə yoluxduğunu və əgər belədirsə, eozinofillərin virus nəslinin istehsalını dəstəklədiyini qiymətləndirmək üçün təzə mühitdə 72 saat ərzində becərilmişdir. Mədəniyyət supernatantlarından real vaxt rejimində RT-PCR ilə ölçülən paraqrip RNT-si 72 saat ərzində tədricən artmışdır (Şəkil 4, sol ox), virusun eozinofilləri yoluxdurmaq və virus transkriptləri istehsal etmək qabiliyyətinə malik olduğunu göstərir. Bununla belə, replikasiyaya baxmayaraq, hemadsorbsiya analizi ilə müəyyən edilən paraqrip virusunun titrləri bu zaman nöqtələrində aşkar edilmirdi (Şəkil 4, sağ ox), eozinofillərin yoluxucu virusun istehsalını dəstəkləmədiyini göstərir.

Şəkil 4. Paraqriplə yoluxmuş eozinofillər yoluxucu olmayan viral nəsillər əmələ gətirir. İnsan eozinofilləri periferik qandan təcrid olunmuş və 2 saat ərzində paraqrip virusu ilə yoluxmuş, bağlanmamış virusu çıxarmaq üçün yuyulmuş və kulturada 72 saat saxlanılmışdır. Eozinofil supernatantlarından paraqrip RNT-si hər 24 saatdan bir real vaxt rejimində RT-PCR ilə ölçüldü (bərk kvadrat, sol ox). Eyni zamanda, yoluxucu paraqrip virusunun titrləri rhesus meymun böyrək hüceyrələrindən istifadə edərək hemadsorbsiya analizi ilə qiymətləndirilmiş və 50% toxuma mədəniyyətinin yoluxucu dozası (TCID) kimi ifadə edilmişdir.50) U/ml (açıq dairə, sağ ox) (n = 4). Məlumatlar vasitə kimi təqdim olunur (±SEM).

Üç paraqrip virusunun struktur zülalını (yəni, matriks zülalı, füzyon zülalı və nukleoproteini) kodlayan RNT səviyyələri virusla yoluxmuş eozinofil kulturaları və virusa yoluxmuş mühitlər ilə kulturalar arasında inokulyasiyadan 2 saat sonra eozinofilin vasitəçiliyi ilə antiviral təsirin olub olmadığını müəyyən etmək üçün müqayisə edildi. eozinofil qranul RNazlarının sərbəst buraxılması nəticəsində baş verir. Parainfluenza virus titrləri eyni zamanda hemadsorbsiya analizi ilə RMK hüceyrələrində bu zaman qiymətləndirilmişdir. Eozinofillər eozinofilləri olmayan virusla aşılanmış kulturalarla müqayisədə paraqrip virusunun titrlərini əhəmiyyətli dərəcədə azaldıb, eozinofillərin paraqrip virusunun yoluxuculuğunu azaltdığını göstərir (Şəkil 5A). Eozinofillər IFNγ ilə əvvəlcədən müalicə edildikdə virus titrlərində daha da azalma müşahidə edildi. Bununla belə, hər üç paraqrip virusunun struktur zülalları üçün RNT miqdarı virusla yoluxmuş eozinofillər və eozinofilləri olmayan virusla aşılanmış kulturalar arasında oxşar idi (Şəkil 5B), bu, infeksiyanın azalmasının viral RNT genomunun deqradasiyası ilə bağlı olmadığını nümayiş etdirir. eozinofil qranul RNases tərəfindən.

Şəkil 5. Eozinofillərin paraqripə qarşı antiviral fəaliyyəti qranul RNazları əhatə etmir. İnsan eozinofilləri periferik qandan təcrid olunmuş və paraqrip virusu ilə yoluxmuşdur. (A) Viral yoluxuculuq inokulyasiyadan 2 saat sonra hemadsorbsiya analizi ilə qiymətləndirilmiş və viral TCID kimi ifadə edilmişdir.50 U/ml. Paraqrip yoluxuculuğu becərilmiş eozinofillərin (Eos) və IFNγ (Eos + IFNγ) ilə əvvəlcədən müalicə edilmiş eozinofillərin supernatantlarında eozinofillər (Media + IFNγ) olmayan mühitlərdə becərilmiş paraqrip virusu ilə müqayisədə demək olar ki, aşkar edilməmişdir. (B) Paraqrip virusunun struktur zülallarını, matrisi, füzyonu və nukleoproteini (NP) kodlayan RNT inokulyasiyadan 2 saat sonra real vaxt rejimində RT-PCR vasitəsilə eozinofil supernatantlarında ölçüldü. Üç genin heç biri arasında heç bir fərq aşkar edilmədi və bu, paraqrip yoluxuculuğun azalmasının eozinofil qranul RNazları tərəfindən viral RNT deqradasiyası ilə bağlı olmadığını göstərir.n = 4–7). *P < 0,05. Məlumatlar vasitə kimi təqdim olunur (±SEM).

Paraqrip virusu təcrid olunmuş insan eozinofillərinin iştirakı ilə 2 saat ərzində inkubasiya edildi və sonra virus infeksiyası RMK hüceyrələrində titrləmə ilə (hemadsorbsiya analizi ilə) ölçüldü. Şəkil 6A-da göstərildiyi kimi, eozinofillər eozinofilsiz mühitdə inkubasiya edilmiş paraqriplə müqayisədə paraqrip virusunun titrlərini əhəmiyyətli dərəcədə azaldır. Eozinofillər nitrik oksid sintaza inhibitoru ilə becərildi, l -NAME, eozinofil vasitəçiliyi ilə antiviral təsirin azot oksidi istehsalına bağlı olub olmadığını müəyyən etmək üçün. l ilə müalicə olunan eozinofillər -NAME lost their ability to reduce virus titers, indicating that, upon exposure to virus, eosinophils attenuate viral infectivity through the production of nitric oxide ( Figure 6A ). The quantity of nitric oxide produced by eosinophils was evaluated with a copper-conjugated intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe 1 hour after addition of virus. Eosinophils exposed to parainfluenza virus had significantly increased fluorescence, indicating that eosinophils produce nitric oxide in response to parainfluenza infection. This increased fluorescence was blocked by l -NAME, confirming that nitric oxide was the mediator responsible ( Figures 6B and 6C ).

Şəkil 6. Eosinophil-derived nitric oxide reduces parainfluenza virus infectivity. Human eosinophils isolated from peripheral blood were cultured overnight with IFNγ. (A) Eosinophils were treated with the nitric oxide synthase inhibitor Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride ( l -NAME 100 μM) or vehicle for 30 minutes, then infected with parainfluenza virus. Virus infectivity was quantified 2 hours after infection by hemadsorption assay and expressed as viral TCID50 U/ml. Parainfluenza virus infectivity was significantly decreased in the presence of eosinophils. Eosinophils treated with l -NAME lost their antiviral activity (n = 4). (B) Nitric oxide production was assessed using an intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe. Eosinophils loaded with the probe were treated with l -NAME or vehicle and infected with parainfluenza for 1 hour. Eosinophil fluorescence increased significantly in response to parainfluenza infection, indicating an increase in nitric oxide production by eosinophils. l -NAME treatment prevented parainfluenza-induced nitric oxide production by eosinophils (n = 4). (C) Representative images of eosinophils loaded with nitric oxide–detecting fluorophore. Magnification, ×100. *P < 0.05. Data are presented as means (±SEM).

Eosinophils were cultured with or without IFNγ overnight. IFNγ increased eosinophil TLR7 expression relative to unstimulated eosinophils, both quantitatively by real-time RT-PCR ( Figure 7A ) and qualitatively by immunostaining ( Figure 7B ). Eosinophils’ response to TLR7 agonist was also evaluated with a nitric oxide–detecting fluorescent probe. Eosinophils treated for 1 hour with the synthetic TLR7 agonist, R837, had significantly increased fluorescence compared with vehicle-treated controls, indicating that TLR7 agonist induces nitric oxide production ( Figures 7C and 7D ). R837-mediated nitric oxide production was potentiated in eosinophils exposed to IFNγ. l -NAME and the oligonucleotide TLR7 antagonist, IRS661, but not a control oligonucleotide, blocked R837-induced nitric oxide production.

Şəkil 7. IFNγ up-regulates Toll-like receptor 7 (TLR7) expression and potentiates TLR7-induced nitric oxide production in eosinophils. Human eosinophils were isolated from peripheral blood and grown in culture. (A) TLR7 expression was quantified by real-time RT-PCR from eosinophils treated with or without IFNγ. TLR7 RNA was significantly increased in eosinophils treated with IFNγ compared with untreated eosinophils (n = 5). (B) Eosinophils were immunostained with antibodies against TLR7 (yaşıl), and nuclei were labeled with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (mavi). TLR7 was expressed in unstimulated (−IFNγ) and IFNγ stimulated (+IFNγ) eosinophils. Images obtained with an LSM780 confocal microscope (numerical aperture 1.4 Zeiss, Thornwood, NY). (C) Eosinophils were loaded with an intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe and stimulated with synthetic TLR7 agonist R837. Eosinophil fluorescence increased in response to R837. IFNγ pretreatment potentiated the R837-induced increase in fluorescence. R837-induced fluorescence was blocked by l -NAME and by the oligonucleotide TLR7 antagonist IRS661, but not by a control oligonucleotide (IRS control) (n = 6). (D) Representative images of eosinophils loaded with nitric oxide–detecting fluorophore. Magnification, ×100. *P < 0.05 compared with no IFNγ control. # P < 0.05 compared with all other groups, except between IFNγ-treated R837 and R837 + IRS control. Data are presented as means (±SEM).

Our results demonstrate a significant antiviral effect of eosinophils on parainfluenza virus infection in mouse airways in vivo and in isolated human eosinophils in vitro. Eosinophils appear to mediate their antiviral effects via both passive and proactive mechanisms. Specifically, our data show that eosinophils are a “dead-end” cellular host for parainfluenza, failing to propagate infectious viral progeny after infection. Thus, elevated eosinophil numbers in the lung may passively disrupt airway infection by acting as a cellular decoy and/or “sink,” interfering with the progressive expansion of viral numbers during infection. Our data also show that eosinophils proactively mediated antiviral activities through the production of nitric oxide and up-regulation of TLR7. In contrast, we did not find evidence that eosinophils directly attenuate parainfluenza through the release of eosinophil peroxidase or by degrading the viral RNA genome through the release of granule RNases.

These findings expand on prior eosinophil studies (12–14, 17, 18, 27) by establishing an antiviral role for eosinophils against parainfluenza virus, while suggesting that key differences exist in the eosinophils’ antiviral mechanisms against different viruses. Previous studies proposed that eosinophils inhibit RSV and pneumonia virus in mice, in part via the degradation of viral RNA genomes by eosinophils’ granule RNases, eosinophil cationic protein, and eosinophil-derived neurotoxin (13, 17, 18). However, we found that eosinophils did not alter the quantity of viral RNA transcripts for three key parainfluenza virus structural proteins (i.e., matrix, fusion, and nucleoprotein), despite causing a substantial reduction in parainfluenza infectivity, titered in RMK cells by hemadsorption assay. This suggests that eosinophils do not inhibit parainfluenza through RNase activity on the viral genome. Importantly, our methods differed from prior studies by quantifying both viral RNA and infectivity compared with only assessing viral infectivity after treating infected eosinophils with RNase inhibitors. Concurrent measurement of viral RNA levels and infectivity led to the additional finding that, although human eosinophils infected with parainfluenza produce viral RNA, these viral progeny are not infectious. This phenomenon, termed an “abortive” infection, has been described for many viruses, including RSV (28) and coronavirus (29) in macrophages, and influenza A in neutrophils (30), as well as for parainfluenza virus in Madin-Darby bovine kidney cells (31) and chick embryo fibroblasts (32). Evidence suggests that specific virus and host cell characteristics impact productive versus abortive outcomes during virus infections (33), but those characteristics require further investigation.

Eosinophils also inhibit parainfluenza through the production of nitric oxide. Previously, systemic suppression of nitric oxide production using an inhibitor of nitric oxide synthase delayed clearance of RSV in wild-type mice and in IL-5 transgenic animals with systemic eosinophilia in vivo (12, 34). Given the widespread expression of nitric oxide synthases, however, these studies were unable to distinguish the specific role of eosinophil-derived nitric oxide, which our study has elucidated. The ability of eosinophils to produce nitric oxide has been suspected for some time, given the presence of both constitutive and inducible nitric oxide synthase isoforms in eosinophils (35), but detecting nitric oxide has historically been challenging due to its short half-life and rapid diffusion across biologic membranes (36). These issues were overcome by using a copper-conjugated intracellularly retained fluorescent probe. We found that eosinophils generate nitric oxide in response to virus infection, and in response to stimulation with synthetic TLR7 agonist. IFNγ potentiated TLR7-mediated nitric oxide production in eosinophils, likely in part through the up-regulation of TLR7 expression. Thus, our results show that antiviral cytokine signaling augments eosinophils’ viral detection and their antiviral nitric oxide response.

Nitric oxide mediates antiviral effects via the production of a variety of reactive nitrogen products that inhibit viral proteases (37), and alter host cell function through nitrosylation of tyrosine and thiol groups (38). The consequences of these nitrogen species are diverse, ranging from inhibition of virus protein and RNA synthesis to potentiation of inflammation and injury to the respiratory tract (39). Nitric oxide also regulates many other physiologic processes, including eosinophil migration (40) and survival (41, 42), airway epithelial cell ciliary motility (43), and airway caliber through airway smooth muscle relaxation (44). Eosinophil-derived nitric oxide may affect multiple functions in the airway beyond what our experiments were designed to assess.

Eosinophils’ attenuation of parainfluenza virus infection was not dependent on the release of eosinophil peroxidase. Eosinophil peroxidase is a granule protein that, together with the respiratory burst from activated eosinophils, generates potent reactive oxygen species that have been suggested to contribute to host immune defense (45). For example, eosinophil peroxidase has been shown to have virucidal effects against human immunodeficiency virus in vitro (46). However, the role of eosinophil peroxidase in vivo as a host defense mechanism remains unclear. Eosinophil peroxidase deficiency had no effect in an experimental model of helminthic parasite infections in mice (47), and its deficiency has also been detected in humans without manifesting an apparent phenotype (48). Our data further suggest that eosinophil peroxidase has no role in eosinophils’ antiviral activity against parainfluenza.

Importantly, our experiments differentiate the effects of eosinophils’ versus IL-5. Although NJ.1726 IL-5 transgenic mice (↑Eos ↑IL-5) with an abundance of airway eosinophils had reduced parainfluenza virus in the lung, NJ.1726-PHIL mice (ØEos ↑IL-5) with elevated IL-5 in the absence of eosinophils did not. This is pertinent given the presence of IL-5 receptors on leukocytes other than eosinophils, including macrophages and neutrophils (49), which could have contributed to the antiviral effect in vivo. Furthermore, our data demonstrate that, although an induced airway eosinophilia promoted viral clearance, clearance of virus was similar for eosinophil-deficient mice relative to wild-type control animals. This suggests that the presence of a specific airway eosinophilia mediates one or more unique antiviral mechanisms not occurring at homeostatic baseline, and underlines the need for better characterization of asthma phenotypes when evaluating respiratory virus infections in humans.

Human studies have historically been confounded by the heterogeneity of asthma phenotypes (50), the need for invasive bronchoscopic testing, the immune effects of corticosteroid treatment, differences in virus detection methods (i.e., PCR, ELISA, culture) and the variety of respiratory viruses that cause asthma exacerbations (20). Recent trials that studied exacerbation rates in well characterized steroid-resistant eosinophilic subjects with asthma treated with mepolizumab, a monoclonal antibody against IL-5, found no difference in the incidence of respiratory tract infections (4, 5). However, airway infections were rare events, and were diagnosed clinically without objective evidence of the presence of an infecting virus. Furthermore, these trials did not quantify airway and lung parenchymal eosinophils, nor did they characterize the eosinophils’ activation state after treatment. Nonetheless, future studies that define the interaction between eosinophils and viruses may lead to novel treatment targets for eosinophilic asthma and for respiratory virus infections in humans.

The results of our study paradoxically suggest that eosinophils have beneficial antiviral effects during respiratory virus infections despite considerable evidence linking viruses to asthma exacerbations (20, 21). However, we cannot conclude that eosinophils’ antiviral effects result in fewer exacerbations. On the contrary, it is possible, and perhaps likely, that eosinophils’ ability to detect and respond to viruses promotes an exuberant, and ultimately detrimental, airway inflammatory response in subjects with asthma. Although our study did not specifically address airway physiology, Adamko and colleagues (14) found that eosinophils mediate virus-induced airway hyperreactivity in sensitized guinea pigs, and were associated with lower viral titers, yet lower viral titers did not improve airway hyperreactivity. Thus, the negative effects of activated eosinophils’ in the airway may mask any positive impact from fewer viral transcripts. Consequently, as therapies become progressively more targeted against pulmonary eosinophils, there will be an even greater need for understanding the complexity of eosinophil biology in the lungs.


Advantages & Limitations of scRNA-Seq Assays

scRNA-Seq is a very powerful method that allows transcriptomic analysis of heterogeneous tissue, or dynamic processes in one single experiment. Without microdissection or FACS-sorting, samples can be directly prepared for the scRNA-Seq protocol. Depending on the number of cells and the sequencing depth, scRNA-Seq can be very sensitive and detect a population representing less than 1% of the total population.

Because of the quantity of information generated by scRNA-Seq, some of the protocol steps have to be handled with care. The preparation of the single-cell solution can be challenging especially for tissues or cells surrounded by an extracellular matrix. The protocols used to isolate these cells can by themselves modify the transcriptome and the sequencing data could be the result of these manipulations instead of an endogenous cellular process. In contrast, for bulk RNA-Seq, tissues can be directly lysed in trizol, freezing the transcriptome at the very first step of the extraction. scRNA-Seq identifies fewer transcripts than bulk RNA-Seq and this imperfect coverage can lead to a biased quantification. However, this flaw can be corrected by bioinformatic analysis. Finally, most scRNA-Seq protocols only focus on poly-A RNAs, which excludes all non-coding RNAs.

scRNA-Seq is more expensive and more time-consuming than bulk RNA-Seq but in one experiment, you obtain the transcriptome profile of several populations.


Pulmonary Adenocarcinoma—Pathology and Molecular Testing

Prodipto Pal MD, PhD , . Ming-Sound Tsao MD, FRCPC , in Pulmonary Adenocarcinoma: Approaches to Treatment , 2019

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) is feasible in clinical laboratories, however, with its own set of challenges. As noted earlier, ALK rearrangement has many different candidate fusion partners, even for the ALK-EML4, the most common fusion in NSCLC, there are many fusion variants, largely due to different breakpoint regions on EML4, thus would require a multiplexed approach. However, with RT-PCR-based methods, a priori knowledge of the candidate fusion genes is needed to identify fusion variants which can later be confirmed by subsequent sequencing 101 and has been used in studies with high level of sensitivity albeit with varying level of specificity (85%–100%) compared with FISH. 102,103 A negative result by RT-PCR requires appropriate caution due to the potential of false-negative results due to the missing unknown fusion variants. In addition, RT-PCR assays are dependent on procuring high-quality RNA from FFPE tissue. Newer RNA-based assays are under active development (assays such as NanoString system) that can simultaneously detect various fusion partners as well as offer the added advantage of detecting other driver fusion-type alterations in a multiplexed setup (such as ROS1, RET, etc.). 104–106


Nəticələr

In summary, we described an alternative method using Real-Time RT-PCR to determine the rate of mRNA degradation by accurately measuring the number of mRNA molecules relative to total RNA. Using this approach, we obtained a values for the β-actin mRNA half-life in Nalm-6 cells that are comparable to those estimated from Northern blot studies using normal human leukocytes [13]. Therefore, Real-Time RT-PCR is a reliable method for measuring mRNA half-life. Because of its sensitivity, half-life of mRNAs expressed at very low level can be determined in cases in which Northern blots may not be sensitive enough. The length of the amplified fragment is important to determine the mRNA half-life because incomplete or degraded mRNA can interfere with the measurement of the actual mRNA half-life. Ideally, full-length cDNA molecules should be amplified to ensure integrity and identity of the mRNA species. The use of the fluorogenic SYBR Green I dye limits the length of the amplified product (cDNA recommended to be less than 200 bp). However, the use of TaqMan ® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), molecular beacons (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA), or fluorescence resonance energy transfer (FRET) probes (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) could overcome this limitation and allow amplification of longer PCR products. In addition, since multiplex Real-Time RT-PCR can be achieved in the same reaction tube using different fluorogenic dyes, this method could be modified to simultaneously estimate mRNA half-life of several genes. Thus, our approach represents a rapid and sensitive assay to determine mRNA half-life.


Sars-CoV-2 RNA on surfaces poor indicator of quantity, timing of previous contamination

Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Transmission electron micrograph of SARS-CoV-2 virus particles, isolated from a patient. Image captured and color-enhanced at the NIAID Integrated Research Facility (IRF) in Fort Detrick, Maryland. Credit: National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH

A team of UK investigators has shown that RNA copies recovered from surfaces are a poor indicator for determining the numbers of viable SARS-CoV-2 virus particles.

The research, published in Tətbiqi və Ətraf Mühitin Mikrobiologiyası, a publication of the American Society for Microbiology, found that a common UK isolate of SARS-CoV-2 that may have initially contaminated surfaces in the general environment became undetectable within 48 hours. The isolate of SARS-CoV-2 remained viable for more than twice as long on hydrophobic surfaces as on hydrophilic surfaces.

The materials tested in the study were representative of those in personal protective equipment, as well as high hand-touch sites such as stainless steel.

An impediment to determining how long SARS-CoV-2 remains viable on different surfaces has been that in most cases, viable virus that has landed on surfaces is rarely detected, according to corresponding author Thomas Pottage, BSc, Senior Project Leader—Biosafety and Bioresponse, Public Health England, Porton Down, UK. However, many studies have used reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) successfully to detect viral RNA and use this as an indicator of how much of the virus was previously found on the surface.

Therefore, the investigators first sought to determine the relationship between initial quantities of viable virus, and subsequent RNA copy number on a contaminated surface, hoping that the latter could serve as a surrogate for the former. To test this, they contaminated surfaces of interest with artificially high concentrations of the virus in the laboratory. But there was no clear relationship between the numbers of RNA copies recovered over time to the number of viable virus particles in the initial inoculum. The investigators did observe that the numbers of virus particles decreased quite rapidly.

The relationship in levels of RNA and viable SARS-CoV-2 shows that in previous surface sampling studies where SARS-CoV-2 RNA was recovered, there were likely low concentrations of viable virus on those surfaces at the time of contamination, according to Pottage.

"This study estimates that the SARS-CoV-2 would survive less than two days on surfaces under normal environmental concentrations," said Pottage.

Conversely, artificially high concentrations of SARS-CoV-2 that were deliberately deposited on surgical mask material and stainless steel in a laboratory setting resulted in relatively lengthy persistence, with 99.9% reductions in viable virus taking place over 122 and 114 hours, respectively. Viability dropped the fastest on a polyester shirt, with a 99.9% reduction occurring over 2.5 hours.

"Our results show that the porous but hydrophobic surfaces of the surgical mask and Tyvek coverall produce similar decay rates when compared to the non-porous hydrophobic surfaces of stainless steel," with a reduction in numbers of virus particles of 99.999% over seven days, said the authors. Viable SARS-CoV-2 was recovered from these surface materials over longer periods of time compared to the porous, hydrophilic surfaces tested, cotton and woven polyester.


Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods

Small noncoding RNAs perform multiple regulatory functions in cells, and their exogenous mimics are widely used in research and experimental therapies to interfere with target gene expression. MicroRNAs (miRNAs) are the most thoroughly investigated representatives of the small RNA family, which includes short interfering RNAs (siRNAs), PIWI-associated RNA (piRNAs), and others. Numerous methods have been adopted for the detection and characterization of small RNAs, which is challenging due to their short length and low level of expression. These include molecular biology methods such as real-time RT-PCR, northern blotting, hybridization to microarrays, cloning and sequencing, as well as single cell miRNA detection by microscopy with in situ hybridization (ISH). In this review, we focus on the ISH method, including its fluorescent version (FISH), and we present recent methodological advances that facilitated its successful adaptation for small RNA detection. We discuss relevant technical aspects as well as the advantages and limitations of ISH. We also refer to numerous applications of small RNA ISH in basic research and molecular diagnostics.

Açar sözlər: LNA probe PLA Piwi-interacting RNA TIRCA enzyme-labeled fluorescence signal amplification padlock probes rolling circle amplification short interfering RNA tyramide signal amplification.

Rəqəmlər

Types of nucleotide modifications used…

Types of nucleotide modifications used in small RNA ISH probes. ( A )…

Sequence amplification and detection methods…

Sequence amplification and detection methods for small RNA ISH include ( A )…

Sequence amplification and detection methods…

Sequence amplification and detection methods for small RNA ISH include ( A )…


Videoya baxın: Nuklein turşuları (Iyun 2022).