Məlumat

Axın sitometriyası üçün ürək toxumasından tək hüceyrəli süspansiyon hazırlamaq üçün hansı fermentlərdən istifadə etməliyəm?

Axın sitometriyası üçün ürək toxumasından tək hüceyrəli süspansiyon hazırlamaq üçün hansı fermentlərdən istifadə etməliyəm?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ürək toxumasından tək hüceyrəli süspansiyon hazırlamaq üçün hansı fermentlərdən istifadə edəcəyimi kimsə təklif edə bilər. Mən həm hüceyrə səthinə, həm də kardiyomiyositləri və fibroblastları əhatə edən hüceyrədaxili antigenlərə baxacağam.


Xarici membran vezikül əsaslı dərman axını mexanizmindən istifadə edərək yeni nanoantibiotiklərin inkişafı

Bakteriyalar yüksək efluks pompası ifadəsi və OMV ifrazı vasitəsilə çoxlu miqdarda antibiotik yüklü veziküllər ifraz edirlər.

OMV-lər antibiotikləri effektiv şəkildə yükləyir və antibiotiklərin dayanıqlığını yaxşılaşdırır.

Antibiotik yüklü OMV, dərmanların sərbəst buraxılması və bakterial işğal vasitəsilə passiv və aktiv bakterisid təsir göstərir.

Antibiotik yüklü OMV-lər əla biouyğunluğa malikdir.

Antibiotik yüklü OMV-lər oral tətbiq ilə bağırsaq bakterial infeksiyalarından effektiv şəkildə qoruya bilər.


Mücərrəd

Ürək xəstəlikləri bütün dünyada ölümün əsas səbəblərindən biridir. Alimlər üçün böyük problem bu növ xəstəliklər üçün yeni terapevtik üsullar hazırlamaqdır. Kök hüceyrələrin (KH) müalicəsi ürək hüceyrələrinin yenilənməsi və ürək xəstəliklərinin müalicəsində istifadə olunan perspektivli üsullardan biri ola bilər. Şərti in vitro ürəyin regenerasiyasının tədqiqi üçün istifadə edilən üsullar təbii ürək fiziologiyasını təqlid etmir. Lab-on-a-a-chip sistemləri ürək əzələsinin modelinin yaradılmasına imkan verə biləcək həll yolu ola bilər ki, bu da ürək hüceyrələrinin oxşar şəraitdə böyüməsini təmin edir. in vivo şərtlər. Mikrosistemlər kök hüceyrələrin ürək hüceyrələrinə diferensiallaşdırılması üçün də uğurla istifadə edilə bilər. Bu, bu hüceyrələrin yayılması və bərpası qabiliyyətini daha yaxşı başa düşməyə kömək edəcəkdir. Bu icmalda təqdim edirik Çip üzərində ürək ürək hüceyrə mədəniyyətinə və kök hüceyrə biologiyasına əsaslanan sistemlər. Bu baxış fizioloji mühitin və ürəyin funksiyalarının təsviri ilə başlayır. Sonra, kök hüceyrələrin ürək hüceyrələrinə diferensiasiyasının ənənəvi üsullarını qısaca təsvir etdik. Bu baxış əsasən təsvirə yönəlib Lab-on-a-a-chip ürək toxumasının mühəndisliyi üçün sistemlər. Buna görə də, bu məqalənin növbəti hissəsində həm ürək hüceyrə mədəniyyəti, həm də SC-lərin ürək hüceyrələrinə diferensiasiyası üçün mikrosistemlər təsvir edilmişdir. Ürək hüceyrələrinə SC-lərin differensasiyası haqqında bölmə biokimyəvi, fiziki və mexaniki stimullaşdırmaları təsvir edən bölmələrə bölünür. Nəhayət, biz mövcud çətinlikləri və gələcək tədqiqatları təsvir edirik Çip üzərində ürək kök hüceyrə biologiyasına əsaslanır.


2.4 Tədqiqat və Tibbdə Tətbiqlər:

ilə axın sitometriyasının birləşməsi SMDC səmərəli təmin edir yeni strategiya üçün standartlaşdırılmış laboratoriyalararası ifadəsi xəstəliyin diaqnozu, xəstəliyin proqnozu eləcə də nəzarət üçün terapevtik səmərəlilik in klinik tibb istifadə etməklə hüceyrə biokimyəvi eləcə də klinik kimya və ya başqa kliniki parametrlər. Bu yanaşmanın praktiki tətbiqi üçün səylər davam edir, məsələn. içində AB tərəfindən maliyyələşdirilir Klinik Hüceyrə Analizi üzrə Avropa İşçi Qrupu (EWGCCA).


Sıçan ürək perisitlərinin izolyasiyası və təmizlənməsi

Əsas tədqiqat və onların biologiyası və terapevtik potensialının tədqiqi üçün siçan ürək perisitlərini təcrid etmək və təmizləmək üçün protokolu optimallaşdırdıq.

Protokolumuz siçan modeli üçün optimallaşdırılıb və bütün tədqiqatçılar üçün asanlıqla mövcud olan materiallardan istifadə edir. Bu texnika sağlam, xəstəlik və ya genetik olaraq dəyişdirilmiş siçan modellərinə tətbiq edilə bilər. Protokolumuz tədqiqatçılara xəstəlik və ya genetik variasiyanın hər hansı bir siçan modelindən ürək perisit biologiyası ilə bağlı istənilən suala cavab verməyə imkan verəcək.

Bu prosedur ürəyin perisit biologiyası haqqında məlumat verəcək və onların həm sağlamlıq, həm də xəstəlikdə ürək homeostazı və hemodinamikaya verdiyi töhfəni anlamağa kömək edəcək. Anesteziya edilmiş siçanı uzanmış vəziyyətdə qoyun və ön ayaqlarını aşağıya yapışdırın. Diqqətlə sinə boşluğunu açın və 25 kalibrli kəpənək iynəsindən istifadə edərək enən aortanı canulasiya edin.

Sağ atriumda bir nick edin. Daha sonra dəyişkən axınlı peristaltik nasosla ən azı 20 millilitr 250 vahid/millilitr heparinləşdirilmiş, kalsium-maqneziumsuz Dulbecco-nun fosfat tamponlu şoranını dəqiqədə iki millilitrlə ürək perfuziya edin. Təmiz PBS sağ qulaqcıqdan çıxdıqda perfuziya tamamlanır.

Ürəyi aortada kəsin və onu buz kimi soyuq kalsium-maqneziumsuz DPBS-yə qoyun. Sonra ürəyi 15x15 santimetrlik Petri qabına köçürün. Parçaları örtmək üçün kifayət qədər ferment məhlulu olan yay qayçı və incə nöqtəli forsepslərdən istifadə edərək ürəyi kiçik parçalara ayırın.

İndi parçaları və məhlulu 50 millilitrlik konusvari boruya köçürün və parafin plastik filmlə bağlayın. 37 dərəcə Selsi temperaturda 120 rpm-də orbital çalkalayıcıda 75 dəqiqə inkubasiya edin. Kollagenaz ferment məhlulu ilə həzm edildikdən sonra mayeni 100 mikron hüceyrə süzgəcindən keçərək yeni 50 millilitrlik boruya tökün, parçaların qurumasın deyə kifayət qədər məhlul buraxın.

İncə nöqtəli forsepslərdən istifadə edərək, toxumanı borudan götürün və bir neçə parçanı mikroskop slaydına qoyun. Sonra toxumanı parçalamaq üçün iki mikroskop slaydları arasında toxuma üyüdün. Slaydları fermentsiz mədəniyyət mühiti ilə yeni 50 millilitrlik konusvari boruya yuyun.

Bütün toxuma parçaları ayrılana qədər bu addımı təkrarlayın. Gərgin məhlulu və üyüdülmüş toxumanı bir boruya birləşdirin. Yaranan süspansiyonu 100 mikron hüceyrə süzgəcindən keçirərək yeni 50 millilitrlik konusvari boruya süzün.

Nümunəni 220 dəfə g və dörd dərəcə Selsi temperaturunda beş dəqiqə sentrifuqa edin. Əvvəlki məhluldan aspire edin və hüceyrə qranulunu DPBS və iribuynuzlu zərdab albumini olan soyuq FACS boyama tamponunda yumşaq bir şəkildə yenidən dayandırın. Hüceyrələri sayın və hüceyrə sayğacından istifadə edərək canlılığı yoxlayın.

Hüceyrələri DPBS və iribuynuzlu zərdab albumini olan soyuq FACS boyama tamponu ilə mililitrdə bir milyon hüceyrəyə qədər seyreltin. Hüceyrələr indi ləkələnməyə və çeşidlənməyə hazırdır. Bütün nəzarət və hüceyrə nümunələri üçün beş millilitrlik FACS borularını hazırlayın və etiketləyin.

Ləkələnməmiş nümunə, flüoresan minus bir nəzarət və izotip uyğun nəzarətlər üçün hər boru üçün bir mililitr hüceyrənin miqdarı. Sıralama üçün qalan xanalardan istifadə edin. Bütün nəzarət və nümunələr eyni vaxtda hazırlana və rənglənə bilər.

Həmçinin, cəmi doqquz kompensasiya nəzarəti, iki növ ləkələnməmiş muncuq və marker panelindən yeddi müxtəlif flüoroxrom üçün beş millilitrlik FACS borularını hazırlayın və etiketləyin. Flüoresan kompensasiya nəzarətlərini optimallaşdırmaq üçün sıxma flakonundan hər boruya bir damcı kompensasiya muncuqları əlavə edin. Sonra muncuqlara bir mikrolitr antikor əlavə edin.

Marker panelindən hər bir antikor üçün təkrarlayın. Spektral üst-üstə düşmə səbəbindən fon rəngini optimallaşdırmaq üçün FMO nəzarətlərindən istifadə edin. FMO nəzarət borularındakı hüceyrələrə marker panelindəki bütün antikorları birdən 100-ə qədər seyreltmə ilə əlavə edin, lakin bir antikoru istisna edin.

Cəmi yeddi nəzarət üçün hər bir antikor üçün təkrarlayın. Qeyri-spesifik boyanma üçün izotipə uyğun nəzarət antikorlarından istifadə edin. İzotip uyğunlaşdırılmış etiketli borulardakı hüceyrələrə izotip uyğun gələn nəzarət antikorunu 1-dən 100-ə qədər seyreltmə ilə əlavə edin.

Sonra, çeşidlənəcək hüceyrələri hazırlayın. Təzə təcrid olunmuş hüceyrələrə birdən 100-ə qədər seyreltilmiş antikor kokteyli əlavə edin. Həmçinin, 1-000 qatılma ilə hüceyrə canlılığı boyası əlavə edin.

Nəbz burulğanı ilə kompensasiya nəzarətlərini güclü şəkildə qarışdırın. Hüceyrə canlılığı muncuqları istisna olmaqla, işıqdan qorunan, otaq temperaturunda buraxıla bilən dörd dərəcə Selsi temperaturunda 30 dəqiqə inkubasiya edin. FMO nəzarətlərini, izotipə uyğun idarələri və impuls burulğanı ilə çeşidlənəcək hüceyrələri yumşaq bir şəkildə qarışdırın.

İşıqdan qorunan dörd dərəcə Selsi temperaturunda 30 dəqiqə inkubasiya edin. Hər kompensasiya nəzarətinə, FMO nəzarətinə və izotip nəzarətinə üç mililitr FACS boyama buferi əlavə edin. Boruları dörd dərəcə Selsidə beş dəqiqə ərzində 300 dəfə g-də sentrifuqa edin.

Məhluldan aspirasiya edin və hər bir qranul 400 mikrolitr FACS boyama tamponunda yenidən dayandırın. Kompensasiya nəzarətləri, FMO nəzarətləri və izotip nəzarətləri artıq istifadəyə hazırdır. Boyanmadan sonra hüceyrələri dörd dərəcə Selsidə beş dəqiqə ərzində 300 dəfə g sentrifuqa edərək FACS boyama tamponu ilə yuyun.

Məhluldan aspirasiya edin və hüceyrə qranulunu FACS boyama tamponunda hər mililitrdə 0,5 milyon hüceyrəyə yenidən dayandırın. 35 mikron filtr zirvələri olan yeni FACS borularından istifadə edərək, tək hüceyrəli suspenziyalar əldə etmək üçün ləkələnmiş hüceyrə nümunələrini qapaqlara və cazibə filtratına pipetka ilə çəkin. Buz üzərində saxlayın.

Hüceyrələri təmizləmək üçün hüceyrə çeşidləyicisindən istifadə edin. Gərginlikləri təyin etmək və fon siqnalını düzəltmək üçün hüceyrə çeşidləyicisində ləkələnməmiş hüceyrələri işə salın. Hər bir kanal üçün gərginliyi tənzimləmək və müsbət siqnal üçün qapıları tənzimləmək üçün hər bir tək rəngli kompensasiya muncuq nümunəsini bir-bir işə salın.

Məlumatları toplayın. Kompensasiya matrisini hesablayaraq spektral üst-üstə düşməyi hesablamaq üçün proqramdan istifadə edin. Bütün gərginliklər hazır və quraşdırılmışdır.

Hər bir izotip nəzarətini bir-bir işə salın. Bu məlumatlar, əgər varsa, qeyri-spesifik bağlama üçün qapıları tənzimləmək üçün istifadə edilə bilər. Hər bir FMO nümunəsini bir dəfə işə salın.

Çoxrəngli panel sayəsində spektral keçidi düzəltmək üçün hər bir kanal üçün gərginlikləri tənzimləyin. Ləkələnmiş hüceyrə nümunələrini hüceyrə çeşidləyicisində işə salın. Hüceyrələri 10 millilitrlik fermentsiz mədəniyyət mühitində 15 millilitrlik konusvari toplama borusuna yığın.

Aşağıdakı keçid strategiyasından istifadə edin. Birincisi, tək hüceyrələr üçün qapı. Sonra canlı hüceyrələr üçün qapı.

Sonra, CD45-mənfi hüceyrələr üçün qapı. CD34 və CD31-mənfi hüceyrələr üçün qapı. Sonra, NG2-müsbət hüceyrələr üçün qapı.

Və nəhayət, CD146 və CD140b-müsbət hüceyrələrin qapısı. Perisitləri yetişdirmək üçün təzə əldə edilmiş hüceyrələri fermentsiz mədəniyyət mühitində örtülmüş 24 quyu boşqabına səpin. Hüceyrələri 37 dərəcə Selsi, 5% karbon dioksid və 95% oksigen ilə müəyyən edilmiş bir hüceyrə inkubatorunda yetişdirin.

Bütün ürəyin fermentativ həzmindən və dissosiasiyasından sonra və hüceyrələrin FACS təmizlənməsindən əvvəl hüceyrələr ürəkdən çoxlu müxtəlif hüceyrə növlərini ehtiva edən xam qarışıqdır. FACS təmizləmə və kultivasiyadan sonra hüceyrələr homojen olur. Onlar tək nüvəli, kifayət qədər düzdür və tipik perisit rombvari morfologiyaya malikdir.

FACS istifadə edərək, hüceyrələr homojenliyə qədər təmizlənir. Birincisi, zibil və dubletlər irəli və yan səpələnmə paylamalarına əsasən çıxarıldı. Sonra ölü hüceyrələr canlı hüceyrələrdən daha böyük və daha sıx bir siqnal verən boya ilə amin reaksiyasına görə çıxarıldı.

Canlı hüceyrələrdən hematopoetik hüceyrələr CD45-müsbət olmaqla xaric edilmişdir. Hematopoetik və endotel hüceyrələrini daha da çıxarmaq üçün CD34-müsbət və CD31-müsbət hüceyrələr çıxarıldı. Nəhayət, NG2-müsbət və CD140b/CD146-müsbət hüceyrələr tipik perisit markerlərinin ifadəsi ilə perivaskulyar hüceyrələr olmaq üçün seçildi.

İnsan beyninin perisitləri ilə müqayisə edildikdə, hüceyrələr oxşar morfologiyaya malikdir. Siçan və insan hamar əzələ hüceyrələri ilə müqayisədə hüceyrələr fərqli morfologiyaya malik idi. Perisit markerləri üçün immunositokimya ilə yeddi keçiddə hüceyrələrin fenotipik səciyyələndirilməsi morfologiyada və ya marker ifadəsində müşahidə edilən dəyişiklikləri göstərmədi. Eynilə, yeddinci keçiddə perisitlərin axın sitometriyası ilə təhlili populyasiyanın homogen qaldığını təsdiqlədi.

Hüceyrə canlılığı yaxşı məhsul əldə etmək üçün vacibdir. Satınalma zamanı toxuma soyuq tutun və hüceyrə boyanması zamanı hüceyrələri soyuq saxlayın. Həmçinin, fermentativ məhlulun hər dəfə təzə hazırlandığından əmin olun.

Kulturadan sonra düzgün hüceyrələrin təcrid olunmasını təmin etmək üçün onları axın sitometriyası və immunofluoresan boyama ilə xarakterizə edin. Bu hüceyrələr funksional maneə tədqiqatları üçün endotel hüceyrələri ilə kokultura təcrübələrində, həmçinin onların bioloji və fizioloji funksiyasını və xüsusiyyətlərini öyrənmək üçün analizlərdə istifadə edilə bilər. Ürək perisitləri damar bütövlüyü və sabitliyində əsas rol oynayır və onların disfunksiyası qlobal ürək funksiyasının nəticəsidir.

Bizim texnikamızla tədqiqatçılar ürək perisitlərinin terapevtik potensialını araşdıra bilərlər.


Mücərrəd

Səbəb:

Miokard infarktından (MI) sonra optimal nəticə həm zibilin çıxarılmasının, həm də miokardın hüceyrədənkənar matrisinin təmirinin böyük rol oynadığı koordinasiyalı sağalma reaksiyasından asılıdır. Bununla belə, mənfi remodeling və həddindən artıq iltihab ürək çatışmazlığını inkişaf etdirə, leykositləri mərkəzi qəhrəmanlar və MI sonrası toxuma təmiri və yaraların sağalmasında potensial terapevtik hədəflər kimi yerləşdirə bilər.

Məqsəd:

Bu işdə, miyeloid hüceyrələr-1 (TREM-1) üzərində ifadə edilən tetikleyici reseptorun MI-dan sonra gələn iltihablı cavabın təşkilində rolunu araşdırdıq. Neytrofillər və yetkin monositlər tərəfindən ifadə edilən TREM-1, fitri immun cavabın gücləndiricisidir.

Metodlar və Nəticələr:

İnfarktdan sonra TREM-1 ifadəsi siçanlarda və insanlarda işemik miokardda yuxarı tənzimlənir. Trem-1 genetik etibarsızlığı və ya sintetik peptiddən (LR12) istifadə edərək farmakoloji inhibisyon miokard iltihabını azaldır, neytrofillərin yığılmasını və monosit kemoatraktan zülal-1 istehsalını məhdudlaşdırır, beləliklə klassik monositlərin ürəyə səfərbərliyini azaldır. O, həmçinin siçanlarda sol mədəciyin funksiyasını və sağ qalmasını yaxşılaşdırır (hər qrup üçün n=20-22). Həm daimi, həm də keçici miokard işemiyası zamanı Trem-1 blokadası həmçinin ürək funksiyasını yaxşılaşdırır və fluorodeoksiqlükoza-pozitron emissiya tomoqrafiyası və keçirici kateter tədqiqatları ilə qiymətləndirilən mədəciklərin yenidən qurulmasını məhdudlaşdırır (hər qrup üçün n=9-18). TREM-1-in aktivləşməsinin markeri olan TREM-1-in (sTREM-1) həll olunan forması kəskin MI olan xəstələrin plazmasında aşkar edilir (n=1015) və onun konsentrasiyası ölümün müstəqil predikatorudur.

Nəticələr:

Bu məlumatlar göstərir ki, TREM-1 kəskin MI zamanı yeni bir terapevtik hədəf təşkil edə bilər.

Giriş

Kəskin miokard işemiyası sitokinlərin və kemokinlərin istehsalına 1,2 və infarkt bölgəsində neytrofillərin və mononükleer hüceyrələrin yığılmasına səbəb olan immun sisteminin intensiv aktivləşməsinə səbəb olur. 3,4 Erkən proinflamatuar siqnallar zədəyə reaksiyaya vasitəçilik etmək, ölü ürək miyositlərinin təmizlənməsini tənzimləmək və yaraların sağalması üçün lazım olan hüceyrə hadisələrini başlatmaq üçün çox vacibdir. Bununla belə, optimal sağalma sitokin və kemokin sintezini boğan və iltihab infiltratın həllinə vasitəçilik edən inhibitor mexanizmlərin aktivləşdirilməsini tələb edir. 5

Buna görə də, iltihab reaksiyasının gücləndirilməsinin məhdudlaşdırılması zədənin qarşısını almaq və infarktın optimal müalicəsi üçün vacib görünür. Miyeloid hüceyrələr-1 (TREM-1) üzərində ifadə edilən tetikleyici reseptor neytrofillər, makrofaqlar və yetkin monositlər tərəfindən ifadə edilən immun reseptordur və fitri immun cavabın gücləndiricisi kimi çıxış edir. 6 Qısa inhibitor peptidlər və ya füzyon zülalları ilə TREM-1 aktivasiyasının blokadasının müxtəlif ağır infeksiya modellərində hiper reaksiya və ölümdən qorunduğu göstərilmişdir. 7-12 Kəskin miokard infarktı (MI) zamanı TREM-1-in vasitəçiliyi ilə immun cavabın hədəflənməsinin faydalı olub-olmayacağı hələ məlum deyil.

Bu işdə biz MI-dan sonra gələn iltihablı reaksiyanın təşkilində TREM-1-in rolunu araşdırdıq. Biz göstəririk ki, Trem-1 genetik etibarsızlığı və ya farmakoloji inhibə miyokard iltihabını azaldır, leykositlərin yığılmasını məhdudlaşdırır və ürəyin fəaliyyətini yaxşılaşdırır. Üstəlik, TREM-1-in (sTREM-1) həll olunan forması kəskin MI olan xəstələrin plazmasında tapılır və onun konsentrasiyası ölümün müstəqil bir göstəricisidir.

Metodlar

Heyvanlar

Trem-1, Rag-1 nokautlu yetkin erkək C57BL/6 (6-8 həftə) və vəhşi tipli tullantılar, həmçinin yetkin erkək Wistar siçovulları (Charles River, Lyon, Fransa) istifadə edilmişdir. Trem-1 −/− siçanları bu yaxınlarda Weber və digərləri tərəfindən ətraflı təsvir edilmişdir. 11 Təcrübə bizim institusional Heyvanlara Qulluq və İstifadə Komitəsi tərəfindən təsdiq edilmişdir.

Cərrahi Prosedurlar

MI əvvəllər təsvir edildiyi kimi siçanlarda daimi koronar ligasiya ilə induksiya edilmişdir. 10 Qısaca olaraq, siçanlar izofluran (2%/2L O) ilə anesteziya edilmişdir.2/dəq), intubasiya edilmiş və Inspira Advanced Safety Tək Heyvan Təzyiqinə/Həcminə Nəzarət Edilən Ventilator (Harvard Aparatı) ilə ventilyasiya edilmişdir. Döş qəfəsi qırxılmış və dördüncü sol qabırğaarası sahədə sol torakotomiya icra edilmişdir. Sol mədəcik (LV) görüntüləndi və sol atriumun altından çıxdığı yerdə sol koronar arteriya daimi olaraq monofilament neylon 8-0 tikişlərlə (Ethicon) bağlandı. Sinə divarı 7-0 neylon tikişlə, dəri isə 6-0 neylon tikişlə bağlandı. Bənzər bir prosedur siçovullarda daimi koronar arteriyaların bağlanması üçün aparıldı. İşemiya-reperfuziya modeli siçovullarda keçici (1 saat) koronar arteriya bağlanması vasitəsilə əldə edilmişdir. Saxta idarə olunan nəzarət siçanları eyni müdaxiləyə məruz qaldı, ancaq ligaturun bağlanmaması.

TREM-1 inhibitor peptid

LR12 (LQEEDAGEYGCM) və LR12-scramble (qeyri-aktiv nəzarət peptididir) COOH terminal amidasiyalı peptidlər kimi kimyəvi yolla sintez edilmişdir (Pepscan Presto BV, Lelystad, Hollandiya). Düzgün peptidlər >99% məhsuldarlıqla əldə edildi və kütləvi spektrometriya və analitik tərs fazalı yüksək performanslı maye xromatoqrafiyası ilə təsdiqləndiyi kimi preparativ təmizlənmədən sonra homojen oldu. Bu peptidlər endotoksindən azad idi.

Heyvanlar 5 gün ərzində gündə bir dəfə peritondaxili 5 mq/kq LR12 və ya LR12-scramble peptidləri qəbul etmək üçün koronar ligasiyadan 2 saat sonra kor-koranə randomizə edilib.

Histologiya

LV-lər zirvədən bazaya eninə dilimlərə bölündü və immunohistokimya üçün optimal kəsmə temperaturu birləşməsinə (Tissue-Tek) daxil edildi. 5 μm qalınlığında kəsikləri miyeloperoksidaza, CD68 və ya CD163 (Serotec) üçün siçovul monoklonal antikoru (mAb) və ya keçi poliklonal antikoru ilə TREM-1 (kataloq nömrəsi AF1278, R&D Systems) ilə rənglədik. Biz polimorfonükleer hüceyrələri tipik çoxnüvəli morfologiyaya malik MPO + hüceyrələr, monositlər və makrofaqlar isə CD68 + / CD163 + mononüvəli hüceyrələr kimi müəyyən etdik. Siçan MMP9 (kataloq nömrəsi AF911, R&D Systems) üçün keçi antikoru ilə matrix metalloproteinaz 9 (MMP9) aşkar etdik. MI-dan sonra ürəyin sağalması 1, 14 və 42-ci gündə qiymətləndirilmişdir. Ürəklər kəsilmiş, fosfat tamponlu salin ilə yuyulmuş və maye azotda dondurulmuşdur. Ürəklər kriostat (CM 3050S Leica) ilə 7 μm qalınlığında hissələrə kəsildi. İnfarkt ölçüsü və miokard fibrozunun qiymətləndirilməsi üçün Masson Trichrome və Sirius Red boyamaları aparıldı.

Axın Sitometriyası

İnfarktlı toxumalardan təkhüceyrəli süspansiyonlar hazırlamaq üçün kollagenaza I, kollagenaza XI, DNase I və hialuronidaza (Sigma-Aldrich) kokteylinə yerləşdirilmiş incə qayçı ilə doğranmış ürəklər yığılmış və 37°C-də 1 saat çalxalanmışdır. Hüceyrələr daha sonra triturasiya edildi və sentrifuqa edildi (15 dəqiqə, 500 q, 4 ° C).

Dalaqlar çıxarıldı, 3 ml-lik şprisin ucu ilə 4°C-də Hankın Balanslaşdırılmış Duz Məhlulunda (HBSS) doğrandı və 70 μm neylon filtrlərdən (BD) süzüldü. Hüceyrə süspansiyonu 300 dərəcə santrifüqa edilmişdirg 4°C temperaturda 10 dəqiqə. Qırmızı qan hüceyrələri parçalandı (Qırmızı Qan Hüceyrələrinin Lizis məhlulu Miltenyi) və splenositlər HBSS ilə yuyuldu və 0,2% (ağırlıq/həcm) iribuynuzlu zərdab albumini ilə əlavə edilmiş HBSS-də yenidən dayandırıldı. Antikoaqulyant kimi sitrat məhlulu ilə ürək ponksiyonu ilə periferik qan götürüldü və qırmızı qan hüceyrələri lizis olundu. Nəhayət, sümük iliyinin tək hüceyrəli süspansiyonları bud sümüyündən 1 ml HBSS ilə yuyulduqdan, 70 μm neylon filtrlərdən filtrasiyadan və 300 ° C-də santrifüjdən sonra əldə edildi.g 4°C temperaturda 10 dəqiqə. Trypan blue (BioRad) ilə hemasitometrdən istifadə edərək alikotlardan ümumi canlı hüceyrə sayı müəyyən edilmişdir.

Hüceyrə süspansiyonları CD4+ və ya CD8+ T hüceyrələrinə (CD4- və ya CD8-APC, CD3ε-PE, CD45-FITC), B hüceyrələrinə (CD19-PE, CD45-FITC), qranulositlərə (CD11b-) qarşı mAb kokteylində inkubasiya edilmişdir. PB, CD45-PerCP, Ly-6G-PE) və monosit alt dəstləri (Ly-6C-FITC, F4/80-APC), Miltenyi Biotech-dən bütün antikorlar. Məlumat verilmiş hüceyrə nömrələri ümumi canlı hüceyrələrin (mL başına ümumi canlı leykositlər) və seçilmiş qapı daxilində hüceyrələrin faizi kimi hesablanmış və hər mq toxuma (ürək), hər orqan (bud sümüyü və dalaq) və ya hər ml (qan) üzrə məlumat verilmişdir. ). Məlumatlar FACScalibur sitometrində (BD) əldə edilmişdir.

Zülalların fosforilləşməsinin təhlili

İzolyasiya olunmuş miokard hüceyrələri PhosphoSafe Ekstraksiya Reagentində (Novagen Merck Biosciences, Nottingham, Birləşmiş Krallıq) parçalanmış və 16 000-də 5 dəqiqə sentrifuqa edilmişdir.g supernatant toplamaq üçün 4°C-də. Protein konsentrasiyası müəyyən edildi (BCA Protein Assay Kit, Pierce ThermoScientific, Brebières, Fransa). Lizatlar daha sonra Western blot (Criterion XT Bis-Tris Gel, 4%–12% BioRad, Marnes-la-Coquette, Fransa və PVDF membran Millipore, Saint-Quentin en Yvelines, Fransa) ilə təhlil edildi, antifosfo-p38, antipERK1/ aşkar edildi. 2, antipGSK3β, anti-iNOS və horseradish peroksidaza (Cell Signaling Ozyme, Saint-Quentin en Yvelines, Fransa) və SuperSignal West Femto Substrate (Pierce ThermoScientific) ilə konyuqasiya edilmiş müvafiq ikincili antikor. Normallaşma üçün fosforlaşdırılmamış formalar və ya tubulin (Hüceyrə Siqnallaşdırma) istifadə edilmişdir. Alma və kəmiyyət siqnal sıxlığı təhlilləri LAS-4000 təsvir cihazı (FSVT, Courbevoie, Fransa) və Multi-Gauge proqramı (LifeScience Fujifilm, Fransa) tərəfindən həyata keçirilib.

Kəmiyyət əks transkriptaza-polimeraza zəncirvari reaksiya

Ümumi RNT-lər RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, Fransa) istifadə edərək miokarddan (infarktlı və ya uzaq ərazilər) çıxarıldı və iScript cDNA sintez dəsti (BioRad) istifadə edərək retrotranskripsiya edilməzdən əvvəl NanoDrop (ThermoScientific) ilə kəmiyyəti təyin edildi və kəmiyyət polimeraza reaksiyası ilə ölçüldü. (PCR) üçün Qiagen mövcud zondları (Quantitect Primers) istifadə edərək Trem-1, İl-6, Tnf-α, Timp1, Mmp9, və Akt B. Akt B ev təsərrüfatı geni kimi xidmət edir. Alternativ olaraq, ümumi RNT-lər PCR massivləri üçün RT° First Strand Kit (SABiosciences, Tebu-bio, Le Perray-en-Yvelines, Fransa) ilə retrotranskripsiya edildi (Siçan Innate Immune/Endothelial Cells RT° Profiler PCR Arrays SABiosciences). Bütün PCR-lər MyiQ Thermal Cycler-də yerinə yetirildi və iQ5 proqramı (Qiagen) ilə ölçüldü. PCR massivinin nəticələri PCR Array Data Analysis Software (SABIosciences) istifadə edərək təhlil edildi və 5 ev təsərrüfatı geni ilə normallaşdırıldı.

Sitokin konsentrasiyasının ölçülməsi fermentlə əlaqəli immunosorbent analizi (siçan Quantikine ELISA Kitləri R&D Sistemləri) və sitokin panel analizləri (Proteome Profiler Mouse Cytokin Array Kit R&D Systems) istifadə edərək həyata keçirilmişdir.

Gel-daxili zimoqrafiya və jelatinaz aktivliyinin təhlili əvvəllər təsvir edildiyi kimi aparılmışdır. 13

Exokardioqrafik Ölçmələr

Transtorasik exokardioqrafiya anesteziya edilmiş siçanlarda (izofluran inhalyasiyası) əməliyyatdan 14 və 42 gün sonra 14 MHz xətti transduksiya ilə exokardioqrafdan (ACUSON S3000 Siemens AG, Erlangen, Almaniya) istifadə edilərək aparılmışdır. Müstəntiq (P.B.) qrup tapşırığına göz yumdu. Son diastolda və son sistolda LV daxili diametrinin, mədəciklərarası çəpər divarının qalınlığının və posterior qalınlığın idarəolunan M rejimində ölçülməsi üçün LV-nin ikiölçülü parasternal uzun oxlu görünüşləri əldə edilmişdir. Faizli fraksiya qısalması aşağıdakı kimi hesablanmışdır: faizlə fraksiya qısalması=[(son diastolda LV diametri–son sistolda LV diametri)/diastolun sonunda LV diametri]×100.

Fluorodeoksiqlükoza-Pozitron Emissiya Tomoqrafiyası

Acipimox (50 mq/kq) ilə metabolik premedikasiyadan sonra ≈70 MBq 18F-fluorodeoksiqlükoza venadaxili olaraq qısa anesteziya altında (izofluran inhalyasiyasının 1,5%-2,5%-i) yeridildi. Altmış dəqiqə sonra, xüsusi kiçik heyvan PET sistemindən (Inveon, Siemens, Knoxville, TN) istifadə edərək, izofluran tərəfindən davamlı anesteziya altında 20 dəqiqəlik PET qeydinə başlandı. Heyvanlar standart EKQ monitoruna qoşuldu və sonradan ümumi ürək dərəcəsi dəyərləri üçün 11-15 ms müvəqqəti ayırdetmə təmin edən 16 ürək intervalında şəkillər yenidən quruldu. Eksenel məkan ayırdediciliyi <1,5 mm idi. Nekrotik miokardın dərəcəsi LV-nin 17 seqmentli bölməsində xüsusi QPS proqram təminatından istifadə edərək, florodeoksiqlükoza qəbulunun <50%-ni göstərən LV seqmentlərinin faizi kimi müəyyən edilmişdir. Tam avtomatik QGS proqram təminatından istifadə etməklə LV ejeksiyon fraksiyası, həmçinin son sistolik və son diastolik həcmlər müəyyən edilmişdir. Bu şərtlərdə, yetkin siçovullarda LV son sistolik həcmi üçün aşağı həddə uyğun gələn 100 μL səviyyəsindən yuxarı olan faktiki boşluq həcmlərinin dəqiq müəyyən edilməsi təmin edilir.

Keçirici kateter tədqiqatları

Siçovullar izofluran ilə anesteziya edildi və 2F yüksək dəqiqlikli mikromanometr kateteri (SPR-407 Millar İnstitutu, Hyuston, TX) sağ karotid arteriya vasitəsilə LV-yə daxil edildi. Millar kateteri AcqKnowledge III proqram təminatı (ACQ 3.2) ilə kompüterlə birləşdirilmiş Harvard Məlumat Alma Sisteminə qoşulmuşdur.

Klinik Tədqiqat

Kəskin ST-seqment-yüksəklik və qeyri-ST-seqment-yüksəklik MI (FAST-MI) Fransa reyestrinin populyasiyası və üsulları əvvəlki nəşrlərdə ətraflı təsvir edilmişdir. 14,15 Qısaca desək, ≥18 yaşda olan bütün xəstələr, əgər kreatin kinaz, kreatin kinaz-MB üçün normanın yuxarı həddindən iki dəfə çox yüksək serum miyokard nekrozu markerləri və ya yüksəlmiş troponinlər və ya uyğun gələn simptomlara malik olduqda, reyestrə daxil edilmişdir. patoloji Q dalğaları və ya davamlı ST yüksəlməsi və ya depressiya ilə ən azı 2 bitişik aparıcıda kəskin MI və ya elektrokardioqrafik dəyişikliklərlə. Semptomların başlanmasından reanimasiya şöbəsinə qəbula qədər keçən müddət <48 saat olmalıdır. Xəstələr adi təcrübəyə uyğun olaraq idarə edildi, müalicə registrində iştirakdan təsirlənmədi. Fransada o dövrdə kəskin MI olan xəstələri müalicə edən 374 mərkəzdən 223-ü (60%) reyestrdə iştirak etmişdir. Bunların arasında 100 mərkəz serum bankına töhfə verən 1015 xəstəni işə götürdü. Hər bir xəstə yazılı məlumatlandırılmış razılıq verdi. Xəstələrin 99% -dən çoxu ağ idi. Nəzarət xəstələrin həkimləri, xəstələrin özləri və ya ailələri və doğulduğu yerin qeydiyyat şöbələri ilə təmaslar vasitəsilə toplanmışdır. 2 illik təqib >98% tamamlandı. Nəticə hadisələri sTREM-1 ölçmələrinin nəticələrinə kor olaraq qiymətləndirildi. Tədqiqat Saint Antoine Universiteti Xəstəxanasının Biotibbi Tədqiqatlarda İnsan Subyektlərinin Müdafiəsi Komitəsi tərəfindən nəzərdən keçirildi və məlumat faylı Komissiya Nationale Informatique et Libertés-ə elan edildi. sTREM-1-in plazma konsentrasiyaları fermentlə əlaqəli immunosorbent analizi (RnD Systems) ilə iki nüsxədə müəyyən edilmişdir.

Statistik təhlil

Heyvan Araşdırmaları

Göstərilməyən bütün məlumatlar normal şəkildə paylandı və sonra orta±SD kimi təqdim edildi və qruplar arasındakı fərqlərin statistik əhəmiyyəti Tələbədən istifadə edərək təhlil edildi t test və ya Kruskal-Wallis testi. Kaplan-Meier sağ qalma əyriləri log-rank testindən istifadə edərək təhlil edildi. A P dəyəri <0.05 əhəmiyyətli hesab edilmişdir.

Klinik Tədqiqat

Nəticə hadisəsi 2 illik izləmə dövründə bütün səbəblərdən ölüm və ya ölümcül olmayan MI kimi müəyyən edilmişdir. İlkin son nöqtə, bütün səbəblərə görə ölüm və ölümcül olmayan MI-nin birləşməsində epizod indeksi kimi müəyyən edilir, üzvləri xəstələrin dərmanlarından və qan ölçmələrindən xəbərsiz olan bir komitə tərəfindən qərara alınıb. Davamlı dəyişənlər orta±SD, kateqoriyalı dəyişənlər isə tezliklər və faizlər kimi təsvir edilir. sTREM-1 tertillərinə görə sağ qalma əyriləri Kaplan-Meier qiymətləndiricisindən istifadə etməklə qiymətləndirilir. 2 illik izləmə dövründə əsas son nöqtə ilə dəyişənlərin müstəqil proqnoz dəyərini qiymətləndirmək üçün çoxdəyişənli Cox proporsional təhlükə modelindən istifadə etdik. Çoxdəyişənli model cins, yaş, əvvəlki və ya indiki siqaret çəkmə, bədən kütləsi indeksi, ailədə koronar xəstəlik tarixi, hipertoniya tarixi, kəskin MI, ürək çatışmazlığı, böyrək çatışmazlığı, şəkərli diabet, qəbul zamanı ürək dərəcəsi, Killip sinfi, sol mədəciyin atılmasından ibarət idi. fraksiya, xəstəxananın idarə edilməsi (reperfuziya terapiyası, statinlər, β-blokerlər, klopidoqrel, diuretiklər, digitalis və heparin daxil olmaqla) və log C-reaktiv protein səviyyələri. Nəticələr 95% etibarlılıq intervalları ilə Cox modelləri üçün təhlükə nisbətləri kimi ifadə edilir. Bütün statistik testlər 2 tərəfli olub və SAS proqram təminatının 9.1 versiyasından istifadə etməklə həyata keçirilib.

Nəticələr

Trem-1 inhibisyonu siçanlarda MI-dən sonra ürəyin işini yaxşılaşdırır

Siçanlarda daimi sol mədəciyin işemiyası infarkt bölgəsində Trem-1 ifadəsinə səbəb oldu (Şəkil 1A). Bu ifadə keçici idi və əsasən infiltrasiya edən neytrofillərdə müşahidə edildi. Trem-1 insan işemik miokardında da ifadə edilmişdir (Şəkil 1B).

Şəkil 1. Miyeloid hüceyrələr-1 (TREM-1) üzərində ifadə edilən tetikleyici reseptor infarktlı miokardda ifadə edilir və onun inhibəsi siçanlarda miokard infarktından (MI) sonra ürəyin fəaliyyətini yaxşılaşdırır.. A, Siçanlarda MI-dan sonra infarktlı və infarktsız bölgələrdə Trem-1 mRNA və protein ifadə səviyyələri kəmiyyət tərs transkriptaza-polimeraza zəncirvari reaksiya, Western blot və axın-sitometriya ilə təhlil edilmişdir. Şam siçanları əməliyyatdan 24 saat sonra n = 5 hər zaman nöqtəsində təhlil edildi *P<0.01 və saxta əməliyyat olunan heyvanlar **P<0,001 infarktlı və infarkt olmayan sahə. B, kəskin MI sonrası xəstələrin ürəyində TREM-1 ifadəsi. TREM-1 ifadəsi kəskin MI-dən 48 saat sonra koronar arter bypass transplantasiyası əməliyyatı keçirmiş 5 xəstədə əldə edilən miokard zirvəsi nümunələrində immunohistokimya ilə müəyyən edilmişdir. Monositlər/makrofaqlar və neytrofillər müvafiq olaraq anti-CD163, CD68 və miyeloperoksidaza (MPO) ilə boyandı. Nümayəndə şəkilləri təqdim olunur. C, Siçanlarda MI-dan sonra Exokardioqrafik analiz. Sol mədəciyin (LV) fraksiya qısalması (FS) başlanğıcda, 14-cü gündə və MI-dan sonra 42-ci gündə n=7-11 siçan arasında ölçüldü *PLR12scr ilə müalicə olunan heyvanlara qarşı <0,05. D, LV sahəsi, risk altında olan sahə (AAR) və infarkt sahəsi (IA) ölçüldü (TTC [2,3,5-trifenil-2H-tetrazolium xlorid] boyanması) və 1-ci gündə infarkt ölçüsünün kəmiyyət təhlili, 14 və 42 qrup üçün n=7-dən 11-ə qədər edildi *P<0.02 və **P<0,01 və LR12scr. E, Ürək fibrozu Sirius Qırmızı boyandıqdan sonra qiymətləndirildi (üst) 14 və 42-ci günlərdə və apoptoz TUNEL (terminal deoksinukleotidil transferaz vasitəçiliyi ilə dUTP nick end-labeling) analizi ilə qiymətləndirilmişdir (alt) 14-cü gündə infarkt keçirən ərazilərin n=4-5 siçan hər qrupa *P<0.02, **P<0.01 vs LR12scr, ***P<0,05 LR12 və Trem-1 −/− siçanları. F, Kaplan-Meier Trem-1 −/− , LR12 − və ya nəzarət peptidində (LR12scr) və anti-Trem-1 monoklonal antikor (mAb) ilə müalicə olunan siçanlarda (qrup başına n=20-22) Mİ-dən sonra sağ qalma təxmini ). Sağ qalma əyriləri log-rank testindən istifadə etməklə müqayisə edilir. *P=0,008 və **P<0,001 və LR12scr. CF, Vəhşi tip siçanlar koronar ligasiyadan 2 saat sonra LR12, LR12-scramble peptid (nəzarət peptid kimi xidmət etmək üçün), Trem-1 mAb (0,2 mq/kq) və ya aidiyyəti olmayan mAb (nəzarət Ab kimi xidmət etmək üçün) almaq üçün kor-koranə randomizə edilib. . Müalicələr 5 gün ərzində gündə bir dəfə intraperitoneal olaraq aparıldı.

Monitorinq apardıq Trem-1 −/− siçanlar və vəhşi tipli tullantılar, sol koronar arteriyanın bağlanmasından 2 və 6 həftə sonra exokardioqrafiya ilə (Şəkil 1C). Trem-1 genetik etibarsızlıq sol mədəciyin fraksiyasının qısalmasının yaxşılaşmasına səbəb oldu (P<0.05). 1-ci gündə heç bir fərq olmasa da, infarktın ölçüsü 14-cü gündə əhəmiyyətli dərəcədə azaldı Trem-1 −/− siçanlar və bu azalma 6 həftədə hələ də aydın idi (Şəkil 1D). Üstəlik, ürək fibrozu, eləcə də apoptotik hüceyrələrin sayı (hansı hüceyrə növünün apoptoza məruz qaldığını ayırd edə bilmədik) azalmışdır. Trem-1 −/− post iskemik miokard (Şəkil 1E). Heyvanlarda sağ qalma nisbəti heyvanlara nisbətən daha yüksək idi Trem-1 +/+ (64%-ə qarşı 91%, P=0,008 Şəkil 1F). Yabanı tipli və 62,5% və 25% ölüm səbəbi ürək cırılmasıdır. Trem-1 −/− siçanlar, müvafiq olaraq (P<0.02).

Trem-1 Genetik Etibarsızlığı Beləliklə, Ürək Funksiyasını Təkmilləşdirdi və Mİ-dən Sonra Ölümdən Qorundu

Bu tapıntıları təsdiqləmək üçün biz 2 tamamlayıcı yanaşmadan istifadə etdik. TREM-1 aktivləşdirilməsi əvvəllər septik şok zamanı qoruyucu təsirlərə malik olduğunu bildirdiyimiz inhibitor peptidin (LR12) istifadəsi ilə məhdudlaşdırıla bilər. 8-10 Əksinə, TREM-1 agonistik mAb (Trem-1 mAb) ilə işə salına bilər. 6 mAb administrasiyası sağ qalma müddətini azaltsa da, LR12 müalicəsi ölüm nisbətinin azalması ilə əlaqələndirilmişdir, bu da müşahidə ediləndən fərqli deyildir. Trem-1 −/− (Şəkil 1F). Bundan əlavə, LR12 tətbiqi ürək funksiyasını yaxşılaşdırdı, infarkt ölçüsünü, apoptozu və fibrozu azaltdı (Şəkil 1C-1E).

Trem-1 infarktlı miokardda leykositlərin yığılmasına və aktivləşdirilməsinə nəzarət edir.

TREM-1 fitri immun sisteminin gücləndiricisi olduğundan, onun modulyasiyasının iltihab reaksiyasını tənzimləyə biləcəyini araşdırdıq.

Tədqiq etdiyimiz fitri toxunulmazlıqda iştirak edən 168 gen arasında 156-nın ifadəsi koronar arteriyaların bağlanmasından sonra, əsasən MI-dən 24 saat sonra miokardda dəyişdi. LR12 administrasiyası MI-induksiya etdiyi gen aktivləşdirilməsinə qarşıdır (Onlayn Cədvəl I). Xüsusilə ifadəsi Tnf-α, Il6, və Trem-1 azaldı və LR12 ilə müalicə olunan qrupda əlaqəli zülalların plazma konsentrasiyası azaldı (Şəkil 2A). LR12-nin tətbiqi həmçinin p38-MAPK və ERK1/2 fosforilasiyasını azaldıb, iNOS-un ifadəsini azaldıb və GSK-3β-nın fosforlaşmasını artırıb (Onlayn Şəkil I).

Şəkil 2. Miyeloid hüceyrələr-1 (Trem-1) üzərində ifadə edilən tetikleyici reseptor infarktlı miokardda leykositlərin yığılmasına və aktivləşməsinə nəzarət edir.. A, Kəmiyyəti Tnf-α, Il6, və Trem-1 miokard infarktından sonra müxtəlif vaxt nöqtələrində infarktlı miokardda gen ifadəsi (MI sol) və müvafiq zülalların plazma konsentrasiyası (sağ) 24 saatda n=5-dən 7-yə qədər *P<0.01 LR12scr digər qruplara qarşı, **P=0.008 Trem-1 −/− LR12 ilə müqayisədə. B, Miokardın miqdarının təyini Timp1Mmp9 LR12 və ya LR12scr ilə müalicə olunan vəhşi tip (WT) siçanlarda MI-dan sonra bir neçə zaman nöqtəsində gen ifadəsi (sağ) MI-dan sonra müxtəlif vaxt nöqtələrində infarkt sahəsinin in-gel zimoqrafiyası (orta) və MI-dən 24 saat sonra infarktlı ərazilərin immunohistokimyəvi toxuma bölmələri matris metalloproteinaz 9 (MMP9) ifadəsini təsvir edir (sol) n=5 qrup və hər zaman nöqtəsi, *P<0.01 və LR12. C, MI-dən 24 saat sonra infarktlı sahələrin nümayəndəsi immunohistokimyası ilə, axın-sitometrik qapaq strategiyası və monositlərin və makrofaqların kəmiyyətinin müəyyən edilməsi. D, İnfarktlı miokardın neytrofillərin infiltrasiyasının axını-sitometrik kəmiyyəti və miyeloperoksidazanın miokard konsentrasiyası və neytrofillərin infiltrasiyasını göstərən MI-dən 24 saat sonra işemik ürəyin nümayəndəli toxuma bölmələri. Bu təcrübələr üçün (CD), n=7-dən 10-a qədər siçan hər qrupa və hər zamana görə *P<0.01, **P<0,001 və LR12scr.

MI-dan 24 saat sonra, Mmp9 mRNT ifadəsi infarktlı bölgələrdə artmışdır (Şəkil 2B). LR12 müalicəsinin artması ilə əlaqələndirildi Timp-1 və azaldılır Mmp9 ifadələri.

Daha sonra iltihabın modulyasiyasının infarktlı ürəkdə iltihablı infiltrasiya edən hüceyrələrin sayının azalması ilə izah edilə biləcəyini araşdırdıq.

Axın sitometriyasından istifadə edərək, koronar ligasyondan sonra miokardda leykositlərin infiltrasiyasını təhlil etdik. Monositlərin və makrofagların sayı əhəmiyyətli dərəcədə azaldı Trem-1 −/− və LR12 ilə müalicə olunan siçanlar ilə müqayisədə Trem-1 +/+ (Şəkil 2C). Trem-1-in silinməsi və ya farmakoloji inhibəsi iltihablı Ly-6C yüksək monositləri tərəfindən infarktlı miokardın infiltrasiyasını demək olar ki, tamamilə ləğv etdi, halbuki Ly-6C-nin aşağı cəlb edilməsinə az təsir göstərdi (Şəkil 2C). Neytrofillərin infiltrasiyası nəzarət siçanlarında erkən (6 saat) başladı və həmçinin LR12 müalicəsi ilə bloklandı, həmçinin Trem-1 −/− heyvanlar (Şəkil 2D). Bu fenomen əvvəllər zədələnmiş ağciyərdə göstərilmişdir. 12

-nin təsiri Trem-1 neytrofillərin miqrasiyasında delesiya da in vitro müşahidə edildi: sümük iliyindən təmizlənmiş neytrofillərin MI heyvanlarından və ya ürəyin işemik lizatlarından alınan plazma ilə stimullaşdırılması ilə məsaməli filtrdən keçməsinə icazə verildi. Neytrofillərdən Trem-1 −/− vəhşi tip hüceyrələrlə müqayisədə miqrasiya azaldı. Lipopolisakkaridlərin yaratdığı neytrofillərin aktivləşməsi də yoxluğunda azalmışdır. Trem-1 (Onlayn Şəkil II).

Limfositlər tərəfindən ifadə edilməməsinə baxmayaraq, TREM-1 B- və T-hüceyrələrinin səfərbərliyinə təsir etdi: B- və CD8 + -limfosit infiltrasiyası azaldı, halbuki LR12 ilə müalicə olunan və nakavt siçanlarda CD4 + -hüceyrələrin toplanması dəyişmədi (Onlayn Şəkil III).

TREM-1 modulyasiyası beləliklə işemik miokardda leykositlərin yığılmasını məhdudlaşdırır.

Trem-1 Uzaq Bölmələrdən Leykositlərin Səfərbərliyini Tənzimləyir

Nəzarət heyvanlarında tac damarlarının bağlanmasından sonra, əvvəllər bildirildiyi kimi, 16 biz 24 saatda sümük iliyi və dalaq mənşəli monositlərin sayının azaldığını, ardınca 72 saatda dövran edən monositlərin sayında nəzərəçarpacaq artım müşahidə etdik (Şəkil 3A). Maraqlıdır ki, Trem-1-in genetik silinməsi və ya farmakoloji modulyasiyası 24 saatda dalaqda və sümük iliyində monositlərin yığılmasına və H72-də qanın azalmasına səbəb olub ki, Trem-1-in bloklanması monositlərin mobilizasiyasını azaldır.

Şəkil 3. Miyeloid hüceyrələr-1 (Trem-1) üzərində ifadə olunan tetikleyici reseptor uzaq bölmələrdən leykositlərin mobilizasiyasını tənzimləyir.. A, Monositlərin axın-sitometrik kəmiyyəti və (B) miokard infarktından (MI) sonra müxtəlif vaxt nöqtələrində dalaq, qan və sümük iliyində neytrofillər. C, MI-dan sonra Ccl-2, Ccl-7 və Cx3cl1 plazma konsentrasiyası. D, Ccl-2 konsentrasiyası və ürəkdəki neytrofillərin ifadəsi. Hər zaman nöqtəsində n=6 ilə 8 arasında *P<0.05 LR12scr vs LR12 və ya Trem-1 −/− . MCP monosit kemoatraktan zülalını göstərir.

Periferik qanda neytrofillərin sayı Mİ-dən 6 saat sonra artmışdır. Bu neytrofiliya müşahidə edilməmişdir Trem-1 −/− və ya LR12 ilə müalicə olunan siçanlar (Şəkil 3B). Mİ-dən sonra dövran edən B limfositlərinin sayı 72 saat artmış, CD4+ və CD8+ limfositlərin sayı isə əhəmiyyətli dərəcədə dəyişməmişdir. Trem-1-in bloklanması bu B-limfositlərin kinetik modellərinin qismən qarşısını aldı (Onlayn Şəkil IV).

Trem-1 inhibisyonu ilə törədilən leykositlərin mobilizasiyasının qüsurunu izah etmək üçün biz daha sonra kemokinlərə diqqət yetirdik. Monosit kemoatraktan zülal 1 (MCP-1 və ya Ccl2), Cx3cl1 (və ya Fraktalkine) və Mcp-3 (və ya Ccl7) müvafiq olaraq Ly-6C yüksək, Ly-6C aşağı monositlər və limfositlərin cəlb edilməsində iştirak edən mühüm kemokinlərdir. iltihablı yerlərə. Ccl-2-nin plazma və ürək konsentrasiyası erkən (6 saat) artdı, halbuki plazmada Ccl-7 və Cx3cl1 səviyyələri MI-dən sonra (24 saat) artdı. Ccl-2 və Ccl-7 səviyyələri azaldı, Cx3cl1 konsentrasiyası isə dəyişmədi Trem-1 −/− və LR12 ilə müalicə olunan siçanlar (Şəkil 3C). Miyokard neytrofilləri tərəfindən Ccl-2 istehsalı azalmışdır Trem-1 −/− və LR12 ilə müalicə olunan siçanlar (Şəkil 3D).

MI-dən sonra neytrofillər monositlərdən bir neçə saat əvvəl işemik miokardın içərisinə sızır (Şəkil 2C və 2D). Buna görə də, neytrofillərin Ccl-2 istehsalına cavabdeh ola biləcəyini fərz etdik ki, bu da sonradan ürəyə iltihablı monositləri cəlb edəcək. 1A8 antikorunun tətbiqi ilə siçanlarda neytrofillərin səmərəli şəkildə tükənməsinə nail olduq (Şəkil 4A). Neytrofilləri tükənmiş heyvanlarda Ccl-2-nin plazma konsentrasiyası azaldı və işemik miokardda çətinliklə aşkar edildi (Şəkil 4b). Bu məlumatlar göstərir ki, neytrofillər ürəkdə Ccl-2-nin mühüm hüceyrə mənbəyidir, baxmayaraq ki, başqa bir hüceyrə növü tərəfindən buraxılmasını tamamilə istisna edə bilmərik.

Şəkil 4. Neytrofillər miyeloid hüceyrələr-1 (TREM-1) modulyasiyasında ifadə olunan tetikleyici reseptorun əsas hüceyrə hədəfidir.. A, 1A8 antikoru ilə neytrofillərdə tükənmiş miokard infarktı (MI) siçanlarında müxtəlif vaxt nöqtələrində qan və ürək neytrofillərinin axını-sitometrik kəmiyyəti. B, Plazma və ürəkdə Ccl-2 konsentrasiyalarının ölçülməsi. AB, n=qrup və zaman nöqtəsinə görə 4-5 siçan *P1A8 heyvanlara qarşı <0,05. C, 1A8 antikoru ilə neytrofillərdə tükənmiş MI siçanlarında müxtəlif vaxt nöqtələrində qan və ürək monositlərinin axını-sitometrik kəmiyyəti. n=qrup və zaman nöqtəsinə görə 4-5 siçan *P1A8 heyvanlara qarşı <0,05. D, Kəmiyyəti Tnf-α, Il6, və Trem-1 Neytrofilləri tükənmiş siçanlarda MI-dan 24 saat sonra infarktlı miokardda gen ifadəsi n=4-5 nöqtədə *P<0.01 1A8-LR12 və 1A8. MCP monosit kemoatraktan zülalını göstərir.

Nəticədə, neytrofillərin tükənməsinin ürəkdə monositlərin infiltrasiyasının azalması ilə əlaqəli olduğunu müşahidə etdik (Şəkil 4C). LR12-dən 1A8-ə qədər müalicə olunan siçanların administrasiyası hüceyrə infiltrasiyasına əlavə təsir göstərmədi (göstərilmir), baxmayaraq ki, ürək iltihabı reaksiyasını daha da azaltdı (Şəkil 4D).

Nəhayət, LR12-nin limfositlərə təsirini istisna etmək üçün, bu hüceyrələrdə Trem-1 ifadəsinin olmaması səbəbindən çox qeyri-mümkün idi, biz təcrübələr apardıq. Rag-1 −/− heyvanlar. Limfositlərin olmaması halında, LR12 hələ də miokardın neytrofil infiltrasiyasının və aktivləşməsinin qarşısını ala bildi (göstərilmir).

Birlikdə götürdükdə, bu məlumatlar göstərir ki, MI-dən sonra Trem-1 inhibisyonu neytrofillərin toplanması və aktivləşdirilməsini azaldır, bu da öz növbəsində uzaq bölmədən monositlərin mobilizasiyasının azalmasına səbəb olur.

Trem-1 Modulyasiyası Siçovullarda MI-dan sonra ürək funksiyasını yaxşılaşdırır

Funksional analizləri daha da genişləndirmək üçün biz MI-nin siçovul modelinə keçdik. Daimi koronar arteriya ligasyonundan sonra 1 saat ərzində siçovulların infarkt uzanmasını və mədəciklərin həcmini müəyyən etmək üçün 18F-fluorodeoksiqlükoza ilə pozitron emissiya tomoqrafiyası ilə təsviri aparıldı və sonra 5 gün ərzində LR12 və ya nəzarət peptidinin (LR) intraperitoneal inyeksiyasını almaq üçün kor-koranə randomizə edildi. Mİ-dən altı həftə sonra siçovullar yenidən sol mədəciyin keçirici kateterindən istifadə edərək fluorodeoksiqlükoza-pozitron emissiya tomoqrafiyası (Onlayn Şəkil V) və invaziv hemodinamikanın tədqiqatlarına məruz qaldılar. 2 heyvan qrupu ilkin olaraq oxşar idi. Mİ-dən altı həftə sonra nəzarət heyvanlarında sol mədəciyin ciddi genişlənməsi baş verdi: bu patoloji mədəciyin yenidən qurulması LR12 tərəfindən qismən qarşılandı (Cədvəl). Qalan siçovullarda mədəcik aritmiyaları səbəbindən 18 LR12scr-dən 12-si və LR12 ilə müalicə olunan 17 heyvanın 12-si üçün invaziv hemodinamik məlumatlar mövcud idi. Əsas yükdən asılı olmayan sistolik və diastolik miokard funksiyası parametrləri LR12 müalicəsi ilə yaxşılaşdırıldı (Onlayn Şəkil VI). Oxşar nəticələr işemiya-reperfuziya modelində əldə edilmişdir (Onlayn Şəkil VII).

Cədvəl. Mİ-dən sonra 1-ci gün və 6-cı həftələrdə siçovullarda ürək funksiyasının FDG-PET tərəfindən qiymətləndirilməsi

P dəyərlər LR12scr və LR12 qruplarının müqayisəsi üçündür. EDV son diastolik həcmi ESV, son sistolik həcmi FDG-PET, flüorodeoksiqlükoza-pozitron emissiya tomoqrafiyası HR, ürək dərəcəsi MI, miokard infarktı və SAP, sistolik arterial təzyiqi göstərir.

Beləliklə, TREM-1 modulyasiyası siçovullarda MI-dan sonra mədəciklərin yenidən qurulmasının və sistolik-diastolik disfunksiyanın qarşısını aldı.

Kəskin koronar xəstəliyi olan xəstələrdə həll olunan TREM-1-in plazma konsentrasiyası

TREM-1 aktivləşməsi onun plazmada həll olunan formasının (sTREM-1) ölçülməsi ilə qiymətləndirilə bilər. Perspektivli, çoxmərkəzli Fast-MI-də (NCT00673036) qeydiyyatdan keçmiş 1015 xəstədən ibarət kohortda dövriyyədə olan sTREM-1 plazma konsentrasiyaları ilə sağ qalma arasında əlaqəni qiymətləndirərək eksperimental tapıntılarımızın insan xəstəliyi ilə bağlılığını nəzərdən keçirdik. Qeydiyyata alınan 1015 xəstədən 14,15-i 2 illik izləmə müddətində 154 xəstə (15%) öldü. Kəskin MI olan xəstələrdə qəbul zamanı artan sTREM-1 konsentrasiyasının yaş, cins, bədən kütləsi də daxil olmaqla bir neçə çoxdəyişkən risk faktoru üçün düzəlişlərdən sonra belə 2 illik təqibdən sonra yüksək ölüm riski ilə əlaqəli olduğunu aşkar etdik. indeks, diabetes mellitus, siqaret çəkmə statusu, hipertoniya, əvvəlki Mİ tarixi, insult, xroniki ürək və ya böyrək çatışmazlığı, sol mədəciyin ifrazı fraksiyası, reperfuziya terapiyası daxil olmaqla xəstəxananın idarə edilməsi, statinlər daxil olmaqla tövsiyə olunan dərman müalicəsi və C-reaktiv protein. sTREM-1-in 1 pq/mL artması ilə bağlı düzəliş edilmiş ölüm təhlükəsi nisbəti 2,22 (95% etibarlılıq intervalı, 1,69-2,93) təşkil etmişdir. P<0,0001), 2 0,29 (95% etimad intervalı, 1,71–3,06) P<0,0001) modelə kreatin kinaz əlavə edilmiş və 2,18 (95% güvən intervalı, 1,61–2,94) P<0,0001) troponin I ilə.

sTREM-1 və kreatin kinaz arasında heç bir əlaqə yox idi (R=0.018 P=0,57) və ya sTREM-1 və troponin I arasında (R=0.012 P=0.72).

sTREM-1-in ilkin üçlü səviyyələrindən asılı olaraq nəticə hadisələrinin baş vermə ehtimalı Şəkil 5-də təqdim olunur. Yuxarıdakı kimi eyni dəyişənlərlə düzəliş edildikdən sonra, sTREM-1 plazma konsentrasiyası 2 il ərzində ölüm riskinin müstəqil korrelyasiyası olaraq qaldı ( İstinad kimi seçilmiş üçüncü tertile 1 ilə müqayisədə müvafiq olaraq 1,65 [0,87–3,10] və 3,11 [1,72–6,64] tertile 2 və tertile 3 üçün düzəliş edilmiş təhlükə nisbəti, P<0,0001).

Şəkil 5. Miyeloid hüceyrələr-1 (sTREM-1) üzərində ifadə edilən həll olunan tetikleyici reseptorun plazma konsentrasiyası insanlarda miokard infarktından (MI) sonra 2 il sonra ölümü proqnozlaşdırır. Kəskin MI olan xəstələrdə həll olunan TREM-1-in plazma konsentrasiyasına görə sağ qalma əyriləri. Sağ qalma təxminləri log-rank testindən istifadə etməklə müqayisə edilir. HR təhlükə nisbətini göstərir.

Müzakirə

MI klinik sınaqlarında həll oluna bilən hüceyrə və ya molekulyar hədəfləri deşifrə etmək üçün xeyli iş aparılmışdır, lakin məyusedici nəticələr əldə edilmişdir. 17,18,19 Burada MI tərəfindən tetiklenen iltihablı reaksiyanın təşkilində TREM-1-in rolunu nümayiş etdirmək üçün bir neçə tamamlayıcı heyvan modelindən, eləcə də xəstələrin nümunələrindən istifadə etdik. Trem-1-in genetik etibarsızlığı və ya farmakoloji blokadası iltihablı hüceyrələrin infarktlı miyokardda toplanmasına və onların aktivləşməsinə mane olur. Bu, infarkt ölçüsünün azalmasına və ürək funksiyasının və sağ qalma qabiliyyətinin yaxşılaşmasına çevrilir. Kəskin MI üçün qəbul edilən xəstələrin ümummilli qrupundan istifadə edərək, qəbul zamanı həll olunan TREM-1 plazma konsentrasiyasının (TREM-1 aktivləşdirilməsinin markeri) 2 illik izləmə zamanı güclü proqnozlaşdırıcı ölüm faktoru olduğunu müşahidə etdik.

İnfarktın sağalması və çapıq əmələ gəlməsinin həlledici determinantı yığılmış leykositlərin növü və miqdarı arasında zərif tarazlıqdadır. 3 İşemiyadan sonra sürətlə zədələnmiş miokardda neytrofillər toplanır və həddindən artıq olduqda belə ekstravazasiyanın zərərli olduğu düşünülür. Trem-1 inhibisyonu, neytrofillərlə miokard infiltrasiyasını demək olar ki, tamamilə ləğv etdi. Bu yaxınlarda belə bir fenomen Trem-1 inhibisyonunun neytrofillərin transepitelial miqrasiyasını maneə törətdiyi pnevmoniya zamanı təsvir edilmişdir. 12 Neytrofillərdən qısa müddət sonra iltihablı Ly-6C yüksək monositləri yığılır ki, nəzarət edilmədikdə infarktın genişlənməsinə və mədəciklərin yenidən qurulmasına səbəb ola bilər. Bu iltihablı alt dəst tədricən iltihabın həllini və hüceyrədənkənar matrisin yenidən təşkilini təşviq edən reparativ Ly-6C aşağı monositləri ilə əvəz olunur. 2 Dalaq MI zamanı monositlər üçün vacib bir anbardır. 16 Biz burada müşahidə etdik ki, Trem-1 təkcə dalaq monositlərinin çıxışına deyil, həm də sümük iliyindən mobilizasiyaya və miokard infiltrasiyasına vasitəçilik edir. Üstəlik, Trem-1 inhibisyonu Ccl-2 istehsalını azaltsa və beləliklə, Ly-6C yüksək hüceyrələrinin yığılmasının qarşısını alsa da, Cx3cl1 tərəfindən tetiklenen Ly-6C aşağı monositlərin cəlb edilməsini pozmur. Limfositlər də az sayda olsa da, infarkt bölgəsində mövcuddur və MI-dən sonra sürətlə çoxalırlar. Limfosit alt qruplarının dəqiq rolu aydın deyil, lakin son sübutlar B hüceyrələrinin zərərli təsirini göstərir, 4 halbuki CD4 + T hüceyrələri yaraların sağalmasını və Ly-6C yüksəkliyindən Ly-6C aşağı monositlərə keçidi asanlaşdırır. 20 Yenə də Trem-1 limfositlərin, xüsusilə sitotoksik CD8+ və B hüceyrələrinin toplanmasında vasitəçilik etməkdə mühüm görünür. Əksinə, Trem-1 inhibisyonu CD4 + işə qəbulunu dəyişdirmir. Dəqiq mexanizmlər hələ aydınlaşdırılmasa da, bütün bu məlumatlar Trem-1-in həm kəmiyyət, həm də keyfiyyətcə leykositlərin cəlb edilməsində mühüm rol oynadığını göstərir.

Trem-1 müxtəlif iltihablı xəstəliklər zamanı immun cavabın gücləndiricisidir. 6 Eyni şeyin MI-dan sonra da keçdiyini göstəririk: Trem-1 inhibisyonu iltihablı geni və protein aktivasiyasını azaldır və sitokin/kemokin istehsalını azaldır. MMP-lərin inhibe edilməsi MI-dan sonra ölümcül ürək yırtığı və mədəciklərin yenidən qurulması riskini azaldır. Miyeloid hüceyrələr, xüsusilə neytrofillər, infarktlı miokardda Mmp9-un əsas mənbəyidir. 13 Trem-1 inhibisyonu, miyeloid hüceyrələrin infiltrasiyasını azaltmaqla, Mmp9 ifadəsini və fəaliyyətini azaldır, Timp1 ifadəsini yaxşılaşdırır. Bu, zədələnmiş miokardda ümumi MMP fəaliyyətinin azalmasına səbəb olur və beləliklə, yenidən qurulmasının qarşısını ala bilər.

Dərhal sağ qalmağı yaxşılaşdırmaqla yanaşı, Mİ-nin müalicəsinin məqsədləri onun əsas gec başlanğıc nəticəsi olan xroniki ürək çatışmazlığının inkişafının qarşısını almaqdır. Buna görə də biz 2 tamamlayıcı üsuldan istifadə edərək siçovullarda MI-dan sonra Trem-1 modulyasiyasının nəticələrini öyrəndik: microTEP görüntüləmə və invaziv hemodinamik tədqiqat. Daimi miokard işemiyasının başlanmasından altı həftə sonra, sol mədəciyin funksiyası pozulmuş olaraq qalır və mədəciyin əhəmiyyətli yenidən qurulması baş verdi. Trem-1 inhibitoru olan heyvanların qısa müalicəsi (ilk 5 gün ərzində) mədəciklərin bu genişlənməsinə qarşı çıxır və mədəciklərin sistolik və diastolik funksiyalarını yaxşılaşdırır. Biz həmçinin miokard işemiyası-reperfuziya zamanı ürək funksiyasının yaxşılaşmasını təsdiqlədik.

Trem-1-in inhibəsinin yalnız MI-dan sonra ilk 5 gün ərzində baş verdiyini nəzərə alaraq (LR12-nin yarımxaricolma dövrü qısadır), 8 beləliklə, biz fərz edirik ki, iltihab reaksiyasının ilkin modulyasiyası bu gec başlayan mədəcik funksiyasının yaxşılaşmasına cavabdeh olmalıdır.

Çox vaxt heyvan tapıntılarının insan patologiyasına çevrilməsi ilə bağlı suallar yaranır. 5 TREM-1-in insanlarda da rol oynaya biləcəyini deşifrə etmək üçün kəskin MI olan xəstələrin plazmasında onun həll olunan formasını ölçdük. Kəskin MI üçün qəbul edilən xəstələrin ümummilli qrupundan istifadə edərək, qəbul zamanı həll olunan TREM-1 plazma konsentrasiyasının 2 illik təqib zamanı ölüm riski ilə əlaqəli olduğunu müşahidə etdik. Əhəmiyyətli olan odur ki, sTREM-1 konsentrasiyası reperfuziya terapiyası və tövsiyə olunan tibbi dərmanlar kimi terapevtik idarəetmə də daxil olmaqla, nəticəyə təsir etdiyi bilinən bütün parametrlər üçün düzəlişlərdən sonra belə proqnozlaşdırıcı olaraq qalır. Beləliklə, TREM-1 xəstələrdə MI zamanı əhəmiyyətli bir vasitəçi kimi görünür.

Nəticə olaraq, nəticələrimiz göstərir ki, TREM-1 MI-dən sonra iltihablı hüceyrələrin yığılması və aktivləşdirilməsinə nəzarət etməkdə böyük rol oynayır. TREM-1 modulyasiyası mədəcik disfunksiyasının qarşısını almağa qadirdir. Nəhayət, TREM-1 aktivləşdirilməsi kəskin MI-dan sonra xəstələrdə ölümün müstəqil nəticəsidir. Terapevtik təsirlərə nail olmaq üçün TREM-1 fəaliyyətini manipulyasiya etmək bacarığı perspektivli görünür və infarkt sonrası xroniki ürək çatışmazlığının epidemik inkişafını nəhayət azaltmaq məqsədi ilə daha da tədqiq edilməlidir.


Reaktiv Oksigen Növlərinə Giriş - Hüceyrələrdə ROS-un ölçülməsi

Reaktiv Oksigen Növləri (ROS) uzun müddətdir ki, immun hüceyrələrin mikrob işğalına öldürücü reaksiyasının tərkib hissəsidir. Son sübutlar göstərdi ki, ROS normal hüceyrə siqnalının ötürülməsində və hüceyrə dövrəsində xəbərçi kimi əsas rol oynayır. Bu reaktiv molekullar bir sıra müxtəlif mexanizmlərlə əmələ gəlir və müxtəlif üsullarla aşkar edilə bilər. Burada biz bu molekulların bəzilərinin arxasında duran biologiyanı və onların aşkarlanması vasitələrini qısaca təsvir edirik.

Giriş

Reaktiv Oksigen Növləri (ROS) bir sıra reaktiv molekulları və molekulyar oksigendən əldə edilən sərbəst radikalları təsvir etmək üçün istifadə edilən bir ifadədir. Oksigen əsaslı radikalların istehsalı bütün aerob növlər üçün bəladır. Aerob tənəffüsün mitoxondrial elektron daşınması zamanı və ya oksidoreduktaza fermentləri və metal katalizli oksidləşmə zamanı əlavə məhsul kimi istehsal olunan bu molekullar bir sıra zərərli hadisələrə səbəb ola bilər. Əvvəlcə hesab olunurdu ki, yalnız faqositik hüceyrələr ev sahibi hüceyrə müdafiə mexanizmlərinin bir hissəsi kimi ROS istehsalına cavabdehdirlər. Son işlər ROS-nun apoptoz geninin ifadəsi və hüceyrə siqnal kaskadlarının aktivləşdirilməsi daxil olmaqla hüceyrə siqnalında rolunun olduğunu nümayiş etdirdi [1]. Qeyd etmək lazımdır ki, ROS həm hüceyrədaxili, həm də hüceyrələrarası messencer kimi xidmət edə bilər.

Reaktiv oksigen növlərinin növləri

Əksər reaktiv oksigen növləri mitoxondrial elektron nəqli zamanı əlavə məhsullar kimi əmələ gəlir. Bundan əlavə, ROS metal katalizli oksidləşmə reaksiyalarının zəruri ara məhsulları kimi əmələ gəlir. Atom oksigeninin xarici elektron qabığında ayrı-ayrı orbitlərdə iki qoşalaşmamış elektron var. Bu elektron strukturu oksigeni radikal formalaşmaya həssas edir. Elektronların əlavə edilməsi yolu ilə oksigenin ardıcıl azaldılması bir sıra ROS-ların əmələ gəlməsinə səbəb olur, o cümlədən: superoksid hidrogen peroksid hidroksil radikal hidroksil ionu və azot oksidi. (Şəkil 1).

Şəkil 1. Ümumi reaktiv oksigen növlərinin elektron strukturları. Hər bir strukturun adı və kimyəvi formulu verilir. Qırmızı və öküz qoşalaşmamış elektronu təyin edir.

ROS-a qarşı hüceyrə müdafiəsi

Reaktiv oksigen növlərinin detoksifikasiyası bütün aerob həyat formalarının sağ qalması üçün çox vacibdir. Bu ehtiyacı ödəmək və ROS-un istehsalı və çıxarılması arasında tarazlığı təmin etmək üçün bir sıra müdafiə mexanizmləri inkişaf etmişdir. Pro-oksidləşdirici vəziyyətə qarşı balanssızlığa çox vaxt &ldquoOksidləşdirici stress&rdquo deyilir.

Hüceyrələr ROS-un zərərli təsirlərini yaxşılaşdırmaq üçün müxtəlif müdafiə mexanizmlərinə malikdir. Superoksid dismutaz (SOD) iki superoksid anionunun hidrogen peroksid (H) molekuluna çevrilməsini katalizləyir.2O2) və oksigen (O2) [3] (Təsvir 1). Eukaryotik hüceyrələrin peroksizomlarında katalaza fermenti H2O2 suya və oksigenə keçir və beləliklə, SOD tərəfindən başlanan detoksifikasiyanı tamamlayır (Eq. 2). Qlutatyon peroksidaza, hidrogen peroksidin, eləcə də üzvi peroksidlərin spirtlərə parçalanmasını kataliz edən selenium tərkibli fermentlər qrupudur.

Detoksifikasiyada rol oynayan bir sıra enzimatik olmayan kiçik molekullu antioksidantlar var. Glutatyon reaktiv oksigen növlərinin zərərli təsirlərinə qarşı ən vacib hüceyrədaxili müdafiə ola bilər. Bu tripeptid (qlutamil-sisteinil-qlisin) hücum üçün bol bir hədəf kimi xidmət edən məruz qalmış sulfhidril qrupu təmin edir. ROS molekulları ilə reaksiyalar glutatyonu oksidləşdirir, lakin azalmış forma NADPH-dən asılı reduktaza tərəfindən redoksda bərpa olunur. Vitamin C və ya askorbin turşusu ROS-u azalda bilən suda həll olunan molekuldur, E vitamini (&alfa-tokoferol) isə membranlarda oxşar rol oynadığı irəli sürülən lipiddə həll olunan molekuldur.

Qlutatyonun oksidləşmiş forması (GSSG) ilə azaldılmış formasının (GSH) nisbəti orqanizmin oksidləşdirici stressinin dinamik göstəricisidir [2].

Oksidləşdirici stressə reaksiya

Reaktiv oksigen növlərinin hüceyrə proseslərinə təsiri təsirin gücü və müddətindən, eləcə də məruz qalma kontekstindən asılıdır. Stressə tipik hüceyrə reaksiyası hüceyrə dövründən çıxmaq və G-yə daxil olmaqdır0. Davamlı məruz qalma və/və ya yüksək ROS səviyyələri ilə apoptoz mexanizmləri işə salınır. Velosiped hüceyrələrində p21 oksidləşdiricilər və ya oksidləşdirici stress kimi stresə cavab olaraq aktivləşir və hüceyrə dövrünün irəliləməsini bloklayır [4]. Eyni şəkildə p27 istehsalı G-yə gətirib çıxarır1 hüceyrələrin tutulması. Velosiped hüceyrələrində p53 və p21 retinoblastomanın (RB) defosforilasiyasını induksiya edərək oksidləşdiricilərə cavab verir. H kimi oksidləşdiricilərə məruz qalma2O2 və ya azot oksidi də p53 və ya p21-dən asılı olmayan RB-nin defosforilasiyası ilə nəticələnir. Hər iki halda hüceyrələr S-fazasında həbs edilir. p27-nin ifadəsi qismən hüceyrə dövrünün irəliləməsi, metabolizm və oksidləşdirici stress reaksiyasında iştirak edən genlərin ifadəsini idarə etdiyi məlum olan Foxo transkripsiya faktorları tərəfindən idarə olunur [5]. Məsələn, PI3K/Akt yolu ilə mitogen stimullaşdırma Foxo3a-nı sitoplazmada saxlayır, lakin stimullaşdırma olmadıqda Foxo3a nüvəyə daxil olur və oksidləşdirici maddələr mübadiləsi və hüceyrə dövrünün dayanması üçün genləri tənzimləyir, məsələn p27 [5]. Bəzi şərtlərdə Foxo3a birbaşa bim gen ifadəsini aktivləşdirə və apoptozu təşviq edə bilər. [6]. Beləliklə, Foxo3a stress reaksiyasını təmin etməklə oksidləşdirici stress altında velosiped hüceyrələrinin sağ qalmasına kömək edir, lakin şərait lazım olduqda hüceyrə ölümünə səbəb olur. Neyronlar kimi dövran etməyən hüceyrələr də Foxo3a-nı əhatə edən oksidləşdirici stresslə mübarizə mexanizmlərinə malikdir. Foxo3a oksidləşdirici stresə cavab olaraq SOD-nun manqan formasının ifadəsini induksiya edir [7].

ROS istehsalının tənzimlənməsi

Faqositik hüceyrələr tərəfindən reaktiv oksigen növlərinin stimullaşdırılmış istehsalı bu hüceyrələr tərəfindən oksigen istehlakının artması səbəbindən əvvəlcə &ldquotthe tənəffüs partlaması&rdquo adlanırdı [8]. Bu proses çoxkomponentli membrana bağlı ferment kompleksi olan NADPH oksidazının təsiri ilə katalizlənir və faqositlərin bakterisid təsiri üçün zəruridir [8].

Bir neçə fermentin ROS hissələrini istehsal edə bildiyi tanınsa da, NADPH oksidaz ən əhəmiyyətlidir [9]. NADPH oksidaz aktivliyi G-protein Rac [10] daxil olan kompleks tənzimləyici sistem tərəfindən idarə olunur (Şəkil 2).

İstirahətdə olan hüceyrələrdə iki polipeptidin (p22-phox və gp91-phox) membrana daxil edilmiş heterodimeri, həm də iki hem qrupunu, həm də bir FAD qrupunu ehtiva edir, membran boyunca sitozolik NADPH-dən elektronların NADPH oksidazı olmadan molekulyar oksigenə ötürülməsinə imkan verir. fəaliyyət [9].

Güman edilir ki, yük kompensasiyası gp91-fox polipeptidi də H+ ion kanalı kimi çıxış etdikdə baş verir. Stimullaşdırıldıqdan sonra bir sıra polipeptidlər (p47-phox, p67-phox və p40phox) NADPH oksidaz aktivliyinə malik tam aktiv ferment kompleksi yaratmaq üçün plazma membranının daxili üzünə keçir. Oxşar prosesin faqositik olmayan hüceyrələrdə də baş verdiyi güman edilir [11].

Şəkil 2. NADPH oksidazanın aktivləşdirilməsinin sxematik təsviri.

Reaktiv oksigen növləri bir sıra hüceyrə proseslərində rol oynayır. Hüceyrə zədələnməsinə, oksidləşdirici stressə və DNT zədələnməsinə səbəb ola bilən yüksək ROS səviyyələri məruz qalmanın şiddətindən və müddətindən asılı olaraq ya hüceyrə sağ qalma, ya da apoptoz mexanizmlərini ortaya çıxara bilər. Nitrik oksidin (&bullNO) qan təzyiqinin azalması kimi təsirlərdən məsul olan hüceyrədən hüceyrəyə xəbərçi kimi xidmət etdiyi göstərilmişdir [12]. Hüceyrədaxili olaraq, ROS növlərinin antioksidant fermentlərlə birlikdə cAMP ikinci xəbərçi sisteminə bənzər şəkildə redoks siqnalı ilə fermentlərin açılmasında və söndürülməsində rol oynadığına inanılır [12]. Nümunələrə superoksid anionu, hidrogen peroksid daxildir. &bullO sabit dövlət səviyyəsi2 - o qədər aşağı olduğu təxmin edilir, lakin onun fəaliyyəti məkan baxımından məhduddur. Hidrogen peroksid (H2O2) katalizatorlar (məsələn, fermentlər,&rdquo çoxvalent metallar və s.) olmadıqda tiollarla normal olaraq reaksiya vermir, tiolat anionu (S-) ilə reaksiyaya girərək sulfen turşusu əmələ gətirir, bu da öz növbəsində ionlaşaraq sulfenat (SO-) əmələ gətirir. . Bu aralıq glutatyonun təsiri ilə geri qaytarıla bilər [13].

Hüceyrə səthində mitogen siqnalizasiya reseptor tirozin kinazalarının liganddan asılı aktivləşməsi ilə başlayır ki, bu da proliferasiya üçün zəruri olan mühüm MAP kinaz kaskadlarını aktivləşdirir. Bu kaskadlar H2O2 bir neçə ferment katalizatorundan, o cümlədən NADPH oksidazlarından [14]. H. istehsalının olduğu təxmin edilmişdir2O2 böyümə faktorlarına cavab olaraq proliferasiya üçün nanomolyar səviyyədə tələb olunur [15]. Hidrogen peroksid həm SOS-Ras-Raf-ERK, həm də PI3K/Akt yolları ilə bir neçə mexanizm vasitəsilə və ondan asılı olaraq qarşılıqlı əlaqədə olur (Şəkil 3). H.-də kiçik artımların olduğu irəli sürülür2O2, Nox1 ifadəsi nəticəsində hüceyrə dövrünə yenidən daxil olmanın artması ilə nəticələnir, eyni zamanda yüksək H səviyyəsi saxlanılır.2O2 hüceyrə həbsinə və uzun müddət həbsdən sonra apoptoza səbəb olur.

Peroksidoksinlər H2O2 və mitogen siqnalizasiya. Bu tioldan asılı peroksidazlar aktivləşir və mitogen stimullaşdırmanın bir hissəsi kimi reseptorlara cəlb olunur və ROS ilə əlaqəli stimullaşdırmanın mitogen şəlaləsinin aşağı axını hədəflərinə təsirini məhdudlaşdırmağa xidmət edir [16]. (Şəkil 3).

Hüceyrə dövrünə nəzarət: Redoks siqnalı

Hüceyrələr çoxaldıqca, hüceyrə böyüməsi, DNT-nin çoxalması və hüceyrə dövrü adlanan mitozun koordinasiyalı prosesindən keçirlər. Hüceyrə dövrü bir neçə nəzarət nöqtəsi ilə sıx tənzimlənən bir prosesdir. Bu nəzarət nöqtələrinin hər biri hüceyrənin oksidləşdirici vəziyyətindən təsirlənən zülallar və zülal kompleksləri tərəfindən tənzimlənir. Redoks vəziyyəti ilə hüceyrə dövrünə nəzarət arasındakı əlaqə Heintz və Burhans [5] tərəfindən edilən araşdırmada ətraflı təsvir edilmişdir.

Çoxhüceyrəli heyvanlarda hüceyrələrin əksəriyyəti çoxalmır və terminal differensiasiya yolu ilə ya müvəqqəti, ya da daimi olaraq hüceyrə dövründən ayrılır. G.-nin çıxışı0 və G-ə daxil olmaq1 hüceyrədənkənar böyümə faktorlarına cavab olaraq oksidantlar tərəfindən idarə olunur. Redoksdan asılı siqnal yolları hüceyrə dövrünə yenidən daxil olmaq üçün əsas zülal olan Cyclin D1 [17] ifadəsini təşviq edir. Beləliklə, siklin D1 ifadəsinin müvəffəqiyyətli mitogen stimullaşdırma üçün bir marker olduğu bildirildi [15]. Əsas tənzimləmə nöqtəsi G1 məhdudiyyət nöqtəsidir (və ya R nöqtəsi), burada hüceyrələrin S-fazasına daxil olmaq öhdəliyi verilir. R nöqtəsində retinoblastoma (pRB) zülalı Cyclin D/CDK kompleksləri ilə fosforilləşir. Maraqlıdır ki, kifayət qədər tədqiqatlar göstərmişdir ki, pRB fosforilasiyası üçün təqribən -207 mV-lik redoks potensialı mövcuddur, ondan yuxarı hüceyrələr pRB fosforsuzlaşır və hüceyrələr dövranını dayandırır [18]. Qeyd edilmişdir ki, sinxronlaşdırılmış hüceyrələrdə ROS istehsalı hüceyrə dövrü ərzində artır və pik səviyyələr G2/M fazasında baş verir [19].

Reaktiv oksigen növləri apoptozda rol oynayır. Rel transkripsiya faktorları ailəsini təsvir etmək üçün kollektiv termin olan NF-kB bir neçə antiapoptotik geni tənzimləməklə apoptozu maneə törədir [17]. Əksinə, c-Jun N-terminal kinaz (JNK) uzun müddət aktivləşdirildikdə apoptozu təşviq edir [20]. Uzun müddət aktivləşmənin birbaşa ROS-a məruz qalması, həmçinin MAP Kinase fosfatazları kimi JNK inhibitorlarını təsirsiz hala gətirməsi ilə göstərilmişdir [20]. TNF-&alfa-induksiya etdiyi ROS yığılmasının yatırılması, NF-kB-nin JNK aktivasiyasını aşağı tənzimləmə mexanizmi kimi görünür.

Şəkil 3. ROS və mitogen şəlalələrin bildirilmiş qarşılıqlı təsirlərinin sxematik təsviri.

Reaktiv oksigen növlərinin ölçülməsi

Reaktiv oksigen növlərinin ölçülməsi sözügedən reaktiv oksigen növləri ilə yanaşı analitik hədəfdən asılıdır. Hüceyrə səviyyəsində spesifik ROS fərdi olaraq toxuma mədəniyyətindən qiymətləndirilə bilər, heyvan səviyyəsində isə oksidləşdirici stressin təsiri adətən qan məhsulundan (məsələn, serum və ya plazma) və ya sidik nümunələrindən ölçülür.

Glutatyon ən əhəmiyyətli ferment olmayan oksidləşdirici müdafiə mexanizmidir. Nisbətən böyük miqdarda (mM səviyyələrində) mövcuddur və peroksidləri zərərsizləşdirməyə və bir sıra vacib antioksidantları (məsələn, &alfa-tokoferol və askorbin turşusu) bərpa etməyə xidmət edir [21].

Azaldılmış qlutatyon (GSH) NADPH-dən asılı reduktazanın təsiri ilə oksidləşmiş formasından (GSSG) bərpa olunur (Eq. 3).

eq. 3. GSSG + NADPH + H+ &rarr 2 GSH + NADP+

GSSG-nin sintezinə və ya ifrazına nisbətən sürətli azalması səbəbindən, GSH-nin GSSG-yə nisbəti hüceyrələrdə oksidləşdirici stressin yaxşı göstəricisidir. GSH və GSSG səviyyələri HPLC [22], kapilyar elektroforez [23] və ya biokimyəvi olaraq mikroplitələrdə [24] təyin oluna bilər.

Nümunələrdəki glutatyonu ölçmək üçün bir neçə fərqli analiz hazırlanmışdır. Qlutatyon S-transferaza fermenti ilə birlikdə lusiferin törəməsi istifadə edilməklə, GSH miqdarı sonrakı mərhələdə lusiferaza əlavə edildikdə yaranan lüminesans siqnalına mütənasib olacaqdır [25]. Glutatyon redüktazın iştirakı ilə GSH-ni DTNB (Ellman rsquos reagenti) ilə reaksiya verməklə ümumi glutatyon kolorimetrik olaraq təyin edilə bilər. Qlutatyon reduktaza GSSG-ni GSH-yə endirir, daha sonra 412 nm-də udulan sarı rəngli 5-tio-2-nitrobenzoy turşusu (TNB) yaratmaq üçün DTNB ilə reaksiya verir.

Hüceyrəaltı redoks statusunun modulyasiyasını, dərmanların təsirini və detoksifikasiya mexanizmlərini başa düşmək üçün GSH-nin hüceyrəaltı aşkarlanması və lokalizasiyası vacibdir. Bundan əlavə, hüceyrələrin subpopulyasiyalarında oksidləşdirici stresə cavab olaraq GSH səviyyələrində fərqlər bildirilmişdir ki, bu da axın sitometriyası və avtomatlaşdırılmış flüoresan aşkarlanması üçün uyğun olan aşkarlama üsullarının əhəmiyyətini vurğulayır.

Birləşənə qədər mahiyyətcə flüoresan olmayan monobromobiman və monoxlorobiman birləşmələri aşağı molekulyar ağırlıqlı tiollarla, o cümlədən qlutatyonla asanlıqla reaksiyaya girərək 394 nm həyəcan dalğası və emissiya [4264 nm] olan flüoresan əlavələr əmələ gətirir. Bu reagentlər disulfidlərin kimyəvi reduksiyasından əvvəl və sonra hüceyrələrdə protein tiollarının paylanmasını aşkar etmək üçün faydalıdır. Monoxlorobiman, monobromobimandan daha çox tiol seçicidir, uzun müddətdir hüceyrələrdə qlutatyon səviyyələrini ölçmək və GST aktivliyini ölçmək üçün üstünlük verilən tiol-reaktiv prob olmuşdur [27]. Monoxlorobimanın mavi-flüoresan glutatyon əlavəsi nəticədə nüvədə toplandığı üçün bu, hüceyrə qlutatyonun nüvə və sitoplazmik paylanmasının etibarlı göstəricisi deyildir [28].

Şəkil 4. Biman quruluşu və tiollarla reaksiya. Monobromobiman və monoxlorobiman müvafiq olaraq 3 mövqeli metil qrupunda yerləşən Br və ya Cl atomuna malikdir və flüoresan deyildir. Bu reaktiv qrup 394 nm həyəcanlanma maksimumu və 490 nm emissiya dalğası ilə flüoresan əlavələr yaratmaq üçün aşağı molekulyar ağırlıqlı tiollarla qarşılıqlı əlaqə qurur.

ThiolTracker&trade Violet (Life Technologies) axın sitometriyası və flüoresan mikroskopiyadan istifadə edərək hüceyrə analizində istifadə üçün bütöv hüceyrələrdə azalmış tiollarla reaksiya verir. ThiolTracker&trade Bənövşəyi reagent canlı hüceyrə membranlarını keçə bilər, hüceyrə tiolları ilə reaksiya verdikdən sonra sellimpermeant olur. Onun 404 nm həyəcanlandırma və 526 nm emissiya dalğa uzunluğu DAPI filtr dəstləri ilə təsvir etmək üçün uyğundur. İstehsalçı tərəfindən bimane birləşmələrindən 10 qat daha parlaq olduğu bildirilir.

Lipidlərin peroksidləşməsi sərbəst radikalların əmələ gəlməsinin ən çox istifadə edilən göstəricilərindən biridir, oksidləşdirici stressin əsas göstəricisidir. Hüceyrə membranlarında olanlar kimi doymamış yağ turşuları sərbəst radikallar üçün ümumi hədəfdir. Reaksiyalar adətən zəncirvari reaksiya kimi baş verir, burada sərbəst radikallar doymamış karbondan hidrogen hissəsini tutaraq su əmələ gətirir. Bu, yağ turşusunda daha sonra oksigeni tutmaq və peroksi radikalı əmələ gətirmək qabiliyyətinə malik olan qoşalaşmamış elektron buraxır (Şəkil 5). Lipid peroksidləri qeyri-sabitdir və malondialdehid (MDA) kimi reaktiv karbonil birləşmələrini ehtiva edən kompleks birləşmələr seriyası yaratmaq üçün parçalanır.

Şəkil 5. Lipidlərin peroksidləşməsinin təsviri.

Lipid peroksidləşməsinin ölçülməsi tarixən lipid peroksidləşmə məhsullarının parçalanması nəticəsində yaranan malondialdehid kimi tiobarbiturik turşunun (TBA) reaktiv birləşmələrinin aşkarlanmasına əsaslanır [25]. Bu metodun olduqca həssas olması ilə mübahisəli olsa da, lakin mütləq MDA-ya xas deyil, lipidlərin peroksidləşməsini təyin etmək üçün ən çox istifadə edilən vasitə olaraq qalır. Turşu şəraitdə 90-100 ºC-də baş verən bu reaksiya 532 nm-də kolorimetrik olaraq və ya 530 nm həyəcan dalğası və 550 nm emissiya dalğa uzunluğundan istifadə edərək flüoresanla ölçülə bilən bir əlavə ilə nəticələnir [29] (Şəkil 6). Absorbsiya və ya flüoresan aşkarlama texnologiyalarından istifadə edərək bu analiz üçün bir sıra kommersiya analiz dəstləri mövcuddur.

Şəkil 6. MDA-TBA əlavələrinin əmələ gəlməsi.

F2-izoprostanlar (IsoP) adlanan araxidon turşusunun F2-yə bənzər prostanoid törəmələrinin əmələ gəlməsinin lipid peroksidləşməsi üçün spesifik olduğu göstərilmişdir [30]. TBA analizindən fərqli olaraq, IsoP-nin ölçülməsi lipid peroksidlərə xas görünür, onlar sabitdir və şərhi asanlaşdıran heç bir fermentativ yolla əmələ gəlmir.

IsoP-lər üçün bir sıra kommersiya ELISA dəstləri hazırlanmışdır, lakin nümunələrdə müdaxilə edən agentlər analizi həyata keçirməzdən əvvəl nümunələrin qismən təmizlənməsini tələb edir. Aşkarlama üçün yeganə etibarlı vasitə GC/MS-in istifadəsidir ki, bu da onu bahalı edir və ötürmə qabiliyyətini məhdudlaşdırır [31].

Canlı hüceyrələrdə lipid peroksidləşməsi membranlarda lokallaşdırılan flüoresan törəmələrdən istifadə etməklə görünə bilər. Məsələn, BODIPY® 581&frasl591 undekanoik turşu flüoroforunun poli doymamış butadienil hissəsinin oksidləşməsi flüoresan emissiyasının 590 nm-dən 510 nm-ə dəyişməsi ilə nəticələnir [32, 33] (Şəkil 7). Image-iT® Lipid Peroksidləşmə Kiti (Life Technologies) kimi kommersiyada mövcud olan bu reagent canlı hüceyrələrdə hüceyrə lipidlərinin oksidləşdirici deqradasiyasını aşkar etmək üçün sadə ratsional metrik üsul təqdim edir [34]. Qırmızı flüoresansın yaşıl flüoresansa nisbəti tək emissiya zondları ilə ölçülməyə təsir edə bilən lipid sıxlığı kimi amillərdən asılı olmayan lipid peroksidləşmə ölçüsünü təmin edir. Bu reagent canlı hüceyrələrə uyğun olduğundan, ölçmələr fiksasiya və boyanmadan real vaxtda həyata keçirilə bilər. Bu reagent həmçinin plazmanın [35] və lipid veziküllərinin [36] antioksidant qabiliyyətini nümayiş etdirmək üçün istifadə edilmişdir.

Şəkil 7. C11-BODIPY (581/591) strukturu.

Sabit hüceyrələrdə lipid peroksidləşməsindən əldə edilən zülal modifikasiyaları Click-iT® kimyası (Life Technologies) ilə birlikdə linoleamid alkin (LAA) istifadə edərək aşkar edilə bilər. Linoleik turşu məməlilərdə tapılan ən bol poli doymamış yağ turşusudur və onun lipid peroksidləşmə məhsulları çox güman ki, lipiddən əldə edilən zülal karbonillərinin əksəriyyətini təşkil edir [37]. Canlı hüceyrələrlə inkubasiya edildikdə, LAA hüceyrə membranlarına daxil olur. Lipidlərin peroksidləşməsi zamanı membrana bağlı LAA oksidləşir və 9 və 13-hidroperoksi-oktadekadienoik turşu (HPODE) əmələ gətirir. Bu hidroperoksidlər onları əhatə edən zülalları asanlıqla dəyişdirən &alfa,&beta-doymamış aldehidlərə parçalanır. Hüceyrələr sabitləndikdən sonra əldə edilən alkin tərkibli zülallar Alexa Fluor® 488 azid ilə reaksiya verərək aşkar edilə bilər (Şəkil 8).

Şəkil 8. Click-iT® LAA-nın Fəaliyyət Mexanizmi.

Superoksidin aşkarlanması ölçülə bilən nəticə yaratmaq üçün superoksidin bəzi digər birləşmələrlə qarşılıqlı təsirinə əsaslanır. Ferrisitoxrom c-nin ferrositokrom c-yə endirilməsi bir sıra hallarda superoksidin əmələ gəlmə sürətini qiymətləndirmək üçün istifadə edilmişdir [38]. (Eq 4)

Superoksid üçün tamamilə spesifik olmasa da, bu reaksiya 550 nm-də kolorimetrik olaraq izlənilə bilər. CN kimi ferment inhibitorlarının və ya katalaza kimi reaktiv növlərin təmizləyicilərinin əlavə edilməsi hər hansı reoksidləşməni minimuma endirə bilər. Akonitaza sitratın izositrata çevrilməsini katalizləyir. Superoksid bu fermenti onun kub <4Fe-4S>klasterindən Fe(II) hissəsini oksidləşdirərək təsirsiz hala gətirir. Beləliklə, superoksidin konsentrasiyası fermentin inaktivasiya dərəcəsi ilə təxmin edilə bilər. Fermentin fəaliyyəti 240 nm-də absorbansdan istifadə edərək 20 mM izositratın sikakonitata çevrilməsi ilə izlənilə bilər. Akonitaza məhsulu olan izositratın daha sonra NADP+-dan asılı izositrat dehidrogenaz tərəfindən &alfa-ketoqlutarata çevrildiyi birləşdirilmiş analiz də istifadə edilə bilər. Bu reaksiyada NADPH istehsalı 340 nm-də kolorimetrik olaraq izlənilə bilər [21].

Kimyalüminessent reaksiyalar, udma əsaslı aşkarlama metodlarına nisbətən həssaslığın potensial artması üçün istifadə edilmişdir. Ən çox istifadə edilən kimilüminesans substrat Lucigenindir, lakin bu birləşmənin redoks dövriyyəsinə meyli var, bu da onun superoksid istehsalının kəmiyyət dərəcələrinin müəyyən edilməsində istifadəsinə dair şübhələri artırmışdır [39]. Bu problemi minimuma endirmək üçün bu birləşmənin aşağı konsentrasiyalarının istifadəsi təklif edilmişdir. Coelenterazine kimyalüminessent substrat kimi də istifadə edilmişdir. Bu lipofilik birləşmə redoks dövrü keçirmir və Lucigenindən daha parlaqdır. Bununla belə, o, superoksidə qarşı tam spesifik deyil, çünki peroksinitritin olması kimilüminesansla nəticələnəcək [40].

Hidrosiyanin boyaları superoksid və hidroksil radikal üçün flüorogen sensorlardır. Bu boyalar siyanin (Cy) boyalarının iminium katyonunu natrium borhidridlə azaltmaqla sintez olunur. Zəif flüoresan olsa da, oksidləşmə zamanı onların flüoresan intensivliyi 100 dəfə artır. Oksidləşmə flüoresan olmaqla yanaşı, həm də molekulu membran keçiriciliyindən ion keçirməyən hissəyə çevirir [41]. Bu zondlardan ən xarakterik olanları Hydro-Cy3 və Hydro-Cy5-dir.

Superoksidin hüceyrə istehsalı hidroetidin kimi də adlandırılan dihidroetidium tərəfindən görüntülənə bilər. Bu birləşmə, əsasən superoksid və daha az dərəcədə digər reaktiv oksigen və ya reaktiv azot növləri ilə oksidləşənə qədər sitozolda mavi flüoresans nümayiş etdirir. Dihidroetidiumun oksidləşməsi 2-mövqeyində 2-hidroksietidium əmələ gətirən hidroksilləşmə ilə nəticələnir (Şəkil 9). Oksidləşmə ilə birləşmə hüceyrə DNT ilə birləşərək nüvəni müvafiq olaraq 535 nm və 635 nm həyəcanlandırma və emissiya dalğaları ilə parlaq flüoresan qırmızı rəngə boyadı [42].

Şəkil 9. Superoksidlə Dihidroetidiumun 2-Hidroksietidiuma oksidləşməsi.

Mitoxondriyaya xas olan superoksid, MitoSOX və ticarət Qırmızı reagenti (Life Technologies) ilə flüoresan mikroskopiyadan istifadə etməklə görüntülənə bilər. MitoSOX&trade Qırmızı reagent canlı hüceyrələrə nüfuz edən dihidroetidiumun kationik törəməsidir, burada seçici olaraq mitoxondriləri hədəf alır. MitoSOX Red indikatorunun kationik trifenilfosfonium əvəzedicisi aktiv tənəffüs edən mitoxondriyalarda zondun elektroforetik yolla udulmasına cavabdehdir (Şəkil 10). Dihidroetidiumda olduğu kimi, bu birləşmə mitoxondrial DNT ilə qarşılıqlı əlaqə yaradır və qırmızı flüoresanla nəticələnir. Floresensiya ölçmələri 590 nm-də emissiya aşkarlanması ilə 510 nm pik həyəcan dalğası uzunluğundan istifadə etməklə edilə bilsə də, daha az həyəcanlanma pikinin olduğu bildirildi.

Superoksiddən başqa reaktiv oksigen növləri tərəfindən yaradılan etidium oksidləşmə məhsulunun həyəcanlanma spektrində olmayan 400 nm, superoksidin daha yaxşı diskriminasiyasını təmin edə bilər [42].

Şəkil 10. Oksidləşmiş MitoSox&trade strukturu Qırmızı mitoxondrial superoksid göstəricisi.

Mitoxondrial reaktiv oksigen növlərinin əmələ gəlməsi MitoSOX & ticarət ləkələnmiş hüceyrələrin görüntülənməsi ilə müşahidə edilə bilər. Nümunə olaraq, qeyri-steroid antiinflamatuar dərman Diklofenak reaktiv oksigen növlərinin induksiyası vasitəsilə hepatotoksiklik ilə əlaqələndirilmişdir [43]. Mitoxondrial oksidləşdirici stress, üç gün ərzində qaraciyər mikrotoxumasının diklofenak dozasının üç log titrindən sonra MitoSOX analizi ilə təsdiq edildi, qırmızı flüoresan zonddan əhəmiyyətli dərəcədə artan siqnal yalnız ən yüksək dozada (300 &mM) görüldü, bu, bir dəfə eşik olduğunu göstərir. yüksək superoksid səviyyələrinə çatdıqda artıq zərərsizləşdirilə bilməz (Şəkil 11).

Şəkil 11. Üç Günlük Diklofenak Dozasından Sonra Mitoxondrial Oksidləşdirici Stressin Qiymətləndirilməsi. Hoechst 33342 (mavi) və MitoSOX&trade Qırmızı (qırmızı) ilə boyanmış 3D qaraciyər mikrotoxumasının üst-üstə yığılmış şəkilləri müvafiq olaraq DAPI və ya RFP Cytation 3 görüntüləmə kanallarından istifadə etməklə çəkilmişdir. Avtofokus DAPI ilə boyanmış hüceyrələrdə həyata keçirilir [44].

CellROX® reagentləri Life Technologies-dən bir sıra xüsusi reagentlərdir. Bu hüceyrə keçirici boyalar azaldılmış vəziyyətdə ikən zəif flüoresandır və reaktiv oksigen növləri (ROS) tərəfindən oksidləşmə zamanı fotostabil floresans nümayiş etdirir.CellROX® yaşıl yalnız nüvə və ya mitoxondriyada mövcudluğunu məhdudlaşdıraraq, sonradan DNT-yə bağlanaraq flüoresan olur. Bu birləşmə 485 nm həyəcan dalğasına və 520 nm emissiya dalğasına malikdir, bu da onu Green GFP filtr dəstlərindən istifadə edərək görüntüləmə üçün əlverişli edir. Bu reagent formaldehidlə fiksasiya oluna bilər və onun siqnalı yuyucu vasitə ilə müalicədən sonra sağ qalır və onun digər uyğun boyalar və antikorlarla çoxalmasına imkan verir. CellROX® Orange və CellROX® Dərin Qırmızı floresan üçün DNT birləşməsini tələb etmir və sitoplazmada lokallaşdırılmışdır. CellROX® narıncı 545 həyəcan dalğa uzunluğuna və 565 emissiyaya malikdir və RFP filtr kubu ilə təsvir edilə bilər, CellROX® Dərin Qırmızı isə 640 nm həyəcan pikinə və 665 nm emissiya zirvəsinə malikdir və CY5 kub ilə təsvir edilə bilər.

Hidrogen peroksid (H2O2) mitogen stimullaşdırma və ya hüceyrə dövrünün tənzimlənməsi baxımından ən vacib ROS-dur. Güclü flüoresan məhsullar istehsal etmək üçün horseradish peroksidaza (HRP) fermenti ilə birlikdə istifadə edilən hidrogen donoru kimi xidmət edən bir sıra flüorogen substratlar var [21]. Siyahı kifayət qədər geniş olsa da, daha çox istifadə olunan substratlara diasetildikloro-flüoresein [45], homovanil turşusu [46] və Amplex® Qırmızı [47] daxildir. Bu nümunələrdə artan miqdarda H2O2 artan miqdarda flüoresan məhsul əmələ gətirir. Məsələn, Amplex Red, HRP-nin iştirakı ilə hidrogen peroksidlə oksidləşir və bununla da rezorufinə çevrilir [47]. Amplex Red-dən fərqli olaraq, rezorufin 570 nm-də kolorimetrik olaraq və ya 570 nm həyəcanlandırma və 585 nm emissiya [48] istifadə edərək flüoresanlıqla aşkar edilə bilən yüksək rəngli birləşmədir (Şəkil 12).

Şəkil 12. Amplex Red-in HRP ilə rezorufinə çevrilməsi H2O2.

Horseradish peroksidaz katalizi vasitəsilə hidrogen peroksid ilə oksidləşdikdə homovannilik turşu dimerləşir. Amplex red-də olduğu kimi, homovanil turşusu monomeri flüoresan deyil, lakin dimmer kimi o, 425 nm emissiya dalğası ilə pik həyəcan dalğası uzunluğu 315 nm-ə malikdir (Şəkil 13). Hidrogen peroksidin istehsalını qiymətləndirmək üçün bu birləşmədən istifadə edərkən diqqətli olmaq lazımdır. Flüoresans ölçmələri üçün həyəcanlanma və emissiya dalğalarının UV-yə yaxın təbiəti bu birləşməni, xüsusən polistirol mikroplitələrdən istifadə edildikdə, həddindən artıq fon siqnalına meylli edir. HRP-yə əlavə olaraq bir neçə peroksidaza bənzər metalloporforinlərin reaksiya üçün katalitik olduğu göstərilmişdir [49].

Şəkil 13. HRP və hidrogen peroksidin təsiri ilə homovanil turşusunun dimerləşməsi.

Tetrametilbenzidin (TMB) və fenol qırmızı kimi bir sıra kolorimetrik substratlar da hidrogen peroksidin konsentrasiyalarını ölçmək üçün HRP ilə birlikdə istifadə edilmişdir. Ümumiyyətlə, kolorimetrik vasitələr flüoresan aşkarlama metodlarından daha az həssasdır, lakin boru əsaslı və ya mikroplata əsaslı aşkarlama metodologiyalarından istifadə edərkən cihaz xərcləri flüoresans əsaslı ölçmələr üçün tələb olunanlardan əhəmiyyətli dərəcədə aşağıdır.

Hidrogen peroksidin miqdarını təyin etmək üçün HRP katalizli substratlardan istifadə edərkən bir sıra məsələlərə diqqət yetirilməlidir. Tiollar kimi hüceyrə birləşmələri HRP üçün substrat kimi xidmət edə bilər. Endogen katalaza aktivliyi H.-nin miqdarını süni şəkildə azalda bilər2O2 indiki. Hüceyrə komponentləri homovanilik dimerdə olduğu kimi həyəcan və emissiya dalğa uzunluğundan asılı olaraq flüoresan siqnala təsir göstərə bilər, digər dalğa uzunluqları isə siqnalın söndürülməsindən əziyyət çəkə bilər.

Tarpley et. al. metod(lar)ın H-nin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün olduqca faydalı olduğunu bildirərək HRP ilə əlaqəli analizlərin faydasını olduqca qısa şəkildə ümumiləşdirdi.2O2- səviyyələri &ldquo&hellip mədəni hüceyrələri, orqan kulturaları və təcrid olunmuş tampon perfused toxuma preparatları. Lakin bu üsullar H2O2 plazmada və ya zərdabda, çünki çoxlu reduksiyaedici maddələr hüceyrədənkənar maye və hellip&rdquo[21].

2&rsquo-7&rsquo diklorofluoressinin (H2DCF) 2&rsquo-7&rsquodichlorofluoresceinə (DCF) oksidləşməsi H-nin miqdarını təyin etmək üçün kifayət qədər geniş şəkildə istifadə edilmişdir.2O2. Diasetat forması, H2DCFDA və onun asetometil esteri H2DCFDA-AM hüceyrələr tərəfindən qəbul edilir, burada qeyri-spesifik hüceyrə esterazları lipofilik qrupları parçalamaq üçün onun üzərində hərəkət edir və nəticədə hüceyrənin içərisində tələyə düşdüyü güman edilən yüklü birləşmə yaranır. H2DCF-nin ROS tərəfindən oksidləşməsi molekulu yüksək flüoresan olan 2&rsquo, 7&rsquo diklorodihidroflüoreseinə (DCF) çevirir (Şəkil 14). DCF flüoresansının ölçülməsi üçün bildirilmiş dalğa uzunluqları həyəcan üçün 498 nm və emissiya üçün 522 nm-dir.

Şəkil 14. ROS tərəfindən flüoresan birləşmə DCF-nin formalaşması.

Əvvəlcə DCF-nin hidrogen peroksid üçün spesifik olduğu düşünülürdü, lakin son sübutlar göstərdi ki, nitrat və hipoklor turşusu kimi digər ROS H2DCF-ni oksidləşdirə bilər [66]. Ən əsası isə odur ki, H2O2H2DCF-nin -asılı oksidləşməsi qara dəmir tələb edir [50]. Bundan əlavə, H2DCF artıq ion olmadığı üçün onun hüceyrədən xaricə miqrasiyası və oksidləşdiricilərlə qarşılıqlı əlaqədə sərbəst olduğu mühitdə toplanması istisna edilmir. PMT əsaslı flüoresan ölçmələrinə əlavə olaraq, oksidləşmiş DCF flüoresansı FITC və ya GFP filtr dəstlərindən istifadə edərək təsvir edilə bilər. Məsələn, DNT topoizomeraz I-ni inhibə edən sitotoksik quinolin alkaloid kamptotesin, becərilmiş ilkin hepatositlərdə oksidləşdirici stresə səbəb olur [51]. Şəkil 15-də göstərildiyi kimi, kamptotesinin mikromolyar konsentrasiyası adətən görünüş sahəsindəki hüceyrələrin təxminən 10-20%-də ROS istehsalına səbəb olur.

Şəkil 15. Hepatositlərdə oksidləşmiş DCF floresansı. 800 nM kamptotesin ilə 0 və 30 dəqiqəlik müalicələrdən sonra alınan mədəni hepatositlərin şəkilləri. Hüceyrə nüvələri Hoechst 33342 (mavi) ilə boyandı, mitoxondriyalar MitoTracker® Red (Qırmızı) ilə boyandı və oksidləşmiş DCF reagenti yaşıl rəngdə göstərildi [68]. Şəkillər 20x obyektivdən istifadə edərək Cytation&trade 3 Imaging multimod mikroplaka oxuyucusu (BioTek Instruments) ilə çəkilib.

DCF floresansının zəif tərəflərini aradan qaldırmaq üçün bir neçə yeni flüoresan zond hazırlanmışdır. İki belə zond Peroxy Green 1 (PG1) və Peroxy Crimson 1 (PC1)-dir. Bu boronat əsaslı H2O2 zondların yüksək seçiciliyə, membran keçiriciliyinə, görünən dalğa uzunluğunda həyəcanlanma və emissiya dalğa uzunluqlarına malik olduğu bildirilmişdir [50]. Hidrogen peroksidlə reaksiya vermək PG1 və PC1 üçün flüoresansın müvafiq olaraq 10 və 40 qat artması ilə nəticələnir. PG1 510 nm-də emissiya maksimumu ilə 460 nm həyəcan dalğasına malikdir (Şəkil 16). PC1, qırmızıya sürüşdürülmüş həyəcanın təkmilləşdirilmiş xüsusiyyətlərini və avtoflüoressensiyanı azaldan daha böyük ehtiyat sürüşmələrini nümayiş etdirir (həyəcan: 480 nm emissiya: 584 nm) [52].

Şəkil 16. Peroxy Green 1 və Peroxy Crimson 1-in strukturu.

Bu molekullar H ilə müşahidə olunmayan hidrogen peroksidlə birbaşa reaksiya göstərir2DCF. Bundan əlavə, bu molekullar hem-zülallardan və H-dən alınan yüksək valentli metal-okso növlərinə qarşı reaksiya vermirlər.2O2. DCFH normal olaraq bu birləşməyə H-yə qarşı olduğundan daha çox cavab verir2O2.

Calcein-acetoxymethylester (Calcein-AM) həmçinin hüceyrədaxili oksidləşdirici aktivliyin detektoru kimi bildirilmişdir [53]. Calcein-AM, hüceyrədaxili esterazlar tərəfindən flüoresan olan hüceyrə keçirməyən anion kalseinə çevrilən flüorogen hüceyrə keçirici birləşmədir (Şəkil 17). Tarixən hüceyrədaxili kalsein istehsalı həm mikroskopiyada, həm də florometriyada canlı hüceyrələrin göstəricisi kimi istifadə edilmişdir. ROS-un aşkarlanmasına gəldikdə, ROS reaksiyasının kinetikası esterazın kalseinə çevrilməsinə nisbətən əlverişlidir.

Calcein AM-nin ROS-oksidləşmiş məhsulunun nazik təbəqə xromatoqrafiyası [53] vasitəsilə kimyəvi cəhətdən Calcein-AM-dən fərqli olduğu göstərilmişdir, lakin o, hələ də hüceyrə membranlarını keçmək qabiliyyətini saxlayır və flüoresan kalseinə oxşar spektral xüsusiyyətlərə malikdir. Beləliklə, hüceyrə yükləndikdən sonra birləşməni yuyulmaqdansa, mediada saxlamaq vacibdir, bu adətən birləşmədən hüceyrə canlılığı üçün istifadə edildikdə həyata keçirilir. Boyanın çıxarılması reaksiyaya girən birləşmənin konsentrasiya qradiyenti ilə hüceyrədən geri hərəkəti ilə nəticələnir. Calcein AM-nin fiziki xassələri də ya Calcein-AM, ya da Calcein-dən fərqlidir, çünki boya yığılmağa və hüceyrə daxilində intensiv flüoresan lokalizasiyalar əmələ gətirir. Bu boyanın hüceyrə lokalizasiyasının mümkün olduğu yerlərdə konfokal mikroskopiya imkanları olsa da, ROS reaksiyasına girən kalsein-AM ilə esterazla reaksiyaya girən məhsul arasında spektral ayırd edə bilməmək bu boyanın mikroplitələrdə istifadəsini problemli edir.

Şəkil 17. Kalsein-AM quruluşu.

Sərbəst radikal azot oksidi (&bullNO) müxtəlif bioloji funksiyaları olan bir sıra müxtəlif hüceyrə tipləri tərəfindən istehsal olunur. Azot oksidi azot oksid sintaza fermenti (NOS) tərəfindən kataliz olunan iki mərhələli prosesdə L-argininin L-sitrulinə oksidləşməsinin məhsuludur. Azot oksid sintazasının iki əsas izoforması müəyyən edilmişdir. Neyronlarda və endotel hüceyrələrində olan konstitutiv izoform kalsium və kalmodulindən asılı olaraq çox az miqdarda azot oksidi istehsal edir. &bullNO hədəf hüceyrələrdə həll olunan guanlyate siklazını aktivləşdirir, nəticədə cGMP səviyyəsinin artmasına səbəb olur, bu da öz növbəsində neyronların ötürülməsini və damarların rahatlamasını asanlaşdırır və trombositlərin yığılmasını maneə törədir [54].

Makrofaqlarda, fibroblastlarda və hepatositlərdə olan induksiya olunan izoform, iltihab və ya mitogen stimullara cavab olaraq nisbətən böyük miqdarda &bullNO istehsal edir və oksidləşdirici toksikliyi ilə ev sahibinin müdafiə rolunu oynayır [55]. Mənbədən və ya rolundan asılı olmayaraq, sərbəst radikal &bullNO çox qısa yarı ömrünə malikdir (t½= 4 saniyə), normal olaraq mövcud olan bir neçə fərqli molekulla reaksiyaya girərək ya nitrat (NO3 -) və ya nitrit (NO2 -)

&bullNO-nun dolayı təyini üçün geniş istifadə olunan üsul onun tərkibi məhsullarının nitrat və nitritin kolorimetrik olaraq təyin edilməsidir. Bu reaksiya üçün nitrat (NO3) əvvəlcə nitritə (NO2), adətən nitrat reduktazasının təsiri ilə (Şəkil 18).

Şəkil 18. Nitrat reduktazanın təsiri ilə nitratın nitritə çevrilməsi.

Nitritin sonradan iki mərhələli proseslə təyini (Şəkil 19) nitrat və nitritin &ldquototal&rdquo-su haqqında məlumat verir. Hidrogen ionlarının iştirakı ilə nitrit sulfanilamidlə reaksiyaya girərək diazonium ionu əmələ gətirən azot turşusu əmələ gətirir. Bu daha sonra N-(1-naptil) etilendiaminlə birləşərək 543 nm-də udulan xromoforu əmələ gətirir [56].

Kolorimetrik analizdən əvvəl nümunələrin azaldılmadığı paralel analizdə yalnız nitrit təyini edilə bilər. Daha sonra faktiki nitrat səviyyələri cəmindən nitrit səviyyələrinin çıxılması yolu ilə hesablanır. Bu analiz nisbətən ucuzdur və yerinə yetirilməsi asandır. Reagentlər asanlıqla əldə edilir və bu analiz üçün çoxsaylı kommersiya dəstləri mövcuddur.

Şəkil 19. Nitratın təyini üçün Qreys reaksiyası.

&bullNO üçün Griess reagent analizinin həssaslığını artırmaq üçün bir sıra flüorometrik analizlər hazırlanmışdır. Qriess reaksiyası kimi onlar da dinitrogen trioksiddən və ya azot turşusundan (N2O3), nitritin (NO2 -). Ən çox istifadə edilən üsul 375 nm həyəcan dalğası və emissiya dalğası ilə yüksək flüoresan olan 2, 3 naftotriazol (NAT) yaratmaq üçün azot turşusu ilə reaksiya vermək üçün nisbətən flüoresan olmayan 2, 3-diaminonaftalin (DAN) istifadə edir. 415 nm (Şəkil 20).

Şəkil 20. 2, 3-diaminonaftalin (DAN) istifadə edərək nitritin florometrik aşkarlanması.

Genetik Kodlanmış Sensorlar

Flüoresan zülal əsaslı biosensorlar real vaxt rejimində ROS-un yerində tədqiqi üçün hazırlanmışdır. Canlı hüceyrə flüoresan sensorlarının bu yeni nəsli redoks vəziyyətindəki dəyişikliklərə və ya xüsusi hədəf analitindəki dalğalanmalara cavab olaraq flüoresanda dəyişikliklər yaradır. Bu sensorlar genetik olaraq kodlaşdırılıb, tək bir flüoresan zülala əsaslanır və hər hansı digər reagentlərin əlavə edilməsini və ya hüceyrə lizisini tələb etmir, bu da onları multipleksləşdirmə üçün çox əlverişli edir.

Azaldılma-oksidləşməyə həssas yaşıl floresan protein (roGFP) redoks-həssas biosensorun nümunəsidir. Aequorea victoria-dan olan GFP zülalının disulfid bağlarını yaratmaq üçün iki sistein uyğun mövqelərdə &beta barel strukturunun səthə məruz qalmış qalıqlarına daxil edilmişdir. İşlənmiş tiolların oksidləşmə vəziyyəti sensorun flüoresan xüsusiyyətlərini müəyyən edir [57]. Əvvəlcə bitkilərdəki sitozol (roGFP2) kimi reduksiya bölmələrinin in vivo təsvirinə imkan vermək üçün müxtəlif roGFP versiyaları təqdim edildi [58], 147 və 204-cü amin turşusu mövqelərində tətbiq edilən sisteinlərin ən böyük dəyişikliyi meydana gətirdiyi aşkar edildi [59] . roGFP2-nin glutatyon üçün spesifikliyi onu insan glutaredoksin 1 (Grx1) ilə əlaqələndirməklə daha da artırılır [60]. Qlutaredoksinlər substratlar tərəfindən oksidləşən və qlutatyon tərəfindən fermentsiz şəkildə azalan kiçik fermentlərdir. Maraqlanan orqanizmdə Grx1-roGFP füzyon sensorlarını ifadə etməklə və/və ya zülalı hüceyrə bölməsinə yönəltməklə, real vaxt rejimində xüsusi hüceyrə bölməsində qlutatyon redoks potensialını ölçmək mümkündür ki, bu da invaziv sistemə nisbətən əhəmiyyətli bir üstünlükdür. statik üsullar. Qeyd edək ki, bu zond birbaşa ROS birləşmələrini ölçmür. Bununla belə, o, oksidləşmiş/azaldılmış (GSH/GSSG) glutatyon tarazlığında sürüşməni aşkar edir. Aşkarlama ilə əlaqədar olaraq, roGFP-lərdə in vitro və in vivo redoks potensialındakı dəyişikliklərə cavab olaraq flüoresanda sürətli və geri dönən nisbi metrik dəyişikliklər göstərən ümumi 515 emissiya ilə təxminən 400 və 490 nm-də iki flüoresan həyəcanlandırma maksimumu var. Disulfidin əmələ gəlməsi 510 nm-də emissiya çıxışı təyin edildikdə, 488 nm həyəcan siqnalları hesabına 405 həyəcan siqnalının artması ilə GFP-nin protonlaşması ilə nəticələnir. Beləliklə, 405 və 488 nm-də həyəcandan flüoresansiyanın nisbəti oksidləşmənin dərəcəsini göstərir. Bu ölçmə nisbi metrik olduğundan, biosensor səviyyələrindəki dəyişikliklər və ya matrisin səbəb olduğu optik həssaslıq düzəldilir.

Şəkil 21. Rasyonometrik redoksa həssas GFP-lərin prinsipi. RoGFP-lərin iki həyəcanlanma maksimumunun nisbi flüoresan intensivliyi redoks vəziyyətindən asılı olaraq dəyişir: azalma 400 nm-də həyəcanın azalmasına və 480 nm-də həyəcanın artmasına səbəb olur (oxlar). [61]-dən.

H.-ni birbaşa hiss etmək üçün2O2 roGFP konstruksiyası H ilə reaksiya zamanı disulfidlər əmələ gətirən maya zülalı olan peroksidaza Orp1 ilə əlaqələndirilmişdir.2O2tiol-disulfid mübadiləsi mexanizmi vasitəsilə roGFP-yə ötürülür [62]. Reaksiya hüceyrə tioredoksin (Trx) və ya GRx/GSH sistemlərinin təsiri ilə geri çevrilir. Bu zondlar həmçinin asan transfeksiyaya imkan vermək üçün Premo&trade ləqəbi (Life Technologies) altında BacMam 2.0 konstruksiyaları kimi mövcuddur.

H. hiss etmək üçün başqa bir üsul2O2 birbaşa redoks-reaktiv zülal domenləri ilə dairəvi permutasiya edilmiş flüoresan zülalları birləşdirməkdir, belə ki, redoks fəaliyyətinin yaratdığı konformasiya dəyişiklikləri flüoresan zülala çevrilir. HyPer adlanan belə ximeralardan biri Sergey A.Lukyanovun [63] laboratoriyasında hazırlanmışdır. HyPer prokaryotik H-nin tənzimləyici sahəsinə daxil edilmiş dairəvi şəkildə dəyişdirilmiş sarı flüoresan zülaldan (cpYFP) ibarətdir.2O2- həssas protein, OxyR [64, 65]. Zondun təkmilləşdirilmiş versiyası olan HyPer2, vəhşi tip OxyR-də A233V-ə uyğun gələn HyPer-dən A406V tək nöqtəli mutasiyası ilə yaradılmışdır [64]. roGFP-Orp1 kimerasından fərqli olaraq, tiol-disulfidin ötürülməsi yoxdur, əksinə OxyR-nin iki sisteini cpYFP hissəsinə köçürülən konformasiya dəyişikliyinə səbəb olan geri dönən disulfid bağı təşkil edir [65]. HyPer hidrogen peroksidə submikromolyar yaxınlıq nümayiş etdirir və superoksid, oksidləşmiş glutatyon, azot oksidi və peroksinitrit kimi digər oksidləşdiricilərə qarşı həssas olmadığı nümayiş etdirilmişdir.

Genetik olaraq kodlanmış sensorlar, kimerik molekulun bir hissəsi kimi hüceyrə ticarəti ardıcıllığından istifadə etməklə xüsusi hüceyrə bölmələrinə yönəldilə bilər. Məsələn, peptidlər zülal səthinə məruz qalmış müsbət yüklü lizin və argininlərin qısa ardıcıllığından ibarət nüvə lokalizasiya siqnalının (NLS) təkrarlarını daxil etməklə nüvəyə yönəldilə bilər. Bu ardıcıllıqlar hüceyrə zülalları (importin & alpha və importin & beta) tərəfindən tanınır, hansı ki, onun nukleaza daşınmasına vasitəçilik edir. Oxşar ardıcıllıqlar ROS sensorlarını mitoxondriyaya, peroksizomlara və ya sitoplazmaya yönəltmək üçün istifadə edilə bilər.

Müzakirə

Reaktiv oksigen növlərinə maraq əvvəlcə aerob tənəffüsün zərərli təsiri ilə əlaqəli patoloji ətrafında fırlanırdı: mitoxondriyadakı elektron nəqliyyat zəncirindən sızma nəticəsində yaranan zəruri pislik. Bu kontekstdə tədqiqat bu agentlərin qocalma, xroniki xəstəliklər və xərçəngdə oynadığı rolu əhatə edirdi.

Faqositik hüceyrələr tərəfindən &ldquooksidləşdirici partlayışın&rdquo əslində reaktiv oksigen növlərinin qəsdən istehsalının nəticəsi olduğunun kəşfi ilə yeni bir sərhəd yarandı. Bunun xüsusi hüceyrələrin işğalçı mikroorqanizmləri öldürmək üçün yalnız zəhərli maddələr kimi təsvir edilə bilənləri istehsal etdiyi çox xüsusi bir tətbiq olduğu düşünülürdü. Sonrakı araşdırmalar göstərdi ki, ROS bütün hüceyrə növlərində istehsal olunur və həm hüceyrədaxili, həm də hüceyrələrarası rabitə üçün vacib mobil xəbərçi kimi xidmət edir. İndi aydın olur ki, hüceyrələrdə ROS-u əhatə edən çox mürəkkəb hüceyrədaxili tənzimləmə sistemi mövcuddur. Hüceyrələr siqnalın intensivliyindən, müddətindən və kontekstindən asılı olaraq ROS hissələrinə müxtəlif yollarla cavab verir. Hüceyrədaxili siqnala gəldikdə, belə görünür ki, hidrogen peroksid (H2O2) ən maraqlı namizəddir, azot oksidi (&bullNO) isə ilk növbədə hüceyrələrarası siqnalla iştirak edir.

ROS-un aşkarlanması üçün ilkin olaraq istifadə edilən kimya, ilk növbədə absorbansın ölçülməsinə əsaslanırdı. Tədqiqat ümumiyyətlə toxuma və ya bütün bədən səviyyəsində oksidləşdirici stressi qiymətləndirmək üçün glutatyon səviyyələrinin ölçülməsini əhatə edirdi. Analitin udma səviyyəsinin millimolyar səviyyələri ilə məlumatlandırıcı və kəmiyyət baxımından daha adekvat olan ölçülərə əsaslanır. ROS-ların hüceyrədaxili xəbərçilər və tənzimləyicilər kimi istifadə edildiyi kəşfi ilə mikromolyar aşkarlama tələbləri nəzərə alınmaqla yeni kimyalar hazırlanmışdır. Bu agentlər ilk növbədə flüoresan əsaslıdır, lakin bu yaxınlarda luminescent əsaslı aşkarlamalar tətbiq edilmişdir.

Kiçik molekullu flüoresan sensorlar və ya genetik olaraq kodlanmış sensorlardan istifadə edərək təsvirə əsaslanan analizin yaranması ROS tədqiqatı ilə bağlı yeni anlayışlar təmin etdi. Şəkil təhlili yalnız kəmiyyət məlumatını deyil, həm də mobil lokalizasiyanı təmin edə bilər. Bu, reportyor dizaynı və ya görüntü təhlili vasitəsilə həyata keçirilə bilər.Kimyəvi ROS reportyorları və ya genetik olaraq kodlanmış ROS sensorları müvafiq olaraq kimyəvi strukturlar və ya peptid ardıcıllığı ilə hazırlanmışdır ki, bu da detektorun xüsusi hüceyrə orqanoidlərinə (məsələn, nüvələr, mitoxondriyalar, lizosomlar və s.) lokalizasiyası ilə nəticələnir. Buna görə də, görüntülərdəki hər hansı dəyişiklik birbaşa müəyyən bir hüceyrə yeri ilə əlaqələndirilə bilər. Alternativ olaraq, orqanoidlərə xas olmayan müxbirlərlə ROS dəyişikliklərinin lokalizasiyası, lokalizasiyaya xas olan ROS ilə əlaqəli olmayan ləkələrlə birlikdə həyata keçirilə bilər. Ayrı-ayrı rəngli şəkillərin üst-üstə düşməsi ilə mobil yerləri müəyyən etmək olar.

Hüceyrəvi ROS tədqiqatlarının çoxunda bildirilən ən böyük çətinlik diskret molekullar üçün xüsusi müxbir agentlərin olmaması ilə bağlı olmuşdur. Təbiətinə görə ROS hissələri bir sıra müxtəlif molekullarla reaktivdir, belə ki, reportyor agentlərin layihələndirilməsi çətin olmuşdur. Xüsusilə hidrogen peroksid üçün daha spesifik kimya ilə tənzimləmə üçün xüsusi mexanizmlər aydınlaşdırılacaqdır.


Giriş

Həm anadangəlmə, həm də qazanılmış ürək xəstəliklərində çoxlu sayda miokard hüceyrələri zədələnir, onların normal funksiyaları itirilir. Bağışlanmış toxuma və orqanlar tez-tez zədələnmiş toxumaların və orqanların dəyişdirilməsi üçün istifadə olunur, lakin transplantasiya edilə bilən toxuma və orqanlara ehtiyac mövcuddur. Son zamanlar ürək xəstəliklərinin müalicəsində kliniki yanaşmalardan biri də ürəyin funksiyalarını yaxşılaşdırmaq və yeni kapilyarların əmələ gəlməsinə təkan vermək üçün kök hüceyrələrin dövriyyəyə yeridilməsi və ya zədələnmiş ürək toxumasına birbaşa transplantasiyası yolu ilə zədələnmiş toxumaların bərpası və dəyişdirilməsidir. [1–3]. Bununla belə, bu yanaşma klinik sınaqlarda əhəmiyyətli bir potensial nümayiş etdirə bilmədi. Bu tədqiqatlarda sınaqdan keçirilmiş kök hüceyrə populyasiyaları geniş şəkildə dəyişir, çünki yeridilmiş hüceyrələr qan axını ilə tez yuyulur və transplantasiyadan sonra ev sahibi ürək toxuması ilə asanlıqla inteqrasiya edə bilmir [4, 5]. Üstəlik, hüceyrələrin ürək toxumasına birbaşa yeridilməsi qan dövranı yollarının mümkün tıxanmalarına görə təhlükəlidir, nəticədə mədəcik aritmiyası kimi həyati təhlükəsi daha çox olan ağırlaşmalar yaranır [6]. Bu problemləri aradan qaldırmaq üçün hüceyrə əsaslı müalicələr üçün yeni strategiya lazımdır. Buna görə transplantasiya edilmiş hüceyrələr və ürək toxuması arasında yapışmanın yaxşılaşdırılması vacibdir. Yapışmanı gücləndirmək üçün müəlliflər tərəfindən temperatura cavab verən kultura qabı ilə innovativ hüceyrə təbəqəsi mühəndisliyi texnikası hazırlanmışdır [7, 8]. On ildən artıqdır ki, bu texnika ilə hazırlanmış hüceyrə vərəqləri heyvan tədqiqatlarında, eləcə də buynuz qişa [9, 10], ürək [11-14], yemək borusu [15, 16], periodontium daxil olmaqla, klinik sınaqlarda müxtəlif toxuma və orqanların təmiri üçün tətbiq edilmişdir. [17, 18], qaraciyər [19, 20], böyrək [21], s.

Kultura temperaturu 37°C-dən 20°C-ə endirildikdə, monolaylı hüceyrə təbəqəsi məhsul üçün tripsin kimi heç bir proteolitik fermentdən istifadə etmədən temperatura cavab verən mədəniyyət qabının səthindən kortəbii olaraq ayrılır. Bu mədəniyyət üsulu hüceyrə-hüceyrə əlaqələrini və qarşılıqlı təsirlərini qoruyub saxlamağa imkan verir və bəzi kollagenlər, lamininlər, fibronektin, vitronektin, elastin və xüsusi zülallar daxil olmaqla hüceyrədənkənar matriks (ECM) komponentlərini ifraz edən və təşkil edən hüceyrələrin mövcudluğunu qoruyur [22, 23]. ECM hüceyrə yapışması və toxuma təşkili üçün struktur dəstəyi təmin edir. Buna görə də, hüceyrə təbəqələri tikiş kimi heç bir mexaniki vasitədən istifadə etmədən müxtəlif növ toxuma və orqanlara birbaşa nəql edilə bilər. Bu üsul tək hüceyrə suspenziyasının inyeksiyasından üstündür və hüceyrə vərəqində ECM-nin saxlanması hüceyrənin sağ qalmasına, formasına, yayılmasına, miqrasiyasına və diferensiasiyasına təsir edərək hüceyrə davranışını tənzimləyir [24]. ECM toxuma bərpasının erkən mərhələsi üçün çox vacibdir.

Son illərdə çoxlu hüceyrə tiplərindən ibarət mürəkkəb toxuma və daxili orqanların bərpası üçün ən çox yayılmış hüceyrə mənbələrindən biri kimi MSC-lər tədqiq edilmişdir [1]. Heyvanlar üzərində aparılan ilkin tədqiqatlar göstərir ki, zədələnmiş ürək toxumasına köçürülmüş mezenximal kök hüceyrələrin faydalı təsirləri ola bilər [2]. Müəlliflərin nəticələri bildirmişdir ki, temperatura cavab verən qabda yetişdirilmiş piy toxumasından əldə edilən MSC-lər hüceyrə təbəqəsi yarada bilir və bu, siçovulların infarktlı miokardını təmir etmək üçün istifadə edilə bilər [11]. Siçan və siçovul modellərində tədqiq edilsə də, kiçik heyvan təcrübələri onun nəticələrini insanlara ekstrapolyasiya etmək üçün kifayət deyil. Bu tətbiqin donuzlar kimi daha böyük heyvan modellərində mümkün olduğu göstərilməlidir. Bu nəticələr insan ürək xəstəliklərinin müalicəsi üçün klinik tətbiq üçün bu texnikanın istifadəsini təşviq edəcək. Açıq ürək əməliyyatı zamanı transplantasiya edilmiş hüceyrə təbəqələrinin zədələnmiş ürək toxumasına möhkəm yapışması üçün tələb olunan vaxtı müəyyən etmək də vacibdir.

Bu tədqiqatda donuz sümük iliyindən əldə edilən MSC vərəqləri temperatura cavab verən qablarda becərildi və əldə edilən hüceyrə vərəqləri ürəyin sol mədəciyinə köçürüldü. Hüceyrə təbəqəsi ilə ürək toxuması arasındakı yapışma müvəffəqiyyətli bir yapışmaya nail olmaq üçün minimum tələb olunan vaxtı müəyyən etmək üçün histoloji olaraq tədqiq edildi. Bundan əlavə, transplantasiya həmçinin hüceyrə vərəqinin bazal tərəfi və ya apikal tərəfi ürək toxuması ilə təmasda olmaqla hüceyrə vərəqinin hansı ECM komponentinin maksimum yapışmaya nail olmaq üçün lazım olduğunu yoxlamaq üçün həyata keçirildi. Bu tədqiqat MSC vərəqlərinin miyokardın uğurlu transplantasiyası üçün klinik sübut və parametrləri təqdim edən ilk hesabatdır və bu işdə əldə edilən məlumat ürək-damar xəstəlikləri üçün potensial hüceyrə əsaslı terapiya kimi hüceyrə təbəqəsi texnologiyasının inkişafında mühüm addımdır.


Müəllif məlumatı

Əlaqələr

Kök Hüceyrə və Regenerativ Tibb Mərkəzi, Zhejiang Universiteti Tibb Məktəbi, Hangzhou, 310058, Çin

Xiaoping Han, Haide Chen, Daosheng Huang, Lijiang Fei və Guoji Guo

Hematologiya İnstitutu, 1-ci Əlaqəli Xəstəxana, Zhejiang Universiteti Tibb Məktəbi, Hangzhou, 310003, Çin

Xiaoping Han, He Huang və Guoji Guo

Dr. Li Dak Sum və Yip Yio Chin Kök Hüceyrə və Regenerativ Tibb Mərkəzi, Zhejiang Vilayəti Toxuma Mühəndisliyi və Regenerativ Tibb üzrə Açar Laboratoriya, Hançjou, 310058, Çin

Biostatistika və hesablama biologiyası şöbəsi, Dana-Farber Xərçəng İnstitutu, Harvard Çan İctimai Səhiyyə Məktəbi, Boston, MA, 02115, ABŞ

Huidong Chen & Guo-Cheng Yuan

Heyvan Elmləri Kolleci, Zhejiang Universiteti, Hangzhou, 310058, Çin

Kompüter Elmləri və Texnologiyaları Departamenti, Tongji Universiteti, Şanxay, 201804, Çin

Həyat Elmləri Kolleci, Zhejiang Universiteti, Hangzhou, 310058, Çin

Kök Hüceyrə İnstitutu, Zhejiang Universiteti, Hangzhou, 310058, Çin

Xiaoping Han, Daosheng Huang, Lijiang Fei, He Huang və Guoji Guo

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Töhfələr

XH və HC, EB və hematopoetik diferensiasiya da daxil olmaqla təcrübələr hazırlayıb apardılar. HH hematopoetik differensiasiya üçün bələdçi təqdim etdi. HC, DH, HC, LF və CC məlumatları təhlil etdi və statistik təhlil apardı. GG və GY tədqiqatı tərtib etdi və nəzarət etdi və əlyazmanı yazdı. Bütün müəlliflər son əlyazmanı oxudu və təsdiq etdi.


NƏTİCƏLƏR

Orqanlar və yaşa görə damar mikromühitlərinin heterojenliyi

Doku mikromühitlərində yaşa bağlı dəyişiklikləri anlamaq üçün sınaqdan keçirdik

Seçilmiş nümunələrdə onların toxuma boyu paylanmasını anlamaq üçün endotel hüceyrəsi (EC), perisit, stromal hüceyrə və matrisin xəritələşdirilməsi üçün 100 antikor. Sonra seçdik

Bu antikorlardan 50-si damar mikromühitlərinin müəyyən edilməsində ən məlumatlı idi və analizi böyrək, düz bud əzələsi, dalaq, timus, qaraciyər, ağciyər, uşaqlıq yolu, ürək, sidik kisəsi, beyin, dəri və bağırsaqda genişləndirdi. Bu orqan və toxumaları əhatə edən qalın uzununa kəsiklər yaradıldı və birincil antikorların (cədvəl S1) optimal flüorofor işarəli ikincil antikor birləşmələri ilə cütləşməsi ilə multipleks immunomarketləşdirməyə məruz qaldı. Biz bu antikorlarla qeyd olunan iş şəraiti və hüceyrə növləri haqqında tam məlumat və mənfi nəzarət vasitələrinin nümunəvi şəkillərini təqdim edirik (cədvəl S1 və şəkil S1A).

EC markerləri Endomucin (Emcn), Endoglin (CD105), CD31 (PECAM1) və CD102 (ICAM2) damar sıxlığının təhlili üçün də istifadə edilmişdir, Tie-2, Bcam1, VEGFR2 (damar endotelial böyümə faktoru reseptoru 2) kimi digər hüceyrə səthi markerləri ) və Podocalyxin qan damarlarını təsvir etmək və təhlil etmək üçün istifadə edilmişdir. Arteriyaların ölçülməsi üçün α–hamar əzələ aktin (α-SMA) rəngindən istifadə edilib və perisitlər trombositdən əldə edilən böyümə faktoru reseptoru β (PDGFRβ) və sinir/glial antigen 2 (NG2) tərəfindən müəyyən edilib. Gənc və yaşlı toxumalarda fibroblastların təsviri üçün fibroblasta xas protein-1 (FSP1) və Podoplanin antikorlarından istifadə edilmişdir. Matris müəyyən etmək üçün HSPG2, Laminin, Kollagen IV və Vimentin istifadə edilmişdir. Mezenximal hüceyrələrin təsviri üçün Desmin, Decorin, PDGFRa və SM22α istifadə edilmişdir. Bölmələrin üçölçülü (3D) plitə skanları bir hüceyrə həlli ilə lazer skan edən konfokal mikroskopda yaradılmışdır (Şəkil 1, A və B). Müxtəlif orqanlardan alınan nümunə plitə skanları EC-lərin, perisitlərin və mezenximal stromal hüceyrələrin təşkilini, ifadə nümunələrini və məkan paylanmasını göstərdi və damar mikromühitlərinin 3D xəritələrinin yaradılmasına imkan verdi (Şəkil 1B). Sonradan, hesablama səthinin göstərilməsi maraq doğuran bölgələrdə (ROI) həyata keçirildi ki, bu da kafel-skan 3D şəkillərindən bir hüceyrə səviyyəli məlumat verir (Şəkil 1C və şəkil S1B). Bundan əlavə, bu yüksək qətnamə şəkilləri bir hüceyrə qətnaməsində lokalizasiyanın və hüceyrə-hüceyrə və hüceyrə-matris qarşılıqlı əlaqələrinin təhlilinə imkan verdi (Şəkil 1C və şəkil S1B). Məsələn, korteksdə və medulla bölgələrində kapilyarların struktur heterojenliyi böyrəyin kafel skanları ilə vurğulandı (Şəkil 1C). Bu şəkillərlə sübut edildiyi kimi, Desmin-ifadə edən stromal hüceyrələr əsasən medulla bölgəsində lokallaşdırılmışdır, lakin böyrəyin qabığında deyil (Şəkil 1C). Bunun əksinə olaraq, Podoplanin glomeruli bölgəsində məhdudlaşdı (Şəkil 1C). Eynilə, Isolectin ifadəsi korteks bölgəsi ilə məhdudlaşdı (Şəkil 1C). Yaşdan asılı dəyişiklikləri araşdırmaq üçün gənc və qocalmış siçanların müxtəlif orqanlarına belə yüksək ayırdetmə qabiliyyətinə malik kafel-skan təsviri tətbiq edilib. Gənc və yaşlı siçanlardan əldə edilən böyrəklərdən alınan nümunəvi 3D kafel skan şəkilləri yaşa bağlı dəyişikliklər nümayiş etdirdi (Şəkil 1D). Orqan və yaşa bağlı heterojenlik 3D bütün orqan toxuması xəritələrinin təhlili vasitəsilə aşkar edilmişdir. 1000-dən çox belə 3D toxuma xəritələri (təxminən 6 terabayt məlumat) yükləmək (cədvəl S2) və OMERO veb interfeysi (http://homeros.kennedy.ox.ac.uk/) vasitəsilə əlavə təhlil üçün pulsuz resurs kimi mövcuddur. pub/chen-et-al-2021-3dOrgans).

(A) Gənc və yaşlı vəhşi tip (WT) siçanlarda təhlil edilən orqanların sxematik təsviri. Multipleks boyanma (üç-beş antikor) aparıldı və konfokal mikroskopiya ilə bütün orqan kafel-skan şəkilləri əldə edildi. Daha çox

Tədqiqat zamanı ortaq verilənlər bazası kimi mövcud olan bütün xam məlumatlar ilə 1000 skan əldə edildi. (B) Göstərildiyi kimi antikorlarla boyanmış gənc siçanların əzələ, dalaq, ürək, sidik kisəsi, bağırsaq, dəri, uşaqlıq yolu, qaraciyər, timus və ağciyərin reprezentativ şəkilləri. Sağdakı yazılar müxtəlif orqanlarda xüsusi sahələrin yüksək böyüdülməsini göstərir. (C) Desmin, Podoplanin, Isolectin və CD102 ilə boyanmış gənc siçan böyrəyinin tək hüceyrəli rezolyusiyaya malik 3D təsvirləri. İçəridə (ortada) böyrəkdə xüsusi bölgələrin yüksək böyüdülməsi göstərilir. Sağdakı ulduz bütün markerlər üçün səth göstərilməsi ilə daha yüksək böyütmələri göstərir. (D) Podocalyxin, SM22α və CD102 ilə immunolənglənmiş gənc və yaşlı böyrəklərin nümunəvi 3D şəkilləri. Böyrək cisimcikləri (RC) ətrafında mavi konturlarla təsvir edilmiş qan damarının səthi ilə daha yüksək böyütmələr göstərir. Nüvələr: göstərildiyi kimi TO-PRO-3 və ya DAPI. Şkala çubuqları, (B-dən D) əzələ, uşaqlıq yolu, sidik kisəsi, dəri, bağırsaq və timusun kafel skanları üçün 200 μm dalaq, böyrək, ürək, ağciyər və qaraciyər üçün 400 μm, 50 μm və tək hüceyrəli təsvirlər , 10 μm.

Fərqli damar hüceyrə tiplərinin spesifik 3D təşkili və məkan paylanması, təbii mühitdə hüceyrə-hüceyrə və hüceyrə-matris qarşılıqlı təsirləri ilə birlikdə onların orqan daxilində funksiyalarına təsir edir və müəyyən edir (13, 14). Məsələn, timus, timusun ölçüsünün azalmasına və T hüceyrələrinin inkişafını dəstəkləmək funksiyasının itirilməsinə səbəb olan hüceyrə tərkibində və toxuma strukturunda yaşdan asılı olaraq nəzərəçarpacaq dəyişikliklərlə orqan yaşlanması üçün bir model təqdim edir (15). Qan damarları toxumalara xas regional oksigenləşmə vəziyyətini və hipoksik bölmələri ehtiva edən timusda metabolik mikromühitləri qoruyur.16). Bundan əlavə, timusdakı toxuma mənşəli siqnallar onun damar şəbəkəsinin böyüməsini tənzimləyir, bu da öz növbəsində T hüceyrələrinin inkişafı üçün şərait yaradır (17, 18). Gənc siçanların timusun 3D xəritələrinin hərtərəfli araşdırılması, timus təsviri bazamızda kapilyarların təşkili və korteks və medulla bölgələri arasında paylanması ilə bağlı fərqləri vurğuladı (şək. S1, C-dən E). Çoxsaylı EC markerləri ilə immunostaining medulla (şək. S1, C və D) ilə müqayisədə korteksdə daha yüksək qan damarı sıxlığını göstərdi. Daha sonra arterial filiallar qabığa daxil oldu və kortikal kapilyarlara bağlandı (şək. S1C). Kapilyar paylanmalara və sıxlığa uyğun olaraq, hipoksiya ilə induksiya olunan amil 1α (HIF1α) immun boyaması, medulla hipoksik olduğu halda korteksin oksigenlə zəngin olduğunu nümayiş etdirdi (şək. S1C). Digər diqqətəlayiq xüsusiyyət ondan ibarət idi ki, korteks deyil, medulla SM22α və Desmini ifadə edən mezenximal stromal hüceyrələr və FSP1 və Podoplaninin ifadəsi ilə müəyyən edilmiş fibroblastlarla dolu idi (şək. S1, D və E). Bundan əlavə, korteks deyil, medulla Kollagen IV və Laminin və yapışma kompleksi ilə əlaqəli zülallar Vimentin və Vinkulin kimi çoxlu hüceyrədənkənar matris zülalları ilə zəngin idi (şək. S1, D və E). Beləliklə, çoxsaylı markerlərin təhlili ilə bir hüceyrəli rezolyusiyaya malik 3D toxuma xəritələrimiz regional hüceyrədənkənar matrisin və hüceyrə paylanmasının heterojenliyi haqqında hərtərəfli məlumat verdi. Bu damar xəritələrindən bir neçəsi cədvəl S3-də təqdim edilmişdir.

Siçanlarda və insanlarda qocalmış toxumalarda damar və perisit bolluğunun itirilməsi

Sonra gənc və qocalmış orqanların geniş təsvirini çəkdik və müqayisə etdik. Biz regional fərqlər, hüceyrə və matriks markerlərinin ifadəsi, qan damarlarının paylanması, qan damarlarının sıxlığı, kapilyar diametrlər, arteriya diametri və arteriya nömrələri üçün şəkillərin təhlilini həyata keçirdik (Şəkil 2 və şək. S1, F-dən H və S2-dən S5). Hematoksilin və eozin (H&E) ilə boyanması yaşlı toxumaların sağlam vəziyyətini təsdiqlədi (şək. S2A). Bu təhlil bir çox orqanların damar bolluğunda yaşla əlaqədar nəzərəçarpacaq dərəcədə itki nümayiş etdirdiyini ortaya qoydu (Şəkil 2A və şəkil S2, B-dən D). Böyrək, dalaq, timus, qaraciyər və ürək daxil olmaqla qocalmış siçan orqanlarında α-SMA boyanması ilə müəyyən edilən arterial nömrələr azalmışdır (Şəkil 2A və şəkil S2, B və D). Bundan əlavə, yaşlanma ilə böyrək, əzələ, dalaq, timus, qaraciyər və beyində mikrovaskulyar sıxlıq azalmışdır (Şəkil 2A və şək. S2B). Üstəlik, çoxsaylı EC markerlərinin təhlili qan damarlarının sıxlığının azalmasının müəyyən hüceyrə səthi markerlərinin ifadəsində azalmanın artefaktı olmadığını təsdiqlədi. Damar sıxlığının azalması ilə yanaşı, digər diqqətəlayiq xüsusiyyət bu orqanlarda PDGFRβ + perisitlərin itirilməsi idi (Şəkil 2B və şəkil S2C). Fərqli toxumalarda damar dəyişikliklərinin tədqiqi hüceyrə və matriks markerlərində yaşdan asılı olaraq toxumaya xas əlavə dəyişiklikləri təsvir etdi. Məsələn, həm timus, həm də dalaq yaşlanmadan sonra Desmin ifadə edən hüceyrələrin artdığını nümayiş etdirdi (şək. S1G, S4, C və D və S5B). Böyrəkdə əsas memarlıq dəyişikliyi böyrək cisimciklərinin sayının azalması və qocaldıqdan sonra böyrək cisimciklərinin ölçüsünün artması ilə bağlıdır (şək. S5A). Qiymətləndirilən orqanların əksinə olaraq, dəri, bağırsaq, uşaqlıq və ağciyər kimi yüksək remodeling qabiliyyətinə malik toxumalar qocaldıqdan sonra damar sıxlığında heç bir aşkar dəyişiklik göstərməmişdir (Şəkil 2C və şək. S5K). Beləliklə, 12 orqanın 9-da (böyrək, əzələ, dalaq, timus, ürək, qaraciyər, beyin, sidik kisəsi və ağciyər) yaşdan asılı olaraq damar aşınması, qalan orqanlarda - bağırsaq, dəri və uşaqlıqda isə yaş müşahidə edilməmişdir. əlaqəli damar dəyişiklikləri (Şəkil 2D və şək. S2, B-dən D və S5K). Böyrək, əzələ, dalaq və timus həm damar sıxlığı itkisində, həm də perisit itkisində ən görkəmli dəyişiklikləri göstərdi. Buna görə də, bu cür yaşa bağlı damar aşınmasının altında yatan sonrakı molekulyar və funksional analiz üçün biz üç-dörd orqanın bu əsas dəstinə diqqət yetirdik.

(AB) Gənc və yaşlı böyrəyin, əzələnin, dalaqın və timusun göstərildiyi kimi immunoqrama ilə təmsil olunan 3D kafel skanları. Ox ucları arteriyaları təmsil edir. Ulduz işarələri səthdə göstərilən kapilyarları göstərən daha yüksək böyüdücü əlavələri ifadə edir. (A) Damar sıxlığının kəmiyyət göstəricilərini göstərən birləşmiş qrafiklər (sağda)n = 5). (B) Qarışıq qrafiklər (aşağıda) gənc və yaşlı böyrək, əzələ, dalaqda PDGFRβ + perisitlərin kəmiyyət göstəricilərini göstərir (n = 5) və timus (n = 6). (C) Qarışıq qrafiklər gənc və yaşlı dəri, bağırsaq, uşaqlıq və ağciyərdə damar sıxlığının kəmiyyət göstəricilərini göstərir (n = 5). (D) Diaqram yaşdan asılı olaraq damarların azalması olan doqquz orqanı və yaşdan asılı olaraq damar dəyişiklikləri olmayan üç orqanı göstərir. The P iki quyruqlu cütləşməmişdən əldə edilən dəyər t testlər bütün qrafiklər üçün verilir. ns, əhəmiyyətli deyil, *P < 0,05 **P < 0,01 ***P < 0,001 ****P < 0,0001. Nüvələr: DAPI və ya TO-PRO-3. Qarışıq süjetdə qutu vasitələri ± SD, qutudakı xətt medianı, aşağı və yuxarı sətirlər dəyərlərin minimum və maksimumunu, qutunun sağ tərəfindəki xətt isə nümunə paylanmasını təmsil edir. Ölçək çubuqları, (A) dalaq və böyrəyin kafel skanları, timus və əzələ üçün 400 μm, əlavələr üçün 200 μm 50 μm (B) 20 μm.

Bundan əlavə, qonşu EC-lərin nüvələri arasında məsafənin təhlili ilə müəyyən edildiyi kimi, yaşlanma toxumalarında EC-lərin yaşdan asılı uzanmasına və ölçüsünün artmasına baxmayaraq damar itkisi müşahidə edilmişdir (Şəkil 3A və şəkil S5L). Ki67 proliferasiya markeri ilə flüoresanla aktivləşdirilmiş hüceyrə çeşidlənməsi (FACS) kəmiyyət göstəriciləri ilə EC proliferasiyasının təhlili proliferasiya edən EC-lərdə yaşa bağlı azalma nümayiş etdirdi (şək. S6, A və B).Təsvirə əsaslanan TUNEL analizi ilə apoptotik hüceyrə ölümünün təhlili (şək. S6C) böyrək və dalaq toxumalarında deyil, timus və əzələdə EC apoptozunun artdığını göstərdi, bu da yaşa bağlı damarların tənzimlənməsində orqan-spesifik mexanizmlərin iştirakını təklif etdi. zərər.

(A) 3D şəkillərdə (solda) gənc (6 həftəlik) və yaşlı (60 həftəlik) siçan böyrəyində, əzələdə və dalaqda qan damarları göstərilir. Qarışıq qrafiklər (sağda) gənc və yaşlı orqanlarda (böyrək, n = yeddi bioloji təkrar əzələdən 42, n = səkkiz bioloji təkrarlanan dalağın 47-si, n = yeddi bioloji təkrardan 37). (B) α-SMA, PDGFRβ və Endoglin ilə boyanmış gənc və yaşlı insan toxumasının reprezentativ şəkilləri. Combo sahələri (sağda) böyrəklərdə damar sıxlığında əhəmiyyətli bir azalma göstərir (n = 5), əzələ (n = 5) və dalaq (n = 4) qocaldıqda. Qarışıq qrafiklər (aşağı solda) gənc və yaşlı insan böyrək və əzələlərində PDGFRβ + hüceyrələrinin miqdarını göstərir (n = 5). Qarışıq süjet (aşağı sağ) gənc və yaşlı insan dalağında α-SMA əhatəsinin (%) kəmiyyətini göstərir (n = 4). (C) Gənc və yaşlı insan dəri toxumasının reprezentativ şəkilləri. Qarışıq süjet (sağda) gənc və yaşlı dərilərdə damar sıxlığının kəmiyyət göstəricilərini göstərir (n = 4). Məlumat ± SD deməkdir. The P iki quyruqlu cütləşməmişdən əldə edilən dəyər t testlər bütün qrafiklər üçün verilir. *P < 0,05 **P < 0,01 ***P < 0,001 ****P < 0,0001. Nüvələr: DAPI və ya TO-PRO-3. N, nüvələr. Ölçək çubuqları, (A) 20 μm və əlavələr üçün 10 μm (B və C) 40 μm.

Perisit itkisinin damar bütövlüyünə təsirini qiymətləndirmək üçün damar sızması təhlil edilmişdir. 55 həftəlik yaşlı siçanların toxumalarında damar sızması əlamətləri müşahidə edilməmişdir (şək. S6D). Yaşdan asılı olaraq damar sıxlığının itməsinin toxumaların oksigenləşmə vəziyyətinə təsirini təhlil etmək üçün biz bu dörd orqanın - böyrək, əzələ, dalaq və timusun bölmələrində pimonidazol boyama tətbiq etdik. Yaşlanan əzələ və dalaq hipoksiyanı artırsa da, timus və böyrək heç bir dəyişiklik göstərmir (şək. S6E). Beləliklə, damar itkisinin hipoksiyaya bu cür təsiri orqanlara xas idi. Damar bolluğunda yaşa bağlı itki olsa da, LYVE-1 və PROX-1 ilə limfa damarlarının təhlili limfa damarlarının sıxlığında heç bir dəyişiklik göstərmədi (şək. S7, A-dan D). LYVE-1 də makrofaqlar tərəfindən ifadə olunduğundan, limfa damarları boruvari formalarına görə fərqləndirilirdi. CD68 və ya F4/80 immunoqrasiyaları ilə makrofaqların sayının kəmiyyəti yaşa görə heç bir dəyişiklik göstərməmişdir (şək. S7E).

Sıçan toxumalarında müşahidə edilən yaşa bağlı dəyişikliklərin patofizioloji aktuallığını anlamaq üçün insan toxuma nümunələrini təhlil etdik. Gənc (<20 yaş) və qocalmış (>70 yaş) fərdlərin sağlam insan toxumaları (cədvəl S4) endotel və perisit markerləri üçün immunohistokimya həyata keçirməklə damar dəyişikliklərini başa düşmək üçün təhlil edilmişdir (Şəkil 3B). Sıçan toxumaları ilə müqayisə edilə bilən, qocalmış insan böyrəyi, əzələsi və dalağı damar sıxlığı və perisitlərin sayında əhəmiyyətli bir azalma nümayiş etdirdi (Şəkil 3B), siçanlara bənzər qocalmış insan dərisi isə damar sistemini saxladı (Şəkil 3C). Beləliklə, dəri kimi yüksək regenerasiya potensialına malik yüksək dərəcədə remodeling edən toxumalar qocalma zamanı qan damarlarının sıxlığını saxlayır, digər toxumalar isə yaşa bağlı damar aşınmasını göstərir. Böyrək kimi digər orqanlarla müqayisədə nisbətən yüksək regenerasiya potensialına malik olan qaraciyər, siçanlarda yaşa bağlı damar azalması nümayiş etdirdi (şək. S2, B və D), lakin insan qaraciyəri qocaldıqda damar sıxlığını saxladı (şək. S7F). Beləliklə, yuxarıda göstərilən məlumatlar qocalmış siçan və insan toxumalarının əsas xüsusiyyəti kimi damar bolluğunun orqanlara xas itkisini təsvir etdi.

Damarların aşınması hüceyrə qocalmasının xəbərçisidir

Çoxsaylı orqanlarda müşahidə olunan yaşa bağlı damar dəyişikliklərinin yaşlanma ilə hüceyrənin pozulmasının nəticəsi olub-olmadığını öyrənmək üçün biz siçanların həyat müddətində bu toxuma səviyyəli damar dəyişikliklərinin üstünlük təşkil etməyə başladığı zaman nöqtəsini araşdırdıq. Bunun üçün müxtəlif yaş qruplarında olan siçanların orqanları analiz edilib. Həm qan damarlarının sıxlığında, həm də PDGFRβ + perisitlərin sayında azalma 30 həftəlik siçanlarda artıq aşkar idi (Şəkil 4A). Qocalmış hüceyrələrin yığılması toxumaların qocalmasının xüsusiyyətidir (19) və hüceyrə qocalması telomerin tədricən qısalması səbəbindən sabit hüceyrə dövrünün dayanması ilə qeyd olunur (20) və derepressiya INK4/ARF yer (21). Beləliklə, biz CDKN2A lusiferaza müxbir siçanlarından istifadə edərək, INK4 ailəsinin bir üzvünü, müəyyən edilmiş qocalma markerini, p16/CDKN2A-nı təhlil etdik.22). Luciferase/CDKN2A immuno-boyanması 30 həftəlik siçanların toxuma bölmələrində mənfi olmuşdur (şək. S7G), lakin yaşlı toxumalarda lusiferaza/CDKN2A ifadəsi aşkar edilmişdir (şək. S7G). Eynilə, CDKN2A üçün fermentlə əlaqəli immunosorbent analizi (ELISA) analizi 55 həftəlik siçanlarda və ya 90 həftəlik siçanlarda 10 və 30 həftəlik siçanlarla müqayisədə CDKN2A səviyyələrinin artdığını nümayiş etdirdi (Şəkil 4B) .

(A) Damar sıxlığı üçün böyrək, əzələ, dalaq və timusun bar qrafikləri (yuxarı, n = 5) və PDGFRβ + hüceyrələri (alt, n = 4 və ya 5). (B) Ştrixli qrafiklər CDKN2A-nın toxumalarda ELISA ilə ölçülən konsentrasiyasını göstərir p16LUC 10, 30, 55 və 90 həftəlik siçanlar (n = 5). (C) 10 və 30 həftələrdə timusda PE-Texas qırmızı-A (DHE + hüceyrələrini təmsil edir) və müsbət nəzarət (Luperox ilə müalicə) ilə müqayisədə yan səpilmə sahəsinin (SSC-A) nümayəndəsi FACS sahələri. Müxtəlif yaşlarda toxumalarda (böyrək və dalaq, n = 5 başqa, n = 4). (D) 10, 30 və 55 həftələrdə timusun MSPC-lərinin nümayəndəsi FACS sahələri. Müxtəlif yaşlarda toxumalarda MSPC-lərin (%) kəmiyyətini göstərən bar qrafikləri (n = 5). (E) Timusun 3D şəkilləri Vegfr2 iΔEC (M) və zibil nəzarəti (C) siçanları göstərildiyi kimi immunolənglənmişdir. CDKN2A konsentrasiyasının, MSPC-lərin (%) və fibroblast nömrələrinin kəmiyyətlərini göstərən bar qrafikləri (n = 5). Məlumat ± SD deməkdir. The P iki quyruqlu cütləşməmişdən əldə edilən dəyər t testlər iki qrup və birtərəfli ANOVA testi ilə Tukey-nin ikidən çox qrup üçün çoxlu müqayisə testi üçün verilir. *P < 0,05 **P < 0,01 ***P < 0,001 ****P < 0,0001. Ölçək çubuqları, (E) 50 μm.

Müxtəlif məlumatlar qocalmada reaktiv oksigen növlərinin (ROS) rolunu müəyyən edir və yaşlı hüceyrələr adətən ROS-un artan yığılmasını nümayiş etdirirlər. Bu artan ROS istehsalı yaşlanma ilə mitoxondrial disfunksiya səbəbindən baş verir ki, bu da öz növbəsində daha çox mitoxondrial degenerasiyaya və qlobal hüceyrə zədələnməsinə səbəb olur (23). Buna görə də, müxtəlif yaş qruplarında siçanların toxumalarında hüceyrə ROS-u təhlil etdik (Şəkil 4C). ROS canlı hüceyrələrdə superoksid və hidrogen peroksid ilə reaksiyadan sonra flüoresan olan dihidroetidium (DHE) flüoresan zondundan istifadə etməklə aşkar edilmişdir.11). DHE-nin axın sitometrik analizi 10 həftəlik siçanlarla müqayisədə 30 həftəlik siçanların toxumalarında ROS yığılmasında əhəmiyyətli artım olmadığını göstərdi (Şəkil 4C). Müsbət nəzarət vasitəsi kimi üzvi peroksid olan Luperoks istifadə edilmişdir.

Orqanların regenerativ qabiliyyətinin azalması məməlilərin qocalmasının aşkar xüsusiyyətidir ki, yetkin kök hüceyrələrin çoxlu toxumalarda onların çatışmazlığı səbəbindən funksional azalması səbəb olur (24). Müxtəlif yaş qrupları olan siçanlarda kök hüceyrələrin vəziyyətini təhlil etmək üçün biz mezenximal kök/əcdad hüceyrələrini (MSPC) təhlil etdik və kəmiyyətini müəyyən etdik, çünki onlar çoxsaylı toxumalarda yaşayır və perivaskulyar yerləşirlər.25). CD45 − /Ter119 − /CD31 − /Sca-1 + /CD140a + kimi MSPC-lərin axın sitometrik analizi26) 10 və 30 həftəlik siçanlar arasında MSPC tezliyində əhəmiyyətli fərqlər göstərmədi, 55 və 90 həftəlik siçanlar isə MSPC-lərdə azalma göstərdi (Şəkil 4D). Yaşlanmanın başqa bir xüsusiyyəti, tez-tez interleykin-6 (IL-6) və IL-1β səviyyələrinin artması ilə əlaqəli xroniki aşağı dərəcəli iltihabın olmasıdır.27). IL-6 üçün ELISA analizi qocalmış 55 həftəlik toxumalarda IL-6 səviyyələrinin artdığını nümayiş etdirdi, lakin damar dəyişiklikləri yarandıqda 30 həftəlik toxumalarda deyil (şək. S7H). Yuxarıdakı nəticələr damar və perisit itkisinin siçan ömrünün əvvəlində baş verdiyini və yaşlanmanın hüceyrə əlamətlərindən əvvəl olduğunu nümayiş etdirdi. Yaşlanma və stresslə bağlı toxumalara xas damar və digər hüceyrə dəyişiklikləri cədvəl S5-də verilmişdir. Buna görə də, yaşdan asılı olaraq müşahidə edilən damar aşınması yaşlanma ilə əlaqəli hüceyrənin pisləşməsinin nəticəsi deyildi.

Sonra, damar dəyişikliklərinin yaşlanmanın hüceyrə əlamətlərinə təsir edib-etmədiyini araşdırdıq. VEGFA-VEGFR2 siqnalı fizioloji və patoloji neoangiogenezin kritik sürücüsüdür və EC-lərdə VEGFR2 itkisi angiogenezi və damarların yenidən qurulmasını maneə törədir (28). Buna görə də VEGFA-VEGFR2 siqnalına müdaxilənin təsirini araşdırdıq. Xüsusilə, biz EC-yə xas funksiyasını itirən siçanlar yaratdıq (Vegfr2 iΔEC) loxP qanadlı Vegfr2 allellərini birləşdirərək (Vegfr2 loxP/loxP ) və Cdh5(PAC)-CreERT2 transgenikləri. Yetkin 8 həftəlik siçanlarda tamoksifen tətbiq edildikdən sonra böyrək, əzələ, dalaq və timus toxumalarının analizi Vegfr2 iΔEC siçanları 11 həftəlik yaşda edildi. Silinmə effektivliyi kəmiyyət polimeraza zəncirvari reaksiya (qPCR) ilə təsdiq edilmişdir Vegfr2 (şək. S7I). dən toxumalar Vegfr2 iΔEC mutant siçanları qan damarlarının və PDGFRβ-ifadə edən perisitlərin itkisini nümayiş etdirdi (Şəkil 4E və şəkil S7J). Artan CDKN2A səviyyələri mutant siçanlarda zibil nəzarət siçanları ilə müqayisədə aşkar edilmişdir (Şəkil 4E). Bu nəticələr qocalmış hüceyrələrin yığılmasının damar itkisi ilə əlaqəli olduğunu göstərdi. Bununla belə, sıralanmış EC-lərdə CDKN2A səviyyələri dəyişməz qalmışdır Vegfr2 iΔEC siçanlarının zibil nəzarətçiləri ilə müqayisədə, damar itkisinin toxuma mikromühitində hüceyrə qocalması ilə əlaqəli olmasına baxmayaraq, EC-lərin özləri bu siçanlarda qocalmaya səbəb olmadığını göstərir (şək. S7K). Əlavə olaraq, Vegfr2 iΔEC mutant siçanları MSPC nömrələrində azalma nümayiş etdirdi (Şəkil 4E), lakin fibroblastların yığılması var idi (Şəkil 4E). Beləliklə, yuxarıda göstərilən nəticələr damarların pisləşməsinin yaşlanmanın hüceyrə əlamətlərinə təsir etdiyini və qlobal hüceyrənin pisləşməsinə səbəb olduğunu nümayiş etdirdi.

Perisitlərin yaşdan asılı olaraq fibroblastlara diferensiasiyası

Siçan orqanları arasında damar mikromühitlərinin təhlili, yaşlanmadan sonra fibroblast markerləri, yəni Podoplanin və FSP1 üçün artan immun boyama nümayiş etdirdi.2931) (şək. 5A və şəkil S8A). Bundan əlavə, Vegfr2 iΔEC mutant siçanları fibroblast nömrələrinin əhəmiyyətli dərəcədə artdığını nümayiş etdirdi (Şəkil 4E). Bundan əlavə, fibroblastların miqdarı qocalmış toxumalarda FSP1-müsbət fibroblastlarda əhəmiyyətli artım nümayiş etdirdi (Şəkil 5A). Eynilə, FSP1 ifadəsinə əsaslanan insan toxumalarında müəyyən edildiyi kimi, fibroblast nömrələrinin təhlili və kəmiyyəti gənc donorlarla müqayisədə qocalmış donorların toxumalarında fibroblastların artdığını nümayiş etdirdi (Şəkil 5B). Üstəlik, qocalmış toxumalarda angiogenezi maneə törədən matris proteoqlikan olan FSP1 və Decorinin üst-üstə düşən ifadəsi artmışdır (şək. S8B).

(A) Sıçan toxumalarında FSP1 boyanması və fibroblast nömrələri (n = 7). (B) İnsan toxumalarında FSP1 boyanması və fibroblastın miqdarı (n = 5). (C) FSP1-də immun boyama PDGFRβ-P2A-CreERT2 ROSA26-td-Pomidor siçan. Ulduz işarələri bir hüceyrə ayırdında bölgələrin daha yüksək böyüdülməsini göstərir. Kombinə edilmiş qrafiklər pomidor + /FSP1 + hüceyrə nömrələrini göstərir (n = 4 və ya 5). (D) FSP1 boyanması və pomidorun miqdarı + /FSP1 + hüceyrə nömrələri NG2-CreERTM ROSA26-td-Pomidor gənc və yaşlı əzələ (n = 5). (E) Nəzarət və fibroz böyrəkdə FSP1 boyanması və PDGFRβ əhatə dairəsinin və pomidor + /FSP1 + hüceyrə nömrələrinin (n = 4). (F) Sinovial oynaqlarda FSP1 immunoqrafik və kəmiyyət göstəriciləri PDGFRβ-P2A-CreERT2 ROSA26-td-Pomidor nəzarət və RA siçanları (n = 4). (G) Gənc və yaşlı siçan oynaqlarının 3D təsvirləri göstərildiyi kimi immunolənglənmişdir. Qarışıq qrafiklər damar sıxlığını göstərir (n = 5) və PDGFRβ + hüceyrə nömrələri (n = 4). Məlumat ± SD deməkdir. The P dəyər iki quyruqlu cütləşməmişdən əldə edilir t testlər. *P < 0,05 **P < 0,01 ***P < 0,001 ****P < 0,0001. Sarı qutular daha yüksək böyütmə ilə əlavələri göstərir. Ox başları pomidor + /FSP1 + hüceyrələrini təmsil edir. fm, femur tb, tibia sy, sinoviya. Nüvələr: DAPI. Ölçək çubuqları, (A və B) 40 μm (D) 50 μm (C, E və F) kafel skanları, 250 μm əlavələr, 50 μm (G) 50 μm.

Yaşlanan toxumalarda fibroblastların genişlənməsi (Şəkil 5, A və B), lakin perisitlərin azalması (Şəkil 2B və 4A) nümayiş etdirildi, buna görə də biz fərz etdik ki, perisitlərin yaşa bağlı itkisi onların fibroblastlara diferensiallaşması ilə bağlıdır. Bunu araşdırmaq üçün gənc və qocalmış siçanlarda perisitlərin genetik nəslini izlədik, çünki bu hüceyrə taleyi və diferensiasiyasının tədqiqi üçün güclü bir yanaşmadır (32). Tamoksifen inyeksiyaları gənc (6 həftəlik) və qoca (55 həftəlik) üçün edildi. PDGFRb-CreERT2 x ROSA26 td-Pomidor ikiqat transgeniklər (şək. 5C). Tamoksifen tətbiq edildikdən sonra 11-ci gündə siçanların təhlili həm gənc, həm də qocalmış siçanlarda perisitlərdə pomidor ifadəsinə gətirib çıxardı və gözlənildiyi kimi, qocalmış siçanlarda azalma (Şəkil 5C və şəkil S8C). FSP1 üçün immun boyama gənc siçanlarda pomidor-müsbət perisitlər və FSP1 ifadəsi arasında nadir və ya heç bir üst-üstə düşmə göstərdi (Şəkil 5C), lakin qocalmış siçanlar pomidor və FSP1 ifadəsi ilə zəngin ikiqat müsbət hüceyrələr nümayiş etdirdi (Şəkil 5C). Beləliklə, perisitlər qocalmış siçanlarda FSP1-i ifadə edən fibroblastların prekursorları idi və gənc siçanlarda deyildi. Bu fərziyyəni başqa bir perisit spesifik induksiya edilə bilən transgeniklərdən istifadə edərək daha da sınaqdan keçirdik, NG2-CreERTM × ROSA26td-Pomidor. Yenə tamoksifen tətbiqindən sonra 11-ci gündə gənc siçanlarda pomidor-müsbət hüceyrələrdə FSP1 ifadəsi nadir hallarda aşkar edildi (Şəkil 5D), lakin qocalmış siçanlarda ikiqat müsbət (pomidor və FSP1-i ifadə edən) hüceyrələr bol idi (Şəkil 2). 5D).

Perisitdən əldə edilən fibroblastlar qocalma və artrit zamanı orqan fibrozuna kömək edir

Hematopoetik olmayan, toxuma rezidenti olan fibroblastlar bir sıra xəstəliklərin patogenezinə kömək edir (33) və zədələ bağlı fibroz (34). Xüsusilə, FSP1 ifadəsi fibrozu təşviq edir və FSP1-müsbət fibroblastların fibrozu təşviq etdiyi göstərilmişdir (31). Buna görə də, fibroz zamanı perisitlərin iştirakını araşdırmaq üçün biz daha sonra böyrəkdə zədə ilə bağlı fibroz zamanı gənc və qocalmış siçanlarda perisitlərin taleyini təhlil etdik. PDGFRb-CreERT2 × ROSA26 td-Pomidor siçanlara böyrək fibrozunu induksiya etmək üçün sisplatin yeridildi və nəsil axtarışı aparıldı (Şəkil 5E və şək. S8D). Sisplatinlə müalicə olunan siçanların sağlam vəziyyətini göstərmək üçün H&E boyanmasından istifadə edilmişdir (şək. S8E). Nəzarət və sisplatinlə müalicə olunan siçanların böyrək toxumalarının nəsil izlənməsi, zibil nəzarəti siçanlarının toxumaları ilə müqayisədə pomidor və FSP1 ikiqat müsbət hüceyrələrində əhəmiyyətli artım nümayiş etdirdi (Şəkil 5E və şək. S8D). FSP1 ifadəsinə əlavə olaraq, bu pomidor-müsbət fibroblastların bir hissəsi Podoplanin, Vimentin və PDGFRa-nı da ifadə etdi (şək. S8F). Bundan əlavə, bu pomidor və FSP1 ikiqat müsbət hüceyrələrin tezliyi fibrozlu gənc siçanlarla müqayisədə fibroz inkişaf edən qocalmış siçanlarda əhəmiyyətli dərəcədə yüksək idi (şək. S8G). Beləliklə, perisitlərin fibroblastlara diferensiasiyası qocalma zamanı baş verən zədə ilə bağlı fibrozda artır.

Fibrozdan əlavə, fibroblastlar iltihabi xəstəliklərin patogenezinə kömək edir (35) və sinovial fibroblastlar, invaziv, toxuma destruktiv fenotipini qəbul edərək, romatoid artritdə (RA) birgə zədələnmə və iltihaba kömək edir (33, 36). Buna görə də, biz daha sonra perisitdən əldə edilən fibroblastların artritdə fibroblastların yayılmasına və genişlənməsinə töhfə verib-vermədiyini araşdırdıq. Beləliklə, RA'nın eksperimental bir modelini istifadə etdiyimiz zymosan'ın diz eklemlerine vuruldu PDGFRb-CreERT2 × ROSA26 td-Pomidor siçanlar artriti induksiya edir (37) sinovial oynaqlarda perisitləri izləmək məqsədi ilə. Bu siçan xəttində nəsil izləmə, artritli oynaqlarda pomidor və FSP1 ikiqat müsbət hüceyrələrin əhəmiyyətli dərəcədə artdığını nümayiş etdirdi, lakin nəzarət oynaqlarında deyil (Şəkil 5F). Beləliklə, perisitlər eksperimental iltihablı artritdə fibroblastların mənbəyi idi. Bundan əlavə, gənc və qocalmış sinovial birgə toxumaların müqayisəsi gənc siçanlarla müqayisədə qocalmış siçanlarda perisitlərin və qan damarlarının azalması ilə fibroblastlarda artım nümayiş etdirdi (Şəkil 5G və şək. S8H). Yuxarıdakı məlumatlar birlikdə göstərdi ki, perisit-fibroblast differensasiyası fibroblastların müxtəlif yollarla töhfə verdiyi iki iltihablı xəstəlik vəziyyətinin görkəmli xüsusiyyətidir.

Yaşlanan EC-lərdə damar və perisit saxlama yollarının aşağı tənzimlənməsi

Yaşla bağlı dəyişikliklərə və damar itkisinə səbəb olan molekulyar vasitəçilərin təsvirini vermək üçün timus toxumalarından təmizlənmiş gənc və qocalmış EC-lərin RNT ardıcıllığı (RNT-seq) aparılmışdır (Şəkil 6A). Yaşlanma ilə diqqətəlayiq dəyişikliklərə məruz qaldığı bilindiyi üçün timus toxuması burada təhlil edilmişdir. Gənc və qocalmış siçan timusları tək hüceyrəli süspansiyonlar əldə etmək üçün işlənmişdir. EC-lər bu orqanlardan anti-Endomucin antikorundan istifadə edərək maqnit muncuq əsaslı ayırma üsulu ilə təcrid olundu və RNT-seq analizinə məruz qaldı. Nəzarətsiz qruplaşma təhlili gənc və qocalmış siçanlar arasında EC-lərin fərqli profillərini göstərdi (Şəkil 6A). Diferensial şəkildə tənzimlənən mRNA-lar arayış nümunələri olaraq gənc siçanlardan EC ilə qocalmış siçanların EC-lərində müəyyən edilmişdir. Əhəmiyyətli dərəcədə differensial şəkildə ifadə olunan genlər səhv kəşf dərəcəsi (FDR) ilə tənzimlənir P dəyəri <0,01 timusda 491 gen yuxarı, 503 isə aşağı tənzimləndi (Şəkil 6A). Biz KEGG (Kyoto Gen və Genomlar Ensiklopediyası) məlumat bazasından istifadə edərək yol analizi (GAGE) üçün gen dəstinin zənginləşdirilməsini həyata keçirdik. Əhəmiyyətli yollar a ilə süzüldü q dəyəri <0.1. Yaşlanan EC-lər Notch siqnalının aşağı tənzimlənməsini göstərdi (Şəkil 6A). Notch və onun Dll4 liqandı angiogenezi toxumaya xas şəkildə tənzimləyir. Bir neçə toxumada Notch angiogenezin mənfi tənzimləyicisidir, lakin skelet sistemində angiogenezin müsbət tənzimləyicisidir (38). Buna görə də, biz sonra induksiv hədəfləmə həyata keçirdik Dll4 gen. Timus toxumalarının təhlili Dll4 iΔEC mutantları (11 həftəlik) qan damarlarının itməsi, perisitlərin azalması və fibroblastların artması (Şəkil 6A və şəkil S9A) nümayiş etdirdi. Bunlardan fərqli olaraq, EC-yə xas olan Notch qazanc funksiyası Fbxw7 iΔEC siçanları (11 həftəlik) qan damarlarında və perisitlərdə artım və fibroblastların sayında azalma nümayiş etdirdi (Şəkil 6A və şək. S9A). Bu nəticələr göstərirdi ki, yaşdan asılı olaraq Notch siqnalının itməsi qlobal damar və perivaskulyar aberasiyalara səbəb olur. Bundan əlavə, damarlarda dəyişikliklər Dll4 iΔEC mutantları T-hüceyrələrinin törəmələrinin kütləvi azalmasına və timus epitelinin pozulmasına gətirib çıxardı, bununla da timusun mikromühitinə və funksiyasına mənfi təsir göstərdi (şək. S9, B-dən E).Bu tapıntılar yaşa bağlı damar itkisinin yetkin T hüceyrələrinin timik çıxışının azalması ilə səbəbli əlaqədə olduğunu göstərirdi.39, 40).

(A) İstilik xəritəsi (solda) gənc (8-10 həftəlik Y) və yaşlı (50-55 həftəlik) timus (FDR-ə uyğunlaşdırılmış) arasında diferensial şəkildə ifadə olunan genlərin RNT-seq ifadə səviyyələrini göstərir. P dəyər kəsimi <0.01). Rəng intensivliyi sıra miqyaslı normallaşdırılmış jurnalı təmsil edir2(CPM) ifadəsi, sütun isə təkrarları təmsil edir. Qırmızı və mavi rəng intensivliyi yuxarı tənzimlənən və aşağı tənzimlənən genləri göstərir. Aşağı solda gen dəstinin zənginləşdirilməsindən əldə edilən ən əhəmiyyətli aşağı tənzimlənən bioloji proseslər göstərilir. 3D şəkillərdə PDGFRβ və FSP1-in immuno-boyanması göstərilir Dll4 iΔEC və littermate timusa, eləcə də nəzarət edir Fbxw7 iΔEC və nəzarət timus (11 həftəlik). Qarışıq qrafiklər fibroblast nömrələrini göstərir (n = 4). (B) Gənc (Y 8-dən 10 həftəyə qədər) və yaşlı (50-55 həftəlik) dalaq və böyrəklər arasında diferensial şəkildə ifadə olunan genlərin RNT-seq ifadə səviyyələrini göstərən istilik xəritələri. Aşağıda aşağı tənzimlənən yolların ən əhəmiyyətli GO şərtləri göstərilir. (C) Böyrək, dalaq və timusdan yuxarı tənzimlənən yolları təmsil edən gen dəsti zənginləşdirmə analizindən əldə edilmiş bioloji proseslərin Venn diaqramı. (D) Gənc (Y) və yaşlı (A) dəri və bağırsaq arasında diferensial şəkildə ifadə olunan genlərin RNT-seq ifadə səviyyələrini göstərən istilik xəritələri. Aşağıda aşağı tənzimlənən yolların GO şərtləri göstərilir. Məlumat ± SD deməkdir. The P dəyər iki quyruqlu cütləşməmişdən əldə edilir t testlər. **P < 0,01. Nüvələr: DAPI. Ölçək çubuqları, (A) 50 μm. ECM, hüceyrədənkənar matris.

Bundan sonra, yaşlanma ilə endotel Notch siqnalının bu aşağı tənzimlənməsinin bir çox toxumalarda ümumi xüsusiyyət olub olmadığını araşdırmaq üçün biz gənc (8-10 həftəlik) olan dalaq və böyrək toxumalarından EC-lərin RNT-seq analizini həyata keçirdik. ) və qocalmış (50-55 həftəlik) siçanlar. Timus üçün yuxarıda təsvir olunduğu kimi oxşar analitik yanaşma tətbiq edilmişdir. Böyrəkdə cəmi 1397 gen və dalaqda 537 gen qocalma zamanı aşağı reqlamentasiya edildiyi halda, böyrəkdə 1286 və dalaqda 341 gen aşağı tənzimlənmişdir (Şəkil 6B və şək. S10, A və B). Əvvəllər olduğu kimi, biz bu yaşlanan EC-lərdə KEGG verilənlər bazasından istifadə edərək GAGE ​​həyata keçirdik. Əhəmiyyətli yollar a ilə süzüldü q dəyəri <0.1. Bu orqanların hər ikisində yuxarıdan aşağı tənzimlənən yollar damarların və perisitlərin saxlanması və yenidən qurulması üçün kritik olduğu bilinən yolların aşağı tənzimlənməsini göstərdi (Şəkil 6B). Bununla belə, bu toxumalarda qocalma zamanı Notch siqnalı dəyişməyib (Şəkil 6B). Böyrəkdə diferensial gen ifadəsi angiogenez və qan damarının saxlanması üçün tələb olunan Hippo və Wnt siqnal yollarının aşağı tənzimlənməsini göstərdi (Şəkil 6B) (41, 42). Dalaqda qocalmış EC-lər metabolik yolların, o cümlədən HIF1α siqnalının aşağı tənzimlənməsini nümayiş etdirdi (Şəkil 6B) (43) və həmçinin, boşluq qovşağı rabitəsi (44) aşağı tənzimlənirdi (Şəkil 6B). Bu tapıntılar məlum damarların saxlanma yollarında yaşa bağlı çoxsaylı dəyişikliklərin müxtəlif toxumalarda damarların itirilməsi ilə birləşdiyini irəli sürdü. Biz daha sonra təhlil edilən bu üç toxuma arasında ümumi AK yaşlanma imzasını sorğuladıq: timus, dalaq və böyrək. Bu toxumalardan qocalmış EC-lər 84 ümumi yuxarı tənzimlənən gen nümayiş etdirdi və GAGE ​​analizi ilə sitokin-sitokin reseptorlarının qarşılıqlı təsirinin və ksenobiotiklərin metabolizmasının yuxarı tənzimlənməsini müəyyən etdi, bu toxumalar arasında qocalmış EK-lərin proinflamatuar təbiətini göstərir (Şəkil 6C və 6C). şəkil S10, C-dən E). Böyrək, dalaq və timusun yuxarı tənzimlənən və aşağı tənzimlənən yolunun GO (Gen Ontologiyası) şərtləri cədvəl S6-da verilmişdir. Daha sonra gənc və qocalmış EC-ləri bağırsaq və dəridən müqayisə etdik, çünki bu toxumalar qocaldıqda damar sıxlığını saxlamışdır. Gənc və qocalmış siçan bağırsağı və dərisi tək hüceyrəli süspansiyonlar əldə etmək üçün işlənmiş və timus, dalaq və böyrəklər üçün RNT-seq analizinə məruz qalmışdır. Bütün beş toxuma bağırsaq, dəri, timus, dalaq və böyrək arasında ümumi yuxarı tənzimlənən və ya aşağı tənzimlənən genlər və yollar müəyyən edilməmişdir (Şəkil 6D və şək. S10F). Timus, dalaq və böyrəklərdən fərqli olaraq, bağırsaqdan və dəridən olan qocalmış EK-lərdə sitokin-sitokin reseptorları qarşılıqlı əlaqə yolunun yuxarı tənzimlənməsi yoxdur, bu da bu EK-lərin proinflamatuar təbiətinin olmadığını göstərir (cədvəl S7 və S8). Beləliklə, EK-ləri damar itkisini nümayiş etdirən toxumalardan damarları saxlayan toxumalardan fərqləndirən əsas amil damar itkisi olan toxumalardan əldə edilən EK-lərdə iltihabi proseslərin yuxarı tənzimlənməsi idi. Bu nəticələr, damar və perisit bolluğunu saxlayan yüksək dərəcədə yenidən qurulan toxumalarda EK-lərin yaşlanma zamanı baş verən iltihabın yaşlanmasından və əlaqəli iltihab zədələnməsindən qorunmaq üçün qoruyucu mexanizmlərlə inkişaf edə biləcəyini göstərir.


MÜZAKİRƏ

Bu araşdırmada biz PSF-ni Fox-3 ilə qarşılıqlı əlaqədə olan zülal kimi müəyyən etdik və NMHC II-B-nin N30 ekzonunun sinir hüceyrəsinə xüsusi alternativ birləşməsini aktivləşdirmək üçün bu qarşılıqlı əlaqənin Fox-3 üçün vacib olduğunu nümayiş etdirdik. Biz həmçinin Fox-3-ün ifadə modelini siçan mərkəzi sinir sistemində hüceyrə səviyyəsində Fox-1 və 2-nin ifadə nümunələri ilə müqayisə etdik və Fox-3 ifadəsi ilə N30 birləşməsi arasında korrelyasiya tapdıq.

İki laboratoriya məməlilərin sinir sistemində Fox-1-in toxuma paylanması və subcellular lokalizasiyası haqqında məlumat verdi (24, 29). Fox-1-in neyron hüceyrələrində ifadə olunması ilə razılaşsalar da, onun nüvədə və ya sitoplazmada lokalizasiyası ilə bağlı fikir ayrılığı var. Müşahidələrimiz Blek və həmkarlarının Fox-1-in əsasən nüvələrdə lokallaşdırılması ilə bağlı fikirləri ilə böyük ölçüdə razılaşır. Bununla belə, onurğa beynindəki motor neyronların somalarında və nüvələrində Fox-1-i də aşkar etdik. Histoloji müşahidələrdəki uyğunsuzluqlar qismən heyvanların yaş və növlərindəki fərqlər, toxumaların fiksasiyası və antigenin axtarışı üsullarında fərqliliklər və Abs tərəfindən tanınan epitoplardakı fərqlərlə bağlı ola bilər. Maraqlıdır ki, Fox-1 izoformunda depolarizasiyanın səbəb olduğu dəyişiklik Fox-1-in nukleo-sitoplazmik nisbətində dəyişikliklə nəticələnir (32). Fox-1-in müxtəlif izoformalarının mədəni hüceyrələrdə ekzogen şəkildə ifadə olunduqda fərqli subhüceyrəvi lokalizasiyalar göstərdiyini daha əvvəl bildirmişdik (23). Buna görə də, hər bir xüsusi sistemdə Fox-1-in hansı izoformunun dominant olduğunu müəyyən etmək lazım gələ bilər.

Birgə immunoqrafik analizimiz və immunoblotinqin ardınca apardığımız FACS göstərdi ki, Fox-1 və ya 2-ni ifadə edən bəzi neyron hüceyrələri Fox-3-ü ifadə etmir. Qeyd etmək lazımdır ki, Fox-3-ün ifadə səviyyələri, Fox-1 və ya 2 deyil, beyincik, beyin sapı və onurğa beynindəki N30 birləşmə nümunələri ilə əlaqələndirilir. Beyin spesifik alternativ birləşməsi ilə bağlı əvvəlki tədqiqatların əksəriyyətində bütün beyin və ya beynin anatomik olaraq parçalana bilən hissələri istifadə edilmişdir. Fox-3-ün ifadə səviyyələrinə görə hüceyrələri ayırmaq üçün FACS-dən istifadə etdik. Hüceyrə çeşidlənməsi və biokimyəvi analizin birləşməsi bizi Fox-3 müsbət və mənfi hüceyrə populyasiyaları arasında müxtəlif birləşmə nümunələri tapmağa gətirib çıxardı. Əvvəlki müşahidəmizə baxmayaraq, Fox-1 və ya 2-nin ekzogen ifadəsi kultura hüceyrələrə N30 daxil edilməsini gücləndirir (23), Fox-1 və/yaxud Fox-2-ni ifadə edən, lakin Fox-3-ü olmayan beyin hüceyrələri N30 birləşməsini aktivləşdirmir. Bunu qismən aşağıdakılarla izah etmək olar. Fox-1 və ya 2-nin orta ifadə səviyyəsi beyincik, beyin sapı və onurğa beynindəki Fox-3 müsbət və mənfi hüceyrələri arasında oxşar olduğundan, Fox-3-ün əlavə ifadəsi sadəcə olaraq hər üç Fox zülalının ümumi miqdarını artırır. Digər səbəb Fox-1 və 2-nin izoformaları ilə bağlı ola bilər. Fox-1 və 2 genləri çoxlu alternativ olaraq birləşdirilmiş izoformalar yaradır. C-terminal bölgəsindəki amin turşusu ardıcıllığındaki fərqlər N30-a doğru birləşmə aktivliyində əhəmiyyətli fərqlərlə nəticələnir (23). Hal-hazırda tədqiqatımız C-terminal amin turşularında fərqləri ayırd etmir, çünki anti-Fox-1 Fox-1 izoformları üçün ümumi olan N-terminal bölgəsinə qarşı yaradılıb və eyni şey anti-Fox-2 üçün də keçərlidir. Buna görə də, Fox-3 üçün mənfi hüceyrələr, daha aşağı birləşmə aktivliyi ilə Fox-1 və/və ya Fox-2 izoformlarını ifadə edə bilər. Üçüncü səbəb, qarşılıqlı zülal(lar) üçün yaxınlıq fərqi ola bilər. Ataksin-1 və 2, atrofin-1, quaking, Fyn tirozin kinaz və estrogen reseptoru-α daxil olmaqla bir sıra zülalların məməlilərdə Fox-1 və ya Fox-2 ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğu bildirilmişdir (29, 44-46). Bununla belə, bu zülalların əksəriyyəti mRNT-dən əvvəlki birləşmə kontekstində funksional olaraq xarakterizə edilməmişdir. Xüsusilə maraq doğuran, U1 snRNP komponenti, U1C zülalının Fox-1 və 2 ilə maya iki-hibrid skrininqində (47) qarşılıqlı təsirini göstərən hesabatdır, baxmayaraq ki, bu qarşılıqlı əlaqənin funksional nəticəsi öyrənilməmişdir. Bu işdə biz PSF-ni N30 birləşməsinin aktivləşdirilməsi üçün Fox-3-ün əsas qarşılıqlı zülalı kimi müəyyən etdik. Fox-1 və 2 izoformlarını müqayisə etsək də, Fox-3 ilə ən yüksək ardıcıllıq oxşarlığını və məlum izoformalar arasında N30 birləşməsi üçün ən yüksək aktivliyi göstəririk, PSF Fox-1 və 2 ilə müqayisədə Fox-3-ə daha effektiv şəkildə bağlanır. Buna görə də bu, Fox-3-ün N30 daxil edilməsində niyə daha aktiv olduğunu izah edə bilər. Bu yaxınlıq fərqi də onu göstərir ki, Fox-3 alternativ birləşmənin sinir spesifikliyinin müəyyən edilməsində rol oynaya bilər. Bununla belə, PSF-nin Fox zülalları üçün yaxınlıq fərqləri hələ də biokimyəvi cəhətdən daha ətraflı öyrənilməli və hüceyrə kontekstində daha dəqiq qiymətləndirilməlidir.

Fox-3 ifadəsinin səviyyəsi ilə N30 birləşməsinin miqyası arasında yaxşı korrelyasiya tapsaq da, bu tədqiqat Fox-1 və 2-dən N30-a birləşdirilməsinin mümkün töhfəsini istisna etmir. Fox-1 və 2-nin bir maya iki hibrid sistemindən istifadə edərək bir-biri ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğu bildirildi (46). Laboratoriyamız həmçinin maya iki-hibrid sistemindən istifadə edərək Fox-2-nin Fox-3 ilə qarşılıqlı təsirini, eləcə də Fox-3-ün Fox-1 və Fox-2 ilə qarşılıqlı immunopresipitasiya yolu ilə qarşılıqlı təsirini (nəşr olunmamış müşahidələr) aşkar etdi. Əslində biz nadir hallarda yalnız Fox-3 ifadə edən neyron hüceyrələri müşahidə etdik. Təhlil etdiyimiz bütün Fox-1 izoformaları həm nüvələrdə, həm də sitoplazmada diffuz şəkildə paylanmış və ya mədəni hüceyrələrdə ekzogen olaraq ekspressiya edildikdə əsasən sitoplazmada lokallaşdırılmış olduğundan, Fox-1-in əsasən bütöv beyindəki nüvələrdə lokalizasiyası gözlənilməz idi. ( 23 ). Bunun əksinə olaraq, ekzogen şəkildə ifadə edilən Fox-3 izoformları demək olar ki, yalnız mədəni hüceyrələrdə nüvələrdə lokallaşdırılır (Əlavə Şəkil S1D). Təhlil etdiyimiz Fox-2 izoformları əsasən nüvələrdə lokallaşdırılır (23). Bu müşahidələr Fox-1-in Fox-3 və ya Fox-2 ilə dimerləşməsi və nüvələrdə lokalizasiyası ehtimalını artırır. in vivo . Fox zülalları heterodimerlər və ya heteromultimerlər kimi fəaliyyət göstərə bilər, xüsusən də pre-mRNA çoxlu UGCAUG elementlərini ehtiva etdikdə. Heterodimerlər və homodimerlər arasında birləşmə aktivliyində fərq olub-olmaması hələ də müəyyən edilməlidir.

Tülkü zülalları tənzimlənən ekzonlara nisbətən pre-mRNA-larda bağlanma yerindən asılı olaraq aktivator və ya repressor kimi fəaliyyət göstərə bilər. Son genom tədqiqatları, model sistemlərdən istifadə edən əvvəlki tədqiqatlarla birlikdə, Fox zülallarının ekzon seçiminə təsir göstərməsi üçün ümumi bir qayda təklif etmişdir (8, 20). Fox zülalları alternativ ekzonun aşağı axınında introna bağlandıqda, ekzon daxil edilməsi baş verir. Digər tərəfdən, Fox zülalları alternativ ekzonun yuxarı axınında introna bağlandıqda, ekzon atlaması baş verir. Bu yaxınlarda bir neçə hesabat Fox zülallarının alternativ ekzonların istifadəsini sıxışdırdığı və ya aktivləşdirdiyi mexanizmə toxunmağa başladı. F1γ pre-mRNA-dan istifadə edərək, yuxarı introna cəlb edilən Fox-1-in tənzimlənən ekzonun aşağı axınında intronda erkən spliseozom kompleksinin formalaşmasına mane olduğu göstərilmişdir (48). Kalsitonin/CGRP pre-mRNA vəziyyətində, yuxarı introna bağlı olan Fox-2, filial yerində SF1-in cəlb edilməsini maneə törədir və daha sonra, alternativ ekzona bağlı olan Fox-2, U2AF-nin toplanmasına mane olur. 3′ birləşmə yeri (27). Fox zülallarının (FOX-1 və ASD-1) xüsusi olaraq əzələdə ifadə olunan başqa bir ardıcıllıqla spesifik RNT bağlayıcı protein SUP-12 ilə qarşılıqlı əlaqəsi haqqında məlumat verilmişdir. C. elegans . FOX-1 (və ya ASD-1) və SUP-12 qarşılıqlı əlaqəsi onların egl-15 pre-mRNT-də bitişik hədəf RNT elementlərinə bağlanmasını gücləndirir və əzələ spesifik bir-birini istisna edən ekzonun daxil olmasına gətirib çıxarır. Bu hesabat Fox tərəfindən tənzimlənən alternativ birləşdirmənin ciddi toxuma spesifikliyi üçün bir mexanizm təqdim edir (49).

Bu araşdırmada biz PSF və PSF-NonO kompleksini Fox-3 ilə qarşılıqlı əlaqədə olan zülallar kimi müəyyən etdik. NonO-nun insan ortoloqu tez-tez p54nrb adlanır. PSF və NonO iki RRM ehtiva edən və DNT ilə yanaşı RNT ilə də bağlana bilən struktur olaraq əlaqəli zülallardır (40). PSF və NonO heterodimer yaratmaq üçün bir-biri ilə qarşılıqlı əlaqədə olur və PSF və ya PSF-NonO kompleksinin iştirakı nüvə funksiyasının bir çox aspektlərində transkripsiya, transkripsiyanın dayandırılması, mRNT-dən əvvəl birləşdirilməsi, mRNT və RNT-nin 3′ son emalı da daxil olmaqla bildirilmişdir. saxlama (40, 50, 51). PSF və NonO müxtəlif toxumalarda və hüceyrə tiplərində ifadə edilir. Fox-3-ün C-terminal bölgəsinin birbaşa PSF-nin N-terminal bölgəsinə bağlandığını və Fox-3 və NonO-nun PSF vasitəsilə dolayı yolla qarşılıqlı əlaqədə olduğunu nümayiş etdirdik. PSF, Fox-3-ün hədəf UGCAUG elementinə bağlanmasını gücləndirir in vitro çarpaz bağlama analizi. Bundan əlavə, PSF-nin olması, bütöv hüceyrələrdə UGCAUG elementlərini ehtiva edən NMHC II-B transkriptinin IDDE-yə Fox-3-ün cəlb edilməsini gücləndirir. PSF-nin bütöv hüceyrələrdə hədəf RNT elementi ilə Fox-3-ə bağlanmasına təsiri ilə müqayisədə yəqin ki, daha çox inkişaf dərəcəsini (>30 qat) göstərir. in vitro (2-dən 3-ə qədər). Bu fərq Fox-3 və PSF kompleksinin formalaşmasının fərqli effektivliyi ilə bağlı ola bilər in vitro və bütöv hüceyrələr. Başqa bir ehtimal, PSF və Fox-3-ün pre-mRNA-ların Fox-3 hədəf sahələrinə birgə transkripsiya ilə cəlb oluna bilməsidir. PSF və NonO-nun transkripsiya uzanma faktorlarını ehtiva edən böyük bir kompleksdə fosforillənmiş RNT polimeraza II ilə əlaqəli olduğu bildirilmişdir (52, 53). Əgər Fox-3 PSF vasitəsilə həmin kompleksə daxil edilsəydi, nüvədəki sadə diffuziya ilə müqayisədə, Fox-3 transkripsiyanın uzanması zamanı pre-mRNT-lərin hədəf sahələrinə daha səmərəli şəkildə cəlb edilə bilərdi.

Hədəf RNT elementi ilə Fox-3 bağlanmasının PSF tərəfindən gücləndirildiyini göstərsək də, alternativ splicingin Fox-3-dən asılı aktivləşdirilməsində PSF-nin rolu bu təsirlə məhdudlaşa bilməz. PSF əvvəlcə spliceosom ilə əlaqəli bir protein olaraq tapıldı (54). Bir sıra tədqiqatlar müxtəlif mərhələlərdə və snRNP-ləri ehtiva edən komplekslərdə pre-spliceosomda və spliceosomda PSF-nin mövcudluğunu nümayiş etdirdi (55). PSF-nin U5 snRNA ilə və 5 ′ birləşmə yeri ilə birbaşa qarşılıqlı əlaqədə olduğu bildirilmişdir (42, 53). Buna görə də PSF Fox-3-ə bağlı pre-mRNT və birləşdirmə mexanizmləri arasında vasitəçi rolunu oynaya bilər. Bu anlayış, PSF-nin birbaşa IDDE-yə və ya digər nüvə amilləri olmadıqda NMHC II-B minigenindən olan pre-mRNT-yə bağlanmaması ilə bağlı müşahidəmizlə dəstəklənir. Bundan əlavə, həm Fox-3 (və ya digər Fox zülalları) həm də PSF N30 birləşməsinin UGCAUG-dən asılı aktivləşməsi üçün vacibdir. Endogen PSF və Fox-2 varlığında, ekzogen Fox-3 ekzogen PSF kimi müəyyən dərəcədə N30 birləşməsini aktivləşdirir. Ekzogen Fox-3 və PSF-nin bu təsirləri, görünür, əlavədir. Endogen Fox-2 və ya PSF aradan qaldırıldıqda, nə ekzogen Fox-3, nə də PSF N30 birləşməsini aktivləşdirə bilməz. PSF-nin N30 splicinginə gücləndirici təsiri UGCAUG elementindən asılıdır, baxmayaraq ki, o, bu elementə bağlanmır və Fox-3 (və ya digər Fox zülallarının) mövcudluğundan tamamilə asılıdır. Fox-3-ün N30 birləşməsinə gücləndirici təsiri də PSF-nin mövcudluğundan tamamilə asılıdır. Beləliklə, iki zülalın təsirləri əslində əlavə deyil, daha çox əməkdaşlıq edir. PSF, yapışma prosesi zamanı Fox-3-ün koaktivatoru və ya vasitəçisi kimi fəaliyyət göstərir. Bütün məlumatları yerləşdirmək üçün ən sadə model PSF və ya PSF tərkibli kompleks körpülər Fox-3 və birləşdirmə mexanizmləridir. Fox-3 və PSF qarşılıqlı təsirindən sonra N30 ekzonunun tanınmasının təfərrüatlı molekulyar mexanizmi hələ də aydınlaşdırılmasa da, bu qarşılıqlı əlaqənin aşağı axın intronik vasitəsilə alternativ ekzon daxil edilməsinin Fox zülalının tənzimlənməsi ilə aktivləşdirilməsinə cavabdeh olan mexanizmin tərkib hissəsi olduğu göstərilmişdir. gücləndirici.


Videoya baxın: 11- Flow cytometry FCM - قياس التدفق الخلوي (Avqust 2022).