Məlumat

Elektroporasiya olmadan Lambda qırmızı rekombinasiyası

Elektroporasiya olmadan Lambda qırmızı rekombinasiyası


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Lambda qırmızı rekombinasiyası haqqında tapdığım bütün protokollar E.coli hüceyrəsinə homoloji DNT (adətən PCR məhsulları və ya xətti dsDNA) təqdim etmək (inyeksiya) üçün bir üsul kimi Elektroporasiyadan istifadə edir. Kimyəvi üsuldan istifadə edə bilərəmmi (CalCl2 + PEG) və əvəzinə istilik şoku üsulu ?


Lambda qırmızı rekombinasiyası nadir bir hadisə olduğundan yaxşı bir transformasiya səmərəliliyinə sahib olmaq istəyirsiniz, buna görə də elektroporasiya ən yaxşı seçiminiz olardı. Həmçinin rekombinasiya sisteminin ifadəsi adətən 42º-də böyüyən bakteriyalara ehtiyac duyduğundan, ehtimal ki, kimyəvi üsulla rekombinasiya mexanizminin ifadəsini maneə törədəcəksiniz.


Biotexnologiyada Tətbiqlər üçün Gen Redaktəsi Metodlarının Birləşdirilməsi

2012-ci ildə bakterial ifadə sistemləri anlayışı ilə praktiki şəraitdə rastlaşdım Escherichia coli (E.coli) orqanizmlər Sidney 1 Universitetinin Biokimya Departamentində rekombinant insan tropoelastinini istehsal etmək üçün istifadə edilmişdir. Sintetik zülal tropoelastin, təbii olaraq hüceyrədənkənar matrisdə (ECM) 2 mövcud olan elastin zülalının xəbərçisidir, sonradan biomateriallarla 3,4 biomühəndislik tətbiqləri üçün istifadə olunur. Rekombinasiya, əsasən canlılarda istifadə olunan genom mühəndisliyi üsuludur E.coli bakteriyalar, metabolik mühəndislik və geniş spektrli biokimyəvi maddələrin istehsalı üçün bakterial xromosomun asan manipulyasiyasına imkan verir 5 . Sistem biologiyasının, sintetik biologiyanın və təkamül mühəndisliyinin inteqrasiyası geniş şəkildə genetik alətlərin və protokolların səmərəli, qənaətcil manipulyasiyası üçün imkan yaratdı. E.coli tədqiqat və sənaye tətbiqlərində 6. Rekombinasiya protokollarını yerinə yetirmək üçün molekulyar və mikrob üsulları haqqında əsas bilik tələb olunur. Bu, gen redaktəsinin cari irəliləyişləri və onun sintetik biologiyada tətbiqləri haqqında xülasədir.

Sintetik biologiyanın yeni dövrü

Hazırda sürətlə inkişaf edən gen texnologiyalarının artan qlobal problemlərin həllində mühüm rol oynaması gözlənilir. Genetik mühəndislik məhdudlaşdırıcı fermentlərin kəşfindən sonra son 30 ildə molekulyar biologiyada tədqiqatlarda inqilab etdi 7 . Məhdudiyyət fermentləri, DNT-ni müəyyən bir yerdə kəsən və redaktə məqsədləri üçün xarici DNT-ni daxil etmək üçün boşluq yaradan molekulyar qayçı kimi genomik tədqiqatlarda mühüm vasitədir. 1970-ci illərdə tətbiq edilən rekombinant DNT texnologiyası xarici genləri daxil etmək üçün bir yol yaratdı. E.coli gen ifadəsi və rekombinant zülal istehsalı üçün plazmidlər adlanan servis vektorları (molekulyar vasitə) vasitəsilə host hüceyrələri (Şəkil 1). Zülalların aşağı məhsuldarlığı, genlərin zərərli dozası və ev sahibi hüceyrələr üçün əhəmiyyətli metabolik yük, o cümlədən plazmid əsaslı tətbiqlərin daxili məhdudiyyətləri səbəbindən, yad genlər sonradan birbaşa olaraq hüceyrələrə inteqrasiya edildi. E.coli əvəzinə genom. Beləliklə, son on ildə gen mühəndisliyində bir çox irəliləyişlər dəyişdirilməklə başlandı in vitro (laboratoriyada) ilə rekombinant gen mühəndisliyi texnologiyası in vivo (orqanizmdə) daha dəqiq, sürətli və praktiki olaraq səmərəli nəticələr üçün rekombinasiya texnologiyası 8 . Əsas odur ki, in vivo rekombinasiya texnologiyası klassik gen mühəndisliyinin mühüm komponenti olan məhdudlaşdırıcı fermentlərə və ya DNT liqazalarına ehtiyac duymur 9 .

Şəkil 1: .Maraqlanan DNT fraqmentini kəsmək və plazmid "vektorlarına" liqazlarla yapışdırmaq üçün məhdudlaşdırıcı fermentlərdən istifadə etməklə. 1970-ci illərin əvvəllərində təqdim edilən qabaqcıl iş hələ də geniş istifadə olunan yanaşmadır (AbFrontier-dən Şəkil).

Rekombinasiya

1998-ci ildə yarandığı gündən bəri rekombinerinq və ya rekombinogen mühəndislik orqanizmdə bakterial xromosomun birbaşa mühəndisliyinə imkan verdi (in vivo) homoloji rekombinasiya ilə 9,10. Homoloji rekombinasiya DNT seqmentlərinin iki DNT molekulu arasında eyni ardıcıllığın bölgələri vasitəsilə dəyişdirilməsi prosesidir, nəticədə genetik materialın yeni kombinasiyası 7 olur. kimi bakteriyalar E.coli, öz homoloji rekombinasiya sistemlərini kodlayır, bakteriyalarda məskunlaşan viruslar (və ya faqlar) isə öz rekombinasiya funksiyalarını daşıyır və bu iki sistem bir-biri ilə və ya bir-birindən asılı olmayaraq işləyə bilir 11 . Biotexnologiya DNT mühəndisliyi üçün homoloji rekombinasiyadan istifadə etmək üçün bakteriyaların tərkibindəki bu cür faj zülallarından istifadə etmişdir. E.coli, beləliklə, seçilmiş DNT bölgəsinin məhdudlaşdırıcı fermentlər və ya əvvəlcədən təcrid olunmadan mürəkkəb qarışıqdan klonlanmasını təmin edir 11,12. Ən məşhur faj sistemləri (bakteriyalarda yaşayan virus sistemləri) bəzi bakteriyalarda mövcud olan bakteriofaq λ (lambda) homoloji rekombinasiya sisteminə əsaslanan RAC prophage və lambda Red tərəfindən kodlanmış genlərə əsaslanan RecET kimi tanınır. E.coli suşlar 13.

Rekombinasiya üçün istifadə edilən donor DNT-nin seqmentləri ya xətti cüt zəncirli DNT (dsDNA) və ya sintetik tək zəncirli oliqonukleotidlər (ssDNA oliqos) 13 ola bilər, müxtəlif yanaşmalarda (tək əsaslı dəyişikliklər, kiçik silmələr, böyük silmələr yaratmaq üçün) səmərəli istifadə olunur. kiçik əlavələr) və mühəndis DNT E.coli 9 . İstənilən dəyişikliyə malik xətti donor DNT substratı rekombinasiya funksiyalarını ifadə etmək üçün bakteriya ştammlarına elektroporasiya yolu ilə daxil edilə bilər, müəyyən müddət ərzində bərpa olunmağa icazə verilir və rekombinant koloniyaları müəyyən etmək üçün yoxlanılır 5,8. Faj əsaslı rekombinasiya sistemi xətti DNT ilə faj λ, bakterial xromosomlar, plazmidlər və bakterial süni xromosomlar (BACS) kimi replikon arasında homoloji rekombinasiyanı kataliz edə bilər. 9. Tədqiqatçılar molekulyar biologiyada bir neçə fərqli, geniş protokol əsasında istənilən konstruksiyanı əldə etmək üçün ən uyğun rekombinasiya yolunu strateji olaraq planlaşdırırlar 8 . Klassik gen mühəndisliyi ilə müqayisədə xətti donor DNT substratı və replikon (BAC) arasında redaktə prosesi nisbətən az əmək tutumlu və rekombinasiya yolu ilə daha səmərəlidir (Şəkil 2).

Şəkil 2: BAC klonlarının dəyişdirilməsi E.coli. a) Ənənəvi gen mühəndisliyində klassik homoloji rekombinasiya üçün DNT fraqmentləri məhdudlaşdırıcı fermentlər və DNT liqazından istifadə edərək kəsilir və yenidən birləşdirilir. b) ənənəvi yanaşma ilə bağlı problemlər rekombinasiya texnologiyasında faj vasitəçiliyi ilə rekombinasiyanın istifadəsi ilə aradan qaldırıldı (istinad 12-dən Şəkil).

Lambda Red Recombineering in Escherichia coli

Bakterial sistemlərə daxil edilən xətti DNT normal olaraq bakterial nukleaza fermentləri 7 tərəfindən deqradasiyaya meyllidir. Son onillikdə lambda Qırmızı rekombinasiyasından xromosomlarda dəqiq müəyyən edilmiş dəyişikliklər üçün güclü bir texnika kimi istifadə edilmişdir. E.coli 10. Üç fajdan əldə edilən lambda Qırmızı zülalları: Gam, Exo və Beta dsDNT rekombinasiyasını tamamlamaq üçün lazımdır. E.coli nükleazlar, Exo tək zəncirli DNT (ssDNA) yaratmaq üçün dsDNT-ni parçalayır və Beta bağlanması rekombinasiyanı asanlaşdırır (Şəkil 3). İstənilən quruluşun üç lambda Qırmızı zülalının iştirakı ilə xromosomla necə rekombinasiya olunduğuna dair dəqiq mexanizm çox müzakirə olunur 14. Bundan əlavə, λ Qırmızı DNT əsaslı mühəndislik birbaşa elektroporasiya ilə bir addımda multipleksləşdirməyə (ardıcıl redaktə) imkan verən yeganə üsuldur və bununla da Multipleks Avtomatlaşdırılmış Genom Mühəndisliyi (MAGE) 13 üçün redaktə vasitəsi kimi geniş istifadə olunur.

Şəkil 3: Rekombinasiya üçün istifadə olunan bakteriofaq λ qırmızı rekombinasiya sisteminə ümumi baxış. 1) Ekzo zülal xətti DNT-də 3' çıxıntı yaradan ekzonükleaza aktivliyinə (5'-dən 3'ə qədər) malikdir. 2) Beta tək zəncirli DNT-ni (3' çıxıntılar) bağlayır, ss-tavlamasını təşviq edir və rekombinant DNT yaradır. 3) Əlavə bir protein Gam (burada göstərilməyib) qarşısını alır E.coli dsDNA rekombinasiyası üçün tələb olunan ikiqat zəncirli xətti DNT fraqmentlərinin parçalanmasından fermentlər (İstinad 5-dən Şəkil).

CRISPR/Cas9 sistemini Lambda Red Recombineering ilə birləşdirin E.coli

Daxil edilmiş yeni texnikalara baxmayaraq, bu cür bakterial ifadə sistemləri ilə gen və zülal məhsuldarlığı kiçik/əhəmiyyətsiz olaraq qalır, bu da metabolik mühəndislik və sistem biologiyasında darboğaza səbəb olur. Məsələn, qısa ssDNA/dsDNA oliqonukleotid vasitəçiliyi ilə rekombinasiyanın effektivliyi qısa genom modifikasiyaları üçün ən yüksəkdir, daha böyük modifikasiyalar isə əhəmiyyətli dərəcədə aşağı tezlikdə baş verir (<1%) 15, polimeraza zəncirvari reaksiya (PCR, molekulyar biologiyada oliqonukleotid gücləndirmə texnikası) vasitəsilə skrininq tələb edir. aydın fenotipik dəyişikliklə nəticələnməyən arzu olunan mutasiyaları müəyyən etmək 15 . Bundan əlavə, rekombinant klonları seçmək üçün rekombinasiya üsulları antibiotik markerlərinin genə daxil edilməsinə əsaslanır ki, bu da sonrakı modifikasiyalardan əvvəl çıxarılmalı və bununla da genomda çapıqlar əmələ gəlir. Çapıqlar, bir neçə raund modifikasiyadan sonra genomun yenidən qurulmasını təşviq edərək, ştammı daha da inkişaf etdirməyi çətinləşdirir. Eukaryotlar, Prokaryotlar, ali bitkilər də daxil olmaqla müxtəlif orqanizmlərin genlərini redaktə etmək qabiliyyətinə malik olan müntəzəm interspased qısa palindromik təkrar (CRISPR)/Cas9 sistemi ilə qruplaşdırılmış molekulyar biologiyada hazırda güclü alətlə lambda qırmızı rekombinasiyasını birləşdirməklə bu məhdudiyyətləri aradan qaldırmaq olar. və hətta insan hüceyrə xətləri 13,15 . Funksiyasına görə, Cas 9 proqramlaşdırıla bilən bir nüvədir, istənilən mutasiyanı əldən verən demək olar ki, hər hansı bir hədəf DNT lokusunda küt cüt zəncirli qırılmaya (DSB) vasitəçilik edə bilər və DSB öldürücü olduğundan, bu, ümumi hüceyrə ölümü ilə nəticələnəcək və bununla da daha yaxşı seçim rolunu oynayacaq. / vəhşi tipə (mutant olmayan hüceyrələrə) qarşı homoloji rekombinasiya yolu ilə yaradılan nəzərdə tutulan modifikasiyaya malik hüceyrələr üçün skrininq proseduru 13 . CRISPR/Cas9-birləşdirilmiş rekombinasiya buna görə də seçim üçün antibiotik markerinə etibar etmədiyindən, bu gen əvəzedici mutantlar ideal olaraq “çapıqsız” olurlar 15 . Proses həm də əvvəlki protokollara nisbətən daha qısa müddətdə həyata keçirilir.

2016-cı ildə CRMAGE 15 kimi tanınan birləşmiş CRISPR/Cas9 və λ Red rekombinasiyaya əsaslanan MAGE texnologiyası üçün avtomatlaşdırmanı (MAGE) inteqrasiya etmək üçün texnologiya bir addım daha irəli getdi. Bu sistem, gündə birdən çox mühəndislik raundları üçün oxşar effektivliyə malik rekombinasiyanın bir raundunda ən azı iki mutasiyanın tətbiqini təmin etmək üçün multipleksləşdirilə bilər 15 . CRMAGE rekombinasiyasının tək raundunda alimlər bir nöqtəli mutasiya üçün 98%-ə yaxın effektivliyə nail ola bildilər ki, bu da ənənəvi MAGE-dən istifadə etməklə əvvəlki 5%-lik effektivliklə müqayisədə misli görünməmişdir. Tədqiqat daha sonra göstərdi ki, zülalların tərcüməsini nisbətən yüksək tezlikli (6%-dən 70%-ə qədər), həmçinin hüceyrə populyasiyasında modulyasiya etmək mümkündür 15 . İstənilən tənzimləyici element bununla da gen ifadəsini və ya protein tərcüməsini modulyasiya etmək üçün daxil edilə bilər. Texniki cəhətdən hətta rekombinasiyadan sonra bütün CRMAGE redaktə sistemini bakteriya populyasiyasından çıxarmaqla təmiz, yekun rekombinant ştammı əldə etmək mümkündür 15 . Redaktə üçün dizayn prosesini sürətləndirmək üçün tədqiqat qrupu redaktə prosesində istifadə üçün oliqonukleotidləri proqnozlaşdıra bilən veb əsaslı aləti asanlaşdırdı. CRMAGE texnikası bir iş günü ərzində bir sikldə və birdən çox sikldə çoxlu mutasiyaların yaranmasına imkan verəcək ki, bu da genomun mühəndisləşdirilməsinin gündəlik imkanlarını əhəmiyyətli dərəcədə artırır. E.coli və biotexnologiyada potensial yüksək məhsuldarlıq, tədqiqat və sənaye tətbiqləri üçün digər bakterial suşlar.

Poster Şəkli: Skrinşot - 'Genetik modifikasiya nədir?' Royal Society animasiya videosu, YouTube vasitəsilə mövcuddur.


Mini-lambda: xromosom və BAC mühəndisliyi üçün sürülə bilən sistem

Qırmızı bakteriofaq lambda (lambda) rekombinasiya sistemi P1-ə klonlaşdırılmış böyük DNT fraqmentlərinin və bakterial süni xromosomların (BAC və ya PAC) vektorlarının mühəndisliyi üçün istifadə edilmişdir. İndiyə qədər bu rekombinasiya sistemi BAC və ya PAC klonlarını qüsurlu lambda profajını saxlayan bakteriya hüceyrələrinə köçürməklə istifadə edilmişdir. Burada biz Qırmızı rekombinasiya funksiyalarını təmin edə bilən və DH10B daşıyan BAC və ya PAC daxil olmaqla istənilən E. coli ştamına elektroporasiya yolu ilə asanlıqla daxil edilə bilən mini-lambda DNT-nin nəslini təsvir edirik. Mini-lambda DNT qüsurlu profaq kimi bakteriya xromosomuna inteqrasiya edir. Bundan əlavə, əlavə yerləri saxladığından, faj DNT-nin hüceyrələrini müalicə etmək üçün çıxarıla bilər. Biz burada BAC klonunun vektor ardıcıllığına seçilə bilən marker daxil etməklə BAC modifikasiyası üçün mini-lambda rekombinasiya sisteminin istifadəsini təsvir edirik. Bundan əlavə, mini-lambdadan istifadə edərək, heç bir seçilə bilən markerdən istifadə etmədən BAC-da klonlanmış insan BRCA2 genində tək səhv mutasiya yaradırıq. Rekombinantlar yaratmaq qabiliyyəti çox səmərəli şəkildə mini-lambdanın homoloji rekombinasiya ilə in vivo genom mühəndisliyi üçün çox sadə mobil sistem kimi faydalılığını nümayiş etdirir, bu proses rekombinasiya adlanır.


Nəticələr və Müzakirə

Qırmızı rekombinaz üsullarının modifikasiyası

Datsenko və Wanner [20] tərəfindən təsvir olunan protokoldan istifadə edərək rekombinant profaqlar yaratmaq üçün ilk cəhdlərimiz uğursuz oldu. Bir neçə sınaqdan sonra protokola dəyişiklik etmək qərarına gəldik. Dəyişikliklər bu metodologiyadan induksiya olunan Şiqa toksinini çevirən profaqları daşıyan suşlarımızın xüsusi xüsusiyyətləri ilə istifadə etməyə imkan verdi.

Ən bariz çatışmazlıq proses zamanı faqın litik dövrünün spontan aktivləşməsi idi. Bu təsdiq əvvəlki induksiya olmadan (məlumatlar göstərilmir) bakterial kulturaların supernatantlarından fag DNT-nin təcrid olunması ilə dəstəklənir. Bu, rekombinant klon əmələ gəlməsinin effektivliyini əhəmiyyətli dərəcədə azaldan profage eksizyonunu və/yaxud fagın sərbəst buraxılmasını artırdı. Bu uğursuzluğun iki mümkün səbəbi nəzərdən keçirildi. Ola bilsin ki, profaq DNT-nin bakterial DNT-dən çıxarılması faj hissəciklərinin əmələ gəlməsi olmadan baş verib. Bu halda hədəf gen (stx) gücləndiricinin yenidən birləşməli olduğu yer itiriləcək, beləliklə düzgün rekombinasiyaya mane olacaq. Alternativ olaraq, kəsildikdən sonra faj hissəcikləri əmələ gəlir və lizis yolu ilə hüceyrələrdən buraxılır. Bu halda, bakteriya hüceyrələrinin əhəmiyyətli bir hissəsi parçalanaraq transformasiyaya həssas hüceyrələrin sayını azaldar. Bu ssenarilərin hər ikisi rekombinant klonların əldə edilməsinin effektivliyinin azalmasına gətirib çıxaracaq. Birinci səbəb yoxlanıla bilmədi, lakin ikincisi eksperimental olaraq OD-nin orta dərəcədə azalması ilə təsdiqləndi.600 OD ilə müqayisədə proses zamanı lizogenlərin kulturalarında müşahidə edilmişdir600 of E. coli Nəzarət kimi istifadə olunan C600 və ya DH5α mədəniyyətləri (qeyri-lizogenlər).

Litik dövrün kortəbii induksiyası SOS cavabını aktivləşdirəcək bir neçə səbəbə görə ola bilər. Məsələn, bakterial hüceyrədə stress reaksiyasını aktivləşdirə bilən elektrokompetent hüceyrələrin hazırlanması üçün protokolun ikiqat tətbiqi (ilk növbədə pKD46 plazmidini çevirmək və ikincisi PCR gücləndiricisini çevirmək üçün). Hər halda, tətbiqimizi optimallaşdırmaq üçün orijinal protokolun bir neçə modifikasiyasını təhlil etdik. Hər bir addımın bu dəyişiklikləri və əldə edilən nəticələr bu bölmədə təsvir edilmişdir.

Mövcudluğunun təsdiqi stx pKD46 vektor transformasiyasından sonra genlər

Transformasiya protokolumuzun effektivliyini qiymətləndirmək üçün metodun ilk addımında pKD46 köməkçi plazmidinin çevrilməsinin effektivliyini araşdırdıq. Nəzarət kimi vektor pBC-SK istifadə edilmişdir. Vektor pKD46, pBC-SK ilə müqayisədə daha aşağı transformasiya effektivliyini təqdim etdi. Transformasiya edilmiş koloniyaların sayı pBC-SK ilə orta hesabla 6-10 dəfə çox idi. Bu nəticələr pKD46-nın temperatura həssas replikasiya mənşəli olması və yalnız 30°C-də təkrarlanması ilə əlaqədar ola bilər. Buna görə də pKD46 ilə transformasiya olunmuş hüceyrələrin böyümə sürəti pBC-SK ilə transformasiya olunmuş və 37°C-də böyümüş hüceyrələrdən daha aşağıdır.

Bu gözlənilən nəticələrə əlavə olaraq, pKD46 vektorunun tətbiqi ilə itki yarandı stx 2bəzi lizogenlərdə gen. Bu, təhlil edilən koloniyaların yüksək nisbətində müşahidə edilmişdir (Cədvəl 1). Belə lizogenlərdə gen itkisi faizi əhəmiyyətli dərəcədə yüksək idi (t-Tələbə, səh < 0,05) faizindən çoxdur stx 2vektor pBC-SK ilə transformasiyadan sonra transformasiya edilmiş hüceyrələrdə gen itkisi, nəzarət kimi istifadə olunur (Cədvəl 1). Yalnız C600(933W) və C600(A9) lizogenləri C600 ştammı ilə əldə edilən lizogenlərin daha yüksək sabitliyini təklif edə biləcək hər hansı gen itkisi göstərməmişdir.

ildən stx 2genin protokolla davam etməsi, vektorun varlığı və stx 2seçilmiş klonlarda gen müvafiq ilə ikiqat hibridləşmə ilə təsdiq edilmişdir stx və Qırmızı rekombinaz zondları. Yalnız pKD46 və olan klonlar stx 2genin antibiotik genini ehtiva edən gücləndiricinin çevrilməsi üçün növbəti addımlarda istifadə oluna biləcəyi müşahidə edildi.

Digər faj ardıcıllıqları, məsələn rho müstəqil terminator, the cI gen və ya Q Tədqiq olunan faqlarda mövcud olan genlər də olmayan koloniyalarda yox idi. stx 2gen (məlumatlar göstərilmir). Bu, ev sahibi hüceyrədən bütün profaq DNT-nin çıxarılmasının baş verdiyini göstərir. Lakin bu işin məqsədi bu olmadığı üçün əlavə araşdırmalar aparılmamışdır.

İtki ilə bağlı heç bir izahat yoxdur stx pKD46 ilə transformasiya olunmuş hüceyrələrin yüksək faizində gen. Şərtlər bütün lizogenlər üçün eyni idi və bəziləri itirmədi stx. Mümkün bir fərziyyə ondan ibarətdir ki, Qırmızı rekombinaz sisteminin mövcudluğu virus meydana gəlmədən və sonrakı hüceyrə lizisi olmadan bəzi lizogenlərin bakterial genomundan müəyyən profaqların eksizyonunu artıra bilər.

Gücləndiricinin konstruksiyası

Protokolda edilən ən mühüm dəyişikliklərdən biri PCR gücləndiricisinin qurulması idi. Təcrübələrin ilk dəstində hər 36 bp və 40 bp uzatma ardıcıllığını (qısa homoloji qollar) ehtiva edən müqavimət markerini gücləndirmək üçün iki primer dəstindən istifadə etdik. stx genlər (Cədvəl 2). Bu paylaşılan ardıcıllığın Qırmızı rekombinaz sistemi ilə effektiv olacağı gözlənilirdi. Primerlər rekombinant faqlara daxil edilə bilən Tc gücləndiricisi və Cm gücləndiricisi əldə etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur. Bununla belə, bu primerlərdən istifadə etməklə lizogenlərimizin heç bir antibiotikə davamlı transformantları əldə edilməmişdir. Buna görə də onlar eksperimental prosedurdan kənarlaşdırılıblar.

Yuxarıda təsvir olunan primerlərdən istifadə edərkən Tc-yə davamlı transformantların mövcudluğu yalnız bir neçə dəfə müşahidə edilmişdir. Lakin Tc kasetinin içərisində yox idi stx 2gen, lakin bakterial xromosomun başqa bir yerində, baxmayaraq ki, antibiotik kasetlərinin şablonları kimi istifadə edilən bütün plazmidlərin orijinal protokolda təklif edildiyi kimi səhv inteqrasiyalardan qaçınmaq üçün şərti replikonları var idi. Gücləndiricilərin həzm edilməsi DpnI Bu problemi azaltmaq üçün nəticələri yaxşılaşdırmadı. Rekombinasiya üçün qısa homoloji ardıcıllığın (36-40 bp) istifadəsi səhv rekombinasiya hadisələrinin və ya rekombinasiyaların olmamasının səbəbi ola bilər. Bu səbəbdən rekombinazanın hərəkət edə bildiyi homoloji bölgələrin uzunluğu artırıldı. Bu məqsədlə 3S-PCR protokoluna əsaslanan yeni strategiya [29] gücləndirici ilə paylaşılan homoloji bölgənin uzunluğunu artırmaq üçün istifadə edilmişdir. stx 2gen.

Qeyri-adi rekombinasiya hadisələrini izah etmək çətindir. Ehtimal ki, mövcudluğu stx Bəzilərinə müxtəlif rekombinaz genləri daxil ola bilən lambdoid profaqlar homoloji olmayan rekombinasiyanı bir şəkildə gücləndirə bilər. Bu, antibiotik müqavimət kasetinin hədəf gendən kənarda gözlənilməz yerlərə daxil edilməsinə gətirib çıxaracaq. Əslində, bir neçə ardıcıllıqla E. coli genomlar oxşar ardıcıllıq homologiyası ilə faq mənşəli çoxsaylı inteqralların [30] geniş yayılmasını aşkar etmişdir. Bunlar digər müəlliflər tərəfindən də təsvir edilən müşahidələrimizi izah etməyə kömək edə bilər [31].

Uzunluğunu artırmaq üçün stx 2Antibiotik müqavimət kasetinin yuxarı və aşağı axınında homoloji bölgə, üç fərqli fraqment arasında üst-üstə düşən bölgələrdən istifadə etməklə yeni gücləndiricilər yaradılmışdır: 3' fraqmenti, tərkibində stx 2homologiya antibiotik müqavimət kaset və 5' kaset, həmçinin ehtiva edir stx 2homologiya (Şəkil 1). Bəzi gücləndiricilər, məsələn, ehtiva edən tet, eyni PCR reaksiyasında şablonlar kimi eyni vaxtda üç fraqmentdən istifadə etməklə birbaşa əldə edilmişdir. üçün pişik, antibiotik kasetinə birləşdirilən 3'-fraqment birinci PCR reaksiyasında gücləndirildi və ikincisində antibiotik kaseti 5' fraqmentinə birləşdirildi. Sonra üçüncü PCR reaksiyasında tam gücləndirici əldə etmək üçün hər iki fraqment birlikdə istifadə edildi.

ehtiva edən gücləndiricilərin qurulması üçün istifadə olunan protokolun sxemi stx antibiotik müqavimət geni ilə əvəzlənmiş gen. Şəkildə istifadə olunan protokol göstərilir pişik gen nümunə kimi.

Antibiotik kasetlərini daşıyan gücləndiricidə daha uzun homoloji bölgələrin (hər tərəfdən 280 bp) istifadəsi yalançı rekombinantlar problemini mütləq həll etdi (Cədvəl 2). Yuxarıda qeyd olunan tətbiqdə (29), homologiyanın daha uzun bölgələrinin istifadəsinin rasional olması qeyri-adekvatlarda arzu olunan allel mübadiləsinə gətirib çıxaran ikiqat rekombinasiya hadisəsi ehtimalını artırmaq idi.E. coli K-12 bakteriyaları. Bu, müəlliflər tərəfindən izah edildi, çünki lambda-qırmızı funksiyalar uzaqdan əlaqəli bakteriyalarda DNT deqradasiyasının qarşısını almaqda daha az effektiv oldu. E. coli. Beləliklə, homologiyanın daha uzun bölgələri səmərəliliyi artırdı. Baxmayaraq ki, tətbiqimiz bir istifadə edərək həyata keçirildi E. coli K-12 törəməsi, gərginlik DH5α, uzun qolların eyni strategiyası məqsədlərimizə uyğun görünür.

Transformasiya ediləcək gücləndiricinin miqdarı da qiymətləndirilmiş və nəhayət, 0,5 μg gücləndirilmiş DNT-də müəyyən edilmişdir (Cədvəl 2). Orijinal protokolda 10-100 ng gücləndirilmiş DNT müəyyən edilmişdir [20]. Bununla belə, əlimizdə və orijinal protokolda təsvir ediləndən daha uzun bir gücləndirici istifadə etdikdə, daha yüksək konsentrasiyalar lazım idi.

Gücləndiricinin çevrilməsi

Əvvəlcə biz Datsenko və Wanner [20] tərəfindən təsvir edildiyi kimi ampisilin və 10 mM L-arabinoza ilə 5 ml SOB kulturalarından istifadə etdik. Bununla belə, rekombinant klonlar əldə edilməmişdir. Ardıcıl cəhdlərdə lizogen hüceyrələr (pKD46+, stx 2 + ) 10, 25 və nəhayət 50 ml kultura həcmlərində elektrokompetent hüceyrələri hazırlamaq üçün istifadə edilmişdir (Cədvəl 2). 50 ml mədəniyyətdən hazırlanmış elektrokompetent hüceyrələr nəhayət rekombinant klonları əldə etmək üçün istifadə edilmişdir. Bu problem Datsenko və Wanner [20] tərəfindən təsvir edilən yanaşmada tətbiq edilmədi, lakin bizim yanaşmamızda bir neçə rekombinant koloniya əldə etmək lazım idi. Bu, bizim mədəniyyətlərimizdə hüceyrələrin ilkin sayının, ehtimal ki, elektrokompetent hüceyrələrin hazırlanması protokolu zamanı faj lizizinin aktivləşdirilməsi və ya mədəniyyət mühitində antibiotikin olması ilə azaldığına dair fərziyyəmizi təsdiqlədi. Buna görə də, tək rekombinant koloniya əldə etmək üçün lazım olan ilkin mədəniyyətdə hüceyrələrin minimal sayı 2,5 × 10 10 CFU/ml idi.

L-arabinozun müxtəlif konsentrasiyaları da sınaqdan keçirilmişdir. Optimal şəraitdə, müxtəlif miqdarda arabinoza istifadə edərkən təcrübələrimizdə əhəmiyyətli fərqlər müşahidə edilməmişdir. Biz 1 mM (orijinal protokolda göstərilmişdir), 10 mM və 0,1 M L-arabinozu təhlil etdik. Bütün hallarda rekombinant klonlar əldə edilmişdir. Bununla belə, ən çox sayda klon 0,1 M arabinoza ilə əldə edilmişdir (Cədvəl 2). Bu nəticələr göstərir ki, sınaqdan keçirilmiş konsentrasiyaların hamısı γβ ifadəsini yaratmaq üçün lazım olan diapazon daxilində olubexo transformasiya olunmuş hüceyrələrin nisbətində gen sistemi. Bu, arabinoza konsentrasiyalarından asılı olan və “P-nin hamı və ya heç biri induksiyası” kimi təsvir edilən sistemdə tələb olunur.PİS" [32].

Gücləndirici transformasiya edildikdən sonra hüceyrələr 1 ml SOC mühitində bərpa edildi və örtükdən əvvəl 37°C-də (orijinal metodda təklif edildiyi kimi) və ya 30°C-də 1-3 saat inkubasiya edildi. Rekombinantları əldə etmək üçün üç saatlıq inkubasiya tələb olundu. Baxmayaraq ki, pKD46 temperatura həssas vektor olmalı və 30°C-dən yuxarı təkrarlana bilməsə də, vektor tərəfindən kodlanmış zülallar yenə də rekombinasiyanı gücləndirən səlahiyyətli hüceyrələrdə aktiv ola bilər. Müxtəlif temperaturlarda inkubasiyadan əldə edilən klonların sayında böyük fərqlər olmamışdır (Cədvəl 2), baxmayaraq ki, 37°C-də daha çox koloniya əldə edilmişdir. Əslində, 37 ° C-də inkubasiya daha çox hüceyrə istehsal edərək böyümə sürətini artırdı.

Kaplama mediası

Seçici mühit kimi tərkibində Tc və Cm olan LB agar plitələrindən istifadə edilmişdir. Datsenko və Wanner [20] Cm və Km üçün 25 μg/ml istifadə etməyi təklif etdilər. Əvvəlcə biz rekombinantların bərpası üçün 20 μg/ml Tc və ya 20 μg/ml Cm konsentrasiyalarını sınaqdan keçirdik. Bununla belə, Cm və ya Tc plitələrində heç bir rekombinant müşahidə edilməmişdir (Cədvəl 2). Seçici mühitdə daha aşağı antibiotik konsentrasiyalarından istifadə edərkən müsbət nəticələr əldə edilmişdir. Buna görə də, 5 μg/ml Tc və ya 5 μg/ml Cm olan LB lövhələri nəhayət rekombinantların bərpası üçün istifadə edilmişdir. Kaplamadan sonra koloniyaları görmək üçün 24 saat inkubasiya kifayət etdi. Daha sonra koloniyalar daha yüksək antibiotik konsentrasiyası (Tc: 20 μg/ml və Cm: 20 μg/ml) olan yeni LB agar plitələrinə köçürüldü. Beləliklə, rekombinant faqları daşıyan lizogenlər gözlənilən antibiotik konsentrasiyalarında dərhal böyümədi, ola bilsin ki, bakterial hüceyrələrin prosesdən sonra bərpası lazım olduğu və birbaşa yüksək antibiotik konsentrasiyalarına məruz qaldıqda zədələnmişdir.

Vektorun itirilməsi, əvvəllər təsvir edildiyi kimi, ardıcıl subkulturalardan və ampisilin seçimi olmadan 43°C-də inkubasiyadan sonra əldə edilmişdir [20]. Plazmidin itirilməsi pKD46 vektoru üçün Cədvəl 1-də təsvir edilən primerlərdən istifadə etməklə, PCR gücləndiricisinin yoxluğunu müşahidə etməklə təsdiq edilmişdir.

Cədvəl 2 müxtəlif modifikasiyalardan və müəyyən edilmiş son şərtlərdən istifadə edərək iki bakteriofaqla əldə edilmiş rekombinant klonların sayı protokolumuzda təhlil edilmiş bütün variasiyaları ümumiləşdirir.

Rekombinant faqlar

The tetpişik genlər təqdim edildi stx 2profaqların geni: ØA9, ØA312, ØA534, ØA549, ØA557, ØVTB55 və 933W. Genlər 251 bp mövqeyinə yerləşdirildi stx 2-A alt birimi və 264 bp yuxarı axın sonunda stx 2-B alt vahid. Hər bir rekombinant profaqda müvafiq genin identifikasiyası və səciyyələndirilməsi PCR və ardıcıllıqla əldə edilmişdir.

induksiyası stx 2-altı rekombinant lizogendən olan faqlar orijinal lizogenlərdən bir qədər fərqli kinetik xüsusiyyətlərə malikdir. Buna baxmayaraq, bütün rekombinant lizogenlər antibiotik müqavimət genini daxil etdikdən sonra litik qabiliyyətini qoruyub saxladılar. Daha əvvəl təsvir edildiyi kimi [33, 34], lövhələr tərəfindən istehsal edilmişdir stx-faqlar adətən zəif görünür və ya üst agar qatında bulanıq olur. Buna görə də, yoluxucu rekombinant faqların mövcudluğunun təsdiqi spesifik ilə lövhə ləkəsinin hibridləşdirilməsi ilə əldə edilmişdir. pişik və ya tet zondlar (məlumatlar göstərilmir).

Antibiotik seçimi olmadan dörd subkultura addımından sonra müşahidə edildiyi kimi, antibiotik müqavimət kasetinin faj genomu daxilində sabit qaldığı görünür. Bununla belə, antibiotik seçimi olmadan fag genomunda marker geninin uzunmüddətli sabitliyi hələ də aydınlaşdırılmalıdır.

Rekombinant keçiricilər

Rekombinant faqların yenilərini yoluxdurmaq və çevirmək qabiliyyətini qiymətləndirmək E. coli ştammlar, rekombinant faqların suspenziyaları hazırlanmışdır. Transmissiya E. coli DH5α və E. coli C600 yerinə yetirildi. Bütün faqlar DH5α və ya C600-də müvafiq antibiotikə qarşı müqavimət göstərən yeni transduktantlar istehsal etdi. Ev sahibi ştammda rekombinant profaqların olması PCR və lövhə hibridizasiyası analizi ilə təsdiq edilmişdir (Şəkil 2).

A) Alınan keçiricilərin sayı (CFU/ml). E. coli DH5α və E. coli Hər rekombinant faq daşıyan C600 təxminən t və ya tet antibiotik müqavimət genləri. B) müvafiq antibiotik müqavimət kasetinə malik stx-profaq daşıyan hər bir rekombinant koloniyanın PCR məhsulları. 1: stx gen nəzarəti, 2: pişik nəzarət, 3: tet nəzarət, 4-5: E. coli DH5α və E. coli C600 lizogenləri ilə stx-faglar::pişik. 6–7: E. coli DH5α və E. coli C600 lizogenləri ilə stx-faglar::tet-. 8 mənfi PCR nəzarəti C) Nümunə olaraq DH5α-nın koloniya ləkəsi (Ø557::tet) üçün xüsusi prob ilə hibridləşdirilmişdir tet gen.

Bəzi digər müəlliflər rekombinant istehsal etmişlər stx-müxtəlif məqsədlər üçün fajlar [9, 15, 16]. Schmidt və b. [9] bağırsaqları yoluxdurmaq və lizogenləşdirmək üçün φ3538 faqından istifadə etmişdir Escherichia coli ştammları və bu cür lizogenləşdirilmiş suşlardan yoluxucu nəsilləri inkişaf etdirmək. Allison və b., [15] iki genetik eyni Stx faqı ilə tək bir ev sahibinin eyni vaxtda yoluxmasının ilk bildirilmiş müşahidəsini göstərmək üçün rekombinant faqlardan istifadə etmişdir. Acheson və b., [16] bağırsaq yolu ilə ötürülməsinin öyrənilməsini asanlaşdırmaq üçün rekombinant Şiqa toksini 1-çevrən faq H-19B yaratmışdır. stx1-faqlar.

Bu işdə biz müxtəlif məqsədlər üçün istifadə etmək üçün iki antibiotik müqavimət geninə malik müxtəlif rekombinant faqlar yaratdıq. Bu faqların istifadəsi qida və ya su nümunələri kimi müxtəlif matrislərdə transduksiyanı təhlil etməyə imkan verəcəkdir. İnduksiyada artım yarada bilən bir üsul olaraq bildirilmiş yüksək temperatur və ya yüksək hidrostatik təzyiq (HHP) kimi qida və ya su prosedurları üçün tətbiq edilən müxtəlif proseslərdən sonra fag induksiyasını və ötürülməsini qiymətləndirmək də maraqlı olardı. müəyyən litik dövrünün stx-faglar [35].

Rekombinant faqlar da qabiliyyətini qiymətləndirmək üçün faydalı vasitələr olardı stx-su mühitində və ya insanlardan və heyvanlardan təcrid olunmuş suşlarda aparılan bəzi müşahidələrin göstərdiyi kimi, ikiqat lizogenlər yaratmaq və ikiqat lizogeniyanın STEC-də həqiqətən üstünlük təşkil edib-etmədiyini qiymətləndirmək üçün faglar [15, 33, 36, 37].


Lambda qırmızı rekombinasiyası və I-SceI parçalanması ilə Escherichia coli-də yüksək effektiv çapıqsız genetik modifikasiya.

Bakterial xromosomların genetik modifikasiyası həm fundamental, həm də tətbiqi tədqiqatlar üçün vacibdir. Bu işdə biz lambda Qırmızı (λ-Qırmızı) rekombinasiyası və I-SceI parçalanmasını əhatə edən iki plazmidli üsul olan Escherichia coli xromosomunun genetik modifikasiyası üçün səmərəli, istifadəsi asan bir sistem hazırladıq. Aralıq gərginlik, λ-Qırmızı PCR hədəfləməsindən istifadə edərək, müqavimət marker gen(lər)inin və hədəf gen lokusunda və ya yaxınlığında I-SceI tanınma sahələrinin inteqrasiyası ilə yaradılır. Aralıq ştam, λ-Qırmızı rekombinasiya və I-SceI endonükleaz üçün ikifunksiyalı köməkçi plazmid ilə birlikdə I-SceI tanınma yerləri ilə əhatə olunmuş istənilən modifikasiya ilə hədəf gen fraqmentini daşıyan donor plazmid ilə çevrilir. Xromosomun və donor plazmidinin I-SceI parçalanması xromosom qırılmaları və donor plazmidindən xətti cüt zəncirli DNT arasında λ-Qırmızı rekombinasiyasına imkan verir. Genetik modifikasiyalar xromosoma daxil edilir və I-SceI saytlarının yerləşdirilməsi rekombinasiyanın və modifikasiyanın xarakterini müəyyən edir. Bu üsul cadA nokautu, gdhA knock-in, pepD-nin problemsiz silinməsi, əsas metK geninin sahəyə yönəldilmiş mutagenezi və metK-nın Rickettsia S-adenosylmetionin daşıyıcı geni ilə əvəz edilməsi üçün uğurla istifadə edilmişdir. Bu effektiv üsul həm əsas, həm də vacib olmayan gen modifikasiyaları ilə istifadə edilə bilər və əsas və tətbiqi genetik tədqiqatlara fayda verəcəkdir.


MÜZAKİRƏ

MAGE, populyasiyada dizayn edilmiş mutasiyaların kombinator dəstlərini yaratmaq (4) və/yaxud yüzlərlə alleli tək bir suşda dəyişdirmək (5) üçün istifadə edilə bilən güclü texnikadır. Geniş genom redaktəsini asanlaşdırmaq üçün multileks genom mühəndisliyi üçün optimallaşdırılmış suşlar hazırlamışıq. Previously, we showed that converting a selectable allele in the vicinity of multiple non-selectable alleles enriches the candidate pool for highly modified clones (9). Additionally, we demonstrated that exonucleases are capable of degrading single-stranded MAGE oligos even when these oligos are protected using phosphorothioate bonds (Mosberg, J.A., Gregg, C.J., və b., in review). Inactivating ExoI, ExoVII, ExoX, RecJ and 㮾xo significantly enhanced multiplex AR frequencies (Mosberg, J.A., Gregg, C.J., və b., in review). This showed that intracellular MAGE oligos are a limiting factor in Redβ-mediated recombination. In the current work, we demonstrate that available ssDNA on the lagging strand of the replication fork is another limiting factor that can be increased by disrupting the interaction between DnaG primase and DnaB helicase on the replisome.

In order to increase ssDNA on the lagging strand of the replication fork, we introduced two known mutations in primase (DnaG)—K580A and Q576A. These mutations have been shown in vitro to increase OF size by interrupting the primase–helicase interaction on the replisome (13). Based on the measurements of Tougu və b. (13), we estimate that the K580A mutation increases OF length by 𢏁.5-fold and the Q576A mutation increases OF length by 𢏈-fold (Supplementary Table S2). EcNR2.dnaG.K580A and EcNR2.dnaG.Q576A exhibited significant increases in the mean number of alleles converted and decreases in the proportion of clones with zero non-selectable alleles converted. Furthermore, the strongest enhancement was observed in EcNR2. dnaG.Q576A (the variant with the longest OFs of the strains reported herein), with an intermediate enhancement observed in EcNR2.dnaG.K580A (the variant with intermediate-sized OFs). This relationship between recombination frequency and OF length further supports the model in which Redβ mediates annealing at the lagging strand of the replication fork (3,15,16,19), and our hypothesis that ssDNA on the lagging strand of the replication fork is a limiting factor during this process. With this in mind, we unsuccessfully attempted to generate a DnaG Q576A/K580A double mutant, suggesting that such an extensive manipulation of the DnaG C-terminal helicase interaction domain (24) was lethal.

Our results indicate that intracellular concentrations of MAGE oligos and the accessibility of their genomic targets are both limiting. To further increase the number of simultaneous mutations that can be generated by CoS-MAGE, it is helpful to understand whether the AR frequency is limited predominantly by the number of oligos that enter the cytoplasm, or whether kinetics are also relevant. Since a maximum of 9 ARs was observed for the 10-oligo sets compared to a maximum of just 12 ARs for the 20-oligo set, oligo uptake may be limiting. However, the fact that primase modulation—in addition to nuclease inactivation𠅎nhances AR frequency underscores the kinetic constraints regarding Redβ-mediated annealing. Each missed opportunity to anneal (i) increases the number of wt alleles in the population due to replication and (ii) decreases the number of MAGE oligos available, via dilution (cell division) and degradation (nucleases). Increasing the concentration of each reactant (i.e. intracellular oligos and accessible genomic targets) would increase the kinetics of annealing. Therefore, the number of intracellular oligos may limit the maximum number of possible mutations, but kinetics appear to be a significant force limiting the population-wide AR frequency average.

Interestingly, the nuclease-deficient Nuc5- strain (Mosberg, J.A., Gregg, C.J., və b., in review) performed statistically similarly to the EcNR2.dnaG.Q576A strain for Sets 1 and 2, whereas EcNR2.dnaG.Q576A strongly outperformed the nuclease-deficient strain for Set 3 ( Tables 1 and ​ and2 2 see also Mosberg, J.A., Gregg, C.J., və b., in review). While oligo design parameters such as type of designed mutation (4), oligo length (4), oligo secondary structure (4) and off-target genomic homology (5) are major determinants of AR frequency, our results highlight the relevance of genomic context. This has previously been difficult to demonstrate, but is apparent from the discrepancy in performance of the same oligo sets tested in our Nuc5- (Mosberg, J.A., Gregg, C.J., və b., in review), EcNR2.dnaG.Q576A, and Nuc5-.dnaG.Q576A strains. For example, different regions may have different replication fork speed or priming efficiency. These factors could locally modulate OF length, thus affecting Redβ-mediated AR frequency (although replication fork speed did not appear to be a major factor in vitro (13)). Therefore, increasing the region that must be replicated by a single OF may profoundly increase AR frequency for oligos targeting such regions. Alternatively, certain oligos may be more susceptible to nuclease degradation, so removing the responsible nucleases would disproportionately improve AR frequency for such oligos. With this in mind, we tested whether combining primase modification and nuclease removal would enhance MAGE performance more than either strategy used individually. Indeed, Nuc5-.dnaG.Q576A consistently performed the best ( Figures 3 and ​ and5) 5 ) of all tested strains. Therefore, the two disparate strategies can be combined for a larger and more robust MAGE enhancement.

To explore the extent to which OF localization impacts CoS-MAGE performance, we tested whether placing 10 oligos within a single putative OF would yield subpopulations of unmodified (few alleles converted) and ‘jackpot’ (most alleles converted) recombinants. However, CoS-MAGE using the densely clustered lacZ oligos ( Figure 4 ) produced a similar AR distribution to the ones observed for Sets 1𠄳 ( Figure 3 ), which target regions of the genome spanning several putative OFs. Since mutations within a single putative OF behaved similarly to mutations spread across many OFs, nascent OF placement does not appear to be a critical determinant of multiplex AR frequency. A number of hypotheses could explain why the expected ‘jackpots’ are not observed. Most likely, MAGE oligos are limiting due to degradation and/or lack of uptake. Thus, it is possible that most cells lack some of the oligos necessary for generating a majority of the desired mutations. Additionally, OF extension may occur too fast for all of the MAGE oligos to anneal before the OF occludes their targets. Still another explanation could be that ssDNA binding proteins occlude ssDNA on portions of the lagging strand, rendering these regions non-accessible for Redβ-mediated annealing. Finally, it is also possible that several MAGE oligos annealed within a single OF could destabilize lagging strand synthesis, leading to selection against highly modified ‘jackpot’ clones. Indeed, Corn and Berger (25) hypothesize that DnaG primase has evolved to only initiate synthesis when multiple DnaG units are bound to DnaB Helicase, as OF synthesis away from the replisome could be detrimental. Since polIIIgecikmə dissociates from the replisome after completing an OF (26), the rapid and repeated dissociation of polIIIgecikmə caused by multiple nearby MAGE oligos could inhibit lagging strand synthesis as the replisome proceeds beyond the target region. In the absence of the rest of the replisome, a cytosolic PolIII holoenzyme alone can synthesize 1.4 kb on a ssDNA template primed by 30 nt DNA oligos (27), but this activity is considerably diminished compared to that of an intact replisome. Therefore, if OFs are not completed when the replisome is in close proximity, this could result in persisting ssDNA that could destabilize the chromosome and/or cause lesions when the next replication fork passes through.

We also investigated whether targeting a greater number of alleles would increase the resulting number of conversions in our enhanced strains ( Figure 5 ). Although the mean number of alleles converted (mean ± std. error of the mean) increased from 2.59 ± 0.19 with 10-oligo Set 3 to 4.50 ± 0.30 (1.74-fold) with 20-oligo Sets 3 + 3X for Nuc5-.dnaG.Q576A, the mean number of alleles converted for EcNR2.dnaG.Q576A only increased from 2.54 to 2.96 (1.17-fold). The superior enhancement for the nuclease-depleted Nuc5-.dnaG.Q576A strain suggests that the intracellular oligo concentration is a limiting factor for highly multiplexed MAGE (㸐 alleles targeted). Therefore, enhancing DNA uptake and/or preservation may be a fruitful means of further improving MAGE. However, the greater multiplexibility of Nuc5-.dnaG.Q576A could also be due to the 10 new Set 3X oligos being more responsive to decreased exonuclease degradation than to increased lagging strand ssDNA availability. Additionally, there may be other limiting factors such as insufficient Redβ or unidentified host proteins. Although there is no known precedent for limiting amounts of λ Red proteins during recombination (28), our novel ability to attain 12 simultaneous non-selectable ARs ( Figure 5 A) shows that our improved strains are in uncharted territory for probing the limits of λ Red recombination.

Given that DnaG primase acts solely on the lagging strand of the replication fork, we expected that the primase modifications would only enhance lagging strand recombination. Therefore, the performance of leading-targeting CoS-MAGE in our strains was surprising, as EcNR2.dnaG.Q576A significantly outperformed EcNR2 (*səh = 0.018). Furthermore, while the total number of tolC+ recombinants was far smaller (� 2 -fold) for leading-targeting CoS-MAGE, the AR frequency of non-selectable alleles in these recombinants was still quite impressive, especially in extremely close proximity to the selectable allele. This suggests that one leading strand recombination event strongly correlates with multiple additional recombinations. Two possible explanations for the superior performance of EcNR2.dnaG.Q576A in leading-targeting CoS-MAGE are that (i) an impaired primase–helicase interaction increases accessible leading strand ssDNA or (ii) infrequent Redβ-mediated strand invasion initiates a new replication fork that travels in the opposite direction and swaps which strand is the lagging strand.

There is strong support for primase function affecting the dynamics of replication on both the lagging and leading strands (26,27,29). Lia və b. (26) observed phases in which OF synthesis is faster than helicase progression at the replication fork, alternating with phases in which helicase progression outstrips the rate of OF synthesis by PolIIIgecikmə. These results demonstrate that DnaB-PolIIIaparıcı does not progress at the same instantaneous speed as PolIIIgecikmə (26). Furthermore, Yao və b. (29) showed that the velocity of leading-strand synthesis decreases during lagging strand synthesis, while its processivity increases. Perhaps less frequent primase–helicase binding leads to transient asynchrony of the helicase and PolIIIaparıcı. Given that PolIII tends to release from the replication fork more readily than does DnaB helicase (29), a transiently increased fork rate and decreased PolIIIaparıcı processivity could exacerbate such an asynchrony, creating a leading strand trombone loop similar to those observed during lagging strand synthesis. However, the effects of lagging strand synthesis on leading strand replication have been historically difficult to demonstrate in experiments beyond single-molecule studies (29). Given that instantaneous changes in replication dynamics appear to occur on timescales relevant to Redβ-bound oligo recombination, it is conceivable that snapshots of exposed ssDNA on the leading strand template could be recorded by measuring rates of leading-targeting AR. Single-molecule analysis of the Q576A variant could explore this hypothesis.

Alternatively, Redβ has been reported to facilitate strand invasion in vitro (30). If this also occurs in vivo, such strand invasion would produce a D-Loop that could act as a new origin of replication (31). Therefore, invasion of one leading–targeting MAGE oligo could initiate a replication fork traveling in the opposite direction. In the reverse orientation, the leading strand would become the lagging strand so that upstream oligos would become lagging targeting and much more likely to recombine. This could lead to the highly modified clones that we observed during leading-targeting CoS-MAGE (Supplementary Figure S1). If this is the case, the non-selectable alleles would be upstream of the tolC selectable marker. Since co-selection is most effective downstream of the selectable marker (9), this may explain why co-selection enhancements decay rapidly with distance on the leading strand.

In this manuscript, we have identified available ssDNA on the lagging strand of the replication fork as a limiting factor in multiplex genome engineering. Compared with a standard recombineering strain (EcNR2), EcNR2.dnaG.Q576A displays on average 62% more alleles converted per clone, 239% more clones with 5 or more allele conversions and 38% fewer clones with 0 allele conversions in a given round of CoS-MAGE with 10 synthetic oligos ( Table 2 ). We used this strategy to build on our recent advances (Mosberg, J.A., Gregg, C.J., və b. in review), generating the Nuc5-.dnaG.Q576A strain, which has extended OFs and also lacks five potent exonucleases. These modifications exploited two distinct mechanisms that together increased the robustness and potency of CoS-MAGE, enabling an average of 4.50 and a maximum of 12 ARs in single cells exposed to a pool of 20 different synthetic AR oligos ( Figure 5 ). Additionally, 48% of recombinants had 5 or more ARs and only 8% had 0 modified non-selectable alleles. Furthermore, in a given round of CoS-MAGE with 10 synthetic oligos, Nuc5-.dnaG.Q576A displays on average 111% more alleles converted per clone, 527% more clones with 5 or more allele conversions and 71% fewer clones with 0 allele conversions in comparison with EcNR2 ( Table 2 ). This improvement in MAGE performance will be highly valuable for increasing the diversity explored during the directed evolution of biosynthetic pathways (4) and for enabling the rapid generation of desired genotypes involving tens to hundreds of ARs (5).


High-Efficiency Scarless Genetic Modification in Escherichia coli by Using Lambda Red Recombination and I-SceI Cleavage

FIG 1 Diagram of the two-plasmid method. (A) Antibiotic cassette fragment with I-SceI recognition sites integrated at a target via λ-Red-mediated recombination, creating an intermediate strain. (B) The intermediate strain, with a mutation(s) and I-SceI recognition sites, was transformed with the donor plasmid. Expression of I-SceI was induced by l -rhamnose or IPTG. I-SceI recognition sites in the donor plasmid and the chromosome were cleaved. Integration of the donor fragment at the cleaved site of the chromosome was mediated by λ-Red recombination. FIG 2 Plasmids used for this method. (A) pREDTKI and pREDTAI (helper plasmids), with arabinose-inducible (araB promoter) λ-Red recombinase functions and IPTG-inducible (trc promoter) I-SceI expression. (B) pKSI-1 (modular plasmid for donors), based on the high-copy-number vector pBluescript II KS(−), with an MCS and two I-SceI recognition sites. (C) Part of plasmid pMDIAI (template plasmid), with the apramycin resistance gene flanked by FRT sites and I-SceI recognition sites. For pMDISI, the apramycin resistance gene was replaced with the spectinomycin resistance gene. Pink arrow, binding sites for primers MDF and MDR.
ModifikasiyaHelper plasmid/promoter for I-SceI expressionDonor plasmid backboneMarker eviction rate (no. of Apr- and/or Spc-sensitive colonies/no. of tested colonies)Donor plasmid curing rate (no. of Amp- or Kan-sensitive colonies/no. of tested colonies)Correct modification rate, confirmed by PCR (no. of colonies with expected PCR bands/no. of tested colonies)Correct modification rate, confirmed by PCR fragment sequencing (no. of colonies with expected sequence/no. of tested colonies)
cadA silinməpREDIA/rhaBpBackZero-T4/103/43/33/3
pREDTKI/trcpMD19-T20/2018/2018/204/4
gntT integrationpREDTKI/trcpMD19-T8/107/87/74/4
pepD seamless deletionpREDKI/rhaBpKSI-13/82/32/22/2
pREDTKI/trcpKSI-16/86/66/66/6
metK mutasiyapREDKI/rhaBpKSI-19/305/99/94/4
pREDTKI/trcpKSI-118/1818/1816/184/4
metK yerdəyişməpREDTKI/trcpKSI-12/42/22/22/2

Markerless knockout and knock-in of selected genes. (i) Knockout of cadA.

(ii) Knock-in of gdhA.

(iii) Multiple modifications.

Seamless deletion of pepD.

FIG 3 Seamless pepD deletion and PCR analysis. (A) Construct with 40-bp short arms homologous to the pepD ORF and a 600-bp pepD segment replaced by a marker. (B) Construct with arms with upstream (U) and downstream (D) homology to pepD, with truncated 1.0-kb pepD segments and the apramycin (apr) resistance gene seamlessly deleted, from ATG to TAA. (C) PCR analysis of pepD expression. Band sizes: BL21(DE3) (wild-type pepD), 2.5 kb intermediate strain (pepD::apr), 3.2 kb final strain (ΔpepD), 0.9 kb.

Modifications in the essential metK gen.

FIG 4 Modifications to metK gene and PCR analysis. (A) Construct with IsceI-apr-IsceI cassette inserted into yqgC and IsceI-spc-IsceI cassette inserted into galP. yqgCgalP are nonessential genes next to metK. (B) Wild-type (WT) metK and resistance genes were replaced by mutated metK or the SAM transporter gene. The galP fragment and speA-yqgB-yqgC fragment were homologous arms. (C) PCR analysis of metK. Band sizes: MG1655 (wild-type metK), 2.8 kb intermediate strain A10 (yqgC::apr galP::spc), 5.9 kb final strain with mutated metK, 2.8 kb (the same length as wild-type metK) final strain with metK replaced by SAM transporter gene, 2.6 kb.

Recombineering with overlapping single-stranded DNA oligonucleotides: testing a recombination intermediate

A phage lambda-based recombination system, Red, can be used for high-efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal or episomal DNA in vivo in Escherichia coli. When long linear double-stranded DNA with short flanking homologies to their targets are used for the recombination, the lambda Exo, Beta, and Gam proteins are required. The current model is: (i) Gam inhibits the host RecBCD activity, thereby protecting the DNA substrate for recombination (ii) Exo degrades from each DNA end in a 5' --> 3' direction, creating double-stranded DNA with 3' single-stranded DNA tails and (iii) Beta binds these 3' overhangs to protect and anneal them to complementary sequences. We have tested this model for Red recombination by using electroporation to introduce overlapping, complementary oligonucleotides that when annealed in vivo approximate the recombination intermediate that Exo should create. Using this technique we found Exo-independent recombination. Surprisingly, a similarly constructed substrate with 5' overhangs recombined more efficiently. This 5' overhang recombination required both Exo and Beta for high levels of recombination and the two oligonucleotides need to overlap by only 6 bp on their 3' ends. Results indicate that Exo may load Beta onto the 3' overhang it produces. In addition, multiple overlapping oligonucleotides were successfully used to generate recombinants in vivo, a technique that could prove useful for many genetic engineering procedures.

Rəqəmlər

Model for Red-mediated recombination. λ…

Model for Red-mediated recombination. λ Exo enters a dsDNA end and degrades one…

Model to explain the high…

Model to explain the high recombination frequency of dsDNA with 5′ overhangs. The…


Giriş

Essential bacterial genes are an especially interesting target for DMS because they play an important role in bacterial evolution (Long və b, 2015 Maddamsetti və b, 2017 ), the emergence of antibiotic resistance (Walsh, 2000 Allen və b, 2010 ), and strain engineering (Winkler və b, 2016 de Jong və b, 2017). It is important to modify the essential genes in their native genomic context. Expressing essential genes on plasmids alters the cellular fitness because of different expression levels due to copy number effects (Gibson və b, 2013 ) and the loss of epigenetic regulation. Current genome mutagenesis techniques suffer from low-editing efficiencies and mutational biasing, which greatly decrease the quality of the fitness data (i.e., due to the overabundance of wild type or a few over-represented members). As such, comprehensive DMS of essential genes using these approaches has remained elusive, especially in bacteria.

Bacterial genome-editing technologies have advanced greatly in the past decade. One technology is multiplexed automated genome engineering (MAGE) that is based on lambda Red-mediated recombination of single-stranded oligos for desired allelic exchange on the genome or “Recombineering” (Wang və b, 2009). The efficiency of introducing a single nucleotide change using recombineering is often very low and context-dependent (Sharan və b, 2009). Using MAGE, efficiency and throughput are improved by re-transforming the same large pool of oligos over repeated cycles (Wang və b, 2009). This technique has been successfully used for several outstanding synthetic biology and metabolic engineering applications (Wang və b, 2009 Sandoval və b, 2012 Lajoie və b, 2013b Raman və b, 2014 Amiram və b, 2015). However, it may be difficult to apply MAGE for DMS of essential genes. Due to the repeated transformation cycles during library construction, the mutations that are deleterious or even neutral to the host would be lost (Wang və b, 2009). Repeated heat shock and electroporation during the recombineering cycles in the MAGE protocol (Wang və b, 2009 ) would also add additional stress that would be detrimental to the diversity in essential genes. Additionally, in order to increase the efficiency of recombination in MAGE, significant modifications such as deletion of methyl-directed mismatch repair (MMR) and DNA primase (dnaG) are required, which change the native genetic context (Wang və b, 2009 Sawitzke və b, 2011 ). Deletion of mismatch repair systems increases the background mutation rate (Isaacs və b, 2011 ), which may also confound fitness estimates.

Genome-editing technologies developed using CRISPR/Cas9-mediated recombineering have helped address several challenges with MAGE. A chimeric guide RNA (gRNA) programs the Cas9 endonuclease to induce a DNA double-strand break (DSB) at any genomic target upstream of a 5′-NGG-3′ PAM sequence and complementary to the 20-bp spacer sequence in the gRNA (Jinek və b, 2012). In several bacteria, including Escherichia coli, the Cas9:gRNA-mediated DNA DSB induces cell death due to a lack of adequate DSB repair pathways (Jiang və b, 2013). Therefore, Cas9:gRNA-induced DSBs can select for PAM substitutions introduced by recombineering (Cong və b, 2013 Jiang və b, 2013). Synonymous PAM-inactivating mutations (SPMs) can be coupled to other mutations in the same recombination template for precise genome manipulation with high efficiency using a single transformation step (Pyne və b, 2015 Reisch & Prather, 2015 Bassalo və b, 2016 Chung və b, 2017 Wang və b, 2018 ).

High-throughput genome editing with Cas9-mediated recombineering was achieved recently using CRISPR-enabled trackable genome engineering (CREATE) (Garst və b, 2017). Using CREATE, the DNA encoding the gRNA expressed under a constitutive promoter was covalently linked to the DNA repair template on 250-bp editing cassettes (Garst və b, 2017). Over 100,000 editing cassettes can be synthesized on microarray chips and subsequently cloned in high-throughput into cells with active Cas9 and lambda Red recombination to generate genome-wide mutation libraries. The editing cassettes on the plasmid also serve as the barcode to track the mutations before and after selection to assign fitness scores to each mutation (Garst və b, 2017). The technology has been used for directed evolution of E. coli proteins, pathways, and strains (Shalem və b, 2014 Cobb və b, 2015 Cho və b, 2017 Liang və b, 2017 Liu və b, 2017 Lu və b, 2017 Wu və b, 2017a , b Zhu və b, 2017 Bassalo və b, 2018 ). However, applying CREATE for DMS proved to be challenging. Anywhere between 10 and 60% of randomly chosen gRNA targeting different genomic loci have been shown not to induce Cas9:gRNA-induced cell death (Cui & Bikard, 2016 Zerbini və b, 2017). Consequently, due to variable selection, editing efficiency can vary between 0 and 100% across gRNAs (Garst və b, 2017 Zerbini və b, 2017). Cells with gRNAs that fail to induce DSB-mediated cell death can grow significantly faster than cells with active gRNAs undergoing DSBs and editing (Jiang və b, 2015 Cui & Bikard, 2016 ). Consequently, in high-throughput non-DSB-inducing gRNAs, with low-editing efficiency, take over the population and reduce overall editing efficiency to only

1–4% (Bassalo və b, 2018 ). Several gRNAs also cause unintended mutations on the genome that are not encoded in the repair template (Cui & Bikard, 2016 Zerbini və b, 2017). Consequently, cells with no edits and unintended mutations can be falsely tracked as beneficial mutations. Finally, each gRNA is coupled to a different synonymous PAM mutation (SPM) and synonymous mutations can lead to significant fitness effects, especially in essential genes (Lind və b, 2010 Agashe və b, 2013 Lajoie və b, 2013a ). Because of these limitations, CREATE experiments have largely been limited to finding mutants with large fitness effects in the presence of strong selective pressures (Bassalo və b, 2018 Pines və b, 2018 ).

We posited that in order to target a single genomic locus, we could use a single pre-screened gRNA and synonymous PAM-inactivating mutations (SPM). In this study, we discuss the CRISPR/Cas9-mediated genomic error-prone editing (CREPE) technology. As opposed to other Cas9-mediated high-throughput technologies in E. coli, in the CREPE protocol we use a single gRNA to integrate an error-prone PCR library of the target with the SPM on the genome (Fig 1). Recently, a similar technology, CASPER, was reported in yeast (Jakočiūnas və b, 2018 ). However, yeast has a significantly higher recombination efficiency than bacteria such as E. coli. Recombination efficiency with linear dsDNA templates is very low in E. coli (Murphy və b, 2000 ), and recombineering using dsDNA template with limited single nucleotide changes is poorly understood. Therefore, we varied the homology arm length and the Cas9 recombineering system to improve recombination and our understanding of recombination using a repair template with single nucleotide changes. We successfully developed a platform that efficiently generates unbiased and diverse genomic mutant libraries with > 80% editing efficiency for non-essential genes and > 55% efficiency for essential genes. Additionally, while CASPER was used for directed evolution, we adapted CREPE for use as a DMS platform to study essential E. coli genes in their native genomic context. Using CREPE, we scored the fitness of naturally accessible mutations in the RNA polymerase beta subunit that confer resistance to rifampicin.


Müzakirə

We demonstrated previously that Red-mediated recombination with synthetic single-strand oligos is very efficient and independent of RecA in E. coli. Only λ Beta appears to be required for this ssDNA recombination (Table 3) (9, 28, 36). Oligos that correspond to either of the two complementary DNA strands generate recombinants, but invariably one oligo recombines more efficiently than the other. By testing six markers in different regions of the chromosome, a pattern emerged (9). At each position, the most efficient of the two complementing oligos was the one corresponding to the lagging-strand DNA (i.e., the same sequence as the Okazaki fragments). We proposed that oligo-directed recombination occurred at the replication fork, and that the “lagging-strand oligo” is more easily annealed by Beta because of larger gaps present in the lagging strand (9, 29). Three points from the results presented here bear on our previous proposal that Beta-mediated recombination with ssDNA oligos occurs at the replication fork. First, we have demonstrated that four different oligos recombine more efficiently when each is targeted to the lagging strand than when targeted to the leading strand (Table 4). Second, we show that MMR can depress the appearance of recombinants by >100-fold (Table 2). The MMR functions MutS, MutL, MutH, UvrD helicase, and Dam methylase are required for mismatch repair at the replication fork (37). Third, when recombination occurs without bias due to MMR efficiencies, we see incredibly high recombination frequencies of 25%. It is difficult to come up with other mechanisms that generate a single-strand gap at a specific site in 25% of the cells during the time period of the experiment. We do not yet understand why 75% of the cells are resistant to recombination despite saturating levels of oligo. Among several possibilities, some cells may not be electrocompetent, may be in a state resistant to recombination, or may have the target sequestered from the oligo.

Although the lagging-strand oligos generate more recombinants than the leading-strand oligo, the leading-strand oligos are still very recombination proficient. Comparing four oligos (Table 4), lagging-strand recombinants are on average 30-fold more frequent than the leading strand. This may be explained by a proportionally different amount of ssDNA generated during replication on each side of the fork. By this logic, the gaps on the lagging-strand side would be 30 times greater than the gap on the leading-strand side. Of course, other factors could be responsible for this difference, because the type of replication and the factors present at the leading and lagging strands are different (38, 39).

One possible alternative we have explored elsewhere is that transcription generates single-strand regions and affects recombination bias (40). We found that gene transcription does not affect the strand bias observed for oligo-mediated recombination. Our results here strengthen that observation by showing that replication direction is critical to the strand bias.

There are eight possible mismatch pairs, and MutS protein has been shown to bind to each pair in vitro (41, 42). The four oligos used here generate four of those eight mismatches. Binding by MutS protein and repair by the MMR system have a similar hierarchical pattern for the eight mismatch pairs (42, 43). The pattern is G·T, A·C, A·A, G·G>T·T, T·C, A·G>C·C, where the C·C mismatch is very weakly bound and poorly corrected. Our studies support a similar pattern of repair efficiency with G·G>T·C>A·G>C·C. A 370-fold difference in repair exists between the well repaired G·G and the poorly repaired C·C mismatches (see lagging strand in Table 4). The same hierarchy and efficiency of correction were found for both the lagging and leading strands.

Because C·C mismatches are not recognized by MMR in other bacterial species (20, 44), this particular feature of oligo recombination might have the potential to create high recombination frequencies in other bacteria. For this reason and others, the ability to transfer the homologous recombination system to other bacterial species and even to eukaryotes would be very useful. Because ssDNA at the replication fork is bound by Ssb protein (45, 46), and Beta protein is important for the interaction between the oligo and the chromosome target, Beta may interact directly and specifically with Ssb (29). The λ Red system has been shown to work in Salmonella typhimurium (47–49), a species very closely related to E. coli, and it may also work in other related Gram-negative bacteria. However, for more distantly related bacteria, it may be necessary to provide Beta-like functions from phage endogenous to those bacteria. Exo- and Beta-like proteins have already been identified in other bacterial phages and even eukaryotic viruses such as HSV-1 (50, 51).

Mismatch repair functions are known to prevent DNA exchange between related species by blocking recombination between homologous but divergent sequences (homeologous recombination) (24). A difference between the role of mismatch repair in homeologous recombination and in replication is that in the former, MutS and MutL appear to be required, whereas MutH and UvrD helicase have less importance (24, 25, 52). It is believed that MutS and MutL bind mismatches generated during homeologous exchanges, and the binding itself aborts further recombination without causing repair (53, 54).

Our results suggest the inhibition of oligo-mediated recombination by MMR functions is more analogous to the correction of DNA replication errors than to the role of MMR functions during homeologous recombination. MMR functions tested, including UvrD and MutH, appear to remove mismatches generated during oligo recombination and replication (Table 2). Also, unlike homeologous recombination, Feinstein and Low (55) found that during E. coli conjugation between sequences with very few mismatches, the MMR system inhibited recombination and that, like oligo-mediated recombination, MutH and helicase are required. Perhaps, as we suggest for oligo recombination, the incoming strand transferred during normal conjugation is annealed at the replication fork. An alternative is that the recombination intermediates formed generate a new replication fork (39, 56, 57) and recruit the MMR complex. A recent discovery that ssDNA modification of murine embryonic stem cells is inhibited by MMR is consistent with our results and may indicate that in stem cells, the modification is also at the replication fork (58).

The in vivo recombination technologies we describe, due to their efficiency, accuracy, and simplicity, may replace classical in vitro genetic engineering techniques. The λ Red-mediated homologous recombination system, which we use as a genetic engineering tool, is particularly useful for modifying the genome of E. coli, as well as cloned genome segments from other organisms (29, 59, 60). This study creates new opportunities for genome modification and in vivo analyses of DNA mechanics. Using synthetic oligos, recombinants with the chromosome and episomes can occur at such high efficiencies that selection is not required. Oligos that create C·C mispairs are recombined into the DNA of cells at efficiencies approaching 25% among the survivors of electroporation. In other words, it might be possible to generate a C replacement of G anywhere in the chromosome at these high efficiencies if the change is not toxic to the cell. Recombination levels approaching 25% were also found for any oligo-generated mismatch in strains defective for the MMR functions tested. This advance in technology allows efficient genetic modifications and may permit nucleotide analogs and adducts to be incorporated directly into the chromosome for in vivo biochemical studies.


Videoya baxın: напряжение лямбды, the voltage of the lambda (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Rufio

    Absurd bir vəziyyət ortaya çıxdı

  2. Malagal

    Very useful piece

  3. Traigh

    Məncə, yanılırsınız. Mən əminəm. Mən bunu müzakirə etməyi təklif edirəm. Mənə PM-ə yazın, danışarıq.

  4. Harlon

    Siz səhv edirsiniz. Mən əminəm. Biz müzakirə etməliyik.

  5. Pessach

    Əla

  6. Gryfflet

    Düşünürəm ki, haqlı deyilsən. Bunu sübut edə bilərəm. PM-də mənə yazın, müzakirə edəcəyik.

  7. Tezuru

    Tamamilə haqlısan. Bu və yaxşı bir fikir var, biz onu dəstəkləyirəm.

  8. Darwin

    Bu ümumi şərtlilikdir



Mesaj yazmaq