Məlumat

Niyə məhdudlaşdırıcı fermentlər dondurulmur?

Niyə məhdudlaşdırıcı fermentlər dondurulmur?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Hamımız məhdudlaşdırıcı fermentlərin zülal olduğunu bilirik, lakin biz onları heç vaxt dondurmuruq. Bunun əvəzinə şirkətlər tərəfindən yüksək qliserol tərkibli məhlullarda verilir və -20C-də saxlanılır. Bunun belə olmasının bir səbəbi varmı?


Fermentləri əritmədən hazır vəziyyətə gətirmək çox daha rahatdır. Fermentləri dondurmağınızın əsas səbəbi onları aktiv saxlamaqdır, əgər aktivliyi itirmədən onları dondurulmamış saxlayan bir tampon tapsanız, bu, rahatlıq baxımından böyük bir artımdır.

İstifadə etməzdən əvvəl fermentləri əritməmək çox vaxta qənaət edir, əgər fermentləri donmayan şəraitdə aktiv saxlaya bilsəniz, bu açıq üstünlükdür.

Qliserin həmçinin məhluldakı zülalları stabilləşdirir və çoxsaylı donma və ərimə dövrləri bəzi fermentlər üçün ferment aktivliyinə mənfi təsir göstərə bilər.


Dondurma-ərimə dövrləri yerli pH dəyişməsi effektləri vasitəsilə zülalları denatürasiya edir


DNT və Molekulyar Biologiyanın Aspektləri

7.14.2.19 Məhdudiyyət və metilləşmə fermentləri

Məhdudlaşdırıcı fermentlər cüt zəncirli DNT-nin ardıcıllıqla spesifik hidrolizini katalizləyir. Məhdudiyyət fermentləri mikroorqanizmlərdə ümumi ardıcıllığı tanıyan DNT-parçalayan ferment/DNT-metilləşdirici ferment cütlərindən ibarət məhdudlaşdırma-metilasiya sistemlərinin bir hissəsi kimi baş verir. Öz DNT-sinin ardıcıllıqla spesifik metilasiyası ev sahibini öz məhdudlaşdırıcı fermentləri ilə DNT deqradasiyasına qarşı qoruyur. Məhdudlaşdırma-modifikasiya sistemləri bu orqanizmləri hüceyrəyə daxil ola biləcək yad DNT-dən qoruyan prokaryotik immun sistemi kimi görünür. 379 Mikroorqanizmlərdə məhdudlaşdırma-metilasiya sistemlərinin fermentləri formal olaraq ikincil metabolit təbii məhsullar hesab edilə bilər. Restriksiya-metilasiya ferment sistemlərinin kimyası və enzimologiyası nəzərdən keçirilmişdir. 379,380


Fermentlər

Fermentlər canlılar deyil, yəni onlara nə etsəniz də, onları öldürə bilməzsiniz. Bunun əvəzinə onlar zülallardır, Drs izah edir. Reginald Garrett və Charles Grisham öz kitablarında "Biochemistry". Onlar bütün canlı orqanizmlərdə mühüm rol oynayırlar, çünki hüceyrələrə lazımi kimyəvi reaksiyalara girməyə kömək edirlər. Məsələn, həzm sisteminiz qidadakı qida molekullarını parçalamaq üçün həzm sistemi hüceyrələri tərəfindən istehsal olunan fermentlərdən asılıdır. Digər bədən hüceyrələri məhsul yaratmaq və digər hüceyrə reaksiyalarında iştirak etmək üçün müxtəlif fermentlərdən istifadə edir.


Bəzən bir mövzunu əhatə edən bağlantıların olması yaxşıdır. Buna görə işinizdə sizin üçün faydalı ola biləcək bir çox bağlantıları burada topladım.

Burada məhdudlaşdırıcı ferment analizində istifadə olunan metodların yaxşı təsvirini tapa bilərsiniz: Methodbook.net

Əgər işiniz üçün məhdudlaşdırıcı fermentlərdən istifadə etmək istəyirsinizsə, aşağıda ən tanınmış məhdudlaşdırıcı ferment təminatçılarının bağlantılarının siyahısını tapa bilərsiniz.

İşinizə bu fermentlərlə başlamaq istəyirsinizsə, lütfən, fermentlə birlikdə təqdim olunan protokola müraciət edin və ya istehsalçının saytında yoxlayın.

İzoskizomerin nə olduğunu, ulduz fəaliyyətinin nə olduğunu və ya ikiqat həzmi necə edə biləcəyinizi bildiyinizə əmin olun (ətraflı burada və burada).

Bunu paylaşın:


DNT Profili

DNT barmaq izi DNT-də meydana gələn nümunələri müəyyən etmək üçün istifadə edilən bir texnikadır. Heç bir iki orqanizmdə eyni DNT yoxdur, ona görə də bu prosedurdan DNT nümunəsinin müəyyən bir şəxsdən gəlib-gəlmədiyini müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilər. Cinayət yerində tapılan DNT nümunəsinin üç şübhəlidən birinə aid olub olmadığını müəyyən etmək üçün laboratoriyada bu prosedurdan istifadə edəcəyik. Texnikanın müxtəlif başqa məqsədləri var, məsələn, fərdlərin müəyyən genetik xəstəliklər üçün gen daşıyıb-daşımadığını müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilər.

Məhdudiyyət fermentləri

DNT-nin barmaq izinin alınması texnikası DNT-nin kiçik parçalara bölünməsini tələb edir. Bu həzmi həyata keçirmək üçün məhdudlaşdırıcı fermentlər istifadə olunur. Virusların və ya digər bakteriyaların DNT-sini kəsmək üçün onlardan müdafiə mexanizmi kimi istifadə edən bakteriyalarda məhdudlaşdırıcı fermentlər aşkar edilmişdir. Yüzlərlə müxtəlif məhdudlaşdırıcı fermentlər təcrid edilmişdir. Hər biri müəyyən bir əsas ardıcıllıqla DNT-ni kəsir. Məsələn, EcoRI həmişə aşağıda göstərildiyi kimi GAATTC-də DNT-ni kəsir.

GAATTC ardıcıllığı aşağıdakı DNT zəncirində üç dəfə görünür. Nəticədə ip dörd hissəyə kəsilir.

Fərqli yerlərdə kəsilmiş digər məhdudlaşdırıcı fermentlər, bəzi nümunələr aşağıda verilmişdir.

Ferment Kəsmə saytı
Bam HI GGATCC
Hae III GGCC
Pst I CTGCAG
Hinf I GANTC

RFLP analizində bir orqanizmin DNT-si məhdudlaşdırıcı fermentlərdən istifadə edərək parçalara bölünür. Çoxlu sayda qısa DNT fraqmentləri istehsal olunacaq.

Məhdudiyyət fermentləri həmişə eyni əsas ardıcıllıqla kəsilir. Heç bir iki fərddə eyni DNT olmadığından, heç bir iki fərddə eyni uzunluqdakı fraqmentlər olmayacaq. Məsələn, EcoRI fermenti həmişə DNT-ni GAATTC ardıcıllığında kəsir. Fərqli insanlar bu xüsusi ardıcıllığın müxtəlif nömrələrinə sahib olacaqlar və buna görə də fərqli fraqment uzunluqlarına sahib olacaqlar. Bundan əlavə, onlardan bəziləri xromosomun müxtəlif yerlərində olacaq.

Gel elektroforezi

Elektroforez DNT fraqmentlərini ölçülərinə görə ayırmaq üçün istifadə edilən bir texnikadır. Onlar jelatin təbəqəsinə yerləşdirilir və təbəqəyə elektrik cərəyanı verilir. DNT yüklüdür və elektrik sahəsində müsbət qütbə doğru hərəkət edəcəkdir. Aşağıdakı diaqramda jelatində deşiklər (quyular) görünə bilər. Bu quyulara yerləşdirilən DNT nümunələri elektrik cərəyanı tətbiq edildikdən sonra jelatindən + tərəfə doğru miqrasiya edəcək.

Ən kiçik fraqmentlər ən sürətli hərəkət edəcək, çünki onlar jelatindəki məsamələrdən daha sürətli hərəkət edə bilirlər. Parçaların yığıldığı jelatin üzərində bantlar istehsal olunacaq. Ən qısa fraqmentlər jelatinin bir ucunda, daha uzun, daha yavaş hərəkət edən fraqmentlər isə digər ucunda qalacaq.

Aşağıdakı diaqramda jelatinin üzərinə dörd DNT nümunəsi yerləşdirilib. Bir müddət elektrik cərəyanı tətbiq edildikdən sonra fraqmentlər ayrıldı. Diqqət yetirin ki, sağdakı D nümunəsi digər üç nümunə ilə uyğun gəlmir.

DNT zolaqlarının görünməsi üçün rənglənməlidir. Etidium bromidlə boyanmış DNT ultrabənövşəyi şüalarla işıqlandırıldıqda flüoresanlaşacaq. Bu texnika üçün kifayət qədər miqdarda DNT istehsal etmək üçün PCR üsulları istifadə olunur.

Prosedur - 1-ci gün

Aparatın Quraşdırılması

Bu məşq üçün sizə ya xərçəng genini (aşağıdakı Cədvəl A-ya baxın) və ya cinayət yerində toplanmış DNT-ni (Cədvəl B) araşdırmaq tapşırılacaqsınız. Hər iki halda, DNT məhdudlaşdırıcı fermentlərdən istifadə etməklə kəsilmişdir.

Cədvəl A. Aşağıdakı cədvəl ailələrdə baş verən xərçəng geninin tədqiqi üçün istifadə olunacaq. Bütün DNT eyni məhdudlaşdırıcı fermentlə kəsildi.

Komponent (boru) DNT mənbəyi
A Standart DNT fraqmentləri
B DNT-yə nəzarət edin
C Xəstə qan DNT
D Xəstə şiş DNT
E Xəstə döşünün normal DNT-si


Cədvəl B. Aşağıdakı cədvəl cinayət yerində aşkar edilmiş DNT və iki şübhəli şəxsin DNT-sini araşdırmaq üçün istifadə olunacaq.

  1. Artıq edilməmişsə, jel qablarının ucundan lenti çıxarın.
  2. Nümunələr üçün quyuların yaradılması üçün plastik daraqdan istifadə edilmişdir. Bu darağı diqqətlə çıxarın.
  3. Gel qabını elektroforez aparatına qoyun. Quyular mənfi (qara) elektroda ən yaxın yerləşdirilməlidir.
  4. Gelin tamamilə suya batırılması üçün kifayət qədər tampon məhlulu əlavə edin.
  5. Gelin səkkiz zolağı var, lakin nümunələriniz üçün beş və ya altı zolaq lazımdır. İki kənar zolaqdan quyularda nümunələrin yüklənməsi üçün istifadə edilə bilər. Bunun üçün təcrübə yükləmə həllindən istifadə edin.
  6. 25 ul nümunə A (komponent A) soldan ikinci quyuya yükləmək üçün mikropipetdən istifadə edin. Qalan nümunələrin hər birini fərqli bir quyuya yerləşdirərək bu proseduru təkrarlayın. Quyuların hər birinə hansı nümunələri yerləşdirdiyinizi qeyd edin. Bu, nümunə məktubunu və həmin nümunə üçün quyu nömrəsini yazmaqla edilə bilər.
Enerji təchizatının qoşulması

7. Qapağı aparatın üzərinə qoyun. Bazadakı qırmızı və qara elektrodlar qapaqdakı elektrod birləşmələrinə uyğun olmalıdır.

8. Aparatı transformatora birləşdirin. Bu transformator iki müxtəlif geli işə salmaq üçün istifadə edilə bilər.

9. Arxa tərəfdə sağ tərəfdəki açardan istifadə edərək transformatoru işə salın.

10. "V." seçmək üçün transformatorun LED displeyinin sağındakı düymədən istifadə edin

11. Gərginliyi 125-ə tənzimləmək üçün LED displeyinin solunda yuxarı və aşağı oxlardan istifadə edin.

12. Gelə güc axınına başlamaq üçün ön panelin sağ tərəfindəki düyməni basın. Bu düymə qaçan adamın rəsmini göstərir. Bu düymənin yanındakı yaşıl işıq enerjinin açıq olduğunu göstərir. Gücün açıldığını təsdiqləmək üçün elektroforez aparatında baloncukların əmələ gəlməsini yoxlayın.

Gellərin işlədilməsi

13. Gellər təxminən 45 dəqiqə işləməlidir. Hər bir nümunədə ən kiçik DNT fraqmentlərindən bir qədər əvvəl gedən marker boyası var. Bu boya gelin sonuna yaxınlaşdıqda elektrik kəsilməlidir. Boyanın geldən axmasına icazə verməyin.

14. Gellər işləməyi bitirdikdən sonra enerjini söndürün, aparatı ayırın və qapağı çıxarın.

Gellərin rənglənməsi

15. Ləkə (mavi) tərəfi yuxarıya baxacaq şəkildə plastik rəngləmə qabına mavi rəngləmə vərəqini qoyun.

16. Elektroforez aparatından plastik gel saxlayıcısını çıxarın və geli plastik rəngləmə qabının üzərinə sürüşdürün. Gel birbaşa boyama kağızının üstündə olmalıdır. İdeal olaraq, boyama kağızı ən azı bir gün otaq temperaturunda geldə qalmalıdır.

17. Əgər DNT-ni başqa bir laboratoriya dövründə nəzərdən keçirməyi planlaşdırırsınızsa, tərkibində gel və boyama kağızı olan qabı plastik sarğı ilə sarın.

2-ci gün - Nəticələr və Nəticələr

Gelin ən azı bir gün ləkələnməsinə icazə verildikdən sonra boyama kağızını çıxarın. Tabağı işıq mənbəyinə qoyaraq gel baxmağa hazır olmalıdır.

Nəticələrinizi çəkin və ya fotoşəkili dəftərinizə yapışdırın. Aşağıdakı cədvəllərdən biri də dəftərinizə daxil edilməlidir.

Xərçəng Geni

Jelin hər zolağı üçün nə nümayiş etdirildiyini və bunun nə üçün etdiyi nəticələrə səbəb olduğunu izah edin.

Niyə bu zolaq onun etdiyi sayda və ölçüdə fraqmentlər yaratdı?

Zolaq 1- Standart DNT fraqmentləri

Zolaq 2 - DNT-yə nəzarət

Zolaq 3 - Qan DNT

Zolaq 4 - Şiş DNT

Lane 5 - Normal Döş Doku DNT

Hadisə yeri

Laboratoriya dəftərinizdə cinayət yerində hansı şübhəlinin DNT-sinin olduğunu izah edin. Necə bildiyinizi izah edin. Şübhəli şəxsin DNT-sinin hadisə yerinə uyğun olduğunu söyləmək kifayət deyil. Siz daha konkret olmalısınız, məsələn, "1-ci fermentlə kəsilmiş cinayət yerindən DNT 1-ə uyğun gəlir (və ya uyğun gəlmir) 1-ci şübhəlinin DNT-si ferment 1 ilə kəsilmiş" və s.


Onlar Soyuqdan Bəyənirlər

İnsanlar qarda donaraq ölə bilər, çünki çox soyuq olanda fermentlərimiz fəaliyyətini dayandırır. Bununla belə, soyuqda inkişaf edən mikroorqanizmlər var. Onlara psikrofillər və ya kriofillər deyilir. Bu orqanizmlərə buzlaqlarda və ya Arktika bölgələrində rast gəlmək olar. Onların fermentləri dondurucu temperaturda yaxşı işləyir. Lakin mülayim temperaturda yaşayan orqanizmlərdəki fermentlər kimi, psikrofillərdəki fermentlər də optimal diapazona malikdirlər. Ola bilər ki, psikrofillərdə olan fermentlər o qədər aşağı temperaturda işləyirlər ki, hər hansı bir aşağı və bütün orqanizm buz kubuna çevrilir, lakin onlar da optimal temperatur diapazonlarına malik olacaqlar.


Ikiqat məhdudlaşdırıcı ferment həzm - işləmir? (21 sentyabr 2006)

Bu yaxınlarda mən DNT-ni ikiqat məhdudlaşdırıcı ferment (EcoR I və Xba I) ilə həzm edirəm, lakin təəssüf ki, hədəf bandını əldə edə bilmirəm. Onlar mənim plazmid DNT ilə işləmir.

Mən plazmid DNT-ni yenidən dəyişdirdim və çıxardım, lakin o da işləmir.

Səbəbini bilmirəm. Bəlkə bu iki ferment plazmid DNT-nin metilləşməsindən təsirlənir?

Zəhmət olmasa mənə bir neçə təklif verin. Çox sağ olun!

bir neçə təklifin nə dərəcədə uyğun olduğunu bilmir

Əgər ikiqat həzm edirsinizsə, ümumi bir tamponla tək addımdan istifadə edirsinizmi?
Əgər belədirsə, onun hər iki fermentlə uyğun olub olmadığını yoxladınızmı?
bu fermentlər eyni şirkətdən alınıb?

hansı temperaturdan istifadə olunur? hər ikisinin eyni temperatur tələbi varmı?

Əgər iki addımda ikiqat həzmdən istifadə edirsinizsə, ikinci fermenti necə əlavə etmək olar?
təmizləndikdən sonra və ya növbəti fermenti birbaşa əlavə etdikdən sonra?

bəlkə təmizlənmə zamanı konsentrasiyanı itirdiniz?

şablon DNT konsentrasiyası necədir?
Aşağı surətli plazmidlərlə işləyərkən zolağı aydın görmək üçün daha böyük miqdarda PLazmid DNT istifadə etməliyik, mən aqrobakteriyadakı ikili vektorla belə problem yaşadım.

bəlkə nə etdiyiniz barədə daha aydın şəkil verin
onda biz daha çox həll yolları təklif edə bilərik

ümid edirəm kömək edir
Hörmətlə
laxmi

Hər iki ferment öz-özünə istifadə edildikdə plazmidi xəttiləşdirirmi?

Bir PCR məhsulunu həzm edirsinizsə, həzm etməzdən əvvəl bir etanol yuyulması edin.
(bir gecədə çökdürün, sonra 75% etanol ilə yuyun.)
Həmçinin 2 addımlı həzm həyata keçirilirsə, nümunəni həzmlər arasında yuyun, əks halda duz konsentrasiyası çox yüksək olur.

NEB fermentlərindən istifadə edirsinizsə.
NEB bufer 2 və BSA istifadə edin

10ul NEB bufer2 (10x)
1ul BSAS(100X)
1ul EcoRI fermenti
1ul XbaI fermenti
87ul nümunə və dH2O

37 dərəcədə minimum 2 saat inkubasiya edin

Məsləhətiniz üçün təşəkkür edirik!

təcrübəmdə yalnız bir addım qəbul edildi və iki ferment MBI şirkətindən alınıb və tampon bu iki fermentə uyğun idi.

XbaI metilasiyaya həssasdır, lakin EcoRI deyil. Mən təklif edərdim ki, əvvəlcə bir fermentlə (ehtimal ki, EcoRI) cəhd edin, gelə nəzər salın və əgər işləyirsə, XbaI-dən istifadə edin. Əgər yalnız ikincisi işləmirsə, DNT-nizlə bənd-bakteriyaları çevirməyə çalışın


Niyə məhdudlaşdırıcı fermentlər dondurulmur? - Biologiya

İki şübhəli şəxsin Məhdudiyyət Fraqmentinin Uzunluğunun Polimorfizmlərini müəyyən etmək üçün gel elektroforezindən istifadə edərkən, hansılardan biri cinayət yerində aşkar edilmiş qanın RFLP-nə uyğun olacaq?

Əgər iki şübhəlinin qanı DNT barmaq izi ilə yoxlanılırsa, o zaman RFLP-lərdən biri cinayət yerində tapılan qanla (şübhəlilərdən biri həqiqətən günahkar olduğu müddətcə) uyğun olacaq, çünki hər bir şəxs (eyni şəxslər istisna olmaqla) əkizlər) RFLP-lərin gel elektroforezi ilə ayrılması yolu ilə nümayiş etdiriləcək öz fərqli DNT ardıcıllığına malikdir.

Müstəqil Dəyişən: qanda DNT

Asılı dəyişən: fraqmentlərin miqrasiya məsafəsi

Nəzarət vasitələri: Gel, ləkə, tampon, şərtlər

1 0,8% Agaroza gel, gel qabında

TBE işləyən bufer I X, 350 mL

İsti su banyosu və ya mikrodalğalı soba

1. Hər bir DNT nümunəsindən 10 mikrolitr uyğun zolağa yükləyin. Qapağı elektroforez kamerasına sürüşdürün, hər şeyin quru olduğundan əmin olun.

2. Qırmızı yamaq şnurunu enerji təchizatının qırmızı elektrod terminalına, qara yamaq kabelini isə qara elektrod terminalına qoşun. Enerji təchizatını qoşun və 75 volta təyin edin, sonra yandırın.

3. Nümunənin geldən aşağı miqrasiyasını müşahidə edin və yükləmə boyası gelin ucundan yarıya qədər çıxdıqda enerjini söndürün.

4. Elektroforez kamerasından geli çıxarın və boyama qabına qoyun. 100 mL seyreltilmiş ləkəni qaba tökün. 10-20 dəqiqə gözləyin.

5. Ləkə qabına distillə edilmiş və ya kran suyu əlavə etməklə geli təmizləyin. Qətnamənin baş verməsini bir gecədə gözləyin.

6. Gelə yüngül fonda baxın və DNT zolaqlarının qət etdiyi məsafəni təhlil edin. Ölçmələrinizi qeyd edin və onların qrafikini yarı log qrafik kağızına çəkin.

7. DNT barmaq izinin nəticələrinə əsasən hansı şübhəlinin günahkar olduğunu müəyyənləşdirin.

Fraqment Köçürülən məsafə (mm) Uzunluq (bp)
1 18 23109
2 24 9416
3 27.5 6557
4 33 4361
5 45 2328
6 48 2027
7 75 564

Fraqment Köçürülən məsafə (mm) Uzunluq (bp)
1 21 10200
2 32 5300
3 33 5000
4 34 4850
5 36.5 4100
6 48 1950
7 49 1800
8 54 1300
9 57 1100
10 66 620
11 68 550
12 74 370

Fraqment Köçürülən məsafə (mm) Uzunluq (bp)
1 21.5 1050
2 27 7000
3 30 6100
4 31 5800
5 33 5000
6 36 4200

Fraqment Köçürülən məsafə (mm) Uzunluq (bp)
1 21 10200
2 32 5300
3 33 5000
4 34 4850
5 36.5 4100
6 48 1950
7 49 1800
8 54 1300
9 57 1100
10 66 620
11 68 550
12 74 370

Cinayət yerindəki DNT barmaq izinin şübhəli 2-ninkinə tam uyğun gəldiyi görülə bilər.

Gel elektroforez testi Məhdudiyyət Fraqmentinin Uzunluğu Polimorfizmlərini ayıraraq DNT barmaq izini təyin etməyə imkan verir. Gel hər bir fraqmentin hüceyrədən köçdüyü məsafəni göstərir və hər bir fərd üçün unikal nümunə yaradır. Bu test iki şübhəlidən hansının günahkar olduğunu müəyyən etmək üçün istifadə edilib. Cinayət yerində tapılan qan yoxlanıldı və o, özünəməxsus nümunəni, şübhəlilərin hər birinin qanının öz nümunəsini yaratdı. Üç nümunənin araşdırılması və baza cütlərinin sayını müəyyən etmək üçün DNT markerindən istifadə edildikdə, şübhəli 2-nin DNT barmaq izinin cinayət yerində tapılan qanın barmaq izinə uyğun gəldiyi qənaətinə gəlindi. Odur ki, cinayəti şübhəli 2-nin törətdiyi qənaətinə gəlmək olar.

1. Gelin hər zolağında əmələ gələn bantlama nümunələrini müqayisə edin. Sizcə yoxlanılan üç DNT nümunəsi eynidirmi? izah edin. Test edilmiş DNT nümunələrindən hər hansı birinin eyni olub-olmadığını daha necə yoxlaya bilərsiniz?

Şübhəli 2 və cinayət yeri nümunələri eynidir. Onlar quyudan eyni məsafələrə malikdirlər, bu da onların eyni olduğunu təsdiqləyir və buna görə də eyni əsas cüt uzunluqlarıdır.

2. İki şübhəlidən hansının əsl oğru olduğuna inanırsınız? Cavabınızı izah edin.

Şübhəli 2, onun əsas cüt uzunluqları cinayət yerində tapılan qanla eyni olduğu üçün.

3. A) Nə üçün yerləşdirdiyini izah edin EkoOnun etdiyi kimi R I məhdudlaşdırıcı ferment.

Tələbə məhdudlaşdırma fermentinin yerini onun etdiyi kimi yerləşdirdi, çünki EkoR I GAATTC-ni tanıyır, hansı ki, birbaşa kəsilmə yerindən əvvəl görülən nukleotid ardıcıllığıdır.

B) Tələbənin necə əlavə edə bildiyini izah edin Hind onun gel nəticələrinə əsasən bu mövqedə III məhdudlaşdırıcı ferment site.

Tələbə əlavə edə bildi Hind III məhdudlaşdırıcı fermenti bu sahəyə göndərir, çünki o, kəsilmiş yerdən birbaşa əvvəl nümunə olan AAGCTT nukleotid ardıcıllığını tanıyır. tərəfindən edilən kəsiklər EkoR tərəfindən edilən bu kəsimə qarışmazdım Hind III məhdudlaşdırıcı ferment.

4. Müxtəlif məhdudlaşdırıcı fermentlər müxtəlif növ bakteriyalardan təcrid olunur. Sizcə bakteriyalar məhdudlaşdırıcı fermentlərə malik olmaqla hansı üstünlükləri əldə edir?

Məhdudiyyət fermentlərinə malik olmaqla, bakteriyalar işğalçı viruslardan qoruna bilir. Məhdudiyyət fermentləri yad DNT-ni kəsir, ev sahibi DNT isə modifikasiya fermenti ilə qorunur.

5. Laboratoriyanızda DNT nümunələrinizi 0,8% agaroza gel üzərində apardınız. Nümunələrinizi daha yüksək faizli agaroza gel üzərində işlətsəniz, eyni nəticələr əldə edərdinizmi? Niyə və ya niyə?

Xeyr, nəticələr eyni olmayacaq. Yüksək faizli agaroza gel geldə daha kiçik məsamələrin əmələ gəlməsi ilə nəticələnəcək. Bu halda, DNT fraqmentləri düzgün istiqamətlənməyəcək.

6. Əgər gelinizi qara rəngin yerinə qırmızı elektrodun yanında DNT olan quyuları olan elektroforez kamerasına yerləşdirsəniz, nə olacağını təxmin edin.

Parçalar çox güman ki, əks istiqamətdə miqrasiya edəcək və beləliklə, geldə sıxışdıqları üçün çox da uzaqlaşa bilməyəcəklər.

7. Əgər DNT parçasını iki tanınma yerində kəsən məhdudlaşdırıcı fermentiniz varsa, bir geldə neçə DNT fraqmenti görərdiniz?

Bir geldə 3 DNT fraqmenti görünəcəkdi.

8. Hind III altı nukleotid ardıcıllığını (AAGCTT) kəsmə yeri kimi tanıyır. Bu ardıcıllığın təsadüfi bir DNT zəncirində baş vermə ehtimalı nədir?

2048-ci ildə şans 1-dir.

10. Aşağıda gel elektroforezində iştirak edən komponentlərin siyahısı verilmişdir. Hər bir komponentin məqsədini qısaca təsvir edin.

Agaroza gel - DNT fraqmentlərinin keçdiyi bir mühit təmin edir

TBE Bufer - cərəyanı bir elektroddan digərinə keçirir

Elektroforez kamerası - geli, tamponu, DNT nümunələrini saxlayır

Enerji təchizatı - cərəyanı təmin edir

DNT nümunələri - agaroz gel elektroforezindən istifadə edərək ölçüsünə görə ayırmağa çalışdığınız DNT fraqmentlərini ehtiva edir

DNT ləkəsi - parçaların görünməsinə imkan verir

12. DNT barmaq izini aparmaq və cinayət təhqiqatında iştirak edən günahkar şübhəlini müəyyən etmək üçün elektroforezdən istifadə etmisiniz. Elektroforez üçün başqa bir istifadəni araşdırın və bu texnologiyadan istifadənin faydalarını qısaca təsvir edin.

Elektroforez genetika və klonlaşdırma dünyasında çox faydalıdır. O, genetiklərə DNT-nin daha aydın təsvirini təqdim edir, həmçinin onu klonlaşdırma və gen mühəndisliyi üçün hazırlamağa kömək edir.


Nə üçün bakterial hüceyrə məhdudlaşdırıcı ferment yad geni parçalamır? (08/08/2005)

Nə üçün bakteriya hüceyrəsini məhdudlaşdıran ferment ona daxil edilmiş heç bir yad geni parçalamır?
sintetik gendən istifadə etdikdə nə baş verir?

Bəlkə də bu sualı DNT metilasiyası, xromatin və histon modifikasiyası müzakirə qrupunda verməlisiniz

salam
Düşünürəm ki, transformasiya edəndə DNT-nin bir hissəsi həzm olunur. Lakin siz plazmidi kəsilməmiş saxlayan bakteriyaları seçdiyiniz zaman həzm olunan DNT-nin nisbətini ölçə bilməzsiniz.
Mən buna əmin deyiləm, amma bu, bir nöqteyi-nəzərdəndir.

Düşünürəm ki, cavab odur ki, genin plazmidə daxil olmasıdır ki, bu da bakteriyaların adətən genləri digər bakteriyalarla dəyişdirmək üçün istifadə edir.

Normalda plazmid məhdudlaşdırıcı ferment tərəfindən həzm olunur, lakin adətən molekulyar biologiyada istifadə olunan plazmidlər antibiotiklərə qarşı müqavimət genini ehtiva edir, buna görə də mühitinizə bir antibiotik əlavə etsəniz, bakteriya antibiotiklərə qarşı müqavimət genini ifadə etmək üçün plazmiddən istifadə etməyə məcbur olur. buna görə də plazmidin sağ qalmasını təmin edəcək.

salam
Əvvəlki yazıma əlavə etmək istəyirəm ki, plazmidlərin əksəriyyətinin bakteriyalar tərəfindən xarici DNT növü kimi tanınmadığını düşünürəm. Əslində, onlar bakteriyadakı digər plazmidlərlə müqayisə etməyə imkan verən replikasiya mənşəli və müvafiq ölçüyə malikdirlər. Aydındır ki, medianıza ampisilin əlavə etdiyiniz fakt plazmidinizi öldürən bakteriyaların çıxarılmasını təmin edir.

Əvvəlki ipucum DNT-nin mtilləşdiyindən qaçmaq idi. Anladığım budur
Plazmid DNT-nin Bakteriofaq kimi həzm olunmur, çünki o, ev sahibi genomik DNT kimi metilləşir, bu da onun çeynənilməsinin qarşısını alır. Mən buna 100% əmin deyiləm, amma 90%-dən çoxam.

Bunun məhdudiyyət saytı ilə əlaqəsi varmı? Mən kəsmək üçün məhdudlaşdırıcı ferment tərəfindən tanınması lazım olan motivi nəzərdə tuturam.
Ola bilsin ki, xarici genin bakterial hüceyrə məhdudlaşdırıcı fermenti üçün məhdudlaşdırıcı sahə yoxdur, buna görə də o, parçalanmır.
Mən səhv edə bilərəm.

Hədəf orqanizmin aktiv fermentlərinə uyğun gələn məhdudlaşdırma yerləri olan plazmidlər kəsilir. coli RE əksər laboratoriya ştammlarından getdi, ona görə də biz bu haqda çox düşünmürük. Hüceyrənin genomik DNT-sini qoruyan metilazla metilləşməmiş DNT-ni kəsən RE arasında yarış var. Bəzən metilaz qalib gəlir və plazmid sağ qalır, lakin bu, RE (və ya plazmiddə RE sahəsi) olmadıqda baş verənlərlə müqayisədə aşağı effektiv çevrilmədir.

İstifadə etdiyiniz batareyanın ştamından asılı olaraq, bəli siz DNT-nin metilasiyası əldə edirsiniz.

lakin DH5 və bənzərləri kimi adi bakteriya xətləri ilə onlar adətən Dam və Dcm metilaz mənfi olurlar, ona görə də onların qarşısını alan metilasiya deyil.


Niyə məhdudlaşdırıcı fermentlər dondurulmur? - Biologiya

C2005/F2401 '10 -- Mühazirə 1 7 -- Son redaktə: 12.11.10 13:45 (Görüləcək problemlər burada göstərilmişdir qırmızı qalın. )
Müəlliflik hüququ 2010 Mowshowitz və Lawrence Chasin Biologiya Elmləri Departamenti Kolumbiya Universiteti New York, NY.

Qeyd: Mətnlərə istinadlar Sadava (Purves) 9-cu nəşrdir. & Becker 7-ci nəşr. (Purvesin 8-ci nəşrinə və Bekkerin 6-cı nəşrinə istinadlar fərqlidirsə, mötərizə içərisindədir.) Rekombinant DNT Purves və Beckerin müxtəlif nəşrlərində müxtəlif fəsillərdə əhatə olunur.

I. Viral Həyat Dövrü və Viral Genetika

A. Transduksiya və (Litik) Viral Həyat Dövrü: Viral həyat dövrü üçün 17A və ya Sadava şək. 16.4 (13.3). Transduksiya üçün Becker şək. 20-18b (20-19b). Həyat dövrü ilə bağlı diqqət edilməli olan əsas məqamlar aşağıdakılardır:

1. Struktur & Ətalət -- Viruslarda bir növ nuklein turşusu (DNT və ya Genetik məlumat kimi xidmət edən tək və ya cüt zəncirli RNT və zülal qabığı (və ya baş). Virusların genetik məlumatı var, lakin onu ifadə etmək üçün heç bir vasitə yoxdur - ribosom yoxdur, ATP yaratmaq üçün heç bir yol yoxdur.

2. Host Xüsusiyyəti qabıq zülalından asılıdır -- Virusun ev sahibi hüceyrə səthinə bağlanması virusun səthi zülalındakı tamamlayıcı strukturlar ilə virusun hücum edəcəyi hüceyrələr arasında uyğunluğu tələb edir, əsasən bu qarşılıqlı təsirlərlə müəyyən edilir.

Qeyd: Virionlar (virus hissəcikləri) müxtəlif formalarda olur. (Bax: Sadava şək. 26.25 (13.2)) Sinifdə göstərilən model virus kimi (və ya Sadava şək. 16.2) həm “başı”, həm də “quyruğu” olan viruslarda baş deyil, adətən quyruq olur. , hüceyrə səthinə bağlanan viriondan.

3. Virus necə ələ keçir . Bir çox viruslarda ev sahibi hüceyrəyə yalnız nuklein turşusu daxil olur. İçəri girdikdən sonra viral nuklein turşusu öz genetik məlumatının transkripsiyasına və tərcüməsinə kömək etmək üçün ev sahibinin fermentlərindən (və ATP) istifadə edir. Viral genetik məlumat materialların (əsasən zülalların) sintezini, ev sahibinin çoxalması hesabına özünün çoxalmasına kömək edir. Bəzi viruslar ev sahibinin DNT-sini parçalayan zülallar, digərləri isə ana hüceyrəni parçalamağa (açmağa) kömək edən fermentlər əmələ gətirir və s. Bax Sadava şək. 16.3 (13.4) bakteriofajın (bakterial virusun) ənciri necə ələ keçirməsi haqqında. Daha mürəkkəb insan viruslarının dövrləri üçün 16,6 (13,5 & amp 13,6).

4. Montaj Xəttinin Reproduksiyası . Viruslar ümumiyyətlə montaj xətti ilə çoxalır -- onlar bütün hissələrin (nuklein turşusu və struktur zülalları) ehtiyatlarını yaradırlar və sonra onları son addım kimi yığırlar. Ölçüləri ikiqat artır və sonra hüceyrələrin yarısına bölünürlər. Bu öz-özünə yığılma üsulu o deməkdir ki, rekombinant viruslar ayrı-ayrı zülal mənbələrindən + nuklein turşusundan (laboratoriyada dəyişdirilmiş) sınaq borusuna yığıla bilər.

5. Lytic Cycle və Lövhələr.

a. Virusların çoxalması bir dövrdür. Bir virus hissəciyi hüceyrəni yoluxdurur, virus hüceyrə daxilində çoxalır, yoluxmuş hüceyrə qonşu hüceyrələri yoluxduran nəsil virus hissəciklərini buraxır və s. Bir çox viruslar lizis (açılır) və ev sahibi hüceyrələrini öldürür, digərləri isə ana hüceyrəni öldürmür, əksinə virus hissəciklərinin tökülməsinə səbəb olur.

b. Lizis. Ev sahibi hüceyrələr parçalandıqda (açdıqda) və nəsil virus hissəciklərini buraxdıqda, yaranan dövrə litik dövr deyilir. Viruslar bərk bakteriya təbəqəsinin ("a qazon") üstündə böyüyürsə, nəticə lövhə -- qazonda nəsil viruslarla dolu bir deşikdir. Petri qabının üzərindəki tək bakteriya koloniya (topaq) əmələ gətirir -- bakteriya çəmənliyinə enən tək bakterial virus lövhə (deşik) əmələ gətirir. Bir koloniya və ya lövhədəki bütün orqanizmlər = klon.

c. "Faq"ın kəşfi. Bakterial viruslar ilk dəfə lövhə əmələ gətirmə qabiliyyətinə görə kəşf edilmişdir. Bakteriyaların qazonunda "sitat" dedikləri üçün onlara "bakteriofaq" adı verildi. (Qeyd: bakteriofaq -- və ya qısaca faq -- termini yalnız bakterial viruslar üçün istifadə olunur. Başqa orqanizmləri yoluxduran viruslara viruslar deyilir., yox faglar.)

6 . Transduksiya --Viral çoxalmanın montaj xətti üsuluna görə, bakterial nuklein turşusu parçaları bəzən təsadüfən viral örtüyə qablaşdırıla bilər. Belə bir virus "saxta fajdır" -- bu, həqiqətən virus DNT-si deyil, bakterial olan virus örtüyüdür. Əgər belə (saxta) virus hissəciyi başqa ev sahibini yoluxdurarsa, bakterial DNT-ni ikinci anaya çatdırır və alıcı hüceyrəni məhv etmir. Bu, transduksiya hadisəsidir -- virus bakterial DNT köçürməsinin istəmədən agenti kimi çıxış etmişdir. (Sədava 8-ci nəşr. şək. 13.13 (b))

Litik dövrü nəzərdən keçirmək üçün problem 11-4-ə baxın.

B. Lizogen sikl Bax 17A, Sadava şək. 16.4 (13.3) və ya Becker Box 18A, esp. şək. 18A-4.

1. İnteqrasiya. Bəzi viruslar viral DNT və bakterial DNT arasında keçid edərək ana xromosomun bir hissəsi ola bilər -- proses F faktoru kimi plazmidin bakterial xromosomla birləşməsinə paraleldir. (Viruslar, plazmidlər kimi, bu prosesin əksinə olaraq bakterial genləri götürə bilər.)

2. Lizogenez. İnteqrasiya edilmiş virus uzun müddət hərəkətsiz qala bilər. Bu hərəkətsiz vəziyyət lizogeniya kimi tanınır və inteqrasiya olunmuş, hərəkətsiz, virusu olan bir bakteriya lizogen (litik dövrə daxil ola bilir) deyilir. Virusun viral zülalların əmələ gəlməsinə və litik dövrəyə girməsinə nə mane olur? Virusun özü tərəfindən hazırlanmış repressor protein. (Bu repressor zülal allosterik deyil, onu təsirsiz hala gətirmək üçün məhv edilməlidir. Repressor zülalının deqradasiyası virusun hərəkətsiz vəziyyətdən çıxmasına və litik dövrəyə daxil olmasına imkan verir.) Jacob, Lwoff, & Monod 1965-ci ildə fiziologiya üzrə Nobel mükafatını aldılar. repressorların həm operonları, həm də lizogeni necə idarə etdiyini anlamaq.

1. Əks transkriptaza ehtiyac: Bunlar viral hissəcikdə RNT olan viruslardır (mütləq prokaryotlardan deyil). RNT hüceyrəyə daxil olduqda, RNT-nin DNT surətini çıxarmaq üçün virusun yaratdığı xüsusi fermentdən, əks transkriptazadan istifadə edir. (Tərs transkriptaza viral hissəciyin içərisindəki ev sahibinə aparılır. O, əvvəlki ana hüceyrədə yaradılmışdır.) Daha sonra DNT ana xromosomuna daxil olur və lizogen virusla eyni şəkildə hərəkətsiz qalır. HİV, QİÇS-ə səbəb olan virus insan retrovirusudur.

2. Əks transkriptazın əhəmiyyəti: Retroviruslardan əldə edilən əks transkriptaza laboratoriyada RNT-nin DNT nüsxələrini hazırlamaq üçün mühüm alət kimi istifadə olunur. (Nümunələr növbəti dəfə müzakirə olunacaq.) HİV-in həyat dövrü üçün Sadava şək. 16,6 (13,6). 1975-ci ildə Fiziologiya üzrə Nobel Mükafatı 1975-ci ildə Dulbekko, Temin və Baltimora viruslara səbəb olan şişlərdə əks transkriptazın kəşfinə görə verildi.

D. Viral xaçlar -- Komplementasiya və rekombinasiya viruslarla, eləcə də bakteriyalarla baş verə bilər. Hüceyrə eyni vaxtda eyni virusun iki variantı (mutant) ilə yoluxmuşdursa, infeksiya zamanı iki virus arasında keçid və/yaxud komplementasiya baş verə bilər. Tamamlama haqqında ətraflı məlumat üçün sonuncu mühazirə, VI-B və paylama materialı 16B-ə baxın (və tamamlama və rekombinasiyanı necə ayırd etmək olar).

Viruslarla xaç nümunəsi üçün 11-8 probleminə baxın. (Viruslarda komplementasiya və rekombinasiya ilə bağlı əlavə problemlər üçün 11-10-dan 11-13-ə baxın.)

Bax Bekker əncir. Viruslarda rekombinasiya üçün 20-17 (20-18). (RNT genomu 8 hissəyə bölünmüş qrip virusu halında yenidən çeşidləmə də baş verə bilər. Ətraflı məlumat üçün CDC səhifəsinə baxın. RNT virusunun həyat dövrü üçün Sadava 8-ci nəşr, şək. 13.5 (13.4)


II. Məhdudiyyət fermentləri

A. Giriş: İdeya/problem: Bakterial genləri daşıyan plazmidlərin və bakteriofaqların mövcudluğu gen mühəndisliyi xəyallarını ilhamlandırdı. Niyə sifariş vermək üçün yeni kombinasiyalar hazırlamırsınız? Beləliklə, biz faydalı genlərlə plazmidlər yarada və onları bakteriyalara (və ya hətta insan hüceyrələrinə) əlavə edə bilərik! Bəs laboratoriyada rekombinant plazmidləri necə düzəldə bilərsiniz? DNT çox, çox uzundur. Onu faydalı ölçülü parçalara necə kəsmək, düzgün parçaları tapmaq, onları bir-birinə yapışdırmaq və s. necə edə bilərsiniz. Həll o zaman heç bir praktiki nəticəsi olmayan məhdudiyyət kimi tanınan bir fenomeni izləməklə tapıldı (aşağıda təsvir olunur).

B. Məhdudiyyət və modifikasiya fermentlərinin kəşfi Bax Becker Box 18B və/və ya Sadava şək. 15.7 (16.1).

1. Fenomen: Bəzi faqlar müəyyən bakteriyalarda yaxşı inkişaf edir, digərləri isə yox. Misal üçün:

a. Virus V A tipli bakteriya → çoxlu nəsilləri yoluxdurur.

b. Virus V B tipli bakteriyaları yoluxdurur → çox az nəsil.

Fagların (virusların) böyüməsinin B tipli bakteriyalarda "məhdudlaşdırıldığı" deyilir (b halı). Lakin təsadüfi virus hissəcikləri məhdudiyyətlərə baxmayaraq infeksiyanı tamamlayır və B tipli bakteriyanı parçalayır. B tipini yoluxdurmaq üçün bu "çox az nəsil"dən birini istifadə etsəniz nə olar?

c. Əgər (b)-dən bir neçə nəsildən birini götürsəniz və B tipli bakteriyalara yoluxsanız → çoxlu nəsil.

Başqa sözlə, parçalanmış B tipli hüceyrədən olan nəsil faqı B tipində yaxşı inkişaf edir -- onlar artıq məhdudlaşdırılmır.

Təəccüblü olan odur ki, virus DNT-sindəki əsasların ardıcıllığı məhdudiyyətdən əvvəl və sonra eynidir! Başqa sözlə, Virus V-nin bütün nəsli eyni DNT ardıcıllığına malikdir, istər orijinal virusu, istər (a)-dan olan nəsli və ya (b)-dən olan nəsli yoxlayın. Burda nə baş verir? Həll bütün gen mühəndisliyi və rekombinant DNT texnologiyasının açarını özündə saxlayır və onu kəşf edən alim (Arber) Arberin işini genişləndirən digər iki alim (Smith & Nathans) ilə birlikdə 1978-ci ildə Nobel mükafatı aldı.

2. Məhdudlaşdırıcı fermentlər. Məhdudiyyətə nə səbəb olur?

    Məhdudiyyət fermentləri nədir? Bakteriyalarda DNT molekullarını müəyyən ardıcıllıqla kəsən endonükleazlar var. (Əvvəllər məlum olan bütün endonükleazlar təsadüfi şəkildə kəsilir.) Bu fermentlərə məhdudlaşdırıcı fermentlər və ya məhdudlaşdırıcı endonükleazlar deyilir.

3. Modifikasiya fermentləri. Nə üçün bakteriyalar öz məhdudlaşdırıcı fermentlərinə "immunitetlidir"? Niyə məhdudlaşdırıcı fermentlər bakteriyanın öz DNT-sini kəsmir?

  • Modifikasiya fermentləri: Bakteriyaların DNT-ni dəyişdirən ikinci fermentlər dəsti var -- bu fermentlər DNT-dəki xüsusi ardıcıllıqlara metil qrupları əlavə edir -- məhdudlaşdırıcı fermentlər tərəfindən kəsilən eyni ardıcıllıqlar.
  • Modifikasiyaların rolu: Bu modifikasiyalar bakterial DNT-ni məhdudlaşdırıcı fermentlərə qarşı davamlı edir.
  • Substrat nədir? Modifikasiya fermentləri normal olaraq yalnız hemi-metilləşdirilmiş DNT-yə metil qrupları əlavə edir -- bir zəncirdə metilləşir, digərində deyil.
  • İrsiyyət: Metilasiya vəziyyəti irsi xarakter daşıyır. Metilləşdirilmiş DNT replikasiya edildikdə, məhsul hemi-metilləşir -- yeni zəncirdə metil qrupları yoxdur. Yeni zəncir düzəldildikdən dərhal sonra modifikasiya fermentləri tərəfindən metilləşdirilir. Metilləşməmiş DNT replikasiya edildikdə, heç bir metil qrupu əlavə edilmir. Beləliklə, DNT-nin vəziyyəti (metilləşdirilmiş və ya olmayan) qurulduqdan sonra nəsildən-nəslə saxlanılır.
  • Terminologiya -- epigenetika. Məhdudiyyətin irsi (yaxud metilasiya nümunəsi) 'epigenetik' deyilir. DNT ardıcıllığı dəyişdirilmir, lakin DNT dəyişdirilir. DNT-nin dəyişdirilmiş vəziyyəti sabitdir və vəziyyət irsi olaraq keçir. Epigenetik dəyişikliklərin öyrənilməsi hazırda çox aktual tədqiqat mövzusudur. (Aşağıda 5-ə baxın.)

4. Nadir virus hissəcikləri məhdudiyyətdən necə xilas olur? Əgər DNT təsadüfən metilləşdirilibsə, o zaman hər dəfə təkrarlananda metilləşəcək. Nadir hissəciklərdə təsadüfən metilləşdirilmiş DNT var. Buna görə də nadir virus hissəciklərinin DNT-si və onların nəsli məhdudlaşdırıcı fermentlərə davamlıdır.

5. Ümumilikdə dəyişiklik: Makromolekulların fermentativ olaraq kiçik və ya iki qrupun əlavə edilməsi və ya çıxarılması ilə modifikasiyası, xüsusilə eukariotlarda çox geniş yayılmışdır.

a. Funksiya: Modifikasiya daimi və ya müvəqqəti olaraq makromolekulyar funksiyanı tənzimləmək və/və ya incə tənzimləmək üçün ümumi üsuldur (bir çox modifikasiyalar geri çevrilə bilər).

b. İndiyə qədər nümunələr (geri dönməz): zülalların amin ucundan metin çıxarılması tRNT-də A əsasının I bazaya çevrilməsi.

c. Növbəti dövr müzakirə olunacaq nümunələr (qaytarıla bilən): bir çox fermentlər fosfat qruplarının əlavə edilməsi ilə aktivləşdirilir və ya inhibə edilir, DNT-nin bəzi bölmələri metil qruplarının DNT-nin özünə və ya əlaqəli zülallara (histonlara) əlavə edilməsi yolu ilə "off" saxlanıla bilər. Bu nümunələrin təfərrüatları (və bir çox başqaları) növbəti semestrdə olacaq.

C. Məhdudiyyətli fermentlərin nümunələri və xüsusiyyətləri (Təfsilatlar 17D və Becker Box 18B-də)

1. Məhdudiyyət yerləri çox vaxt palindromlardır (= eyni şeyi irəli və geri oxuyun)

DNT nümunəsi üçün "eynini geri və irəli oxuyur" ilə nəyi nəzərdə tuturuq? Bunu izah etməyin bir neçə yolu var:

a. Əsas ardıcıllıqla. Hər iki ardıcıllıq 5'-dən 3'-ə qədər oxunsa, iki fərdi teldəki ardıcıllıqlar eynidır.

b. Baza cütləri ilə. Əsas cütlər eynidir, sağdan sola və soldan sağa "top" ipi həmişə 5'-dən 3'-ə qədərdir.

c. Fırlanma yolu ilə. Əgər DNT-ni 180 dərəcə çevirsəniz, tam olaraq eyni görünür.

2. Sonların vəziyyəti. Cuts made by restriction enzymes can be staggered (generating so called "sticky ends") or blunt (see handout 17D or Becker Box 18B for examples)

3. Sites can sometimes be methylated -- this makes the sites resistant to cutting. (See Modification enzymes, above.)

4. There are a wide variety of restriction enzymes made by different bacteria . (See handout or texts for some examples.)
Therefore there are many different options for cutting up any given DNA. Misal üçün:

  • Some enzymes recognize relatively short sequences. For example, an enzyme may be a "4 cutter" = enzyme that recognizes a 4 base pair site. (See handout.) Short sites (sequences) are found more often, and enzymes that cut them produce many relatively short fragments.
  • Some enzymes recognize longer sequences. Longer sites are found less often, and enzymes that cut them produce a smaller number of relatively long fragments.

D. Significance of Restriction enzymes = Essential tools for Recombinant DNA Analysis

1. Allows you to cut up DNA into manageable size pieces for manipulation and analysis.

a. Most DNA is very long. Without some sort of breakage, most DNA molecules are too big to handle.

b. Before this, all known DNases cut at random → big mess (random collection of different sized pieces).

c. Restriction enzymes cut DNA into fixed size pieces. Pieces resulting from restriction enzyme digestion can be separated by size using gel electrophoresis. (Sadava fig. 15.8 (16.2) or Becker fig. 18-12.) Principle is similar to SDS gel electrophoresis, except no SDS is used -- all nucleic acids are negatively charged and migrate to the positive pole -- smaller fragments travel farther. (Same procedure as used for analysis of PCR products.)

2. Joining. Existence of "sticky ends" allows you to join, not just cut, DNA's readily, using overlapping ends and ligase. This allows you to make new, recombinant molecules in a test tube. See handout 17B (= Becker fig. 20-25 [20-26]) or Sadava fig. 18.2 (16.8) Why is this helpful? Allows molecular cloning, as will be explained next time. (See 17B for an overview.)

3 . Forensics/ IDs & RFLPs

  • PCR method for DNA fingerprinting (described previously) picks up differences in the numbers of repeats in a particular region. (between primers).
  • To use PCR, you have to know enough about the DNA to make the correct primers. No primers are needed for this method.
  • This method picks up differences in length -- for any reason -- between restriction sites. Variations in length can be due to differences in the restriction sites themselves (as in problem 13-3 ) or to differences in the length of the sequences between the restriction sites.
  • Additional uses of RFLPs will be explained in detail later, after human genetics.

To review restriction enzymes, try Problems 13-1 & 13-2 parts B & C, 13-3, & 13-8 A. (Problem 13-8 is not in older editions of the problem book the '08 version was revised for '09. For a complete copy of the 2009/10 version, go to the update page or prob 13-8for09.) To review RFLPs try 13R-4, parts A & B. (Homozygous means both copies of the gene in a diploid, such as a human, are the same.)

A. What's a probe? It's a nucleic acid that's complementary to the target sequence you are looking for, and it is usually labeled or tagged in some way -- with radioactivity, fluorescence, or something else that's relatively easy to detect . Probe may consist of single stranded DNA or double stranded DNA. (Double stranded DNA must be denatured before it will hybridize to the target DNA.)

B. Why would you need a probe?

To find the right piece of DNA -- the piece from a particular part of the genome. If you cut up genomic DNA, you will have many pieces of DNA, and you want to find all the ones carrying a particular sequence. For example, to detect an RFLP (such as the one shown on handout 17D), you need to look at DNA from that particular part of the genome. But if you cut up the total DNA of an organism, you get many, many pieces. How will you find the right pieces, that is, the ones carrying a particular gene or section of the DNA where the RFLP is? (How will you I know if my DNA is type 1, 2, or 3?)

C. How do you get a probe that is complementary to a particular gene? This will be covered next time. Stay tuned.

A. What's a Blot? -- using probes to detect DNAs that are immobilized on a solid support. DNA does not need to be purified first. Can be released from colonies in place (yerində) or "blotted" from a gel. Once DNA is stuck to a support, it can be denatured while still attached to the support. Then you can add a solution of probe (the complementary, labeled, DNA) and see if probe hybridizes to the denatured DNA. You wash off unattached (unhybridized) probe and see what is left. That allows you to identify band, colony, etc. containing the nucleic acid of interest (= nucleic acid that hybridizes to and/or traps probe.) Blots allow you to test hybridization of probe to many DNA samples at once. (How you use blots to test DNA from colonies will be discussed next time.)

B. Basic procedure for detecting DNA Bands on gels Handout 17C. Italics = terms on HO. How do you find a particular fragment of DNA? The one containing the gene or RFLP you are looking for? See Becker, box 18C or Sadava fig. 15.16 (16.3).

1. Cut DNA up , or do PCR to amplify selected pieces. (If you cut the DNA with restriction enzymes, either cut up the same DNA with several different enzymes, or cut up several different samples with the same enzyme.)

2. Separate pieces on gel (agaroz gel elektroforezi). Consider: Without probe, what would pattern of bands look like? How can you find the band you want without cutting up the whole gel into slices and testing each one? A "Southern Blot" allows you to do this.

3. Blot DNA from gel to paper or plastic (transfer to nitrocellulose.) DNA sticks to the support.

4. Denature DNA (in situ)

5. Add probe (labeled cDNA or RNA)

6. Allow DNA and probe to hybridize in situ. Note: You can use stringent or nonstringent conditions, depending on whether you want a only a perfect match or are looking for approximate matches too.

7. Put blot in dark next to film if label is radioactive

8. Detect bands (look at autoradiograph = developed film use other methods if label is non-radioactive.)

C. Types of Blots (from gels) -- Terminology & Variations -- Southerns, Northerns and Westerns.

1. Southerns -- Cut up DNA, separate DNA fragments by gel electrophoresis, blot, find desired fragment by hybridization to probe.

2. Northerns --Separate RNAs by gel electrophoresis. (RNAs are small enough as is don't cut them up first.) Then blot, hybridize as before.

3. Westerns -- Separate proteins by SDS gel electrophoresis, blot, find desired protein using antibodies specific for that protein.

D. Example of use of Blots -- how to detect the RFLP's on handout 17D. Example will illustrate the following features:

1. Need not purify the DNA of interest first -- you test a mix and locate where in the mix your DNA of interest is. You separate everything first by size (on gels), and then find the position of the piece you are interested in/want. Or you grow up multiple colonies containing different DNA sequences. You don't have to know in advance where the sequence you want will be. Needle in the haystack, but it works! (You spread out the hay in your haystack and glue to a support. Then cover it with magnetic particles and shake off the ones that don't stick. Where there are particles, your needle is underneath. This analogy is nice but misses point that your "haystack" or "needles" are sorted by size when using gels.)

2. Can test many samples at once -- can use multiple wells and/or repeat hybridization to same blot using diff. probes.

3. Probe need not be same length as fragment -- probe can be shorter or longer than target sequence or fragment you are looking for. Probe and target need not be the same length, but there must be overlap, so some region of target hybridizes to probe. Sample must "capture" probe. (Think Velcro.)

To review blots & probes, try problem 13-8, A-C (the '09/'10 version).

Next Time: Anything above we don't get to, and Wrap up of genetic engineering -- how you make a recombinant plasmid, and how you find a cell that got the gene you are trying to clone.
Copyright 2010 Deborah Mowshowitz and Lawrence Chasin Department of Biological Sciences Columbia University New York, NY .


Videoya baxın: Communities (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Torran

    sadəcə mövzuda !!!!)))))))))))))))))))))))))))))))))

  2. Kieron

    Qəti şəkildə razı deyiləm

  3. Owain

    I suggest you go to the site, which has a lot of information on this issue.

  4. Bagul

    Siz səhv edirsiniz. Mənə PM-də yazın, sizinlə danışır.

  5. Waed

    I well understand it. I can help with the question decision.

  6. Noell

    Səhv deyirsən.



Mesaj yazmaq