Məlumat

Xərçəng Rəqəmsal Slayd Arxivindən histoloji slaydı necə yükləyə bilərəm

Xərçəng Rəqəmsal Slayd Arxivindən histoloji slaydı necə yükləyə bilərəm



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mümkün olub-olmadığını və http://cancer.digitalslidearchive.net saytından şəkillər məlumatlarını necə endirəcəyini söyləyə bilərsinizmi?

Çox sağ ol.


Rəqəmsal Patologiyanın Gələcəyi

Michael Schubert, Luke Turner | 22.10.2020 | Daha uzun oxu

Bəzi şübhələr qalmasına baxmayaraq, rəqəmsal patologiyanın dəyəri dünyada getdikcə daha çox tanınır - xüsusən də bu post-pandemiya dövründə. Rəqəmsal həvəskarlar Jonhan Ho və Sylvain Mailhot oyunun hazırkı vəziyyətini və rəqəmsal qəbulun necə təşviq oluna biləcəyini nəzərdən keçirirlər.

Rəqəmsal patologiya, şübhəsiz ki, bu sahənin gələcəyidir. Bəziləri hələ də laboratoriyadakı yerini qəbul etmək istəməsələr də - və bir çox müəssisələrdə yavaş qəbul edilməsinə baxmayaraq - rəqəmsal slayd təsviri yavaş-yavaş mikroskopun səhnəsindəki şüşə slaydını əvəz edir. Çeviklik, dəqiqlik və daim təkmilləşən informatika və təsvirin təhlili alətlərinin tətbiqi potensialı rəqəmsal patologiyanı cəlbedici seçimə çevirir. Lakin buna baxmayaraq, əhəmiyyətli maneələr qalır – ilkin xərclər, pozulmuş iş axınları və həyata keçirilməsi üçün tələb olunan dəyişdirilmiş infrastruktur bir çox laboratoriyanın rəqəmsal patologiyanın tam potensialına çıxışına mane olur.

Bununla belə, 2020-ci ilin əvvəlində COVID-19 böhranının başlaması yalnız rəqəmsal sistemlərin bəzi əsas üstünlüklərini vurğulamağa xidmət etdi. Rəqəmsal patologiyası olan bu müəssisələr patoloqlarına iş yüklərini daha yaxşı idarə etməyə və öz evlərinin rahatlığı və təhlükəsizliyindən diaqnoz qoymağa imkan verdi. Tənzimləmə problemləri rəqəmsal övladlığa mane ola bilər – lakin biz pandemiyanın praktiki nəticələrinə uyğunlaşdıqca, tibbi və tənzimləyici icmalar slaydların rəqəmsallaşdırılmasını və uzaqdan diaqnostikanın faydalarını birləşdirməyin yollarını getdikcə daha çox təhlil edirlər. Mövcud oyun vəziyyəti və hadisələrin hara doğru getdiyi haqqında daha çox öyrənmək üçün rəqəmsal təcrübəyə malik iki patoloq Jonhan Ho və Sylvain Mailhot ilə danışdıq.

Sponsorlu Məzmun

Laboratoriyada süni intellekt patoloqlara və xəstələrə necə fayda verə bilər?

Filippo Fraggettanın INIFY Prostat Skrininqindən istifadə edərək öz təcrübəsini və klinik nəticələrini paylaşmasını dinləmək üçün 25 Martda The Patologist və ContextVision-a qoşulun.

Dəyişiklik vaxtıdır
Jonhan Ho patoloji rezidenturasında ilk dəfə tam slayd şəklini görəndə heyrətə gəldi. "Mən bilirdim ki, bir gün hamımız rəqəmsal patoloji ilə müntəzəm olaraq diaqnoz qoyacağıq" dedi. Bununla belə, o, təklif olunan ağır tibbi proqramdan əsəbiləşirdi. “Lazımsız düymələrə klikləməklə nə qədər vaxt itirdiyimiz üçün inanılmaz dərəcədə məyus oldum. Mən o vaxt hiss etdim ki, gələcək onilliklər üçün patoloji proqram təminatının gələcəyinə təsir etmək üçün unikal şansımız var. Gələcəyə dair bir baxış, pis proqram təminatı tərəfindən məcbur edilən qeyri-kamil patoloji iş axınlarına gətirib çıxardı, digəri isə işdəki xoşbəxt və ilhamlı patoloqlara - və Ho sonuncunu reallaşdırmaq üçün əlindən gələni etmək istədi.

Pandemiyanın artması ilə onun istəkləri vaxtında idi. "COVID-19 həqiqətən uzaqdan öyrənmə ehtiyacını sürətləndirdi və biz bütün tədrisimizi tam slayd şəkillərinə keçirdik" deyə Ho izah edir. Ancaq təhsil getdikcə demokratikləşdikcə, o, gözə çarpan bir yoxluğun fərqinə vardı - həkimlər, xüsusən də patoloqlar üçün biliklərini bölüşmək üçün bir platforma. Bu problemi həll etmək üçün Ho KiKo-nu yaratdı – “knowledge in, information out” üçün qısaltma. Orada patoloqlar videolar və digər məzmun formaları ilə birləşdirilmiş bütün slayd şəkillərinin kolleksiyalarını paylaşırlar. Və KiKo havaya qalxır. Bu yaxınlarda platforma ilk qlobal rəqəmsal dermatopatologiya möhtəşəm turlarına ev sahibliyi etdi, burada bütün dünyada dermatopatoloqlar halları paylaşdılar və ən yaxşı məsləhət və tövsiyələrini alqışladılar.

"Rəqəmsal patologiya patoloqa güc verir" dedi Ho. “Biz artıq histologiya laboratoriyasının yerləşdiyi yerə zəncirlənmirik. Üstəlik, rəqəmsal patologiya indi yaratmağa başladığımız tamamilə yeni informatika və görüntü analizi alətləri dəstini açır”. Bununla belə, o, xəbərdarlıq edir ki, bütün rəqəmsal patoloji proqram təminatı yaxşı istifadəçi təcrübəsi təqdim etmir - və satıcılara komandalarında xüsusi istifadəçi təcrübəsi dizaynerlərinin olmasının vacibliyini təəssüratlandırmaq vacibdir.

Bəs indi rəqəmsal sistemə keçmək üçün doğru vaxtdırmı? Ho belə düşünür. "Xəstəxana sistemləri səhvləri azaltmaqla və iş yüklərini dinamik şəkildə paylayaraq rəqəmsal patologiya ilə pula qənaət edəcək" deyir. "Ümid edirəm ki, pandemiya ehtiyacı vurğuladığı üçün tənzimləyici orqanlar patoloqların rəqəmsal patologiyanı qəbul etmələrinə icazə verməyə daha çox hazır olacaqlar."

Ho'nun Ən Yaxşı İpucu: “Zibil içəri = zibil çölə. Yaxşı, təmiz şəkillər əldə etmək üçün histologiya laboratoriyası yaxşı, təmiz slaydlar çıxarmalıdır."

Rəqəmsal arzuolunanlığı nümayiş etdirmək
Sylvain Mailhot Laval Universitetinin virtual slayd telepatologiyası layihəsi zamanı ilk dəfə rəqəmsal slaydlarla təcrübə etdikdən sonra onun qeyri-məhdud potensialını dərk etdi və beş il ərzində sahənin tam rəqəmsal olacağına əmin idi. Niyə? “Planetin istənilən yerində həmkarlarınıza dərhal çıxışınız var. Siz onlara faylları ötürə və tez bir zamanda ikinci rəy əldə edə bilərsiniz”, - Mailhot izah edir. "Tələb olunduqda slaydları fiziki olaraq tapmaq da çətin ola bilər, ona görə də rəqəmsal sistemdə onlara dərhal daxil olmaq çox vaxta qənaət edir." Mailhot həmçinin hesab edir ki, rəqəmsal patologiya ənənəvi quraşdırmadan daha erqonomikdir, rəqəmsal slayd izləyiciləri mikroskopun üstündə əyilmiş oturmaqdan daha rahat iş təcrübəsi təklif edir.

Bəs niyə rəqəmsal patologiya Mailhot-un on il əvvəl gözlədiyi kimi bütün sahə üzrə tam əhatə olunmadı? "Rəqəmsal slaydlarla işləmək təcrübəmə və Kanada və ABŞ-da başqaları ilə müzakirələrə əsaslanaraq, rəqəmsal patoloji üçün əsas maneə patoloqun müqavimətidir" dedi. Mailhot hesab edir ki, rəqəmsal qəbulun uğur qazanması üçün rəqəmsal patoloji ilə maraqlanan və ona həvəs göstərən patoloqların sayı kritik həddə çatmalıdır. O, etiraf edir ki, rəqəmsal tətbiqə gəldikdə büdrəmə blokları ola bilər, lakin heç birini aradan qaldırmaq mümkün deyil. Mailhot izah edir: "Öz slaydlarınızı skan edərkən slaydların istehsalı ilə rəqəmsal görüntü arasında gecikmə var, ona görə də mühüm slaydlara üstünlük vermək üçün sistem hazırlamaq vacibdir". “Rəqəmsal təsvirin keyfiyyətindən məyus olduğunuz vaxtlar da olacaq, buna görə də diqqət mərkəzində olmayan sahələri aşkar etmək üçün bütün slaydları əvvəlcədən əl ilə skan edirik.”

Mailhot laboratoriyasının COVID-19 çağırışlarına uğurla uyğunlaşması qismən rəqəmsal patologiyaya görədir. Kilidləmə zamanı yerlərdə işə icazə verilmədiyindən, halları rəqəmsal olaraq diaqnostika etmək qabiliyyəti patoloqların evlərinin təhlükəsizliyindən istifadə edə bilməsi demək idi. Mailhot həmçinin xəstəlik halında iş axınının faydalarını vurğulayır. “Əgər bir patoloq işləyə bilmirsə, mən slaydları dərhal sistemdəki başqa bir patoloqa göndərə bilərəm. Əvvəllər slaydları fiziki olaraq götürüb yenidən paylamaq üçün onların ofisinə getməli idim”.

Mövcud övladlığa götürmə nisbətini nəzərə alaraq, Mailhot şübhə edənləri rəqəmsal patologiyanın irəliyə doğru yol olduğuna inandırmağı necə təklif edir? “Bəzi patoloqlar səhv təsəvvürə malikdirlər ki, rəqəmsal slaydlar heç vaxt mikroskop altında şüşə qədər yaxşı görünməyəcək və naviqasiya üçün daha çox vaxt lazımdır. Bunun belə olmadığını sübut etmək üçün təsvirin keyfiyyətini və istifadənin asanlığını nümayiş etdirmək üçün qabaqcıl sistemdən istifadə edərək yüksək keyfiyyətli ekranda rəqəmsal slaydları bu insanlara göstərmək vacibdir”. İnsanlar gəmiyə daxil olduqdan sonra Mailhot hesab edir ki, uğurlu tətbiqin ikinci addımı İT departamenti ilə sıx əməkdaşlıq etməkdir. Onun sözlərinə görə, bu, təkcə əla görüntüyə malik olmaq məsələsi deyil, həm də qüsursuz rəqəmsal sistemi dəstəkləmək üçün kifayət qədər saxlama və şəbəkə imkanlarına malik olmaqdır.

Müntəzəm rəqəmsal diaqnostikaya keçid başlanğıcda qurumlar üçün baha başa gələ bilsə də, Mailhot hesab edir ki, uzunmüddətli qənaətlər bunu faydalı edir. Rəqəmsal slayd istehsalının bir saytda birləşdirilməsi, slaydların rəqəmsal şəkildə yayılması və slaydların təşkilinin təkmilləşdirilməsi uzunmüddətli perspektivdə pula və vaxta qənaət edəcəkdir. Mailhot deyir: “Gələcəyə daha çox nəzər salsaq, mən hesab edirəm ki, mürəkkəb süni intellekt (AI) alətləri laboratoriyaları rəqəmsal olmağa məcbur edəcək”. “Süni intellektə dair ilkin vəd həyata keçirildikdən sonra slaydların kateqoriyalara əvvəlcədən yoxlanılması həm vaxta, həm də pula qənaət edəcək”.

Slaydları skan etdikdən və uzun illər rəqəmsal diaqnostikadan sonra Mailhot hesab edir ki, onun kimi qurumların əsas rolu var. “Artıq keçidi həyata keçirmiş laboratoriyalar təcrübə və ekspert biliklərini artıracaq – və onlar rəqəmsal patologiyanın dəyərini artırmaq və keçiddə kömək etmək üçün bunu başqalarına ötürdüklərindən əmin olmalıdırlar.”

Mailhot-un Əsas İpucu: “Düşünürəm ki, insanların rəqəmsal patologiya haqqında yanlış təsəvvürləri var. Hər kəsə sınamağı məsləhət görərdim. Yüksək keyfiyyətli ekran, kompüter və skanerdən istifadə edərək slaydlara baxın və məncə bunu bəyənəcəksiniz!”

Jonhan Ho Dermatologiya və Patologiya kafedrasının assistenti və Pittsburq Tibb Mərkəzindəki Dermatopatologiya Bölməsinin direktorudur, Pittsburq, Pensilvaniya, ABŞ.

Sylvain Mailhot PathAssistant Laboratoriyasının tibbi direktoru, Monkton, Nyu-Brunsvik, Kanada.


Mücərrəd

Fon

Kolorektal xərçəngi (CRC) olan praktiki olaraq hər bir xəstə üçün hematoksilin-eozin (HE) ilə ləkələnmiş toxuma slaydları mövcuddur. Bu şəkillərdə proqnostik biomarkerləri obyektiv çıxarmaq üçün müntəzəm olaraq istifadə edilməyən kəmiyyət məlumatları var. Bu tədqiqatda biz dərin konvolyusiya neyron şəbəkələrinin (CNN) bu geniş yayılmış şəkillərdən birbaşa proqnozlaşdırıcıları çıxara bilib-bilmədiyini araşdırdıq.

Metodlar və tapıntılar

Biz 100.000-dən çox HE təsvir yaması əldə edərək, 86 CRC toxuma slaydlarında tək toxumalı bölgələri əl ilə təsvir etdik və bunlardan öyrənməni köçürməklə CNN-i öyrətmək üçün istifadə etdik və 7180 təsvirdən ibarət müstəqil məlumat dəstində >94% doqquz sinif dəqiqliyinə çatdıq. 25 CRC xəstəsindən. Bu alətlə biz CRC toxumasının böyük beynəlxalq çoxmərkəzli kolleksiyası olan Xərçəng Genom Atlası (TCGA) kohortunda 500 mərhələ I-IV CRC xəstəsində 862 HE slayddan təmsil olunan multitoxuma HE təsvirlərinin avtomatlaşdırılmış toxuma parçalanmasını həyata keçirdik. CNN-də çıxış neyronlarının aktivləşdirilməsinə əsaslanaraq, çoxdəyişənli Cox proporsional təhlükə modelində (95% inam intervalı ilə təhlükə nisbəti [HR]) ümumi sağ qalma (OS) üçün müstəqil proqnostik amil olan “dərin stroma hesabı” hesabladıq. CI]: 1,99 [1,27–3,12], səh = 0,0028), eyni kohortda stromal sahələrin əl ilə ölçülməsi və xərçənglə əlaqəli fibroblastların (CAFs) gen ifadə imzası yalnız şişin spesifik mərhələlərində proqnozlaşdırıcı idi. Biz bu tapıntıları 2003-2007-ci illər arasında Almaniyanın bir çox müəssisələrində işə götürülmüş “Darmkrebs: Chancen der Verhütung durch Skrininq” (DACHS) tədqiqatından I-IV mərhələli 409 CRC xəstəsinin müstəqil kohortunda təsdiq etdik. Yenə də hesab ƏS üçün müstəqil proqnostik faktor idi (HR 1.63 [1.14-2.33], səh = 0,008), CRC-xüsusi ƏS (HR 2,29 [1,5–3,48], səh = 0,0004) və residivsiz sağ qalma (RFS HR 1,92 [1,34-2,76], səh = 0,0004). Bu biomarkerin klinik iş axınlarında tətbiq edilməsindən əvvəl perspektiv yoxlama tələb olunur.

Nəticələr

Retrospektiv tədqiqatımızda göstəririk ki, CNN insan şişinin mikromühitini qiymətləndirə və proqnozu birbaşa histopatoloji şəkillərdən proqnozlaşdıra bilər.


Nəticələr

Dərin sağ qalma konvolyusiya neyron şəbəkələri ilə xəstə nəticələrini öyrənmək.

SCNN model arxitekturası Şəkil 1-də təsvir edilmişdir (Şəkil S1 ətraflı diaqramı göstərir). H&E ilə boyanmış toxuma bölmələri əvvəlcə bütün slayd şəkillərinə rəqəmsallaşdırılır. Bu təsvirlər, reprezentativ histoloji xüsusiyyətlərə malik canlı şişi ehtiva edən və artefaktlardan azad olan maraq rayonlarını (ROI) müəyyən etmək üçün veb-əsaslı platformadan istifadə etməklə nəzərdən keçirilir (Metodlar) (34, 35). Bu ROI-lərdən yüksək güclü sahələr (HPFs) daha sonra xəstənin nəticələrini proqnozlaşdırmaq üçün Cox proporsional təhlükə modeli ilə problemsiz şəkildə inteqrasiya olunmuş dərin konvolyusiya şəbəkəsini hazırlamaq üçün istifadə olunur. Şəbəkə, HPF görüntüsünü ardıcıl olaraq yüksək proqnozlaşdırılan proqnostik xüsusiyyətlərə çevirən təsvirin emal əməliyyatlarının və qeyri-xətti funksiyaların bir-birinə bağlı təbəqələrindən ibarətdir. Konvolutional təbəqələr əvvəlcə konvolyusiya ləpələri və hovuz əməliyyatlarından istifadə edərək çoxlu miqyasda HPF-dən vizual xüsusiyyətləri çıxarır. Bu təsvirdən əldə edilən xüsusiyyətlər əlavə transformasiyalar həyata keçirən tam əlaqəli təbəqələrə qidalanır və sonra son Cox model təbəqəsi xəstə riskinin proqnozunu verir. Şəbəkənin statistik ehtimalını optimallaşdırmaq üçün geri yayılma texnikasından istifadə edərək, şəbəkə tərəfindən proqnozlaşdırılan riski sağ qalma və ya hadisəyə qədər olan digər nəticələrlə müqayisə etməklə qarşılıqlı əlaqə çəkiləri və konvolyusiya nüvələri öyrədilir (Metodlar).

SCNN modeli. SCNN, histoloji şəkillərdən sağ qalma ilə bağlı nümunələri öyrənmək üçün dərin öyrənmə CNN-lərini ənənəvi sağ qalma modelləri ilə birləşdirir. (A) Böyük bütöv slayd şəkilləri H&E vitraj slaydlarının rəqəmsallaşdırılması ilə yaradılır. (B) Şəkildəki təmsilçi ROI-ləri əl ilə müəyyən etmək üçün veb-əsaslı görüntüləyicidən istifadə edilir. (C) HPF-lər bu bölgələrdən nümunə götürülür və xəstənin sağ qalmasını proqnozlaşdırmaq üçün neyron şəbəkəsini öyrətmək üçün istifadə olunur. SCNN ibarətdir (i) bükülmə və birləşdirmə əməliyyatlarından istifadə edərək sağ qalma ilə bağlı vizual nümunələri öyrənən konvolyusiya təbəqələri, (ii) çıxarılan təsvir xüsusiyyətlərinin əlavə qeyri-xətti çevrilməsini təmin edən tam əlaqəli təbəqələr və (iii) ümumi sağ qalma və ya irəliləyiş üçün vaxt kimi hadisələrə qədər məlumatı modelləşdirən Kox proporsional təhlükələr təbəqəsi. Qatları birləşdirən şəbəkə çəkilərini adaptiv şəkildə öyrətmək üçün proqnozlar xəstənin nəticələri ilə müqayisə edilir.

SCNN modellərinin performansını yaxşılaşdırmaq üçün intratumoral heterojenliyi və təlim nümunələrinin məhdud mövcudluğunu həll etmək üçün nümunə götürmə və risk süzgəcindən keçirmə texnikasını inkişaf etdirdik (Şəkil 2). Təlimdə, hər bir təlim iterasiyasının əvvəlində hər bir ROI-dən təsadüfi olaraq yeni HPF-lər seçilir, SCNN modelinə hər bir xəstənin histologiyasına yeni nəzər salınır və ROI daxilində heterojenlik ələ keçirilir. Hər bir HPF, şəbəkənin möhkəmliyini toxuma oriyentasiyasına və rəngləmə dəyişikliyinə gücləndirmək üçün sahəni təsadüfi şəkildə dəyişdirən standart məlumat artırma üsullarından istifadə etməklə işlənir (33). SCNN, ROI-lər arasında intratumoral heterojenliyi daha da nəzərə almaq üçün hər bir xəstə üçün (hər ROI üçün bir) çoxlu transformasiya edilmiş HPF-lərdən istifadə etməklə öyrədilir. Perspektivli proqnoz üçün, biz əvvəlcə xəstə üçün nümayənd sahələrin kolleksiyasını yaratmaq üçün hər bir ROI daxilində birdən çox HPF nümunəsi götürürük. Median risk hər bir ROI daxilində hesablanır və sonra bu median risklər sıralanır və süzülür ki, onların xəstəliyinin aqressivliyini əks etdirən sağlam xəstə səviyyəli risk proqnozlaşdırılır və hər hansı kənar risk proqnozları rədd edilir. Bu nümunə götürmə və filtrləmə prosedurları ətraflı təsvir edilmişdir Metodlar.

SCNN təlim və proqnozlaşdırmanın möhkəmliyini yaxşılaşdırmaq üçün şəkil seçmə və filtrləmədən istifadə edir. (A) Təlim zamanı hər bir bölgədən tək 256 × 256 piksel HPF nümunəsi götürülür və hər xəstə üçün çoxlu HPF istehsal olunur. Hər bir HPF bir sıra təsadüfi çevrilmələrə məruz qalır və sonra şəbəkə çəkilərini yeniləmək üçün müstəqil nümunə kimi istifadə olunur. Hər təlim dövründə yeni HPF nümunələri götürülür (bir təlim bütün xəstələrdən keçir). (B) Yeni diaqnoz qoyulmuş xəstənin nəticəsini proqnozlaşdırarkən, hər bir ROI-dən doqquz HPF nümunəsi götürülür və hər bir sahə üçün risk proqnozlaşdırılır. Median HPF riski hər bölgədə hesablanır, bu median risklər daha sonra sıralanır və ikinci ən yüksək dəyər xəstə riski kimi seçilir. Bu nümunə götürmə və filtrləmə çərçivəsi, proqnozun adətən heterojen nümunədə müşahidə edilən ən bədxassəli bölgəyə əsaslandığı əllə histoloji qiymətləndirməni təqlid edərək toxuma heterojenliyi ilə məşğul olmaq üçün nəzərdə tutulmuşdur. Təcrübələrimizdə ən yüksək riskə və ikinci ən yüksək riskə əsaslanan proqnozlar orta hesabla bərabər performansa malik idi, lakin maksimum risk zəif proqnozlaşdırma dəqiqliyi ilə bəzi kənar göstəricilər yaratdı.

SCNN-in Proqnostik Dəqiqliyinin Qiymətləndirilməsi.

SCNN-nin proqnoz düzgünlüyünü qiymətləndirmək üçün formalinlə sabitlənmiş, parafinə daxil edilmiş nümunələrdən tam slayd təsvir toxuması hissələrini və TCGA-dan (Dataset S1) 769 qlioma üçün klinik təqibi yığdıq. Bu məlumat toplusu aşağı dərəcəli qliomalardan (ÜST II və III dərəcələri) və glioblastomalardan (ÜST IV dərəcə) ibarətdir, həm astrositomaları, həm də oliqodendroqliomaları ehtiva edir və 1 ilə 14 yaş arasında dəyişən ümumi sağ qalma müddəti var. Bu kohort üçün demoqrafik göstəricilər, dərəcələr, sağ qalma və molekulyar alt tiplərin xülasəsi Cədvəl S1-də təqdim olunur. Rəqəmsal Slayd Arxivi bu şişlərdən 1061 H&E ilə boyanmış bütün slayd şəkillərində ROI-ləri müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir.

SCNN modellərinin proqnostik dəqiqliyi Monte Carlo cross validation istifadə edərək qiymətləndirilmişdir. 15 təlim/sınaq dəsti cütü yaratmaq üçün kohortu təsadüfi olaraq qoşalaşmış təlim (80%) və sınaq (20%) dəstlərinə ayırdıq. Biz hər bir təlim dəstindən istifadə edərək SCNN modelini öyrətdik və sonra bu modellərin qoşalaşmış test dəstlərində proqnostik dəqiqliyini qiymətləndirdik və cəmi 15 dəqiqlik ölçmələri əldə etdik (Metodlar və Dataset S1). Dəqiqlik, proqnozlaşdırılan risklər və faktiki sağ qalma arasında uyğunluğu ölçən qeyri-parametrik statistika olan Harrell c indeksindən istifadə etməklə ölçüldü (36). c indeksi 1 proqnozlaşdırılan risk və ümumi sağ qalma arasında mükəmməl uyğunluğu göstərir və 0,5 c indeksi təsadüfi uyğunluğa uyğundur.

Müqayisə üçün biz həmçinin qliomaların ÜST təsnifatından genomik biomarkerlərdən və əl histoloji dərəcələrindən istifadə etməklə yaradılan əsas xətti Cox modellərinin proqnostik düzgünlüyünü qiymətləndirdik (Şəkil 3).A). ÜST diffuz qliomaları izositrat dehidrogenazda mutasiyalarla müəyyən edilən üç genomik alt tipə təyin edir.IDH) genlər (IDH1/IDH2) və 1p və 19q xromosomlarının kodlaşdırılması. Bu molekulyar alt tiplər daxilində qliomalara mənşə hüceyrəsindən (ya astrositik, ya da oliqodendroqlial) asılı olaraq dəyişən meyarlara əsasən histoloji dərəcə təyin edilir. Bu meyarlara mitotik aktivlik, nüvə atipiyası, nekrozun olması və mikrovaskulyar strukturların xüsusiyyətləri (mikrovaskulyar proliferasiya) daxildir. Histoloji dərəcə qliomaların müalicəsinin planlaşdırılmasında əhəmiyyətli müəyyənedici olaraq qalır, III və IV dərəcələr adətən radiasiya və eyni vaxtda kemoterapiya ilə aqressiv müalicə olunur.

Diffuz gliomalar üçün proqnoz meyarları. (A) Diffuz qliomalarda proqnoz genomik təsnifat və manual histoloji dərəcələndirmə ilə müəyyən edilir.Diffuz gliomalar ilk olaraq üç molekulyar alt tipdən birinə təsnif edilir IDH1/IDH2 mutasiyalar və 1p və 19q xromosomlarının kodlaşdırılması. Sonra histoloji xüsusiyyətlərdən istifadə edərək hər bir alt növdə dərəcə müəyyən edilir. Astrositik nəsil olan alt növlər bölünür IDH mutasiya statusu və 1p/19q kodelesiyasının birləşməsi və IDH mutasiya oliqodendroqlioma müəyyən edir. Bu nəsillərin histoloji fərqləri var, lakin histoloji qiymətləndirmə molekulyar alt tipin etibarlı proqnozu deyil (37). Qiymətləndirmə üçün istifadə edilən histoloji meyarlar nüvə morfologiyasından tutmuş nekroz və ya anormal mikrovaskulyar strukturların mövcudluğu kimi daha yüksək səviyyəli nümunələrə qədər dəyişir. (B) SCNN modellərinin proqnostik dəqiqliyinin molekulyar alt tip və ya molekulyar alt tip və histoloji dərəcə əsasında baza modelləri ilə müqayisəsi. Modellər 15 müstəqil təlim/sınaq dəsti ilə randomizə edilmiş xəstə tapşırıqları ilə və təlim və sınaq nümunəsi ilə/olmadan qiymətləndirilib. (C) SCNN modelləri tərəfindən proqnozlaşdırılan risklər həm histoloji dərəcə, həm də molekulyar alt tip ilə əlaqələndirilir, dərəcə ilə azalır və ümumiyyətlə genomik alt tiplərin klinik aqressivliyi ilə tendensiyaya malikdir. (D) Əllə histoloji qiymətləndirmə və SCNN proqnozlarını müqayisə edən Kaplan-Meier planları. Risk kateqoriyaları (aşağı, orta, yüksək) SCNN risklərinin həddi qoyulması ilə yaradılmışdır. N/A, tətbiq edilmir.

SCNN modelləri 0,754 median c indeksinə nail olmaqla əhəmiyyətli proqnoz gücü nümayiş etdirdi (Şəkil 3).B). SCNN modelləri də manuel histoloji səviyyəli baza modelləri ilə (median c indeksi 0,745, P = 0,307) və molekulyar alt tipli baza modelləri ilə (median c indeksi 0,746, P = 4.68e-2). Həm molekulyar alt tip, həm də əl histoloji dərəcəsini birləşdirən ÜST təsnifatını təmsil edən ilkin modellər, median c indeksi 0,774 (Wilcoxon tərəfindən imzalanmış rütbə) ilə SCNN-dən bir qədər yaxşı çıxış etdi. P = 2.61e-3).

Biz həmçinin SCNN modellərinin performansının yaxşılaşdırılmasında Şəkil 2-də göstərilən seçmə və sıralama prosedurlarının təsirini qiymətləndirdik. Bu seçmə üsulları olmadan SCNN təcrübələrinin təkrarlanması SCNN modellərinin median c indeksini 0,696-a endirdi ki, bu da seçmənin istifadə edildiyi modellərdən əhəmiyyətli dərəcədə pisdir (P = 6.55e-4).

SCNN Proqnozları Molekulyar Alt Növlər və Manual Histoloji Dərəcə ilə əlaqələndirilir.

SCNN proqnozları ilə ÜST paradiqması arasındakı əlaqəni daha da araşdırmaq üçün biz SCNN tərəfindən proqnozlaşdırılan risklərin molekulyar alt tip və histoloji dərəcə üzrə necə paylandığını vizuallaşdırdıq (Şəkil 3).C). SCNN proqnozları həm molekulyar alt tip, həm də dərəcə ilə yüksək korrelyasiyaya malik idi və gözlənilən xəstə nəticələrinə uyğun idi. Birincisi, hər bir molekulyar alt tip daxilində SCNN tərəfindən proqnozlaşdırılan risklər histoloji dərəcə ilə artır. İkincisi, proqnozlaşdırılan risklər molekulyar alt tiplərlə əlaqəli dərc edilmiş gözlənilən ümumi sağ qalma ilə uyğundur (37). IDH WT astrositomları, əksər hallarda, yüksək aqressivdir, orta sağ qalma müddəti 18 aydır və bu xəstələr üçün kollektiv proqnozlaşdırılan risklər digər alt tiplərdən olan xəstələrə nisbətən daha yüksəkdir. IDH mutant astrositomalar 3 ilə 8 il arasında dəyişən ümumi sağ qalma müddəti əhəmiyyətli dərəcədə yaxşı olan başqa bir alt tipdir və bu alt tipdə olan xəstələr üçün proqnozlaşdırılan risklər daha orta səviyyədədir. Xüsusilə, SCNN üçün risklər IDH mutant astrositomalar II və III dərəcələr üçün yaxşı ayrılmayıb, histoloji dərəcənin bu alt tipdə nəticələrin qeyri-adekvat predikatoru olduğu hesabatlarına uyğundur (38). Birləşməsi ilə infiltrasiya edən gliomalar IDH mutasiyalar və xromosomların 1p/19q kodelesiyaları hazırkı ÜST sxemində oliqodendroqliomalar kimi təsnif edilir və bunlar 10+ y ümumi sağ qalma ilə uyğun gələn ən aşağı ümumi proqnozlaşdırılan risklərə malikdir (37, 39). Nəhayət, müqayisə edərkən proqnozlaşdırılan risklərdə əhəmiyyətli fərq qeyd etdik IDH mutant və IDH WT III dərəcəli astrositomalar (dərəcə cəmi P = 6.56e-20). Bu alt tiplər astrositik nəsilləri bölüşür və eyni histoloji meyarlardan istifadə edilməklə qiymətləndirilir. Baxmayaraq ki, bəzi histoloji xüsusiyyətlər daha çox yayılmışdır IDH- mutant astrositomalar, bu xüsusiyyətlər yüksək spesifik və ya həssas deyil IDH mutant şişlərdir və IDH mutasiyasının vəziyyətini etibarlı şəkildə proqnozlaşdırmaq üçün istifadə edilə bilməz (40). SCNN tərəfindən proqnozlaşdırılan risklər daha pis nəticələrə uyğundur IDH Bu halda WT astrositomları (orta sağ qalma 1,7 ilə 6,3 il arasındadır. IDH mutant həmkarları), SCNN modellərinin əlaqəli histoloji fərqləri aşkar edə biləcəyini təklif edir IDH astrositomalarda mutasiyalar.

Biz həmçinin SCNN risk proqnozlarına əsaslanan manuel histoloji qiymətləndirməni “rəqəmsal qiymətlərlə” müqayisə etmək üçün Kaplan-Meier analizini həyata keçirdik (Şəkil 3).D). Aşağı, orta və yüksək riskli kateqoriyalar hər molekulyar alt tipdə əl ilə histoloji dərəcələrin nisbətlərini əks etdirmək üçün SCNN proqnozlarına hədlər təyin etməklə müəyyən edilmişdir (Metodlar). Müşahidə etdik ki, hər bir alt tip daxilində SCNN risk kateqoriyaları tərəfindən tutulan sağ qalma fərqləri manuel histoloji qiymətləndirmə ilə çox oxşardır. SCNN risk kateqoriyaları və əl histoloji dərəcələri oxşar proqnoz gücünə malikdir IDH WT astrositomları (log rank P = 1.23e-12 qarşı P = 7.56e-11). In IDH mutant astrositomalar, həm SCNN risk kateqoriyaları, həm də manual histoloji dərəcələri II və III dərəcələr üçün Kaplan-Meier əyrilərini ayırmaqda çətinlik çəkirlər, lakin hər ikisi IV dərəcəni daha pis nəticələrlə əlaqəli olaraq aydın şəkildə fərqləndirir. Oliqodendroqliomun sağ qalması üçün ayrı-seçkilik SCNN risk kateqoriyaları və manuel histoloji dərəcələr (log rank) arasında da oxşardır. P = 9.73e-7 ilə müqayisədə P = 8.63e-4, müvafiq olaraq).

Genomik Biomarkerləri İnteqrasiya Etməklə Proqnostik Dəqiqliyin Təkmilləşdirilməsi.

Həm histoloji, həm də genomik məlumatları vahid bir proqnozlaşdırma çərçivəsinə inteqrasiya etmək üçün biz genomik sağ qalma konvolyusiya neyron şəbəkəsini (GSCNN modeli) inkişaf etdirdik. GSCNN, genomik məlumatları SCNN-nin tam əlaqəli təbəqələrinə daxil etməklə eyni vaxtda genomika və histologiyadan öyrənir (Şəkil 4). Hər iki məlumat məşq zamanı şəbəkəyə təqdim edilir və genomik dəyişənlərin molekulyar alt tip məlumatı təmin etməklə SCNN tərəfindən öyrənilən nümunələrə təsir göstərməsinə imkan verir.

GSCNN modelləri təkmilləşdirilmiş performans üçün genomik və görüntüləmə məlumatlarını birləşdirir. (A) Xəstə sağ qalmasının inteqrasiya olunmuş proqnozlarını vermək üçün histoloji təsviri və genomik məlumatları birləşdirmək üçün hibrid arxitektura hazırlanmışdır. Bu modellər genomik dəyişənləri onların tam əlaqəli təbəqələrinə giriş kimi daxil edir. Burada gliomalar üçün genomik dəyişənlərin birləşməsini göstəririk, lakin eyni şəkildə istənilən sayda genomik və ya proteomik ölçülərdən istifadə etmək olar. (B) GSCNN modelləri SCNN modellərini, eləcə də genomik alt tipə və histoloji qiymətləndirməyə əsaslanan ÜST paradiqmasını əhəmiyyətli dərəcədə üstələyir.

Histoloji şəkilləri olan GSCNN modellərindən istifadə edərək təcrübələrimizi təkrarladıq, IDH mutasiya statusu və giriş kimi 1p/19q kodlaşdırma və median c indeksinin 0,754-dən 0,801-ə qədər yaxşılaşdığını aşkar etdi. Genomik dəyişənlərin əlavə edilməsi performansı orta hesabla 5% yaxşılaşdırdı və GSCNN modelləri ekvivalent məlumatlar (imzalı dərəcə) üzrə öyrədilmiş ÜST alt tipli modeldən əhəmiyyətli dərəcədə üstündür. P = 1.06e-2). Təlim zamanı genomik dəyişənlərin birbaşa şəbəkəyə inteqrasiyasının dəyərini qiymətləndirmək üçün biz GSCNN-ni daha səthi inteqrasiya yanaşması ilə müqayisə etdik, burada SCNN modeli əvvəlcə histoloji şəkillərdən istifadə edərək öyrədilib, sonra isə bu modeldən gələn risklər birləşdirildi. IDH və sadə üçdəyişənli Cox modelində 1p/19q dəyişənləri (Şəkil S2). Tamamilə əlaqəli təbəqələrdə genomik dəyişənlərin işlənməsi və onların təlimə daxil edilməsi səthi yanaşmadan istifadə etməklə öyrədilmiş modellərin 0,785-ə (imzalı dərəcə) enən median c indeksi ilə GSCNN modellərindən daha pis performans göstərməsi üçün statistik əhəmiyyətli fayda təmin etdi. P = 4.68e-2).

SCNN və GSCNN tərəfindən proqnozlaşdırılan risklərin müstəqil proqnoz gücünü qiymətləndirmək üçün çox dəyişənli Cox reqressiya təhlili apardıq (Cədvəl 1). SCNN risklərini, alt növünü, dərəcəsini, yaşını və cinsini daxil edən çoxdəyişənli reqressiyada SCNN riskləri 3.05 təhlükə nisbətinə malik idi və əl dərəcəsi və molekulyar alt tip də daxil olmaqla bütün digər xüsusiyyətlər üçün korrektə edilərkən proqnostik idi (P = 2.71e-12). SCNN çoxdəyişənli reqressiya modelində molekulyar alt tip də əhəmiyyətli idi, lakin histoloji dərəcə yox idi. Biz həmçinin GSCNN riskləri ilə çoxdəyişənli reqressiya həyata keçirdik və GSCNN-nin əhəmiyyətli olduğunu gördük (P = 9.69e-12) təhlükə nisbəti 8.83 ilə. GSCNN çoxdəyişənli reqressiya modelində molekulyar alt tip əhəmiyyətli deyildi, lakin histoloji dərəcə az əhəmiyyətli idi. Biz həmçinin SCNN və GSCNN-dən yaranan risk kateqoriyalarını müqayisə etmək üçün Kaplan-Meier analizindən istifadə etdik (Şəkil S3). SCNN və GSCNN üçün sağ qalma əyriləri bütün kohortda qiymətləndirildikdə çox oxşar idi. Bunun əksinə olaraq, molekulyar alt tiplər daxilində sağ qalmağı ayırd etmək qabiliyyətləri əhəmiyyətli dərəcədə fərqli idi.

Tək və çoxdəyişənli Cox reqressiya modelləri üçün təhlükə nisbətləri

Proqnozla əlaqəli Histoloji Nümunələrin Görünüşü.

Dərin öyrənmə şəbəkələri tez-tez onların proqnozlaşdırma mexanizmlərinə dair anlayışları ortaya qoymayan qara qutu yanaşmaları olduğuna görə tənqid olunur. SCNN modellərinin zəif nəticələrlə əlaqələndirdiyi vizual nümunələri araşdırmaq üçün biz bütün slayd şəkillərinin müxtəlif bölgələrində şəbəkəmiz tərəfindən proqnozlaşdırılan riskləri göstərmək üçün istilik xəritəsi vizualizasiyasından istifadə etdik. Şəffaf istilik xəritəsi örtükləri rəqəmsal patologiyada vizuallaşdırma üçün tez-tez istifadə olunur və bizim tədqiqatımızda bu örtüklər patoloqlara yüksək dəqiqlikli sağ qalma modellərinin proqnozlarını bütöv bir slayd şəklinin genişliyində əsas histologiya ilə əlaqələndirməyə imkan verir. Bütün slayd təsvirində hər bir üst-üstə düşməyən HPF üçün riski proqnozlaşdırmaq üçün təlim keçmiş SCNN modelindən istifadə etməklə istilik xəritələri yaradılmışdır. Proqnozlaşdırılan risklər qırmızı və mavi müvafiq olaraq daha yüksək və aşağı SCNN riskini ifadə edən rəng kodlu şəffaf örtük yaratmaq üçün istifadə edilmişdir.

Üç xəstənin risk istilik xəritələrinin seçimi Şəkil 5-də SCNN-lərin riski mühüm patoloji hadisələrlə necə əlaqələndirdiyini göstərən inlaylarla təqdim olunur. TCGA-DB-5273 üçün (ÜST III dərəcəli, IDH mutant astrositoma), SCNN istilik xəritəsi yüksək risklə əlaqəli olaraq bədxassəli inkişafın əlaməti olan angiogenezin qabaqcıl forması olan erkən mikrovaskulyar proliferasiya bölgələrini aydın və xüsusi olaraq vurğulayır. Bu istilik xəritəsində risk həm də hüceyrəlilik, nüvə forması və ölçüsündə heterojenlik (pleomorfizm) və anormal mikrovaskulyar strukturların olması ilə artır. TCGA-S9-A7J0 bölgələrində normal beyindən tutmuş satellitoz nümayiş etdirən (neoplastik hüceyrələrin neyronların ətrafında toplandığı) seyrək infiltrasiya olunmuş normal bölgələrə qədər orta və yüksək dərəcədə infiltrasiya olunmuş bölgələrə qədər dəyişən şiş infiltrasiyasının müxtəlif dərəcələri var. Bu istilik xəritəsi ən aşağı riskləri normal beyin bölgələri ilə düzgün şəkildə əlaqələndirir və normal beyni seyrək infiltrasiya edilmiş qonşu bölgələrdən ayırd edə bilir. Maraqlıdır ki, daha yüksək risklər seyrək infiltrasiya olunmuş bölgələrə aid edilir (region 1, Üst) nisbətən daha çox şiş infiltrasiyası olan bölgələrə nisbətən (region 2, Üst). Bənzər bir nümunəni TCGA-TM-A84G-də müşahidə etdik, burada ödemli bölgələr (region 1, Aşağı) orta hüceyrəli şiş bölgələrinə bitişik (region 1, Üst) də daha yüksək risklər təyin edilir. Bu sonuncu nümunələr əvvəllər tanınmamış və patoloji praktikasını məlumatlandıra və təkmilləşdirə bilən histoloji bölmələrə daxil edilmiş risk xüsusiyyətlərini təmin edir.

Bütün slayd SCNN istilik xəritələri ilə riskin vizuallaşdırılması. SCNN-nin müxtəlif histoloji nümunələrlə əlaqələndirdiyi risklərin istilik xəritəsinin üst-üstə düşməsini yaratmaq üçün biz SCNN proqnozlarını bütün slayd şəkillərində hərtərəfli yerinə yetirdik. Qırmızı rəng nisbətən yüksək riski, mavi isə daha az riski göstərir (hər slayd üçün miqyas fərqlidir). (Üst) TCGA-DB-5273-də SCNN aydın və xüsusi olaraq erkən mikrovaskulyar proliferasiya regionları (region 1) üçün yüksək riskləri və həmçinin şiş infiltrasiyasının və hüceyrə sıxlığının artması ilə daha yüksək riskləri proqnozlaşdırır (region 2 vs. 3). (Orta) TCGA-S9-A7J0-da SCNN normal korteks arasında müvafiq olaraq ayrıseçkilik edə bilər (bölgə 1-də Aşağı) və şişin infiltrasiya etdiyi bitişik bölgələr (region 1 in Üst). Görkəmli mikrovaskulyar strukturları ehtiva edən yüksək hüceyrəli bölgələr (region 3) yenidən şişin aşağı sıxlıqlı bölgələrindən (region 2) daha yüksək risklərə malikdir. Maraqlıdır ki, korteksdə aşağı sıxlıqlı infiltrat yüksək risklə əlaqələndirilirdi (bölgə 1 Üst). (Aşağı) TCGA-TM-A84G-də SCNN ödemli bölgələrə yüksək risklər təyin edir (bölgə 1-də Aşağı) şişə bitişik olanlar (region 1 in Üst).


Histologiya və Histopatologiya üçün Mikroskopiya Həllləri

Patologiya, histopatologiya və ya histologiya toxuma morfologiyasının mikroskopik müayinəsi ilə xəstəliyin təzahürünü öyrənmək məqsədi daşıyır. Patologiyada mikroskop altında tədqiq ediləcək nümunə adətən toxuma nümunəsinin fiksasiyası, təmizlənməsi/yerləşdirilməsi və kəsilməsindən sonra cərrahiyyə, biopsiya və ya yarılma nəticəsində əldə edilir. Alternativ olaraq, dondurulmuş bölmənin kriostatla işlənməsi sürətli nəticələr tələb olunduqda (məsələn, əməliyyat zamanı) və ya fiksasiya lipidlər və ya müəyyən antigenlər kimi hədəf strukturlara zərərli olduqda həyata keçirilir. Fiksasiyadan və mumun yerləşdirilməsindən sonra toxuma kəsikləri rənglənmədən əvvəl adətən mikrotomla iki-beş mikron nazik dilimlərə kəsilir və işıq mikroskopu ilə müayinə üçün şüşə slaydına köçürülür. Patologiyada tipik nümunələr kolon, böyrək, mədəaltı vəzi, serviks, ağciyər, döş, prostat və ya birləşdirici toxumadır.

İnsan/heyvan və bitki toxumaları üçün müxtəlif rəngləmə prosedurları hələ 17-ci əsrdə inkişaf etdirilsə də, müasir histopatologiyanın atası hesab edilən alman həkimi Rudolf Virchow olmuşdur. Virchow 19-cu əsrin yeni mikroskop üsullarının potensialını öz təməlqoyma tədqiqatları üçün dərk etdi, çoxlu sayda elmi yazı dərc etdi və minlərlə histopatoloji nümunə slaydlarından ibarət təsirli kolleksiya yaratdı, beləliklə, müasir histologiya və xərçəng tədqiqatlarının əsasını qoydu.

Histoloji slaydın hazırlanması toxuma nümunəsinin fiksasiyası ilə başlayır. Bu, toxumaların hazırlanmasında həlledici addımdır və onun məqsədi toxumaların avtolizinin və çürüməsinin qarşısını almaqdır. Ən yaxşı nəticələr üçün bioloji toxuma nümunələri toplanandan dərhal sonra fiksatora köçürülməlidir, adətən 24-48 saat ərzində 10% neytral tamponlu formalin içində. Təsbit edildikdən sonra nümunələr emal başlayana qədər formalin içərisində saxlanılan müvafiq olaraq etiketlənmiş toxuma kasetinə sığdırmaq üçün bir neştər istifadə edərək kəsilir.

Emalın ilk addımı su və formalini toxumadan çıxarmaq üçün nümunənizi artan spirt konsentrasiyasına batırmaqdan ibarət olan susuzlaşdırmadır. Təmizləmə, spirti çıxarmaq və parafin mumu ilə infiltrasiyaya imkan vermək üçün ksilen kimi üzvi həlledicinin istifadə edildiyi növbəti addımdır. Yerləşdirmə son addımdır, burada nümunələr yerləşdirmə agenti - adətən çox incə kəsilməyə imkan verən dəstək matrisini təmin edən parafin mumu ilə süzülür. Mikrotom, histokimyəvi boyanmadan sonra (adətən hematoksilin və eozin - “HE ləkəsi”) sonra blokdan çox nazik toxuma kəsiklərini lent şəklində kəsmək üçün istifadə olunur ki, bu da toxuma hissələrinin kontrastını təmin edir, toxuma strukturlarını daha yaxşı görünən və qiymətləndirməyi asanlaşdırır. . Müəyyən hallarda əlavə analiz üçün HER2 və ya Ki-67 kimi immunohistokimyəvi boyama (IHC) tələb olunur.


Kəskin pnevmoniyanın siçan modellərində bütün ağciyər slaydlarında rəqəmsal görüntü təhlili

Pnevmoniyanın siçan modellərinin təsviri histopatologiyası bütün ağciyərlər kontekstində infeksiyaların, molekulyar manipulyasiyaların və ya müalicələrin nəticələrini qiymətləndirmək üçün vacibdir. Bununla belə, eksperimental qruplar arasında kəmiyyət müqayisələri daha çox və ya daha az təcrübəli müşahidəçinin subyektivliyindən asılı olan zəhmətli stereologiya və ya düzgün müəyyən edilməmiş qiymətləndirmə sistemləri ilə məhdudlaşır. Burada biz siçanın bütün ağciyər bölmələrindən optik məlumatı statistik olaraq yoxlanıla bilən məlumatlara çevirməyə imkan verən öz-özünə öyrənən rəqəmsal təsvir analizlərini təqdim edirik. Xəstəliyə yoluxmuş ağciyərlərin bütün slayd skanlarından istifadəçi tərəfindən müəyyən edilmiş patologiyaların kəmiyyətini müəyyən etmək üçün nümunənin tanınmasına əsaslanan proqram təminatı və nüvə sayma alqoritmi qəbul edilmişdir. Streptococcus pneumoniae və ya qrip A virusu PBS-ə qarşı mübarizə aparan ağciyərlərlə müqayisədə. Hematoksilin və eozinlə boyanmış kəsiklərdən olan lezyonların kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün müvafiq meyarlar kimi “təsirə məruz qalmış nisbi sahə” və “əraziyə düşən nüvə sayı” oxu parametrləri təklif olunur, həmçinin, məsələn, immun hüceyrə infiltratlarının istilik xəritəsinin yaradılmasına imkan verir. bütün ağciyər bölmələri üzrə anatomik tapşırıqlarla. Bundan əlavə, marker zülallarının immunohistokimyəvi etiketlənməsi ilə birləşdirildikdə, hər iki yanaşma, məsələn, immun hüceyrə populyasiyalarının identifikasiyası və sayılması üçün faydalıdır, burada axın sitometriya məlumatları ilə birbaşa müqayisələrlə təsdiqlənir. Həlllər asanlıqla və çevik şəkildə müxtəlif modellərin və ya patogenlərin xüsusiyyətlərinə uyğunlaşdırıla bilər. Bütün siçan ağciyər hissələrinin avtomatlaşdırılmış rəqəmsal analizləri histoloji və immunohistokimyəvi təsvirlərin istifadəçi tərəfindən müəyyən edilmiş, yüksək məhsuldarlıqlı müqayisəli kəmiyyəti üçün yeni standart təyin edə bilər. Yenə də burada qurulan alqoritmlərimiz yalnız başlanğıcdır və gələcəkdə əlavə tədqiqatlarda və digər tətbiqlərdə sınaqdan keçirilməlidir.

Bir çox onilliklər ərzində klassik morfoloji histopatologiya heyvan ağciyər infeksiyası təcrübələrində (məsələn, müalicə effektlərinin qiymətləndirilməsində və ya molekulyar siqnal yollarının aşkar edilməsində) toxuma lezyonlarının və immun hüceyrə infiltrasiyalarının qiymətləndirilməsi üçün vacib oxunma vasitəsi kimi xidmət etmişdir. Məsələn, bir neçə müəyyən edilmiş histoloji lezyon nümunələri siçanlarda eksperimental kəskin ağciyər zədələnməsinin qiymətləndirilməsində əsas diaqnostik xüsusiyyətlər hesab olunur (1). Bu ilk növbədə təsviri məlumatdan daha çox istifadə etmək üçün eksperimental olaraq induksiya edilmiş patologiyaların ilk yarımkəmiyyət qiymətləndirilməsinə və nəzarət vasitələri ilə kobud müqayisəyə imkan verən qiymətləndirmə sistemləri yaradılmışdır (1, 2). Ağciyərdə bu cür qiymətləndirmə sistemləri adətən xarakterik toxuma lezyonlarını və hüceyrə infiltrasiyalarını əks etdirən bir neçə parametrləri əhatə edir ki, bu da subyektiv qiymətləndirmələr və lezyonların paylanması və şiddətinin dərəcələri (3) ilə yarı kəmiyyətlə ölçülür. Daha kəmiyyətli yanaşma əlavə etmək üçün vahid xal parametrləri seçilmiş hadisələrin və ya təmsil olunan sahələrin əllə hesablanması və ya ölçülməsi ilə ölçülə bilər. Bununla belə, bu yanaşmalar vaxt aparan, qeyri-dəqiq və mahiyyətcə subyektivdir və buna görə də böyük verilənlər toplularının təhlili və ya qruplar arasında kiçik fərqlərin etibarlı aşkarlanması üçün problemlidir (4, 5).Aydındır ki, lezyon sahələrinin və ya yüksək məhsuldarlıqlı tədqiqatlara münasib olan hadisələrin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün daha dəqiq, təkrarlana bilən və daha həssas, lakin praktiki yanaşma histopatoloji nəticələrin toplanması, təhlili, təfsiri və ötürülməsi, xüsusən də bir-biri ilə birbaşa müqayisələr üçün arzuolunan olardı. təcrübə qrupları və ya biokimyəvi və ya molekulyar məlumatlarla (6). Bu gün stereologiya, hüceyrə nömrələri, səthlər və ya həcmlər kimi ədədi son nöqtələrin mütləq qiymətləndirilməsi üçün qızıl standart kimi qəbul edilir. Bununla belə, stereologiyaya bir sıra məhdudiyyətlər tətbiq edilir, o cümlədən yüksək qiymət və vaxt xərcləri, həmçinin onun retrospektiv tədqiqatlarda arxiv materialı üçün istifadə oluna bilməməsi (5).

Tam slayd rəqəmsal görüntüləmə sahəsində son inkişaflar histopatoloji nümunələrinin optimallaşdırılmasında və daha çox kompüterləşdirilmiş müayinəsində, o cümlədən təsadüfi yerləşdirilmiş nümunələrin retrospektiv müayinəsində perspektivli potensial təklif edir (7, 8). Bu bütöv slaydın skan edilməsi (WSS) texnologiyası bütün histoloji slaydın optik olaraq ikili təsvir məlumat faylına skan edilməsinə imkan verir, onu mikroskop olmadan kompüter ekranında vizuallaşdırmaq, qiymətləndirmək və emal etmək olar (8, 9). Bundan əlavə, sürətlə inkişaf edən iki ölçülü (2D) morfometrik rəqəmsal təsvir analizi (DIA) alətləri təsviri və ya yarı kəmiyyət histopatologiya məlumatlarının statistik testlərə uyğun rəqəmsal məlumatlara dəqiq çevrilməsini sürətləndirir və sadələşdirir (7, 10).

Kompüter dəstəkli nümunənin tanınması təsvirin təhlili proqramı rəqəmsal histoloji təsvirlər daxilində maraq dairələrinin avtomatlaşdırılmış və öz-özünə öyrənilməsi və kəmiyyətinin müəyyən edilməsində yeni ölçü təklif edir (11). Xüsusilə pnevmoniya zamanı immun hüceyrələrin infiltrasiyası, ödem, çökmə və ya amfizem kimi struktur dəyişiklikləri və ya nekroz sahələri kimi müxtəlif parametrlərlə xarakterizə olunan qeyri-homogen şəkildə yayılmış iltihab sahələri potensial maraq zonaları hesab edilə bilər. Öz-özünə öyrənən nümunənin tanınması görüntü təhlili proqramı GENIE yüksək məhsuldarlıqlı analizlər üçün nəzərdə tutulmuşdur ki, bu da rəqəmsal olaraq skan edilmiş histoslaydların böyük partiyalarının praktiki vaxt çərçivəsində tədqiqinə imkan yaradır (7, 10). Skan edilmiş histoslaydların kompüterləşdirilmiş təhlilində “bütün hüceyrənin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi” adlanan ikinci yeni inkişaf hematoksilin və eozin (H&E) – ləkələnmiş hüceyrələr və ya nüvələr kimi geniş spektrli histoloji nümunələri və ya hadisələri müəyyən etməyə və sadalamağa imkan verir. immunohistokimyəvi siqnallar (9). Stereologiya (12, 13) ilə əldə edilən mütləq təxminləri vermək əvəzinə, 2D toxuma bölmələrində nümunələrin və hadisələrin bu cür kəmiyyətləri müəyyən edilmiş anatomik struktura və ya kvadrat millimetrə düşən hüceyrə sayı kimi nisbətlərin və ya sıxlıqların yaradılması üçün xüsusilə uyğundur.

Bu günə qədər avtomatlaşdırılmış DİA-da, xüsusən də GENIE və bütün hüceyrə kəmiyyətini təyin edən proqram sistemlərindəki bu cür inkişaflar yalnız siçan ağciyərlərinin müayinəsi üçün, məsələn, onkologiyada (14) istifadə edilmişdir, lakin eksperimental pnevmoniyada deyil. Burada, biz nümunəyə əsaslanan GENIE alqoritmini və PBS-dən əziyyət çəkən ağciyərlərdən bütün orqan H&E ilə boyanmış hissələrin rəqəmsal skan edilməsi ilə əldə edilən ikiölçülü optik məlumatın nisbi morfometrik kəmiyyəti üçün v9 nüvə sayı (v9 nc) alqoritmini təqdim edirik. və ya yoluxmuş ağciyərlər Streptococcus pneumoniae və ya qrip A virusu (İAV). Axın sitometriyası (FC) ilə əldə edilən məlumatlarla müqayisələrimizdə nüvə sayma alqoritmi immun hüceyrələrin immunohistokimyəvi olaraq işarələnmiş alt tiplərinin nisbi kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün də işləkliyini sübut etdi və onun tətbiqi səviyyəsini genişləndirdi. yerində xəstəliyin molekulyar markerlərinin kəmiyyəti.

Siçanlar, infeksiya prosedurları, emal, histologiya, immunohistokimya (IHC), FC və rəqəmsal görüntü analizləri ilə bağlı təfərrüatlar məlumat əlavəsindəki M üsullarındadır.

Bütün ağciyər toxumaları, əsasən, bu tədqiqatdan başqa məqsədlər üçün aparılan və başqa yerlərdə dərc edilmiş təcrübələrdən əldə edilmişdir (15-18). Bütün heyvan prosedurları Charité-Universitätsmedizin Berlin, Justus-Liebig Universiteti, Gießen, Jena Universitet Xəstəxanası və yerli hökumət orqanları (LaGeSo Berlin, RP-Gießen, TLV-Thüringen təsdiq ID: A-0050/15) institusional etika komitələri tərəfindən təsdiq edilmişdir. , G 0139/14, 02-067/11, 02-043/15 [S. pneumoniae], G 0358/11 [PBS], G 0044/11 [IAV]). Heyvanlar üzərində tədqiqatlar Avropa Laboratoriya Heyvan Elmi Assosiasiyaları Federasiyasının təlimatlarına və laboratoriya heyvanlarına qulluq və istifadəyə dair tövsiyələrə uyğun olaraq aparıldı və heyvanların narahatlığını və əziyyətini minimuma endirmək üçün bütün səylər edildi.

5 × 10 6 cfu ilə yoluxmuş siçanlar S. pneumoniae PN36 (serotip 3)–, 5 × 10 7 cfu S. pneumoniae D39 (serotip 2) – və ya 100 pfu PR8 qrip virusu – və PBS ilə mübarizə aparan siçanlar 24 və ya 48 saat ərzində insancasına öldürüldü (S. pneumoniae, PBS) və ya 7 gün (IAV), əvvəllər təsvir edildiyi kimi (15-19). Alveolyar kollapsın qarşısını almaq üçün traxeyanın bağlanmasından sonra ağciyərlər diqqətlə çıxarıldı, 24-48 saat ərzində formalin pH 7.0 ilə fiksasiya olundu, parafinə basdırıldı və 2 μm-lik hissələrə kəsildi.

Tam ağciyər bölmələri (n = qrup başına 4-8 siçan) H&E ilə boyandı və ya IHC üçün emal edildi. CD68 (makrofaqlar/monositlər), neytrofil elastaz (neytrofillər), CD3 (T limfositlər) və ya CD45R (B limfositləri), poliklonal dovşan anticisimləri və ya monoklonal siçovul anticisimlərinin aşkarlanması üçün müvafiq olaraq istifadə edilmişdir. IHC slaydları hemalaun ilə əks olundu. Bütün slaydlar dərəcəli etanollar vasitəsilə susuzlaşdırıldı, ksilendə təmizləndi və örtüldü.

Ağciyər leykositləri təcrid olunmuş və anti-CD11c (N418 ATCC), anti-CD11b (M1/70 eBioscience), anti-F4/80 (BM8 eBioscience), anti-Ly6G (1A8 BD), anti-CD3 (17A2 eB) ilə boyanmışdır. , anti-CD4 (RM4–5 BD), anti-B220 (RA3–6B2 eBioscience) və anti-CD19 (1D3 BD) antikorları. Bütün ləkələnmiş hüceyrələr BD FACS Canto II istifadə edərək əldə edilmişdir. Hüceyrələr BD FACSDiva proqramı ilə təhlil edildi.

Ləkələnmiş slaydlar avtomatik rəqəmləşdirildi (n = hər qrup üçün 4–8) Aperio CS2 skanerindən (Leica Biosystems Imaging Inc.) 400× böyütmədə (0,25 μm/piksel ayırdetmə) istifadə edərək. Təsirə məruz qalmış və təsirlənməmiş ağciyər toxumasının nümunəsinin tanınması üçün Aperio GENIE histologiya nümunəsinin tanınması proqramı (Leica Biosystems Imaging Inc.) istifadə edilmişdir. Maraqlanan hər bir toxuma sinfinin təmsil sahələri (Cədvəl 1) histoloji xüsusiyyətlərə əsaslanaraq təlim keçmiş eksperimental baytarlıq patoloqu tərəfindən müəyyən edilmiş və GENIE təsnifatını yaratmaq üçün 100× böyütmə ilə rəqəmsal montajda tərtib edilmişdir. Bu təsnifatçı təsirə məruz qalmış əraziləri, fondan və şüşədən fərqləndirmək üçün bir partiyanın müxtəlif ağciyər slaydları üzərində öyrədilib və bu, modelə xas xarakteristika və uyğunlaşmaya imkan verir (Cədvəl 1). Aperio v9 nc alqoritmi, hemalaun ilə boyanmış nüvələrin və ya hüceyrələrin ümumi sayının kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün və ya hər bir boyama və istifadə olunan antigen üçün xüsusi parametrlərlə IHC tərəfindən istifadə edilmişdir (görmək Cədvəl E1 məlumat əlavəsində).

Cədvəl 1. Təhlil edilən Modellərdə Toxuma Siniflərinin Tərifi

Məlumatlar orta (±SEM) kimi ifadə edilir. Statistik təhlillər birtərəfli ANOVA/Sidak-ın çoxsaylı müqayisə testi və ikitərəfli ANOVA/Türkiyə çoxlu müqayisə testindən istifadə etməklə aparılmışdır. P 0,05-dən az olan dəyərlər əhəmiyyətli hesab edilmişdir (GraphPad PRISM 7 Graph Pad Software Inc.).

Ağciyər histologiyasında ən çox istifadə edilən kəmiyyət oxuma parametrlərindən biri təsirlənmiş toxuma sahəsinin qiymətləndirilməsidir (16, 17). Bununla belə, həm subyektiv qiymətləndirmələr, həm də iki ölçüdə maksimal ölçülərdən istifadə edən sadə ölçmələr insan tərəfindən həyata keçirildikdə məhdud təkrarlanma qabiliyyəti ilə qeyri-dəqiq məlumatlarla nəticələnməyə meyllidirlər. Burada, üfüqi bütün ağciyərlərin ardıcıl təyyarələrinin sürüşmələri S. pneumoniae– yoluxmuş ağ ciyərlər patoloji histoslayd skaneri vasitəsilə rəqəmsallaşdırılıb və sonrakı DİA üçün istifadə oluna bilən şəkil məlumat faylı yaradılıb (Şəkil 1A, məsələn, GENIE alətindən istifadə etməklə). Belə yeni GENIE alqoritminin yaradılması təsirə məruz qalmış ağciyər toxuması (Şəkil 1B, sol panel, qırmızı ilə işarələnmiş), təsirlənməmiş ağciyər toxuması (Şəkil 1B, mərkəzi panel, yaşıl rənglə işarələnmiş), fon daxil olmaqla, müxtəlif lezyon siniflərinin müəyyən edilməsi ilə başlayır. (Şəkil 1B, sağ panel, boz rənglə etiketlənmiş) və yalnız şüşə (Şəkil 1B, sağ panel, bej etiketli). Proqram düzbucaqlı və ya dairəvi formalar və ya əl ilə işləyən alət kimi müxtəlif annotasiya üsullarını təklif edir. Bu məqsədlə, sonradan proqram təminatı tərəfindən avtomatik olaraq müəyyən edilməli olan dörd diferensial xarakterli toxuma sinfini (Cədvəl 1) daxil edən montaj (Şəkil 1C) yaradılmışdır (Şəkil 1C), sonra dəqiq kəmiyyət müəyyən edilmişdir. GENIE alqoritmi məkan, məntiq və hədd operatorları tərəfindən yerinə yetirilən əlavə təsvir emalı ilə şəkillərdən əsasən multispektral məlumatları çıxarır. Xüsusi GENIE alqoritmi təkamüllü hesablamalı öyrənmə zamanı hədəf toxumanın hər bir sinfinin ayrı-seçkiliyi üçün unikal məkan-spektral xüsusiyyətləri müəyyən etmək üçün minimum 500 iterasiyadan istifadə etməklə iterativ öyrənmə prosesi ilə təkmilləşdirilmişdir. 95% və ya daha çox olan yekun orta təlim dəqiqliyi kifayət qədər əvvəlcədən müəyyən edilmişdir. GENIE proqramında “klassifikator” adlandırılan son alqoritm ağciyər olmayan toxumaları, məsələn, yağ və limfoid toxumaları istisna etmək üçün əl ilə qeyd edildikdən (yaşıl xətt) sonra bütün ağciyər slayd skanlarına tətbiq edilmişdir (Şəkil 1D). Müəyyən edilmiş dörd sinifin hamısı, şura tərəfindən təsdiq edilmiş patoloqlar tərəfindən gözlənildiyi kimi, xüsusi GENIE təsnifatı tərəfindən bütün ağciyər bölmələrində (Şəkil 1D və 1E) dəqiq müəyyən edilmişdir (Şəkil 1F). Hər bir GENIE klassifikatoru onların unikal və patogenə xas xüsusiyyətlərini tutmaq üçün hər bir infeksiya modeli üçün ayrıca yaradılmışdır.

Şəkil 1. Rəqəmsal təsvirin təhlili (DIA)—GENIE və v9 nüvə sayı (v9 nc). (AF) DİA Streptococcus pneumoniae– GENIE alqoritmindən istifadə edərək yoluxmuş ağciyərlər. (A) Ağciyərlər tam slayd tarama (WSS) texnologiyası ilə vizuallaşdırıldı. (B) Təlim dəsti yaradaraq ağciyər toxumasının müxtəlif siniflərinin təyini montajla nəticələndi (C), təsirə məruz qalanlar arasında fərq qoymağa imkan verir (B, sol panel, qırmızı) və təsirsiz (B, mərkəzi panel, yaşıl) ağciyər sahələri, fon (B, sağ panel, boz) və şüşə (B, sağ panel, bej). (D) Ağciyərlərin əl ilə annotasiyasından sonra (yaşıl xətt) və əvvəllər yaradılmış təlim dəstinə və montaja əsaslanaraq, təsirlənmiş və təsirlənməmiş ağciyər sahələrinin ayrı-seçkiliyi üçün GENIE təsnifatı yaradıldı. (E) İltihab sahələri kimi müəyyən edilmiş bütün siniflər (məsələn, immun hüceyrələrin alveolyar boşluqlara ox başlığına infiltrasiya ilə xarakterizə olunur) yeni yaradılmış GENIE alqoritmi ilə dəqiq müəyyən edilmişdir. (GI) DİA S. pneumoniae– v9 nc alqoritmindən istifadə edərək yoluxmuş ağciyərlər. (G) Ağciyərlərin əl annotasiyasından sonra (yaşıl xətt), nüvələrin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün uyğunlaşdırılmış və dəyişdirilmiş v9 alqoritmi bütün ağciyər skanlarında tətbiq edilmişdir. (HI) Hemalaunla boyanmış nüvələrin ümumi sayı dəqiq (daxili, ox ucu) və etibarlı şəkildə ölçüldü. Ölçək çubuğu (A): 1 mm, həmçinin aiddir DG miqyas çubuğu (E): 100 μm, həmçinin aiddir F miqyas çubuqları (BH): 50 μm, həmçinin aiddir I və miqyas çubuğu (daxildir H): 10 μm, daxilə də aiddir I.

Hüceyrələrin ümumi və ya nisbi sayının və ya neytrofillər kimi hüceyrələrin xüsusi alt çoxluqlarının əllə hesablanması və ya FC analizləri ilə müəyyən edilməsi eksperimental pnevmoniyanın nəticələrinin qiymətləndirilməsində tipik parametrdir (16, 17). Ağciyər infeksiyası modellərindən histoloji slaydlar üçün oxunma variantlarını daha da təkmilləşdirmək üçün nüvələrin və ya hüceyrələrin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün v9 nc alqoritmi H&E ilə boyanmış WSS-də xüsusi şərtlərə (Cədvəl E1) cavab vermək üçün burada uyğunlaşdırılmışdır. S. pneumoniae– yoluxmuş ağciyərlər (Şəkil 1G). Ağciyər toxumalarının əl annotasiyasından sonra (Şəkil 1G, yaşıl xətt), H&E ilə boyanmış nüvələr (Şəkil 1H, daxil) dəyişdirilmiş alqoritm (Şəkil 1I, daxil) ilə ölçüldü.

Təsirə məruz qalan ağciyər sahələrinin dəqiq rəqəmsal kəmiyyəti, eləcə də histoloji bölmələrdə hər sahəyə düşən hüceyrələrin və ya hadisələrin hesablanması eksperimental qrupların (məsələn, müalicə olunan) nisbi müqayisəsi üçün güclü, obyektiv, etibarlı və yüksək dərəcədə təkrarlana bilən, lakin praktiki alət ola bilər. müalicə olunmamış qruplara qarşı) və ya patogenlərin və ya sahiblərin genetik modifikasiyalarının təsirlərinin qiymətləndirilməsi üçün. PBS ilə mübarizə aparan nəzarət siçanlarından və yoluxmuş siçanlardan ağciyərlərin WSS S. pneumoniae və ya IAV (Şəkil 2A) təsirlənmiş ağciyər sahələrinin təyini üçün xüsusi olaraq dəyişdirilmiş GENIE təsnifatçılarından və tam ağciyər bölmələri daxilində sahəyə düşən ümumi nüvələrin sayılması üçün xüsusi olaraq uyğunlaşdırılmış v9 nc alqoritmlərindən istifadə etməklə müqayisə edilmişdir (Şəkil 2A). Hər bir sahəyə görə hüceyrələr kimi nisbətlər və ya sıxlıqlar qeyri-bərabər paylanmış lezyonları ehtiva edən 2D toxuma bölmələrində ölçüldükdə, texniki artefaktları minimuma endirmək üçün hazırlıq, yerləşdirmə və kəsmə prosedurlarını bərabərləşdirmək vacibdir. Bundan əlavə, parafinin yerləşdirilməsi zamanı qaçınılmaz toxuma büzülməsi eksperimental qruplar arasında büzülmə artefaktları fərqli olduqda qrup müqayisələrində səhv mənbəyi ola bilər (5). Bu məqsədlə, bərabər şəkildə işlənmiş WSS-nin ümumi ağciyər sahələri rəqəmsal analizlərdən əvvəl ölçüldü və eyni gərginlik, yaş və cinsdən olan siçanların ağciyərlərinin bərabər ilkin ölçüləri qəbul edilərək eksperimental qruplar arasında müqayisə edildi (Şəkil 2B). Yoluxmuş siçanların bütün ağciyərlərinin kəsik sahələri arasında heç bir fərq qeydə alınmamışdır S. pneumoniae (80,13 ± 21,89 mm 2), IAV (75,82 ± 16,20 mm 2) və PBS ilə etiraz (77,96 ± 14,40 mm 2 Şəkil 2B). Əksinə, təsirlənmiş ağciyər parenximasının sahələri yoluxmuş siçanlarda PBS ilə mübarizə aparan nəzarətlərlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (PBS, 12.80 ± 5.53%) S. pneumoniae, 44,53 ± 10,58% IAV, 28,97 ± 4,90% Şəkil 2C). Ardıcıl olaraq, bütün ağciyər bölməsinə düşən ümumi nüvələrin sayı da bundan sonra əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır S. pneumoniae (750,404 ± 181,110 nüvə) və ya IAV (541,023 ± 157,223 nüvə) infeksiyası, PBS ilə mübarizə aparan ağciyərlərlə müqayisədə (400,395 ± 51,519 nüvə Şəkil 2D). Oxşar fərqlər hər kvadrat millimetr ağciyər sahəsinə düşən nüvələrin ümumi sıxlığı üçün qeydə alınmışdır (PBS, 5,282 ± 878 nüvə/mm2 S. pneumoniae, 10,342 ± 1,163 nüvə/mm 2 və IAV, 7,733 ± 575 nüvə/mm 2 ağciyər bölməsi Şəkil 2E). Qeyd edək ki, ağciyərlər yoluxmuşdur S. pneumoniae həm daha yüksək ümumi hüceyrə sayı, həm də təsirə məruz qalan daha böyük ərazilər baxımından İAV-ə yoluxmuş ağciyərlərlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə daha ciddi şəkildə təsirlənmişdir (Şəkil 2A, 2C və 2E).

Şəkil 2. Ağciyər infeksiyası modelləri arasında kəmiyyət müqayisələri və rəqəmsal görüntü analizlərinin təkrarlanması. (A) PBS ilə mübarizə aparan və yoluxmuş siçanların ağciyərlərinin WSS (Streptococcus pneumoniae [Spn] və A qrip virusu [IAV]) GENIE və v9 nüvə sayı (v9 nc) alqoritmlərindən istifadə edərək təsirlənmiş ağciyər sahəsi və ümumi nüvələrin sayı baxımından müqayisə edildi. (B) Rəqəmsal görüntü analizlərindən əvvəl bütün ağciyərlərin ümumi kəsik sahələri ölçüldü. (C) Təsirə məruz qalan ağciyər sahələrinin faizləri, eləcə də (D) bütün ağciyər sahəsinə düşən ümumi nüvələr müəyyən edildi və (E) hər sahəyə (mm 2) ümumi nüvələri qiymətləndirmək üçün kəsik sahəsinə normallaşdırılır. (FG) Pnevmokokların iki müxtəlif serotipi (ST) (ST2, D39 ST3, PN36) və ya PBS-ə qarşı mübarizə aparan nəzarət vasitələri ilə yoluxmuş ağciyərlərin eyni analizləri infeksiyadan 24 saat və 48 saat sonra iki fərqli vaxt nöqtəsində aparılmışdır. Dəyərlər orta olaraq verilir (±SEM n = 4-8 hər qrup). ## P < 0.01, ### P < 0.001, #### P < 0,0001 PBS-nəzarətlərinə qarşı. *P < 0,05, **P < 0.01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 birtərəfli ANOVA/Sidak-ın çoxsaylı müqayisə testindən istifadə etməklə göstərildiyi kimi (BE) və ikitərəfli ANOVA/Türkiyənin çoxlu müqayisə testi (FG). Ölçək çubuğu (WSS): 1 mm. (H) Histoslidlərin skan edilməsi də daxil olmaqla bütün kəmiyyətin təyini proseduru pnevmokok pnevmoniyasından və v9 nc və GENIE alqoritmlərindən fərqli təsirə məruz qalmış dörd tam ağciyər slaydlarından istifadə etməklə üç dəfə təkrarlandı. Dəyərlər orta olaraq verilir (±SEM n = Hər nümunə üçün üç təkrar ilə 4 nümunə).

Pnevmokokların iki fərqli serotipi, 2 və 3 serotipləri və ya PBS-ə qarşı mübarizə aparan nəzarət vasitələri ilə yoluxmuş ağciyərlərin rəqəmsal görüntü analizləri bir ştammda pnevmoniyanın müxtəlif şiddətlərini ölçmək və müqayisə etmək üçün infeksiyadan 24 və 48 saat sonra iki fərqli vaxt nöqtəsində aparılmışdır. zamandan asılı moda. Ölçülmüş şiddət parametrləri təsirlənmiş ağciyər sahələrinin faizləri, həmçinin ağciyərlərdə hüceyrələrin mütləq və nisbi sayı idi. Məlumatlar həqiqətən təsirlənmiş ərazilərin faizlərində zamandan və gərginliyə bağlı artımı aşkar etdi (Şəkil 2F). həmçinin hüceyrələrin sayında (Şəkil 2G). PBS nəzarətləri ilə müqayisə edildikdə, serotip 3 ştammı PN36 zaman nöqtəsindən asılı olaraq əhəmiyyətli dərəcədə daha böyük pnevmoniya sahələrinə səbəb oldu (24 saat, PBS, 9.80 ± 3.69% D39, 18.34 ± 10.38% PN36, 23.97, P31, 8.8% P31, 8. BS). ± 6,74% D39, 34,23 ± 3,56% PN36, 46,52 ± 9,52% Şəkil 2F). Hüceyrələrin sayı (24 saat, PBS, 4,560 ± 378 nüvə/mm 2 D39, 5,779 ± 1,167 nüvə/mm 2 PN36, 7,584 ± 972 nüvə/mm 2 ağciyər bölməsi, 48 h, P17) üçün çox oxşar təsir müşahidə edilmişdir. ± 1,205 nüvə/mm 2 D39, 7,574 ± 848 nüvə/mm 2 PN36, 10,186 ± 995 nüvə/mm 2 ağciyər bölməsi Şəkil 2G). Üstəlik, pnevmoniyaya səbəb olma qabiliyyətinə uyğun olaraq (20), serotip 2 ştammı D39 24 və 48 saatda PN36 ştamından hər iki parametrdə daha az artıma səbəb oldu, yenə də zamandan asılı olaraq (Şəkil 2F və 2G).

Hər iki tətbiqin (GENIE və v9nc) təkrarlanma qabiliyyəti baxımından dəqiqliyi yoxlamaq üçün şablon kimi dörd fərqli təsirə məruz qalmış pnevmokok pnevmoniya nümunəsindən istifadə etməklə bütün prosedurlar üç dəfə təkrarlandı. Bu məqsədlə, eyni dörd ağciyər slaydları yenidən skan edildi, əl ilə yenidən annotasiya edildi və v9 nc və GENIE təsnifatı tərəfindən üç dəfə yenidən təhlil edildi (Şəkil 2H). Bütün prosedur boyunca əldə edilmiş yekun məlumatlar arasında uyğunluq v9 nc alqoritmi üçün 99,70 (±0,19)% və GENIE təsnifatı üçün 99,03 (±0,63)% təşkil edir ki, bu da hər iki tətbiq tərəfindən əldə edilən nəticələrin yüksək təkrar istehsalını təklif edir (Şəkil 2H).

İmmunohistokimyəvi siqnalların v9 nc alqoritmində hemalaunla boyanmış hüceyrə nüvələrinə bənzər sayıla bilən hadisələr kimi xidmət edə biləcəyini fərz etdik. İmmun hüceyrələrin müxtəlif alt qruplarının sayılması üçün IHC aparıldı S. pneumoniae– CD68 (makrofaglar/monositlər, Şəkil 3A), neytrofil elastaz (neytrofillər Şəkil 3B), CD3 (T hüceyrələri, Şəkil 3C) və ya CD45R (B hüceyrələri Şəkil 3D) əleyhinə antikorlardan istifadə edərək yoluxmuş ağciyərlər. v9 nc alqoritmi hər bir boyanma protokoluna uyğunlaşdırılmışdır (Cədvəl E1) və immunohistokimyəvi etiketli hüceyrələrin etibarlı identifikasiyası və sayılmasına imkan verir (Şəkil 3E-3H). Çıxış məlumatları ağciyər sahəsinin hər kvadrat millimetrinə düşən müsbət hüceyrələrin ümumi və nisbi sayını, eləcə də burada ləkələnməmiş (0+), zəif (1+), orta (2+) və ya güclü (3+) kimi müəyyən edilən müxtəlif rəngləmə intensivliyini ehtiva edir. ) siqnalları, orta nüvə qırmızı, yaşıl və mavi intensivlikləri, piksel və kvadrat millimetrlə orta nüvə ölçüləri və piksel və ya kvadrat millimetrlə analiz sahəsi (Şəkil 3E-3H). Nisbi immun hüceyrə populyasiyalarının müqayisəsi S. pneumoniae– İAV-ə yoluxmuş ağciyərlərə qarşı təhlil edilən bütün hüceyrə növlərinin əhəmiyyətli dərəcədə, lakin əsasən müxalif olaraq iki infeksiya modelində işə götürüldüyünü aşkar etdi (Şəkil 3I). Neytrofillər dominant leykositləri təmsil etsə də S. pneumoniae infeksiya (S. pneumoniae, 3,627 ± 228 etiketli hüceyrə/mm 2 IAV, 885 ± 126 etiketli hüceyrə/mm 2 ), T hüceyrələri (S. pneumoniae, 1,164 ± 282 etiketli hüceyrə/mm 2 İAV, 2,583 ± 235 etiketli hüceyrə/mm 2) və makrofaqlar (S. pneumoniae, 905 ± 93 etiketli hüceyrə/mm 2 İAV, 1,770 ± 273 etiketli hüceyrə/mm 2) İAV-ə yoluxmuş ağciyərlərdə əsas hüceyrə növləri idi. B hüceyrələri (S. pneumoniae, 220 ± 88 etiketli hüceyrə/mm 2 İAV, 370 ± 66 etiketli hüceyrə/mm 2 ) daha az cəlb edilib S. pneumoniae– və İAV-ə yoluxmuş ağciyərlər PBS nəzarətləri ilə müqayisədə və hər iki infeksiya modelində təhlil edilən immun hüceyrələrin ən aşağı sayını təmsil edir (Şəkil 3I). PBS nəzarətində üstünlük təşkil edən T hüceyrələri (1,494 ± 179 etiketli hüceyrə/mm 2), eyni sayda S. pneumoniae– yoluxmuş ağciyərlər, lakin İAV infeksiyasından sonra əhəmiyyətli dərəcədə yüksək rəqəmlər (Şəkil 3I). Makrofaqlar PBS-ə qarşı mübarizə aparan ağciyərlərdə T hüceyrələrindən bir qədər az idi (880 ± 79 etiketli hüceyrə/mm 2), eyni zamanda İAV ilə yoluxmuş ağciyərlərdə də əhəmiyyətli dərəcədə artdı. PBS ilə mübarizə aparan ağciyərlərdə üçüncü ümumi populyasiya kimi B hüceyrələri (725 ± 90 etiketli hüceyrə/mm 2) hər iki patogenlə yoluxduqdan sonra əhəmiyyətli dərəcədə azaldı, halbuki neytrofillərin sayı (512 ± 233 etiketli hüceyrə/mm 2) əhəmiyyətli dərəcədə aşağı idi. Gözlənildiyi kimi bakterial infeksiya ilə müqayisədə PBS ağciyərləri (Şəkil 3I).

Şəkil 3. Hüceyrələrin immunofenotiplənməsi və kəmiyyətinin təyini və axın sitometriyası (FC) məlumatları ilə müqayisə edilərək doğrulama. (AD) İmmunohistokimyəvi boyanma Streptococcus pneumoniae– CD68+ aşkarlanması üçün yoluxmuş ağciyər bölmələri (A, makrofaqlar/monositlər), neytrofil elastaz-müsbət (B, neytrofillər) CD3 + (C, T hüceyrələri) və CD45R + (D, B hüceyrələri) hüceyrələri. (EH) Hər bir antigen üçün uyğunlaşdırılmış v9 nc alqoritmindən istifadə edərək immunohistokimyəvi ləkələnmiş ağciyərlərin DİA (Cədvəl E1). Çıxış məlumatlarına ləkələnmiş hüceyrələrin sayı və intensivliyi kimi bir neçə növ məlumat daxil edilmişdir. (I) Hər kvadrat millimetr ağciyər sahəsinə görə etiketlənmiş hüceyrələrin kəmiyyət göstəriciləri S. pneumoniae– və ya İAV-ə yoluxmuş ağciyərlər və PBS-ə qarşı mübarizə aparan nəzarətçilər. (JK) DİA və FC analizləri ilə müəyyən edilmiş nisbi immun hüceyrə populyasiyalarının PBS-də sınaqdan keçirilməsi (J) və S. pneumoniae- yoluxmuş ağciyərlər (K). Dəyərlər orta olaraq verilir (±SEM n = 4-5 hər qrup). #### P < 0,0001 PBS-nəzarətlərinə qarşı. ****P < 0.0001 birtərəfli ANOVA/Sidak-ın çoxsaylı müqayisə testindən istifadə etməklə göstərildiyi kimi. Ölçək çubuğu (H): 50 μm, həmçinin aiddir AG. Ölçek çubuğu daxiletmə (H): 20 μm, daxilə də aiddir EG.

2D tam ağciyər bölmələrindən rəqəmsal olaraq əldə edilmiş məlumatların təsdiqi üçün PBS problemindən sonra bütün ağciyərlərdən çıxarılan nisbi immun hüceyrə populyasiyaları və ya S. pneumoniae infeksiya FC (Şəkil E1) tərəfindən müəyyən edilmiş və DIA tərəfindən əldə edilən nisbətlərlə birbaşa müqayisə üçün eyni şəkildə hesablanmışdır. PBS ilə mübarizə aparan ağciyərlərdə makrofaqların nisbi sayı (DİA, 24,05 ± 1,83% FC, 27,58 ± 3,09%), neytrofillər (DIA, 13,40 ± 4,83% FC, 10,50 ± 1,07%, T ± 1,01%, T ± 1,72%). FC, 31.72 ± 2.29% və B hüceyrələri (DIA, 21.77 ± 1.89% FC, 30.20 ± 2.11%) hər iki üsulda demək olar ki, oxşar idi (Şəkil 3J), bu da makrofaqların sayına (DIA, 14.93 ±) aiddir. 1,17% FC, 14,57 ± 1,47%, neytrofillər (DİA, 60,27 ± 7,12% FC, 72,75 ± 1,50%), T hüceyrələri (DIA, 19,02 ± 3,82% FC, 8,83 ± DI, 8,83 ± A7, 0.8 hüceyrələr) ± 3,77% FC, 3,85 ± 0,50% in S. pneumoniae– yoluxmuş ağciyərlər (Şəkil 3K). Əslində, bu iki yanaşma ilə əldə edilən məlumatların əksəriyyətində yüksək uyğunluq müşahidə edildi (Şəkil 3J və 3K), bu, 2D DİA-nın nəticələrinin əslində etibarlı ola biləcəyini və həqiqətən də bütün ağciyərlərdəki vəziyyətə bənzədiyini göstərir.

Burada qurulmuş avtomatlaşdırılmış rəqəmsal nümunənin tanınmasının iki fərqli yanaşması, iltihablı ağciyər toxumasının nisbi və mütləq sahəsi və hüceyrələrin sayı və sıxlığı daxil olmaqla, 2D tam ağciyər slaydlarında pnevmoniyanın histopatologiyasının iki universal aktual aspektinin kəmiyyətini müəyyən etməyə imkan verir. Bundan əlavə, v9 nc alqoritmi immun hüceyrələrin immunohistokimyəvi etiketli alt dəstlərinin kəmiyyətini müəyyən etmək üçün uğurla istifadə edilmişdir. Aydındır ki, burada ölçülən parametrlər yalnız başlanğıcdır və bir çox digər tətbiqlər və hədəf parametrləri təsəvvür etmək olar. Nümunələrin tanınması proqramı, GENIE və v9 nc alqoritmi beləliklə, təsviri histopatologiya üçün adətən istifadə edilən standart şüşə slaydlardan istifadəçi tərəfindən müəyyən edilmiş mürəkkəb histoloji lezyonların yüksək məhsuldarlıqlı, avtomatlaşdırılmış kəmiyyətini əldə etmək üçün öz-özünə öyrənmə vasitələri təmin edir. Bu inkişafla, skan edilmiş bütün ağciyər bölmələrində kompüterləşdirilmiş görüntü təhlili ədədi məlumatların dəqiq əldə edilməsində və siçan pnevmoniyasında morfoloji dəyişikliklərin statistik qiymətləndirilməsində həm texniki, həm də logistik irəliləyişləri təmsil edir. Ağciyər xərçəngi və beyin zədəsi ilə bağlı əvvəlki tədqiqatlar göstərmişdir ki, seçilmiş parametrlərin əl ilə ölçülməsi ilə müqayisədə bu texnologiyalarla əldə edilən kəmiyyət göstəriciləri daha etibarlı, təkrarlana bilən və vaxtında uyğundur (6, 11, 21, 22). Beləliklə, standart təsviri histopatologiyaya, yarı kəmiyyət qiymətləndirmə sistemlərinə və sterologiyaya əlavə olaraq, bütün orqan bölmələri üzrə DİA indi ağciyər tədqiqatları üçün mövcuddur və ağciyər histologiyasının dəyərini daha da gücləndirərək, siçan pnevmoniyası tədqiqatlarında oxuma variantlarını geniş şəkildə genişləndirəcəyi gözlənilir ( Şəkil 4).

Şəkil 4. Tam ağciyər bölməsinin histopatologiyası üçün analitik variantlar. 2D = iki ölçülü 3D = üç ölçülü.

Burada DIA-nı bakterial və viral ağciyər infeksiyası modellərinə tətbiq etdik və məlumatları PBS-ə qarşı mübarizə aparan nəzarətlərlə müqayisə etdik. Təsirə məruz qalmış ağciyər sahələrinin obyektiv təyini və müqayisəli kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün ayrıca və modelə xas GENIE alqoritmləri yaradılmışdır ki, bu da keçmişdə yalnız 2D bölmələr üzrə təxmini hesablana bilirdi (16, 17). Fərqli infeksiya modelləri və patogenlərin histopatologiyaları arasında geniş uyğunsuzluqlara görə (3), lakin kəmiyyətcə ölçüləcək unikal model və ya patogenə xas xüsusiyyətləri tutmaq üçün hər bir model və ya patogen üçün xüsusi GENIE alqoritmləri yaradılmalıdır. Burada yaradılan modelə xas alqoritmlər, təsirlənmiş və təsirsiz ağciyər sahələri, fon və şüşə arasında fərq qoymağa və kəmiyyətcə qiymətləndirməyə imkan verən şərhli toxuma siniflərini dəqiq müəyyənləşdirdi. Eynilə, nüvələrin və ya hüceyrələrin sayı v9 nc alqoritmləri ilə ölçüldü ki, bu da həm hemalaunla boyanmış nüvələrin, həm də nüvələr və ya hüceyrələr daxilində immunohistokimyəvi marker siqnallarının dəqiq miqdarını təyin etməyə imkan verdi.

Hər iki sistemin, GENIE və v9 nc alqoritmlərinin yüksək dəqiqliyi, slaydların skan edilməsi və bitişik piy və limfoid toxumaların əllə xaric edilməsi də daxil olmaqla, bütün prosedurlar üzrə nəticələrin təkrar istehsalı vasitəsilə burada qiymətləndirildiyi kimi, faktiki göstəricilərin əks olunması baxımından yüksək məlumat etibarlılığını göstərir. Slaydlarda morfoloji məlumatlar. Üstəlik, mərkəzi ağciyər müstəvilərinin 2D toxuma bölmələrindən DİA və tam ağciyər ekstraktlarından əldə edilən FC məlumatları arasında immun hüceyrə alt tiplərinin faizlərini müqayisə etdikdə, ümumi yaxın oxşarlıqlar nisbi məlumatların, məsələn, tam ağciyər bölmələrində ölçülən hüceyrə nisbətlərinin, stereologiya və ya FC kimi daha mütləq ədədi yanaşmalarla müqayisədə faydalı və praktiki kompromis ola bilər (12, 13, 23). 2D tam ağciyər bölmələrindən DİA-nın aşkar üstünlüklərinə tələb olunan investisiyalar qoyulduqdan sonra, onun nisbətən aşağı vaxt və xərc xərcləri, böyük nümunə nömrələrinin yüksək məhsuldarlıqlı analizləri üçün yüksək praktikliyi və arxiv materialları ilə retrospektiv tədqiqatlar üçün faydalı olması daxildir. stereologiya üçün tələb olunduğu kimi adətən qeyri-təsadüfi şəkildə daxil edilir (12). Bununla belə, məlumatların istifadəsinə dair bir sıra kritik texniki ilkin şərtlər və məhdudiyyətlər nəzərə alınmalıdır. Birincisi, ağciyərlərin çox diqqətli və yüksək standartlaşdırılmış hazırlanması, sıxılma atelektazı və ya heyvanlar və ya eksperimental qruplar arasında qeyri-bərabər inflyasiya səbəbindən artefaktları istisna etmək üçün kritik görünür. Bu homojenlik səviyyəsinə nail olmaq üçün biz burada orijinal ağciyər həcmlərini tam saxlamaq üçün terminal ekshalasiyadan dərhal sonra tam traxeyanın bağlanması metodundan istifadə etdik. Ağciyər ölçülərinin homojenliyi, müxtəlif dərəcəli deflyasiya və ya atelektaza dair heç bir dəlil gətirə bilməyən gömülü ağciyərlərin kəsik sahələrini müqayisə etməklə idarə olundu. Daha standart bir yanaşma, 15-25 sm H eyni inflyasiya təzyiqinə ağciyərlərin postmortal inflyasiyası olardı.2O, Amerika Torakal Cəmiyyətinin tövsiyə etdiyi kimi (24). İkincisi, parafin bloklardan əl ilə kəsildikdən sonra skan ediləcək toxuma hissələrinin keyfiyyəti DİA-nın tətbiqinə böyük təsir göstərir. Toxuma hissələri təqribən daha qalındır. 2 μm, çatlar və ya qıvrımlar olan kəsiklər, sıxılmış kəsiklər və ya şüşə slaydlar üzərində həddindən artıq uzanan kəsiklər əlimizdə açıq şəkildə səhv nəticələr verdi. Qəribədir ki, əl bacarıqları proqram təminatı tərəfindən yaradılan məlumatların müvəffəqiyyəti və etibarlılığı üçün kritik bir amilə çevrilir. Üçüncüsü, toxumaların rənglənməsinin intensivliyi və homojenliyi skan edilmiş slaydlardan məlumatların əldə edilməsinə də təsir göstərə bilər ki, bu da yüksək standartlaşdırılmış rəngləmə prosedurlarını zəruri edir. Əhəmiyyətli olan, eyni maksimum standartlaşdırılmış iş prosesində bütün eksperimental heyvanları və qrupları əhatə edən toplu emal və təhlillər tövsiyə olunur. Bu məqsədlə intraeksperimental variasiyalar və kəsmə və ya boyanma prosedurlarındakı fərqlər üçün müvafiq nəzarət vasitələri daxil edilməlidir. Bundan əlavə, 40× obyektivdən istifadə edərək orta histoslayd skanerləri tərəfindən əldə edilən təxminən 0,25 μm/piksel ayırdetmə dəqiqliyi, hüceyrənin xüsusi immunobelinqləri olmadan spesifik immun hüceyrə alt tiplərinin (məsələn, neytrofillər və limfositlər) sırf morfoloji diferensasiyası üçün kifayət deyil. Bu baxımdan, təlim keçmiş patoloqun gözü kiçik ölçülü mürəkkəb optik nümunələrin tanınmasında hələ də üstün görünür, ehtimal ki, burada skan edilməmiş real mikroskopiyada z müstəvisi ilə əlaqədardır. Bundan əlavə, ayrı-ayrı bakterial strukturların etibarlı identifikasiyası və hesablanması, patogenlərin immunohistokimyəvi olaraq etiketləndiyi yanaşmaları tələb edən, hazırda mövcud texnologiyanın həlli və optik həssaslığından açıq şəkildə kənardadır (16). Aydındır ki, məhdud optik həssaslıq və toxuma emalının əl ilə dəyişməsi səbəbindən süni effektlər kimi texniki çatışmazlıqlar bu metodologiyanın daha da təkmilləşdirilməsi üçün gələcək problemləri təmsil edir.

Digər tərəfdən, bütün ağciyərlər üçün mütləq rəqəmlər tələb olunduqda, DIA tərəfindən 2D tam ağciyər bölmələrindən əldə edilən məlumatlar kifayət deyil. Tək bir müstəvinin dəyəri açıq şəkildə onun bütün orqan üçün təmsilçiliyindən asılıdır, lezyonlar qeyri-homogen şəkildə yayıldıqda, məsələn, əksər bakteriya və ya viruslar tərəfindən törədilən pnevmoniya zamanı məhduddur (16). Müqayisə ediləcək bütün ağciyərlər yüksək standartlaşdırılmış, qeyri-təsadüfi bir şəkildə yerləşdirildikdə, əsas bronxların diametrləri boyunca bir mərkəzi müstəvini olduqca faydalı tapdıq. Aydındır ki, bütün ağciyər üçün təmsilçilik və lezyonların faktiki paylanması haqqında daha çox məlumat mikronlarda və ya anatomik təyinatlarda əvvəlcədən müəyyən edilmiş məsafələrlə təhlil edilən serial təyyarələrin sayını artırmaqla yaxşılaşdırıla bilər. Yenə də, dəqiqliyi artırmaq üçün ağciyər başına bir neçə əlavə təyyarə təhlil edilsə belə, DİA tərəfindən tam ağciyər slaydlarından əldə edilən məlumatlar hələ də istiqamət istiqamətli meyl və seçmə qərəzliyi də daxil olmaqla 2D morfometriyasına tətbiq edilən ümumi məhdudiyyətlərin əsasını təşkil edir (5).

Bu texnologiya yenicə ortaya çıxsa da, bütün histopatoloji ağciyər bölmələrinin DİA siçanlarda və ehtimal ki, digər növlərdə eksperimental pnevmoniya tədqiqatlarının oxu variantlarını və elmi dəyərini əhəmiyyətli dərəcədə təkmilləşdirəcək və genişləndirəcək.


Xərçəng Rəqəmsal Slayd Arxivi - Biologiyadan histoloji slaydı necə yükləyə bilərəm

MDPI tərəfindən nəşr olunan bütün məqalələr açıq giriş lisenziyası altında dərhal bütün dünyada mövcuddur. MDPI tərəfindən dərc edilmiş məqalənin, o cümlədən rəqəmlər və cədvəllər də daxil olmaqla, hamısının və ya bir hissəsinin təkrar istifadəsi üçün xüsusi icazə tələb olunmur. Açıq giriş Creative Common CC BY lisenziyası altında dərc olunan məqalələr üçün məqalənin hər hansı hissəsi orijinal məqaləyə aydın şəkildə istinad etmək şərti ilə icazəsiz təkrar istifadə edilə bilər.

Feature Papers sahədə yüksək təsir üçün əhəmiyyətli potensiala malik ən qabaqcıl tədqiqatları təmsil edir. Bədii məqalələr elmi redaktorlar tərəfindən fərdi dəvət və ya tövsiyə əsasında təqdim olunur və dərc edilməzdən əvvəl ekspert rəyindən keçir.

Bədii məqalə ya orijinal tədqiqat məqaləsi, tez-tez bir neçə texnika və ya yanaşmanı özündə cəmləşdirən əsaslı yeni tədqiqat işi, ya da elmi sahədə ən maraqlı nailiyyətləri sistematik şəkildə nəzərdən keçirən sahədəki ən son irəliləyişlərə dair qısa və dəqiq yenilikləri olan hərtərəfli icmal sənədi ola bilər. ədəbiyyat. Bu tip kağız tədqiqatın gələcək istiqamətləri və ya mümkün tətbiqlər haqqında dünyagörüşünü təqdim edir.

Redaktorun Seçimi məqalələri dünyanın hər yerindən MDPI jurnallarının elmi redaktorlarının tövsiyələrinə əsaslanır. Redaktorlar jurnalda bu yaxınlarda dərc edilmiş az sayda məqaləni seçirlər ki, onlar müəlliflər üçün xüsusilə maraqlı və ya bu sahədə vacib olacaq. Məqsəd jurnalın müxtəlif tədqiqat sahələrində dərc edilmiş ən maraqlı işlərdən bəzilərinin şəklini təqdim etməkdir.


TCIA-da TCGA subyektləri üçün Rəqəmsal Patoloji Şəkillərinə daxil olmaq

Rəqəmləşdirilmiş TCGA patologiyası şəkilləri Genomik Məlumat Commons - GDC Legacy Arxivində tapıla bilər. GDC TCGA genomik, klinik və molekulyar məlumatların rəsmi mənbəyidir.

Xahiş edirik unutmayın ki, Xərçəng Görüntü Arxivinin kolleksiyalarında oxunur:

Uyğun TCGA xəstə identifikatorları tədqiqatçılara toxuma genotipi, radioloji fenotip və xəstənin nəticələri arasında korrelyasiya üçün TCGA/TCIA məlumat bazalarını araşdırmaq imkanı verir.

bu o deməkdir ki, xəstə identifikatoru GDC veb-saytında (slaydlar, genotip, klinik məlumat) və TCIA (radioloji görüntüləmə, klinik məlumatlar) arasında uyğunlaşdırılır. YOX iş/nəzarət uyğunluğu. Yalnız xəstə məlumatları daxil edilmişdir.

Bəzi TCGA subyektlərinin radioloji məlumatlarını endirmisinizsə və patoloji şəkillərinə daxil olmaq istəyirsinizsə, aşağıdakı addımları yerinə yetirməlisiniz.

  1. Xəstə ID-sini toplayın (məsələn, TCGA-A6-2672) və TCIA-dan radiologiya məlumatlarını endirin
  2. GDC Legacy Arxive gedin
  3. Aşağıdakı ekrana bənzər bir şey gördüyünüzü təsdiqləyin:

    Məlumat Növü IS Toxuma slayd şəkli və ya Diaqnostik və ya hər ikisi

MATERİALLAR VƏ METODLAR

Bu tədqiqat üçün institusional baxış şurasının təsdiqi alınmışdır (Pittsburgh Universiteti, Pensilvaniya, STUDY18100084, PRO17120392 Witwatersrand Universiteti, Yohannesburq, Cənubi Afrika rəsmiləşdirilməsi sertifikatı M191003).

Doku Floater Slayd Yaradılması

Bu təcrübənin məqsədləri üçün təzə atılmış yetkin insan şiş toxumasından istifadə edərək 3 şüşə slayd hazırlanmışdır (Şəkil 1). Hazırlanmış toxuma üzən slaydlar süni şəkildə yaradılmışdır ki, bunlarda (1) tip 1 (bazofil) papiller böyrək hüceyrəli karsinomasından əldə edilən böyrək hüceyrəli karsinomasının böyük mərkəzi hissəsi və (2) slaydın kənarına 2 ayrı əlavə kiçik hissəciklər yerləşdirilmişdir. orta dərəcədə differensiallaşmış kolon adenokarsinomasından və sidik kisəsinin yüksək dərəcəli papilyar urotelial karsinomasından əldə edilən toxuma (“toxuma üzənləri”). Tədqiqatda bu slaydların qeyri-adi kimi seçilməməsi üçün seçilmiş patoloji halların diaqnozu nisbətən asan idi və adi təcrübədə rast gəlinən hallara xas idi. Həmçinin, hazırlanmış slaydlar adi boyanma protokollarına uyğun olaraq hematoksilin və eozin (H&E) ilə boyanmışdır. Bütün 3 slayd daha sonra Aperio AT2 bütöv slayd skanerindən (Leica Biosystems) istifadə edərək ×40 böyütmə ilə tamamilə rəqəmsallaşdırıldı. Unikal identifikatorların və/və ya artefaktların daxil edilməməsi üçün bu rəqəmsal slaydların keyfiyyəti yoxlanılıb.

Böyrək hüceyrəli karsinomasının bir hissəsini (A) və 2 ayrı-ayrılıqda kolon xərçəngi (B) və sidik kisəsi xərçəngi (C) toxuma floaterlərini (hematoksilin və eozin ləkəsi, ×20 böyütmədə göstərilən əlavələr) ehtiva edən hazırlanmış slayd.

Böyrək hüceyrəli karsinomasının bir hissəsini (A) və 2 ayrı-ayrılıqda kolon xərçəngi (B) və sidik kisəsi xərçəngi (C) toxuma floaterlərini (hematoksilin və eozin ləkəsi, ×20 böyütmədə göstərilən əlavələr) ehtiva edən hazırlanmış slayd.

Patoloji Rəqəmsal Slayd Data Sets

Yuxarıda qeyd olunan WSI-lər rəqəmsal slaydların 2 məlumat dəstinə daxil edilmişdir. İlk məlumat dəsti, Pittsburgh Tibb Mərkəzində, Pittsburq, Pensilvaniya Universitetində (“UPMC məlumat dəsti”) tədris fayllarından H&E ilə boyanmış cərrahi patologiya hallarının 300 deidentifikasiya edilmiş WSI (.svs fayl formatı) təsadüfi seçilməsi ilə yaradılmışdır. Bu arxiv slaydları Aperio ScanScope XT alətindən (Leica Biosystems) istifadə etməklə ×40 böyütmə ilə skan edilib. Bu WSI-lərə müxtəlif diaqnostik patoloji obyektləri (yəni, reaktiv, iltihablı, xoşxassəli yenitörəmələr) nümayiş etdirən müxtəlif anatomik yerlərdən (məsələn, kolon, beyin, tiroid, prostat vəzi, döş, böyrək, tüpürcək vəzi, dəri, yumşaq toxuma və s.) hallar daxildir. və bədxassəli şişlər). Bu tədqiqatda istifadə edilən digər məlumat dəsti Xərçəng Genom Atlası (TCGA) proqramı (https://portal.gdc.cancer.gov) tərəfindən təklif olunan ictimaiyyətə açıq rəqəmsal patoloji slayd arxivindən əldə edilmişdir. Cəmi 2025 WSI təsadüfi seçilmiş və TCGA-dan (“TCGA verilənlər bazası”) endirilmişdir. Orta WSI təxminən 45 000 × 45 000 piksel idi. Aşağı keyfiyyətli rəqəmsal slaydlar (məsələn, çox zəif rəngləmə, aşağı ayırdetmə, fokusdan kənar böyük bölgələr) ×20-dən az böyütmələr aradan qaldırıldı və bulanıq yamalar başa düşülən şəkildə şəkil axtarışının yaxşı yerinə yetirilməsinə mane olur və zəif boyanma dərin xüsusiyyətlərin çıxarılmasına mənfi təsir göstərir.TCGA verilənlər bazası 25 anatomik yerdən ən azı 33 müxtəlif diaqnostik obyekti özündə birləşdirdi. Dondurulmuş bölmələrin TCGA slaydları və əl ilə qeydlər (qələm işarələri) olan slaydlar daxil edilmişdir. Bütün rəqəmsal slaydlar həm bədxassəli şişin növü (ilkin diaqnoz), həm də təsirlənmiş orqan (əsas yer) ilə etiketlənmişdir. Bu etiket bütün WSI-yə təyin edilib və heç bir ayrı-ayrı bölgə təsvir olunmayıb. Cədvəl 1 birləşmiş verilənlər bazasında ən çox WSI sayına malik ilk 20 əsas saytı göstərir (yəni, UPMC + TCGA məlumat dəstləri).

Datasetdə Bütün Slayd Görüntüsünün (WSI) Ən Çox Sayıya Sahib 20 Əsas Sayt

BrdbvVh7dDXyun5J60iKvBkHdeCr1ukaubcBk4WI8BGoHZl6u4tyTHXNMnMr9UG5wDkKFVDcnfHCV-adcL2ebFBkcpuAvRe5UZcyQ8Gf9kFwUIITsPDZA7gmHx3ehEZZ1NAub-G2bVG7FNfGIlEriuQ __ & ampKey-Pair-Id = APKAIE5G5CRDK6RD3PGA "/>

Hesablama Platforması

Bütün təcrübələr 2x Intel(R) Xeon(R) Gold 5118 (12 nüvə, 2.30 GHz), 4x Telsa V100 (v-RAM 32 GB, hər biri yalnız 2 qrafik prosessor [GPU] istifadə edilmişdir) ilə Dell EdgeServer Ra üzərində aparılmışdır. , və 394 GB təsadüfi giriş yaddaşı. İndeksləmə kodu C/C++ dilində yazılmışdır. İstifadəçi interfeysi komponentləri bir çox dildə yazılmışdır, lakin əsasən Python və JavaScript-də. Böyük arxivlərin indeksləşdirilməsi üçün yüksək səviyyəli GPU gücü lazım idi, bu, mövcud depolar üçün 1 dəfəlik bir iş idi. Şəkil axtarışından gündəlik istifadə üçün adi (az qiymətli) mərkəzi prosessor/GPU gücü kifayət edəcək, çünki barkodlar (aşağıya bax) böyük arxivlərdə səmərəli axtarışı təmin edir.

Şəkil Axtarış Aləti

Ansambl yanaşması vasitəsilə (müxtəlif alqoritmlərin kohortundan istifadə etməklə) təsvirin emalı üçün həm nəzarət edilən (təlim olunmuş dərin şəbəkələr), həm də nəzarətsiz (klasterləşdirmə və axtarış) hesablama metodlarının güclü tərəflərindən istifadə edən etibarlı axtarış motoru prototipi hazırlanmışdır. 23 Beləliklə, bu şəkil axtarış alətinə seqmentləşdirmə və klasterləşdirmə alqoritmləri, dərin şəbəkələr və axtarış və axtarış üçün məsafə ölçüləri daxildir. Dərin şəbəkələr nəzarət edilən üsullar olduğu və etiketlənmiş məlumatlarla geniş təlim tələb etdiyi halda, axtarışın özü əvvəlcədən təlim olmadan nəzarətsizdir. Əvvəlcədən hazırlanmış dərin şəbəkədən incə tənzimləmə olmadan istifadə birbaşa nəzarət təşkil etmir, çünki o, heç bir tənzimləmə olmadan funksiyaların çıxarılması üçün istifadə olunur. Bu, yanaşmamıza əl ilə müəyyən edilmiş WSI-lərdən müstəqil olmağa imkan verir. Biz ictimaiyyətə açıq olan DenseNet-121-dən istifadə etdik. Şəkil seqmentasiyası toxumanı ağ fondan ayırmaq üçün istifadə edilmişdir. WSI-lər üst-üstə düşmədən sabit ölçülərdə (məsələn, 500 × 500 μm 2 × 20) yamaqlara və ya plitələrə bölündü. Yamalar klasterləşdirmə üsulları (məsələn, k-means alqoritmi) vasitəsilə kateqoriyalara qruplaşdırılıb və xüsusiyyət mədənçiliyi üçün əvvəlcədən hazırlanmış süni neyron şəbəkələrindən keçirilib. Hər bir xüsusiyyət vektoru xətti barkoda çevrildi (Şəkil 2) və bu “barkod dəstəsi” indeksləşdirmə prosesi axtarışın axtarışı prosesini sürətləndirmək üçün istifadə edilmişdir. 24 Barkod yaratmaq yalnız dərin xüsusiyyətlərin gradient dəyişməsinin binarizasiyasını ehtiva edirdi. Şəkilləri müqayisə edərkən uyğunluq dərəcəsini daha da artırmaq üçün çoxlu oxşarlıq ölçüləri araşdırıldı. Alınan şəkil yamaqları sorğulanan şəkilə oxşar olma ehtimalından ən kiçikə doğru sıralandı (Şəkil 3) və bu nəticələr son istifadəçinin nəzərdən keçirməsi və şərh etməsi üçün qalereya formatında nümayiş etdirildi. Reytinq (uyğun uyğunluğun reytinqi kimi müəyyən edilir) şübhəli yamağın arxivdəki bütün digər yamaqlarla oxşarlığı ilə müəyyən edilir və onların müvafiq ştrix-kodları arasında məsafənin hesablanması yolu ilə ölçülür. Yamaq nə qədər oxşardırsa (yəni, ən yaxşı reytinqli nəticə) barkodlar arasındakı fərq bir o qədər kiçikdir. Bütün uyğunlaşdırılmış yamalar bu fərqə əsasən sıralanıb (ən az fərqli birinci sıralanır və s.).

Şəklin təsviri üçün barkodlardan istifadənin ümumi ideyasının sxematik təsviri: ayrı-ayrı yamaları barkodlara çevirməklə indeksləşdirilmiş bütün slayd şəkli.

Şəklin təsviri üçün barkodlardan istifadənin ümumi ideyasının sxematik təsviri: ayrı-ayrı yamaları barkodlara çevirməklə indeksləşdirilmiş bütün slayd şəkli.

Şübhəli floaterin mənşəyinin necə aşkar edildiyini göstərən sxematik diaqram. Proses şübhəli toxuma parçasının yerini müəyyən etməklə başlayır. Fraqmentdən seçilmiş yamaq daha sonra xüsusiyyətləri çıxarmaq üçün əvvəlcədən hazırlanmış dərin şəbəkəyə verilir. Axtarış mühərriki daha sonra bir çox bütöv slayd şəkillərinin (WSI) çoxlu yamaqlarının barkodlarını ehtiva edən “Yottixel İndeksi” daxilində axtarış etmək üçün yaradılan ştrix kodu alır. Nəhayət, floaterin mənşəyi ən yüksək səviyyəli yamaqların araşdırılması ilə tanınır.

Şübhəli floaterin mənşəyinin necə aşkar edildiyini göstərən sxematik diaqram. Proses şübhəli toxuma parçasının yerini müəyyən etməklə başlayır. Fraqmentdən seçilmiş yamaq daha sonra xüsusiyyətləri çıxarmaq üçün əvvəlcədən hazırlanmış dərin şəbəkəyə verilir. Axtarış motoru daha sonra bir çox bütöv slayd şəkillərinin (WSI) çoxlu yamaqlarının barkodlarını ehtiva edən “Yottixel İndeksi” daxilində axtarış etmək üçün yaradılan ştrix kodu alır. Nəhayət, floaterin mənşəyi ən yüksək səviyyəli yamaqların araşdırılması ilə tanınır.

İstənilən toxuma parçası potensial olaraq arxivdə axtarış aparmaq üçün son istifadəçi (patoloq) tərəfindən seçilə bilər. Beləliklə, bir axtarış patoloq tərəfindən əl ilə başlanır. İndeksləşdirilə və axtarıla bilən ən kiçik yamaq ölçüsü 500 × 500 μm-dir (x20-də ~1000 × 1000 piksel) ondan kiçik hər hansı floater aşkar edilə bilməz.

Axtarış alətinin qiymətləndirilməsi

Yuxarıda qeyd olunan 3 hazırlanmış slayd skan edildikdən, indeksləşdirildikdən və 2 məlumat dəstindən milyonlarla şəkil yamaları arasında qarışdırıldıqdan sonra yamaqların sayı klasterləşdirmə yolu ilə təxminən 16 000 yamağa endirildi (empirik olaraq 9 qrupa təyin olundu), halbuki hər birinin yalnız 5%-i klaster WSI-ni təmsil etmək üçün seçilmişdir. Axtarış aləti daha sonra hər bir toxuma floaterinə aid olan uyğun slaydı sınamaq və müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir (Şəkil 4). Axtarış floater nümunəsinin dəyişkən faizlərindən istifadə etməklə aparılmışdır (yəni seçilmiş toxuma floater bölgəsinin 5%-100%-i). Aşkarlama dəqiqliyi hər bir nümunəni 100 dəfə (əllə və avtomatlaşdırma ilə) işə salmaqla və axtarış nəticələri arasında düzgün aşkarlamanın median dərəcəsini, həmçinin 95-dən istifadə edərək axtarış nəticələri arasında aşkar edilmiş floaterin ən yaxşı və ən pis dərəcəsini hesablamaqla ölçüldü. % CI.

(A) Mozaika yaratmaq üçün 33 yamaq verən nümunənin bütün slayd təsvirinin indeksləşdirilməsi (sidik kisəsi şişi ilə skan edilməsi). (C) Mozaikanın müvafiq ştrix-kodları MinMax alqoritmindən istifadə etməklə yaradıla bilər. Vurğulanmış yamaqlara uyğun gələn 3 barkod göstərilir.

(A) Mozaika yaratmaq üçün 33 yamaq verən nümunənin bütün slayd təsvirinin indeksləşdirilməsi (sidik kisəsi şişi ilə skan edilməsi). (C) Mozaikanın müvafiq ştrix-kodları MinMax alqoritmindən istifadə etməklə yaradıla bilər. Vurğulanmış yamaqlara uyğun gələn 3 barkod göstərilir.


Prostat vəzinin əridilmiş-MRT-Patologiyası

Məlumatların toplanması və təhlili Case Western Reserve Universitetinin PhD, PhD Anant Madabhushi və Pensilvaniya Universitetində Xəstəxananın tibb elmləri namizədi Michael D. Feldman tərəfindən təmin edilmişdir. Bu iş NIH R01CA136535 tərəfindən dəstəkləndi.

İstinadlar

  1. Singanamalli, A. , Rusu, M. , Sparks, RE, Shih, NN, Ziober, A. , Wang, L. , Tomaszewski, J. , Rosen, M. , Feldman, M. and Madabhushi, A. (2016) , Mikrodamar arxitekturası və prostat xərçənginin qlison dərəcələri ilə əlaqəli in vivo DCE MRT markerlərinin müəyyən edilməsi. J. Magn. Rezonans. Təsvir, 43: 149-158. doi: 10.1002/jmri.24975 (PMID: 26110513).
  2. Toth, R, Feldman, M, Yu, D, Tomaszewski, J, Madabhushi, A. "Histostitcher™: Genişləndirilə bilən Görüntü Platforması (XIP™) Çərçivəsindən istifadə edərək Prostat Histologiyasının Rekonstruksiyası üçün İnformatika Proqramı Platforması,” Patologiya İnformatika Jurnalı, cild. 5, səh. 8, 2014 (PMID: 24843820, PMCID: PMC4023035).
  3. Xiao, G, Bloch, N, Chappelow, J, Genega, E, Rofsky, N, Lenkinsky, R, Tomaszewski, J, Feldman, M, Rosen, M, Madabhushi, A. "Prostat Xərçənginin MRT əsaslı Xəstəlik İmzalarını Müəyyən etmək üçün Histologiya-MRT Dilim Uyğunluqlarının Müəyyən edilməsi,” Bütün Slayd Mikroskopik Şəkil Emalı üzrə Kompüterləşdirilmiş Tibbi Görüntü və Qrafikanın Xüsusi Buraxılışı, cild. 35[7-8], s. 568-78, 2011 (PMİD: 21255974).
  4. Chappelow, J, Bloch, N., Rofsky, N, Genega, E, Lenkinski, R, DeWolf, W, Madabhushi, A. "Multimodal Prostat MRT və Histologiyasının Multi-Atributlu Qarşılıqlı Məlumat vasitəsilə Elastik Qeydiyyatı,” Tibbi Fizika, cild. 38[4], s. 2005-2018, 2011 (PMID: 21626933).

Data Access

üzərinə klikləyin Yüklə NBIA Data Retriever ilə açmalı olduğunuz ".tcia" manifest faylını kompüterinizdə saxlamaq üçün düyməni basın. üzərinə klikləyin Axtar Məlumatların toplanmasına baxa və/yaxud onun məzmununun alt dəstini endirə biləcəyiniz Data Portalımızı açmaq üçün düyməni basın.

Annotasiyalı Bütün Slayd Patoloji Şəkilləri və Annotasiyalar (Tiff, XML 76,8 GB)


Videoya baxın: slayd hazirlamaq (Avqust 2022).