Məlumat

Stimuldan gen ifadəsinə qədər vaxt

Stimuldan gen ifadəsinə qədər vaxt


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Anladığım kimi, gen ifadəsi, bəzi stimullara cavab olaraq, ümumiyyətlə dəqiqələrdə baş verir. Mən ekstremallarla maraqlanıram... ən sürətli və ən yavaş hallar.

Genlərin bir stimula cavab olaraq ifadə edilməsi üçün qeydə alınan ən sürətli vaxt(lar) neçədir? Ən yavaş vaxtlar hansılardır?


Bildiyim ən sürətli istilik şoku lokusudur Drosophila. Transkripsiya faktoru (HSF) təxminən 30 saniyə ərzində toplanır və RNT Polimerazın 3 dəqiqə ərzində yığılmağa başladığı görülə bilər.

Katie L. Zobeck, Martin S. Buckley, Warren R. Zipfel, John T. Lis. 2010. Canlı Hüceyrələrdə Hsp70 Lokuslarında İşə Qəbul Zamanı və Transkripsiya Faktorlarının Dinamikaları. Molekulyar hüceyrə 40(6): 965-975


Real vaxtda ələ keçirilən gen ifadəsində əsas ilk addımlar

Gözümüzün görə bilməyəcəyi qədər kiçik tərəzilərdə həyatın işi hüceyrələrimizə həm quruluş, həm də funksiya verən zülalların istehsalı ilə baş verir. Hüceyrə zülalları hərəkət əmrlərini DNT-də kodlanmış genetik təlimatlardan alır, onların ardıcıllığı ilk olaraq transkripsiya deyilən çox mərhələli prosesdə kopyalanır və RNT-yə çevrilir.

Kolorado Dövlət Universitetində tədqiqat əməkdaşlığı yüksək ayırdetmə qabiliyyətinə malik flüoresan mikroskopiya və hesablama modelləşdirməsi üzrə ixtisaslaşır ki, bu cür həyati prosesləri incə detallarda, real vaxtda, tək genlər səviyyəsində vizuallaşdırmaq və təsvir etmək. İndi, doktoranturadan sonrakı tədqiqatçı Linda Forero-Quintero-nun rəhbərlik etdiyi elm adamları, ilk dəfə olaraq, RNT polimeraza fermentlərinin bir DNT ardıcıllığına bağlanaraq transkripsiyanı harada, nə vaxt və necə başlatdığını qeyd edərək, erkən RNT transkripsiya dinamikasını müşahidə etdilər.

Jurnalda təfərrüatlı sıçrayış texnologiyası Təbiət Əlaqələri, saysız-hesabsız mümkün fəsadlara malikdir, bunlara əsas bioloji prosesləri daha yaxşı başa düşmək, müəyyən xəstəliklərin genetik əsaslarını açmaq daxildir.

Monfort professoru və biokimya üzrə dosent Tim Staseviç və dosent Brayan Munski ilə məsləhətləşdiyi postdoktoral tədqiqatçı Forero, "Bu, ilk dəfədir ki, kimsə tək nüsxəli gendə RNT polimerazının fosforlaşma dinamikasına baxır" dedi. kimya və biologiya mühəndisliyi üzrə professor. Keçmişdə bu cür erkən transkripsiya fəaliyyəti yalnız bir genin yüzlərlə nüsxəsindən ibarət olan və ümumiyyətlə hüceyrə nüvəsində tapılmayan süni strukturlar olan gen massivlərindən istifadə etməklə vizuallaşdırıla bilərdi.

Stasevich və Munsky W.M. tərəfindən maliyyələşdirilən əməkdaşlığa rəhbərlik edirlər. Keck Fondu və Milli Ümumi Tibb Elmləri İnstitutu (iki Maksimləşdirici Müstəntiqlərin Tədqiqat Mükafatı vasitəsilə) canlı, tək hüceyrələrdə real vaxtda genetik ifadəni ortaya çıxarmaq və kəmiyyətini müəyyənləşdirmək istəyir. Əməkdaşlığın himayəsi altında hər iki laboratoriyada işləyən Forero, əvvəllər nevroloji vəziyyətlərlə əlaqəli hüceyrə membranlarında olan zülalları və daşıyıcıları tədqiq etmişdi.

Erkən transkripsiya fəaliyyəti

-də təsvir olunduğu kimi Təbiət Əlaqələri, Forero et al. ilkin transkripsiya prosesini canlı rənglərdə: mavi, yaşıl və qırmızıda çəkmək üçün müəyyən edilmiş məməli hüceyrə xətti, mühəndis flüoresan antikor fraqmentləri və xüsusi super rezolyusiyaya malik mikroskopdan istifadə edərək bir üsul hazırladı. Daha dəqiq desək, onlar RNT polimeraza II (RNAP2) transkripsiya fermentinin amin turşusu quyruğunda fosforilləşdiyi və ya fosfat qrupları ilə bəzədildiyi zaman baş verən transkripsiya dövrünün başlanğıcını müşahidə etdilər.

Əməkdaşlığın hesablama aspektlərinə nəzarət edən Munski dedi: "Burada fənlərarası elm yeni eksperimental imkanların və təkhüceyrəli dinamikanın mexaniki hesablama modelləşdirilməsi üçün yeni yanaşmanın fantastik qarışığıdır, hər ikisi öz sahələrində çox yenidir" dedi. .

Laboratoriyada tədqiqatçılar antikor fraqmentlərini transkripsiya edildikdə flüoresan işarəli zülal tərəfindən işıqlandırılan müxbir geni ehtiva edən müəyyən edilmiş məməli hüceyrə xəttinə yüklədilər. Staseviçin bir neçə il əvvəl inkişafına kömək etdiyi antikor fraqmentləri, RNAP2 quyruğunda xüsusi hədəflərini işıqlandıran flüoresan molekullarla işarələnmişdir. Bu etiketləmə texnologiyalarından birlikdə istifadə edərək, tədqiqatçılar transkripsiya dövründə müxtəlif rənglərlə qeyd olunan üç fərqli addımı ayıra bildilər. Bu sistemlə əldə edilən şəkillər flüoresan intensivliyinin dəyişməsinə çevrilir. Tədqiqatçılar daha sonra bu siqnallardan tək nüsxəli gendə transkripsiya dövrü boyunca RNAP2 fosforilasiyasının məkan-zaman təşkilini şərh etmək üçün istifadə etdilər.

Hesablama modeli vasitəsilə yeni məlumatlar

Aspirant Uilyam Raymondun rəhbərlik etdiyi Munskinin komandası Forero və Staseviçin mikroskop məlumatlarını götürdü və stoxastik diferensial tənliklərə əsaslanan hesablama modelinə çevirdi. Bütün eksperimental nəticələrin təkrar istehsalı üçün bu statistik modeli uyğunlaşdıraraq, hesablama qrupu daha sonra transkripsiya prosesi vasitəsilə müxtəlif molekullar və onların vəziyyətləri haqqında yeni mexaniki və kəmiyyət məlumatları toplamaq üçün təhlillərini genişləndirdi.

Məsələn, onlar DNT-nin promotoru bölgəsində keçici qruplar yaratmaq üçün neçə fərdi RNT polimeraza molekulunun toplandığını, bu qrupların nə qədər davam etdiyini və polimerazaların DNT boyunca necə, nə vaxt və harada paylandığını təxmin etdilər. Onlar, məsələn, aşkar etdilər ki, transkripsiya fəaliyyətinin hər bir partlayışı genin promotor bölgəsi ətrafında əmələ gəlmək üçün beş ilə 40 arasında RNT polimerazadan ibarət klaster əmələ gətirir və onların 46%-i sonda RNT-ni transkripsiya etməyi bacarır. Onlar həmçinin aşkar ediblər ki, hər bir RNT-nin buraxılmadan əvvəl tam transkripsiyaya və emal edilməsinə təxminən beş dəqiqə vaxt lazımdır.

Forero deyir ki, bu texnologiya, xüsusən də xüsusi genlərin seçilə və manipulyasiya edilə biləcəyi CRISPR kimi yeni texnologiyalarla birlikdə geniş potensiala malikdir. Maraqlanan müəyyən bir genin seçilməsi, deyək ki, xəstəliyə aid olan bir genin seçilməsi və CSU tədqiqatçılarının transkripsiya dövrünün real vaxt rejimində oxunuşunu tətbiq etmək tədqiqatçılara tək genlərin fəaliyyət səviyyəsində baş verən xəstəlik proseslərini izləməyə imkan verə bilər.

Forero, "Transkripsiya dövrünün məkan və zaman dinamikasını bir gendə həll etmək qabiliyyəti bu işin ən maraqlı tərəfidir" dedi.


Eukaryotik gen ifadəsinin mexanizmi | Genetika

Bu yazıda biz eukaryotik gen ifadə mexanizmini, xüsusən də insanlarda müzakirə edəcəyik.

1. Çoxhüceyrəli orqanizmdə hər bir hüceyrə öz genlərinin bir hissəsini ifadə edir.

2. Hüceyrə böyümə vəziyyətindən və ya mühitindən asılı olaraq müxtəlif genləri ifadə edir.

3. Bəzən gen transkriptləri müxtəlif hüceyrələrdə fərqli şəkildə birləşir.

4. Hər bir gen təkcə struktur məlumat və şimasiya deyil, həm də onun məkan və zamanda düzgün ifadəsi üçün göstərişlər daşıyır.

5. Prokariotlarda (promotor) olduğu kimi, eukaryotik genlərin də 5 tərəfli bölgəsində com­mon motivini paylaşdıqları aşkar edilmişdir.

6. Vacib motivlərdən biri TATAA ardıcıllığı idi, tez-tez transkripsiyanın başlanğıcına qədər təxminən 25-30 bp 5′ tapılır (bu ardıcıllıq bakteriya promotorunda -10 elementinə bənzəyirdi).

7. Genlərin yuxarı axınında adətən tapılan digər ardıcıllıqlara CCAAT və GGGCG (GC qutuları) daxildir.

8. CCAAT və GC qutusunun mövqeyi dəyişkən idi, lakin onlar həmişə TATAA ilə müqayisədə -genindən daha uzaqda idilər.

9. Bu üç ardıcıllığın hamısı eukaryotik transkripsiyaya nəzarət edir.

10. Gücləndiricilər ümumiyyətlə 50-150 bp uzunluğunda olan hüceyrə genlərində tapılan digər ardıcıllıqdır.

11. Ümumilikdə tək qısa ardıcıllıqdan ibarət olan bakterial promotor elementlərdən fərqli olaraq motiv gücləndiriciləri daha çox mürəkkəbdir və gücləndiricidə lazımsız alt elementlər var.

12. Gücləndiricilər toxumalara xasdır və/yaxud siqnallarla tənzimlənir.

13. Gücləndiricinin əsas funksiyası hüceyrə transkripsiya faktorlarını bağlamaqdır.

14. Ümumiyyətlə iki geniş növ zülal faktoru vardır ki, onlardan bəziləri bütün promotorlarda başlanğıc üçün tələb olunan ümumi amillər kimi tanınır, digərləri isə gen-spesifikdir və yalnız müəyyən təşviqatçılar üçün tələb olunur.

15. Müxtəlif ümumi amillərdən, TATAA ardıcıllığına bağlanan transkripsiya və şitlik faktoru II D (TF IID).

16. Əslində gen spesifik transkripsiya faktorları DNT quşçuluq zülallarıdır.

17. Gücləndiricilər uzun məsafələrdə gen ifadəsini aktivləşdirmək xüsusiyyətinə malikdirlər.

18. Transkripsiya faktorlarında iki funksional sahənin olduğu aşkar edilmişdir, biri DNT-yə bağlanma və utanma, digəri isə transkripsiya aktivləşdirmə və utanma.

19. Trans və şiskripsiya faktorlarının DNT-ni bağlayan sahəsi əsasən ilkin amin turşusu ardıcıllığına əsaslanan bir neçə struktur ailəyə bölünür.

20. Transkripsiya faktorları 5 əsas kateqoriyaya bölünür:

(a) Homeodomain proteini:

Bunlar prokaryotik DNT-ni bağlayan və utandıran proteinə çox bənzəyir.

(b) Sink barmaq proteini:

Təkrarlanan sistein və histidin motivlərinə malikdir və onun üçölçülü strukturu sink ionu ilə koordi-şinatdır. məs. TFIIIA RNT Polimeraz III üçün faktordur.

(c) Leucine Fermuar zülalı:

4-5 lösin qalıqları fermuar kimi bir dimer meydana gətirərək təkrarlanır.

(d) Helix-Ioop-helix (HLH) Proteini:

Struktur olaraq bunlar lösin fermuarına çox bənzəyir, lakin burada lösin təkrarı yoxdur,

(e) Qanadlı spiral (çəngəl) zülalı:

H5-də (histon) DNT bağlayıcı domen.

21. Transkripsiya faktorları moduldur, yəni bir faktorun aktivləşmə sahəsi digərinin DNT-ni bağlama domeninə birləşdirilə bilər və nəticədə yaranan hibrid zülal hüceyrələrdə tam aktivdir (bu çarpaz bağlanma cAMP tərəfindən tənzimlənən stimul və şitilasiya ilə bağlı ola bilər).

22. Eukariotlarda 3 növ RNT Polimeraza var, bunlar:

(a) RNT Polimeraz I: rRNT-nin transkripsiyası.

(b) RNT Polimeraz II: mRNT-nin transkripsiyası.

(c) RNT Polimeraz III: tRNT və digər kiçik nüvə və sitoplazmik RNT-nin transkripsiyası.

23. Müxtəlif RNT Polimeraz üçün müxtəlif transkripsiya faktorları və həmçinin transkripsiyaya nəzarət etmək üçün müxtəlif növ promotorlar mövcuddur. RNT Polimeraz I və II halında, transkripsiya, ümumiyyətlə, müvafiq genin yuxarı və ya aşağı axını olan bəzi ardıcıllıqla (məsələn, TATAA, GC qutusu, CCAAT qutusu və s.) tənzimlənir və tənzimlənir, RNT Polimeraz III transkripsiyası isə ardıcıllıqla tənzimlənir. genin ortasında.

Aşağıda bəzi transkripsiya faktorlarının siyahısı verilmişdir:

24. Eukaryotik genomun təşkili kimi, yəni xromosom DNT-si əsas vahidi nukleosom olan (ətrafında 200 bp DNT-nin mövcud olduğu səkkiz histon zülalından ibarət kompleks) olan yüksək dərəcəli nukleoprotein strukturlarına sıx şəkildə yığılmışdır. Transkripsiya amilləri DNT-ni nukleosomdan azad etmək üçün hərəkət edə bilər ki, promotor böyük transkripsiya kompleksinə əlçatan olsun.

25. İndi qəbul edilir ki, rRNT-nin mRNT-nin trans&şilasiyası zamanı mühüm funksional rolu var və zülal zəncirinin başlaması, uzanması və bitməsi zamanı mRNT ilə rRNT arasında əsas qoşalaşmış qarşılıqlı təsirlər mövcuddur.

Başlanğıc zamanı fərqli və utancaq mRNT-nin nisbi tərcümə səviyyəsi qismən mRNT-nin parlaq Dalqamo ardıcıllığı (5'in sonunda AGGAGGU) və 3'ün yaxınlığındakı anti-parıltı- Dalqamo ardıcıllığı arasındakı tamamlayıcı ilə müəyyən edilir. 16s rRNA-nın sonu (16s DNT-nin 3′ sonunda UCCUCCA).

26. Tərcümə üçün xüsusi mRNT-nin seçilməsinə bir çox digər amillər də təsir göstərir, bunlar Shine-Dalgamo ardıcıllığı və başlanğıc Kodonu (AUG və ya GUG), ikisi arasında uyğun və utancaq məsafə (SD ardıcıllığı və başlanğıc kodonu), tərcümə gücləndiriciləri ardıcıllığı ( məsələn, Epsilon sequence, UUAACUUUA McCarthy’s gücləndirici UUAAUUUAC və s.).

27. Yuxarıda qeyd olunan transkripsiya faktorları kimi, eukaryotik hüceyrələrdə zülal sintezi və şitezinin başlanğıc mərhələsi ən azı 10 müxtəlif başlanğıc faktoru zülalları tərəfindən təşviq edilir. Tərcümə sürətləri IF-2α, β, müxtəlif başlanğıc amillərinin başlanğıc faktorunun fəaliyyətini tənzimləməklə idarə olunur ϒ və IF-4. A, B, D və E ən əhəmiyyətlidir və başlanğıc zamanı onların funksiyaları aşağıdakı kimidir:

RNT-dən asılı ATPaz aktivliyi ilə IF-4A-ATP bağlayan zülal

IF-4B- mRNT-nin ribosomlara bağlanmasına kömək edir və IF-4A, F-nin funksiyalarını təşviq edir.

IF-4D- ilk polipep və şitid bağının formalaşmasını təşviq edərək, 80-ci illərin başlanğıc com­plex formalaşmasından sonra başlanğıc yolunda gec fəaliyyət göstərir.

IF-4E- mRNT-nin 7-metil-guanozin qapaq strukturu ilə birləşir və qapaq bağlayan və utandıran kompleks IF-4F-nin tərkib hissəsidir.

28. Təkcə başlanğıc faktorları (İF) deyil, həm də uzanma faktorları (EF), ribosomal pro&şitein s6 və onların fosforilləşmə vəziyyəti ilə dəyişməsi tərcümə prosesinin sürətini dəyişə bilər.

29. İnsan genləri cis-təsirli transkripsiya nəzarət ardıcıllığının mürəkkəb dəstlərinə malikdir və transkripsiya faktorları spesifik cis-təsirli ardıcıllıq elementlərini tanıyan və birləşdirən transkripsiya elementləridir. İnsan genləri cis təsirli tənzimləyici elementlərin 4 və ya daha çox sinifini göstərir.

Hər bir sinif adətən bir neçə yüz əsas cütdən çox paylanmış çox və sadə qısa ardıcıllıq elementlərindən ibarətdir. Bununla belə, sin­gle genini tənzimləyən müxtəlif siniflər xeyli məsafədə yerləşə bilər.

Aşağıda fərdi gen üçün cis-fəaliyyət göstərən elementin tanınmış sinifləri verilmişdir:

Bunlar genin aralıq yuxarı bölgəsində yerləşir (ümumiyyətlə transkripsiyanın başlanğıc yerindən 200 bp daxilində) və transkripsiyanın başlamasına xidmət edir, məsələn. CCAAT qutusu, TATAA qutusu və GC qutusu.

(b) Cavab elementləri (RE):

Bunlar yalnız ifadəsi hormon, böyümə faktoru və ya daxili siqnal molekulu cAMP kimi xarici faktor tərəfindən idarə olunan seçilmiş genlərdə olur. Bunlar pro­moter elementindən qısa məsafədə yuxarıda yerləşir (ümumiyyətlə transkripsiyanın başlanğıc yerindən 1 kb məsafədə).

Bunlar müsbət tənzimləyici və utancaq elementlərdir ki, onların funksiyaları promotorlardan fərqli olaraq həm oriyentasiyadan asılı deyil, həm də müəyyən dərəcədə genlərdən məsafəni tənzimləyir. Onlar tez-tez 200-300 bp aralığında olurlar və toxumalara xas transkripsiya və şitlik faktorları ilə tanınırlar.

Bunlar mənfi tənzimləyici elementlərdir və həm yuxarı, həm də intronlar daxilində promouterlərə çox yaxındırlar.


Nəticələr və müzakirə

TimeXNet

Şəkil 1-də TimeXNet alqoritminə ümumi baxış göstərilir. TimeXNet alqoritmi zülal-zülal və zülal-DNT qarşılıqlı təsirlərini, eləcə də etibarlılıq üçün çəkilmiş post-translational modifikasiyaları ehtiva edən böyük molekulyar qarşılıqlı əlaqə şəbəkəsindən istifadə edir. Hüceyrə stimullaşdırılması üzrə ardıcıl vaxt nöqtələrində toplanmış gen ifadəsi məlumatlarını tələb edir. İfadəsində əhəmiyyətli dəyişiklik olan genlər ifadədə ən yüksək qat dəyişmə vaxtına görə üç qrupa bölünür - ilkin reaksiya genləri, ara tənzimləyicilər və gec effektorlar. Üç qrupdakı genlər ifadədəki dəyişikliklərin miqyasına görə hesablanır. Genlərin xallarından və başlanğıc molekulyar şəbəkədə qarşılıqlı təsirlərin etibarlılıq çəkilərindən istifadə edərək, TimeXNet, ara tənzimləyiciləri daxil etməklə, ilkin cavab genlərini gec effektorlara birləşdirən qarşılıqlı əlaqə şəbəkəsi daxilində ən çox ehtimal olunan yolları müəyyən edir. TimeXNet şəbəkədə bu cür yolları müəyyən etmək üçün minimum xərc axını optimallaşdırmasından istifadə edir. Şəbəkə vasitəsilə axın məhduddur ki, o, yalnız ilkin reaksiya genlərindən başlayaraq aralıq tənzimləyicilər vasitəsilə gec effektorlara qədər zamandan asılı bir yolu izləyə bilsin. Alqoritmin ətraflı təsviri Patil və başqalarında tapıla bilər.[8]. TimeXNet aktiv gen alt şəbəkəsini genlərin siyahısı və əlaqəli axınları olan kənarları şəklində təqdim edir. Axın alt şəbəkədə genin əhəmiyyətinə uyğundur və onun statistik əhəmiyyəti ilə düz mütənasibdir [8]. Beləliklə, yüksək axın şəbəkəyə daxil olan genin yüksək etibarlılığının, həmçinin hüceyrə reaksiyasında əhəmiyyətli rolun göstəricisidir.

TimeXNet alqoritminin sxematik diaqramı. TimeXNet ardıcıl T1, T2 və T3 zaman intervallarında diferensial şəkildə ifadə olunan genləri birləşdirən ən çox ehtimal olunan kənarları müəyyən edir. Node rəngləri gen ifadəsində maksimum qat dəyişmə vaxtını göstərir. Mavi qovşaqlar cavab şəbəkəsində hərəkət edəcəyi proqnozlaşdırılan naməlum ifadəsi olan genlərdir. Düyün formaları: almaz: yuxarı tənzimləmə, üçbucaq: aşağı tənzimləmə, dairə: proqnozlaşdırılan gen.

Beləliklə, TimeXNet, gen ifadəsinin müvəqqəti məlumatlarını özündə birləşdirən vahid cavab şəbəkəsi istehsal edir. Şəbəkə ardıcıl vaxt nöqtələrində ifadə olunan genlər arasında müvəqqəti əlaqələri göstərən yolları müəyyən edir. Bu yollara həmçinin nümunə götürülmüş zaman nöqtələrində ifadə səviyyələrində dəyişiklik göstərməyən genlər daxildir. Bu, TimeXNet-ə əvvəllər naməlum, müvəqqəti olaraq ifadə edilmiş tənzimləyiciləri müəyyən etməyə imkan verir.

Qiymətləndirmə

Siçanda anadangəlmə immun reaksiya

TimeXNet, lipopolisakkarid (LPS) ilə stimullaşdırıldıqdan sonra 8 zaman nöqtəsində siçan dendritik hüceyrələrindən gen ifadə məlumatlarından istifadə edərək, 103218 qarşılıqlı təsirdən ibarət ağırlaşdırılmış molekulyar şəbəkədə fitri immun cavabda aktiv gen alt şəbəkələrinin müəyyən edilməsi üçün qiymətləndirilib. Çəkili molekulyar qarşılıqlı əlaqə şəbəkəsi HitPredict [9], InnateDB [10], TRANSFAC [11] və KEGG [12] daxil olmaqla bir çox mənbədən siçan zülal-zülal və zülal-DNT qarşılıqlı təsirlərinin birləşməsi kimi müəyyən edilmişdir. İnsan qarşılıqlı əlaqələrinin homoloqları da daxil edilmişdir. Qarşılıqlı əlaqələr HitPredict [13] tərəfindən təsvir edilən sxemdən istifadə edərək qiymətləndirildi. İfadəsində 2 dəfədən çox dəyişikliyə malik genlərə LPS stimullaşdırılması zamanı ifadədə nisbi dəyişikliyə əsaslanan xal təyin edilmişdir. İmmun cavab zamandan asılı olaraq üç ardıcıl mərhələyə təsnif edildi - erkən, orta və gec. TimeXNet, immun cavabın erkən və gec fazalarında ifadə olunan genlər arasında molekulyar şəbəkədə ən çox ehtimal olunan yolları müəyyən etmək üçün istifadə edilib, aralarındakı müddətdə ifadə olunan genlər daxil edilib. Nəticə şəbəkəsi anadangəlmə immun cavabın bir neçə yeni və məlum tənzimləyicisini, həmçinin nümunə götürülmüş vaxt nöqtələri arasında keçici olaraq ifadə olunanları ehtiva edir. Proqnozlaşdırılan temporal şəbəkə cavabın gec mərhələsində immunoproteazomun tənzimlənməsində protein fosfataza 2a katalitik alt birimi α-nın rolunu təklif etdi. Myd88-nokaut və TRIF-nokautlu dendritik hüceyrələrdən zaman kursu gen ifadə profillərinin təhlili fitri immun cavabında Myd88-dən asılı və TRIF-dən asılı yollar arasındakı fərqləri aydınlaşdırmağa kömək etdi [8].

TimeXNet cavab şəbəkələrini proqnozlaşdırmaq üçün gen ifadəsi profillərindən istifadə edən digər iki analiz aləti ilə müqayisə edildi, ResponseNet [14] və SDREM [5]. ResponseNet iki gen qrupu arasında yolları müəyyən etmək üçün minimum xərc axını şəbəkəsinin optimallaşdırılması alqoritmini tətbiq edir.Biz ResponseNet-dən ilkin cavab genlərindən və yalnız son effektorlardan istifadə edərək şəbəkəni proqnozlaşdırmaq üçün baza metodu kimi istifadə etdik, çünki o, aralıq tənzimləyicilərdən məlumatları daxil edə bilmir və buna görə də müvəqqəti yolu proqnozlaşdıra bilmir. Digər tərəfdən, SDREM müəyyən vaxt nöqtələrində işlək transkripsiya faktorlarını tapmaq üçün zaman kursu gen ifadə profillərindən istifadə edir. Daha sonra məlum tənzimləyiciləri bu transkripsiya faktorlarına birləşdirən molekulyar şəbəkə daxilində yolları tapmağa çalışır. Hər bir alətin performansı üç xüsusiyyət baxımından qiymətləndirilmişdir: 1) müstəqil eksperimental tədqiqatlar nəticəsində müəyyən edilmiş yeni tənzimləyicilərin sayı [15, 16], 2) KEGG-də yol ilə üst-üstə düşdüyü proqnozlaşdırılan ardıcıl yolların sayı [12], və 3) icra sürəti. Cədvəl 1-də göründüyü kimi, TimeXNet müstəqil eksperimental verilənlər bazalarından ResponseNet və SDREM-dən 15-40% daha çox yeni tənzimləyicilər müəyyən etmişdir. O, həmçinin daha çox əlaqəli KEGG yolları daxilində yolları proqnozlaşdırdı (2 ilə müqayisədə 13). Bunlara Jak-STAT siqnal yolu, Chemokine siqnal yolu və digərləri arasında Toll kimi reseptor siqnal yolu daxildir. Yollar da bu yollarla daha uzun üst-üstə düşür (SDREM üzrə 4 ilə müqayisədə 7 ardıcıl, istiqamətlənmiş kənarlara qədər). TimeXNet həm də SDREM-dən daha sürətli idi, dəqiqələrlə günlərlə işləyərək onu yerli iş stansiyasında istifadə üçün əlverişli edirdi. SDREM-dən fərqli olaraq, o, tədqiq olunan hüceyrə sistemi haqqında heç bir qabaqcadan bilik tələb etmir. Şəbəkə daxilində aktiv yolları müəyyən edərkən aralıq tənzimləyiciləri nəzərə almaq qabiliyyəti proqnozlaşdırılan cavab şəbəkəsinin keyfiyyətini əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırır.

Qarşılıqlı əlaqə şəbəkəsində səs-küyün təsiri

Qarşılıqlı əlaqə şəbəkəsindəki səs-küyün TimeXNet tərəfindən edilən proqnozlara təsirini təsadüfi olaraq 10.000-ə qədər sintetik kənar əlavə etməklə (10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10 addımlarla) qiymətləndirdik. siçan qarşılıqlı şəbəkəsi və sonra cavab şəbəkəsinin proqnozlaşdırılması. Proqnozlaşdırılan cavab şəbəkəsi müəyyən edilmiş məlum tənzimləyicilərin sayı, eləcə də əvvəlki bölmədə təsvir olunduğu kimi KEGG-də aşkar edilmiş yolun üst-üstə düşməsinin sayı və miqyasına görə qiymətləndirilmişdir. Bu testi 5 dəfə təkrarladıq. Təsadüfi kənarların əlavə edilməsinin TimeXNet tərəfindən proqnozlaşdırılan cavab şəbəkəsinə əhəmiyyətli dərəcədə təsir etmədiyini aşkar etdik (Əlavə Fayl 1). Eynilə, 5 təkrar üzərində siçan qarşılıqlı şəbəkəsindən 10.000-ə qədər kənarın təsadüfi çıxarılması proqnozlaşdırılan cavab şəbəkəsinə təsir göstərmir (Əlavə Fayl 2). Beləliklə, TimeXNet tərəfindən proqnozlaşdırılan aktiv gen alt şəbəkələrinin qarşılıqlı əlaqə şəbəkəsindəki səs-küyün təsirinə davamlı olduğu qənaətinə gəlirik.

Maya osmotik stress reaksiyası

TimeXNet-in başqa bir növdə performansını qiymətləndirmək üçün biz ondan hiperosmotik stressə cavab olaraq mayada aktiv gen alt şəbəkəsini proqnozlaşdırmaq üçün istifadə etdik [17]. Osmotik şokdan sonra 1,5 dəfə yuxarı tənzimlənən genləri müəyyən etdik S. cerevisiae. Cavab genlərini ilkin reaksiya genləri (2-4 dəqiqə arasında ifadədə ən yüksək qat dəyişməsi), ara tənzimləyicilər (6-8 dəqiqə arasında ifadədə ən yüksək qat dəyişməsi) və gec effektorlar (arasında ifadədə ən yüksək qat dəyişməsi) olaraq 3 qrupa ayırdıq. 10-15 dəqiqə). 23,153 ballı zülal-zülal və zülal-DNT qarşılıqlı təsirindən ibarət hərtərəfli maya molekulyar qarşılıqlı əlaqə şəbəkəsindən istifadə edilmişdir [5] (şəxsi ünsiyyət, Dr. Anthony Gitter). TimeXNet bu üç gen qrupu arasında aktiv gen alt şəbəkəsini proqnozlaşdırmaq üçün istifadə edilmişdir (Şəkil 2). TimeXNet tənzimləyicilər, Hog1, Hot1, Pbs2, Ypd1, Msn4, Ste11 və Ste20 daxil olmaqla, mayada osmotik stressə əsas cavab yolu olan HOG MAPK yolunun əhəmiyyətli bir hissəsini bərpa edə bildi (Tam siyahısı üçün Əlavə Fayl 3-ə baxın). proqnozlaşdırılan genlər və qarşılıqlı təsirlər). SDREM və ResponseNet-in maya osmotik stres cavab şəbəkəsinin proqnozlaşdırılmasında performansı əvvəllər bu verilənlər bazasında qiymətləndirilmişdir [5] və biz TimeXNet tərəfindən edilən proqnozları iki metodun proqnozları ilə müqayisə etdik (Cədvəl 2). Əvvəllər məlum olan 30 osmotik stresə cavab genindən TimeXNet SDREM tərəfindən proqnozlaşdırılan 10 və ResponseNet tərəfindən proqnozlaşdırılan 3 ilə müqayisədə 19-nu müəyyən edə bildi. Bundan əlavə, TimeXNet SDREM tərəfindən proqnozlaşdırılan 4 və ResponseNet tərəfindən proqnozlaşdırılan 2 ilə müqayisədə 7 məlum transkripsiya faktorundan 5-ni müəyyən etdi. Bu nəticələr göstərir ki, TimeXNet nəinki növlərdən və hüceyrə sistemindən asılı olmayaraq aktiv gen alt şəbəkəsini uğurla proqnozlaşdırır, həm də proqnozlaşdırma qabiliyyətinə görə digər vasitələrdən üstündür.

TimeXNet tərəfindən proqnozlaşdırılan qismən maya osmotik stress cavab şəbəkəsi. Düyünlər genləri/zülalları göstərir. Kenarlar qarşılıqlı əlaqənin növünü göstərir. Bərk xətt: zülal-zülal qarşılıqlı əlaqəsi, nöqtəli xətt: Zülal-DNT qarşılıqlı əlaqəsi. Düyün rəngləri gen ifadəsinin vaxtını göstərir. Mavi düyünlər ifadə modelində əhəmiyyətli dəyişiklik göstərməyən, lakin cavab şəbəkəsinin bir hissəsi olacağı proqnozlaşdırılan genləri təmsil edir. Maya osmotik stress reaksiyasında məlum rolu olan genlər qırmızı haşiyə ilə göstərilir.

Qiymətləndirmə məlumatlarına əsaslanaraq belə nəticəyə gəlirik ki, TimeXNet çoxlu zaman kursu gen ifadəsi profillərini təhlil etmək üçün hazırda tədqiqat icması üçün mövcud olanlardan xeyli yaxşı vasitədir.

İstifadəsi

TimeXNet yüklənə bilən zip faylının məzmununu çıxarmaqla istifadəçi maşınına quraşdırıla bilər. Nümunə məlumat faylları və yardım faylları da təqdim olunur.

Giriş

TimeXNet-ə giriş aşağıdakılardan ibarətdir:

1. Zaman kursu gen ifadə profillərini təmsil edən üç gen siyahısı: Bu gen siyahıları hüceyrənin xarici stimula məruz qalması zamanı ardıcıl üç vaxt intervalında (ilkin, aralıq və gec mərhələ) ifadədə əhəmiyyətli dəyişikliklər göstərən genləri təmsil edir. Hər bir gen siyahısı gen adını və gen hesabını ehtiva edən nişanla ayrılmış fayl şəklində verilir. Gen hesabı ifadədəki dəyişikliyə, adətən log qatının dəyişməsinə əsaslanan genə təyin edilmiş dəyəri təmsil edir. Üç gen qrupu bir-birini istisna edir, yəni bir qrupdakı genlər digərində ola bilməz.

2. Çəkili qarşılıqlı əlaqə şəbəkəsi: Qarşılıqlı əlaqə şəbəkəsi həmçinin iki gen ilə işarələnmiş hər bir kənarı, qarşılıqlı əlaqənin növü (biristiqamətli/iki istiqamətli) və etibarlılıq xalını ehtiva edən nişanla ayrılmış fayl kimi verilir. Kenarlar iki gen/zülal arasında fiziki və ya funksional əlaqəni ifadə edə bilər. Hesab, kənarın eksperimental və ya genomik annotasiya məlumatlarına əsaslanaraq nə dərəcədə etibarlı olduğunu göstərir və 0 ilə 1 arasında olmalıdır. TimeXNet siçanda çəkili zülal-zülal, zülal-DNT qarşılıqlı əlaqəsi və post-translational modifikasiyaların əhatəli şəbəkəsini təmin edir.

3. Alqoritm parametrləri: Bunlara iki real müsbət sabit, γ1 (qamma1) və γ2 (qamma2) daxildir, bunlar proqnozlaşdırılan cavab şəbəkəsinə daxil ediləcək ilkin cavab genlərinin və ara tənzimləyicilərin sayını təyin etmək üçün istifadə olunur. TimeXNet optimallaşdırma problemini həll etmək üçün GNU xətti proqramlaşdırma dəstini (GLPK) tələb edir. Quraşdırılmış GLPK-nı avtomatik aşkarlamağa çalışır. Əgər o, GLPK-nın yerli nüsxəsini tapa bilmirsə, istifadəçidən onu quraşdırmağı və TimeXNet-ə yeri təqdim etməyi xahiş edir.

4. Çıxış yeri: TimeXNet bir neçə çıxış faylı yaradır və istifadəçidən bu faylların saxlanacağı çıxış kataloqunu təyin etməyi tələb edir.

İcra

Yüklənmiş zip faylından bütün faylları çıxardıqdan sonra TimeXNet üç rejimdə işlədilə bilər:

1. İstifadəçi interfeysi: TimeXNet timexnet.jar faylına iki dəfə klikləməklə istifadəçi interfeysi (Şəkil 3) vasitəsilə işlədilə bilər. İstifadəçi interfeysi həmçinin istifadəçiyə analiz üçün nümunə məlumatları və şəbəkəni yükləməyə imkan verir. İcra zamanı TimeXNet müəyyən edilmiş genləri və proqnozlaşdırılan cavab şəbəkəsinin qarşılıqlı təsirlərini istifadəçi interfeysində cədvəl formatında göstərir. Proqnozlaşdırılan cavab şəbəkəsinə birbaşa TimeXNet-dən işə salınan Cytoscape-də də baxmaq olar. Nəticələr istifadəçinin maşınında müəyyən edilmiş yerdə bir neçə nişanla ayrılmış faylda saxlanılır.

TimeXNet istifadəçi interfeysi. TimeXNet istifadəçi interfeysi üç əsas paneldən ibarətdir - giriş paneli, irəliləyiş paneli və çıxış paneli. TimeXNet işləmək üçün üç hesablanmış gen siyahısı, çəkili qarşılıqlı əlaqə şəbəkəsi və iki real müsbət sabit tələb edir. Qiymətləndirmə üçün nümunə məlumatları "Nümunəni Yüklə" düyməsini istifadə edərək istifadəçi interfeysinə yüklənə bilər. İcra zamanı TimeXNet istifadəçini cari vəziyyət barədə məlumatlandırmaq üçün tərəqqi panelini yeniləyir. Tamamlandıqdan sonra çıxış panelindəki cədvəllər növləri və axını ilə birlikdə proqnozlaşdırılan cavab şəbəkəsindəki genlər və qarşılıqlı əlaqə ilə doldurulur. "Şəbəkəyə Bax" düyməsi TimeXNet tərəfindən proqnozlaşdırılan cavab şəbəkəsini göstərmək üçün Cytoscape-i işə salır.

2. Komanda xətti: TimeXNet həm də istifadəçi interfeysi ilə eyni giriş parametrləri ilə komanda xəttindən işlədilə bilər. Bu versiya xüsusilə TimeXNet-i superkompüterdə işlətmək üçün faydalıdır. Proqnozlaşdırılan cavab şəbəkəsi göstərilən yerdə nişanla ayrılmış fayllar şəklində saxlanılır.

3. İterativ əmr xətti: TimeXNet-in komanda xətti versiyası optimal şəbəkə ilə nəticələnən kombinasiyanı, yəni üç qrupdan ən çox sayda gen və ən az sayda gen olan birini müəyyən etmək üçün γ1 və γ2 dəyərlər diapazonu üçün iterativ şəkildə işlədilə bilər. başlanğıc şəbəkədən aşağı etibarlılıq kənarları. Bu rejimdə işləmək üçün TimeXNet γ1 və γ2 üçün bir sıra real müsbət dəyərlər tələb edir. Çıxış TimeXNet tərəfindən idarə olunan bütün γ1 və γ2 kombinasiyaları üçün proqnozlaşdırılan şəbəkədə orijinal genlərin sayını və aşağı etibarlılıq kənarlarını ehtiva edən statistik fayl təqdim edir. γ1 və γ2 dəyərlərinin hər bir kombinasiyası üçün istifadəçi tərəfindən müəyyən edilmiş çıxış yerində ayrıca kataloq yaradılır. Hər bir γ1 və γ2 kombinasiyası üçün proqnozlaşdırılan cavab şəbəkəsi tək komanda xətti və istifadəçi interfeysi versiyasına bənzər nişanla ayrılmış fayllar şəklində saxlanılır.

Çıxış

TimeXNet-in bütün versiyaları proqnozlaşdırılan alt şəbəkənin genlərini və qarşılıqlı təsirlərini, həmçinin onların axınlarını müəyyən edilmiş yerdə ehtiva edən nişanlarla ayrılmış faylları yaradır və saxlayır. Bunlar birbaşa Cytoscape-ə yüklənə bilər. Proqnozlaşdırılan cavab şəbəkəsindəki genlərə bir növ təyin olunur - SRC, INT, SNK və NOD. SRC tipli genlər giriş kimi TimeXNet-ə verilən ilkin cavab genlərinin alt çoxluğudur. INT genləri ara tənzimləyicilərin bir hissəsidir, SNK genləri isə son zaman nöqtələrində ifadədə böyük dəyişikliklər göstərən son effektorların bir hissəsidir. NOD genləri, nümunə götürülmüş vaxt nöqtələrində ifadədə dəyişiklik göstərməyən, lakin TimeXNet tərəfindən cavab şəbəkəsinin bir hissəsi olacağı proqnozlaşdırılan genlərdir. Əlavə olaraq, cavab şəbəkəsini proqnozlaşdırmaq üçün GLPK-ya daxil edilmiş optimallaşdırma probleminin tərtibi və optimallaşdırma problemini yaratmaq üçün istifadə olunan son kənar siyahı formatlaşdırılmamış həll ilə birlikdə saxlanılır. Nəhayət, TimeXNet işinin təfərrüatlı tərəqqisini əks etdirən jurnal faylı, o cümlədən təkrar kənarların, kənarların və səhv xalları olan qovşaqların siyahısı və GLPK-nın ətraflı çıxışı çıxış kataloqunda saxlanılır.

Quraşdırma, giriş-çıxış faylları və formatları və TimeXNet-in istifadəsi haqqında əlavə təfərrüatları http://timexnet.hgc.jp/ saytında tapa bilərsiniz.


İstinadlar

Barrett, T. et al. NCBI GEO: funksional genomik məlumat dəstləri üçün arxiv - 10 ildən sonra. Nuklein turşuları Res. 39, D1005–D1010 (2011).

Gasch, A. P. və başqaları. Maya hüceyrələrinin ətraf mühitdəki dəyişikliklərə reaksiyasında genomik ifadə proqramları. Mol. Biol. Hüceyrə 11, 4241–4257 (2000). Mayaların müxtəlif streslərə reaksiyasının geniş tədqiqi, ümumi ekoloji stresə cavab genlərinin böyük dəstini ortaya qoydu.

Chechik, G. et al. Fəaliyyət motivləri maya metabolik şəbəkəsinin transkripsiya nəzarətində vaxt prinsiplərini ortaya qoyur. Təbiət biotexnologiyası. 26, 1251–1259 (2008).

Amit, I. et al. Mənfi rəy tənzimləyicilərinin modulu böyümə faktoru siqnalını müəyyən edir. Təbiət Genet. 39, 503–512 (2007). Bu tədqiqat müvəqqəti immun cavab məlumatlarını nümunə və inteqrasiya etmək üçün ağıllı dizayn strategiyasından istifadə etdi. O, məməlilərin immun cavabının bir hissəsi kimi aktivləşən bir neçə şəlalə müəyyən etdi.

Zinman, G. et al. Siçan və makakada viral və bakterial patogenlərə anadangəlmə reaksiyaların geniş miqyaslı müqayisəsi. PLoS BİR 6, e22401 (2011).

Tang, F., Lao, K. & Surani, M. A. Tək hüceyrəli transkriptom analizinin inkişafı və tətbiqləri. Təbiət üsulları 8, S6–S11 (2011).

Locke, J. C. W. & amp Elowitz, M. B. Tək hüceyrələrdə gen dövrə dinamikasını təhlil etmək üçün filmlərdən istifadə. Təbiət Rev. Mikrobiol. 7, 383–392 (2009).

Amit, I. et al. Patogen reaksiyalarına vasitəçilik edən məməli transkripsiya şəbəkəsinin qərəzsiz yenidən qurulması. Elm 326, 257–263 (2009).

Huang, Y. et al. Ev sahibinin molekulyar reaksiyalarının müvəqqəti dinamikası simptomatik və asimptomatik A qripi infeksiyasını fərqləndirir. PLoS Genet. 7, e1002234 (2011). Simptomatik və asimptomatik reaksiyaları ayırd edən dinamik ifadə nümunələrini müəyyən edən insan könüllülərində qrip infeksiyasının eksperimental və hesablama analizi.

Arbeitman, M. N. et al. Həyat dövrü ərzində gen ifadəsi Drosophila melanogaster. Elm 297, 2270–2275 (2002). Zaman seriyası ifadə məlumatlarından istifadə edən ilk inkişaf tədqiqatlarından biri. O, milçək inkişafı zamanı ifadə olunan bir neçə gen kaskadını müəyyən etdi.

Mathavan, S. et al. Mikroarraylardan istifadə edərək zebrafiş embriogenezinin transkriptom analizi. PLoS Genet. 1, 260–276 (2005).

Gerstein, M. B. et al. inteqrativ təhlili Caenorhabditis elegans modENCODE layihəsi ilə genom. Elm 330, 1775–1787 (2010).

Roy, S. et al. Funksional elementlərin və tənzimləyici sxemlərin müəyyən edilməsi Drosophila MODENKOD. Elm 330, 1787–1797 (2010). Bir neçə növ müvəqqəti və statik omik məlumatlarını toplayan və birləşdirən milçək inkişafının hərtərəfli öyrənilməsi.

Spellman, P. T. və başqaları. Mayanın hüceyrə dövrü ilə tənzimlənən genlərinin hərtərəfli identifikasiyası Saccharomyces cerevisiae mikroarray hibridizasiyası ilə. Mol. Biol. Hüceyrə 9, 3273–3297 (1998). Zaman seriyası təcrübələrindən istifadə edərək tsiklik cavabların ilk tədqiqatları arasında. O, maya dövran edən genlərin böyük dəstini müəyyən etdi və bu cür məlumatları öyrənmək üçün hazırlanmış bir neçə hesablama metodu üçün əsas rolunu oynadı.

Menges, M., Hennig, L., Gruissem, W. & amp Murray, J. A. H. Hüceyrə dövrü ilə tənzimlənən gen ifadəsi Ərəbidopsis. J. Biol. Kimya. 277, 41987–42002 (2002).

Whitfield, M. L. et al. İnsan hüceyrə tsiklində vaxtaşırı ifadə olunan genlərin müəyyən edilməsi və onların şişlərdə ifadəsi. Mol. Biol. Hüceyrə 13, 1977–2000 (2002).

Rustici, G. et al. Parçalanma maya hüceyrəsi dövrünün dövri gen ifadə proqramı. Təbiət Genet. 36, 809–817 (2004).

Bar-Joseph, Z. et al. İnsan hüceyrə dövrünün genom miqyasında transkripsiya analizi normal və xərçəng hüceyrələrində diferensial şəkildə tənzimlənən genləri müəyyən edir. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 105, 955–960 (2008).

McDonald, M. J. & Rosbash, M. Mikroarray analizi və sirkadiyalı gen ifadəsinin təşkili. Drosophila. Hüceyrə 107, 567–578 (2001).

Schaffer, R. et al. Gündəlik və sirkadiyalı tənzimlənən genlərin mikroarray analizi Ərəbidopsis. Bitki hüceyrəsi 13, 113–123 (2001).

Ştorç, K.-F. və b. Qaraciyər və ürəkdə geniş və fərqli sirkadiyalı gen ifadəsi. Təbiət 417, 78–83 (2002).

Pauli, A. və başqaları. Zebra balığı embriogenezi zamanı ifadə olunan uzun kodlaşdırmayan RNT-lərin sistematik identifikasiyası. Genom Res. 22, 577–591 (2012).

Otto, T. D. və başqaları. Qan mərhələsinin transkriptomuna dair yeni anlayışlar Plasmodium falciparum RNT-Seq istifadə edərək. Mol. Mikrobiol. 76, 12–24 (2010).

Trapnell, C. et al. Transkript yığılması və RNT-Seq ilə kəmiyyətin müəyyən edilməsi hüceyrə diferensasiyası zamanı qeyd olunmamış transkriptləri və izoforma keçidini aşkar edir. Təbiət biotexnologiyası. 28, 511–515 (2010).

Grabherr, M. G. et al. İstinad genomu olmayan RNT-Seq məlumatlarından tam uzunluqlu transkriptom montajı. Təbiət biotexnologiyası. 29, 644–652 (2011).

Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M. & Gilad, Y. RNT seq: texniki təkrarlanmanın qiymətləndirilməsi və gen ifadə massivləri ilə müqayisə. Genom Res. 18, 1509–1517 (2008).

Kelley, D. R., Schatz, M. C. & amp Salzberg, S. L. Quake: ardıcıllıqla səhvlərin keyfiyyətlə aşkarlanması və düzəldilməsi. Genom Biol. 11, R116 (2010).

Shalem, O. et al. Stressə keçici transkripsiya reaksiyaları mRNT istehsalının və deqradasiyasının əks təsirləri ilə yaranır. Mol. Sistem. Biol. 4, 223 (2008).

Bolstad, B. M., Irizarry, R. A., Astrand, M. & amp Speed, T. P. Variasiya və qərəzliliyə əsaslanan yüksək sıxlıqlı oliqonukleotid massivi məlumatları üçün normallaşdırma üsullarının müqayisəsi. Bioinformatika 19, 185–193 (2003).

Li, C. və Hung Wong, W. Oliqonukleotid massivlərinin model əsaslı təhlili: modelin təsdiqi, dizayn məsələləri və standart səhv tətbiqi. Genom Biol. 2, RESEARCH0032 (2001).

Ernst, J. et al. IL-3 və onkogen Abl mRNT sabitliyini dəyişdirərək miyeloblast transkriptomunu tənzimləyir. PLoS BİR 4, e7469 (2009).

Bar-Joseph, Z., Gerber, G., Simon, I., Gifford, D. K. & Jaakkola, T. S. Diferensial şəkildə ifadə olunan genləri müəyyən etmək üçün zaman seriyası ifadə profillərinin davamlı təqdimatının müqayisəsi. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 100, 10146–10151 (2003).

Bar-Joseph, Z., Gerber, G. K., Gifford, D. K., Jaakkola, T. S. & Simon, I. Zaman seriyası gen ifadə məlumatlarının davamlı təmsilləri. J. Comput. Biol. 10, 341–356 (2003).

Kaminski, N. & amp Bar-Joseph, Z. Klinik tədqiqatlarda temporal ifadə profilləri üçün xəstə-gen modeli. J. Comput. Biol. 14, 324–338 (2007).

Calvano, S. E. və başqaları. İnsanlarda sistemli iltihabın şəbəkə əsaslı təhlili. Təbiət 437, 1032–1037 (2005).

Lu, R. et al. Sıçan embrion kök hüceyrələrində taleyin dəyişməsinin sistem səviyyəsində dinamik analizləri. Təbiət 462, 358–362 (2009). Bu tədqiqat kök hüceyrə fərqləndirməsində bir neçə növ müvəqqəti yüksək ötürmə məlumat dəstini ölçdü. Dinamik zülal və mRNT ifadə səviyyələri arasındakı korrelyasiyanın əvvəllər düşünüldüyündən daha aşağı olduğunu müəyyən etdi.

Nau, G. J. və başqaları. Bakterial patogenlər tərəfindən törədilən insan makrofaqlarının aktivləşdirilməsi proqramları. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 99, 1503–1508 (2002).

Shapira, S. D. və başqaları. Host-qrip qarşılıqlı əlaqəsinin fiziki və tənzimləyici xəritəsi H1N1 infeksiyasında yolları aşkar edir. Hüceyrə 139, 1255–1267 (2009).

Tusher, V. G., Tibshirani, R. & amp Chu, G. İonlaşdırıcı radiasiya reaksiyasına tətbiq olunan mikroarrayların əhəmiyyətinin təhlili. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 98, 5116–5121 (2001).

Storey, J. D., Xiao, W., Leek, J. T., Tompkins, R. G. & Davis, R. W. Zaman kursu mikroarray təcrübələrinin əhəmiyyətinin təhlili. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 102, 12837–12842 (2005).

Aryee, M. J., Gutiérrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T. & amp Quackenbush, J. Mikroarray zaman kurs məlumatlarında diferensial gen ifadəsini qiymətləndirmək üçün təkmilləşdirilmiş empirik bayes yanaşması: BETR (Müvəqqəti Tənzimləmənin Bayes Qiymətləndirilməsi). BMC Bioinformatika 10, 409 (2009).

Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O. & Botstein, D. Cluster analizi və genom geniş ifadə nümunələrinin nümayişi. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 95, 14863–14868 (1998).

Ramoni, M. F., Sebastiani, P. & amp Kohane, I. S. Gen ifadə dinamikasının klaster analizi. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 99, 9121–9126 (2002).

Schliep, A., Schönhuth, A. & amp Steinhoff, C. Gen ifadəsi zamanı kurs məlumatlarını təhlil etmək üçün gizli Markov modellərindən istifadə. Bioinformatika 19, i255–i263 (2003).

Ernst, J., Nau, G. J. & Bar-Joseph, Z. Clustering qısa zaman seriyası gen ifadə data. Bioinformatika 21, i159–i168 (2005).

Baranzini, S. E. və başqaları. Nəzarət olunan hesablama metodlarından istifadə edərək IFNβ-ya cavabın transkripsiyaya əsaslanan proqnozu. PLoS Biol. 3, e2 (2005).

Borgwardt, K. M., Vishwanathan, S. V. N. & Kriegel, H.-P. Dinamik sistem ləpələrindən istifadə edərək zaman seriyası gen ifadə profillərindən sinif proqnozu. Pac. Simp. Biokompüter. 2006, 547–558 (2006).

Lin, T., Kaminski, N. & Bar-Joseph, Z. Klinik tədqiqatlarda zaman seriyası gen ifadəsinin uyğunlaşdırılması və təsnifatı. Bioinformatika 24, i147–i155 (2008).

Costa, I. G., Schönhuth, A., Hafemeister, C. & Schliep, A. Analiz və klinik zaman sıralarının möhkəm təsnifatı üçün məhdud qarışıq qiymətləndirilməsi. Bioinformatika 25, i6–i14 (2009).

Qian, J., Dolled-Filhart, M., Lin, J., Yu, H. & amp Gerstein, M. Sinekspressiya əlaqələri xaricində: zamanla yerdəyişmiş və ters çevrilmiş gen ifadə profillərinin yerli klasterləşdirilməsi yeni, bioloji cəhətdən uyğun qarşılıqlı əlaqələri müəyyən edir. J. Mol. Biol. 314, 1053–1066 (2001).

Mukhopadhyay, N. D. & amp Chatterjee, S. Mikroarray zaman seriyası təcrübəsində səbəbiyyət və yol axtarışı. Bioinformatika 23, 442–449 (2007).

Shi, Y., Mitchell, T. & Bar-Joseph, Z. Çox vaxt seriyası verilənlər bazasından qoşa tənzimləyici münasibətlərin çıxarılması. Bioinformatika 23, 755–763 (2007).

Zhu, J. et al. İnsan qanının transkripsiya şəbəkəsində dinamik dəyişiklikləri xarakterizə etmək. PLoS Comput. Biol. 6, e1000671 (2010).

FANTOM Konsorsiumu və Riken Omics Elm Mərkəzi. İnsan miyeloid lösemi hüceyrə xəttində böyümənin dayandırılmasını və diferensiasiyanı idarə edən transkripsiya şəbəkəsi. Təbiət Genet. 41, 553–562 (2009).

Ramsey, S. A. və başqaları. Motif skanından və ifadə dinamikasından sübutların inteqrasiyası ilə makrofaqların transkripsiya proqramının aşkarlanması. PLoS Comput. Biol. 4, e1000021 (2008).

Davidson, E. H. Heyvan gen tənzimləyici şəbəkələrinin ortaya çıxan xüsusiyyətləri. Təbiət 468, 911–920 (2010).

Oliveri, P., Tu, Q. & Davidson, E. H. Embrion hüceyrə nəslinin dəqiqləşdirilməsi üçün qlobal tənzimləmə məntiqi. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 105, 5955–5962 (2008).

Simon, I. et al. Maya hüceyrəsi siklində transkripsiya tənzimləyicilərinin ardıcıl tənzimlənməsi. Hüceyrə 106, 697–708 (2001).

Ihmels, J., Levy, R. & Barkai, N. Metabolik şəbəkədə transkripsiya nəzarətinin prinsipləri. Saccharomyces cerevisiae. Təbiət biotexnologiyası. 22, 86–92 (2004).

Alon, U. Şəbəkə motivləri: nəzəriyyə və eksperimental yanaşmalar. Təbiət Rev. Genet. 8, 450–461 (2007).

Zaslaver, A. et al. Metabolik yollarda tam vaxtında transkripsiya proqramı. Təbiət Genet. 36, 486–491 (2004).

Kalir, S., Mangan, S. & amp Alon, U. SUM daxiletmə funksiyası ilə əlaqəli irəli ötürülmə döngəsi flagella ifadəsini uzadır. Escherichia coli. Mol. Sistem. Biol. 1, 2005.0006 (2005).

Yosef, N. & amp Regev, A. İmpuls nəzarəti: gen transkripsiyasında müvəqqəti dinamika. Hüceyrə 144, 886–896 (2011). Zaman seriyası gen ifadə məlumatlarında impuls cavabının hərtərəfli nəzərdən keçirilməsi. O, həm əsas cavab nümunələrini, həm də xüsusi cavab proqramlarında bu cür nümunələrin birləşməsini vurğulayır.

Chechik, G. & amp Koller, D. Ətraf mühit dəyişikliklərinə gen ifadə reaksiyalarının vaxtı. J. Comput. Biol. 16, 279–290 (2009).

Braun, E. və Brenner, N. Eukaryotik gen tənzimləmə sistemində sabit vəziyyətə keçid reaksiyaları və uyğunlaşma. Fizik. Biol. 1, 67–76 (2004).

Murray, J. I. və başqaları. Mədəni insan hüceyrələrində streslərə müxtəlif və spesifik gen ifadə reaksiyaları. Mol. Biol. Hüceyrə 15, 2361–2374 (2004).

López-Maury, L., Marguerat, S. & Bähler, J. Dəyişən mühitlərə gen ifadəsini tənzimləmək: sürətli reaksiyalardan təkamül uyğunlaşmasına qədər. Təbiət Rev. Genet. 9, 583–593 (2008).

Litvak, V. et al. C/EBPδ-nin keçici və davamlı TLR4-induksiyalı siqnalları arasında fərq yaradan tənzimləyici dövrədə funksiyası. Təbiət immunol. 10, 437–443 (2009).

Basma, H. et al. İnsan embrionunun kök hüceyrələrindən alınan hepatositlərin differensasiyası və transplantasiyası. Qastroenterologiya 136, 990–999 (2009).

Iliopoulos, D., Hirsch, H. A. & amp Struhl, K. NF-κB, Lin28, Let-7 microRNA və IL6-nı əhatə edən epigenetik keçid iltihabı hüceyrə transformasiyası ilə əlaqələndirir. Hüceyrə 139, 693–706 (2009).

Seok, J., Xiao, W., Moldawer, L. L., Davis, R. W. & amp Covert, M. W. LPS ilə müalicə olunan insan subyektlərində dinamik transkripsiya şəbəkəsi. BMC Sistemi. Biol. 3, 78 (2009).

Shedden, K. & amp Cooper, S. Mikroarraylar və ikiqat timidin blokunun sinxronizasiyası ilə müəyyən edilən insan hüceyrələrində hüceyrə dövrü-spesifik gen ifadəsinin təhlili. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 99, 4379–4384 (2002).

Simon, I., Siegfried, Z., Ernst, J. & Bar-Joseph, Z. Time-series ifadə profillərinin keyfiyyətini təyin etmək üçün birləşdirilmiş statik və dinamik analiz. Təbiət biotexnologiyası. 23, 1503–1508 (2005).

Lu, Y. və başqaları. Kombinə edilmiş analiz velosiped genlərinin əsas dəstini ortaya qoyur. Genom Biol. 8, R146 (2007).

Jensen, L. J., Jensen, T. S., de Lichtenberg, U., Brunak, S. & Bork, P. Transkripsiya və post-translational hüceyrə dövrü tənzimlənməsinin birgə təkamülü. Təbiət 443, 594–597 (2006). Növlər arasında hüceyrə dövrü tənzimlənməsinin qorunmasının öyrənilməsi. Müəyyən etdi ki, növlər arasında spesifik gen ifadəsi deyil, müvəqqəti kompleks aktivləşdirmə qorunur.

Eshaghi, M. et al. MBF işğallarının xromatin immunoprecipitation-mikroarray (ChIP-chip) təhlili dekonvolution MBF hədəf genlərində Rep2-nin müvəqqəti cəlb edilməsini aşkar edir. Eukariot. Hüceyrə 10, 130–141 (2011).

Sandmann, T. et al. Transkripsiya faktoru fəaliyyətinin müvəqqəti xəritəsi: Mef2 əzələ inkişafının bütün mərhələlərində hədəf genləri birbaşa tənzimləyir. Dev. Hüceyrə 10, 797–807 (2006).

Jakobsen, J. S. və başqaları. Temporal ChIP-on-chip Biniou-nu visseral əzələ transkripsiya şəbəkəsinin universal tənzimləyicisi kimi ortaya qoyur. Genes Dev. 21, 2448–2460 (2007).

Liu, Y.-H. və b. Tinman funksiyasının sistematik təhlili əzələ inkişafının əsas tənzimləyiciləri kimi Eya və JAK-STAT siqnalını ortaya qoyur. Dev. Hüceyrə 16, 280–291 (2009).

Mohn, F. et al. Soy-xüsusi polycomb hədəfləri və de novo DNT metilasiyası neyron progenitörlərinin məhdudiyyətini və potensialını müəyyən edir. Mol. Hüceyrə 30, 755–766 (2008).

Jayaswal, V., Lutherborrow, M., Ma, D. D. F. & Hwa Yang, Y. Uyğun mikroRNA-mRNA vaxt kursu məlumatlarından istifadə edərək tənzimləmə potensialı olan mikroRNT-lərin müəyyən edilməsi. Nuklein turşuları Res. 37, e60 (2009).

Luscombe, N. M. et al. Tənzimləyici şəbəkə dinamikasının genomik təhlili böyük topoloji dəyişiklikləri aşkar edir. Təbiət 431, 308–312 (2004). Bu, transkripsiya faktorlarının müvəqqəti aktivliyini müəyyən etmək üçün zaman seriyası və statik qarşılıqlı əlaqə məlumatlarını birləşdirən ilk tədqiqatlar arasında idi.

Liao, J. C. və başqaları. Şəbəkə komponentlərinin təhlili: bioloji sistemlərdə tənzimləyici siqnalların yenidən qurulması. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 100, 15522–15527 (2003).

Bansal, M., Della Gatta, G. & amp di Bernardo, D. Gen tənzimləyici şəbəkələrin və zaman kursu gen ifadə profillərindən mürəkkəb fəaliyyət rejiminin nəticəsi. Bioinformatika 22, 815–822 (2006).

Ernst, J., Vainas, O., Harbison, C. T., Simon, I. & Bar-Joseph, Z. Dinamik tənzimləyici xəritələrin yenidən qurulması. Mol. Sistem. Biol. 3, 74 (2007). Bu sənəd göstərir ki, statik zülal-DNT bağlayan qarşılıqlı əlaqənin müvəqqəti gen ifadə məlumatları ilə inteqrasiyası dinamik şəbəkələrin yenidən qurulmasına imkan verir.

Mendoza-Parra, M. A., Walia, M., Sankar, M. & amp Gronemeyer, H. İnteqrativ genomika ilə F9 embrional kök hüceyrələrinin retinoid səbəb olduğu diferensiasiyasının disseksiyası. Mol. Sistem. Biol. 7, 538 (2011).

Kalir, S. et al. Canlı bakteriyaların ifadə kinetikasının təhlili ilə bayraq yolunda genlərin sıralanması. Elm 292, 2080–2083 (2001).

Sigal, A. et al. Canlı insan hüceyrələrində flüoresan etiketli endogen protein kitabxanasının yaradılması. Təbiət protokolu. 2, 1515–1527 (2007).

Yeang, C.-H., Ideker, T. & Jaakkola, T. Fiziki şəbəkə modelləri. J. Comput. Biol. 11, 243–262 (2004).

Yeger-Lotem, E. et al. Yüksək məhsuldarlıqlı genetik və transkripsiya məlumatlarının əlaqələndirilməsi α-sinuklein toksikliyinə hüceyrə reaksiyalarını aşkar edir. Təbiət Genet. 41, 316–323 (2009).

Huang, S. C. & amp Fraenkel, E. Proteomik, transkripsiya və interaktom məlumatlarının inteqrasiyası gizli siqnal komponentlərini ortaya qoyur. Sci. Siqnal. 2, ra40 (2009).

Vinayagam, A. et al. Hüceyrədaxili siqnal ötürülməsini araşdırmaq üçün yönəldilmiş protein qarşılıqlı şəbəkəsi. Sci. Siqnal. 4, rs8 (2011).

White, F. M. Siqnal şəbəkəsi dinamikasının kəmiyyət fosfoproteomik təhlili. Curr. Rəy. Biotexnol. 19, 404–409 (2008).

Kholodenko, B. N., Hancock, J. F. & Kolch, W. Signaling ballet in məkan və zamanda. Təbiət keşişi Mol. Hüceyrə Biol. 11, 414–426 (2010).

Olsen, J. V. və başqaları. Qlobal, in vivo, və siqnal şəbəkələrində sahəyə məxsus fosforlaşma dinamikası. Hüceyrə 127, 635–648 (2006).

Gaucher, D. et al. Sarı qızdırma peyvəndi inteqrasiya olunmuş çoxnəsilli və çoxfunksiyalı immun cavabları yaradır. J. Exp. Med. 205, 3119–3131 (2008).

Cho, R. J. və başqaları. İnsan hüceyrə dövrü ərzində transkripsiya tənzimlənməsi və funksiyası. Təbiət Genet. 27, 48–54 (2001).

Lu, X., Zhang, W., Qin, Z. S., Kwast, K. E. & amp Liu, J. S. Statistik resinxronizasiya və dövri olaraq ifadə olunan genlərin Bayes aşkarlanması. Nuklein turşuları Res. 32, 447–455 (2004).

Bar-Joseph, Z., Farkash, S., Gifford, D. K., Simon, I. & Rosenfeld, R. Tamamlayıcı məlumatlarla hüceyrə dövrü ifadə məlumatları. Bioinformatika 20, i23–i30 (2004).

Siegal-Gaskins, D., Ash, J. N. & Crosson, S. Hüceyrə dövrü vaxt seriyası məlumatlarının modelə əsaslanan dekonvolyusiya yüksək qətnamə ilə gen ifadə detallarını ortaya qoyur. PLoS Comput. Biol. 5, e1000460 (2009).

Klutstein, M. et al. Genomik yanaşmaların funksional genetik təcrübələrlə birləşməsi maya orta fazalı meioz genlərinin repressiyasının iki rejimini ortaya qoyur. BMC Genomics 11, 478 (2010).

Smith, A. A., Vollrath, A., Bradfield, C. A. & Craven, M. Temporal toksikogenomik ifadə profilləri üçün oxşarlıq sorğuları. PLoS Comput. Biol. 4, e1000116 (2008).

Hafemeister, C., Costa, I. G., Schönhuth, A. & Schliep, A. Parçalı sabit funksiyaların Bayesian qiymətləndirilməsi ilə qısa gen ifadəsi zaman kurslarının təsnifatı. Bioinformatika 27, 946–952 (2011).

Desai, K. H. və başqaları. Xəstə daxilində gen ifadəsi dəyişiklikləri ilə kritik yaralı xəstələrdə iltihablı fəsadların parçalanması: uzununa klinik genomika tədqiqatı. PLoS Med. 8, e1001093 (2011).

Taylor, M. W. et al. Xroniki hepatit C virusunun pegilləşdirilmiş interferon və ribavirin terapiyası zamanı gen ifadəsindəki dəyişikliklər cavab verənləri antiviral terapiyaya cavab verməyənlərdən fərqləndirir. J.Virol. 81, 3391–3401 (2007).

Liew, C.-C., Ma, J., Tang, H.-C., Zheng, R. & Dempsey, A. A. Periferik qan transkriptomu sistem geniş biologiyasını dinamik şəkildə əks etdirir: potensial diaqnostika vasitəsi. J. Laboratoriya. Clin. Med. 147, 126–132 (2006).

Smyth, G. in R və Biokeçiricilərdən istifadə edərək bioinformatika və hesablama biologiyası həlləri 397–420 (Springer, 2005).

Leek, J. T., Monsen, E., Dabney, A. R. & amp Storey, J. D. EDGE: diferensial gen ifadəsinin çıxarılması və təhlili. Bioinformatika 22, 507–508 (2006).

Woo, S., Leek, J. T. & Storey, J. D. Hesablama baxımından səmərəli modul optimal kəşf proseduru. Bioinformatika 27, 509–515 (2011).

Ernst, J. & Bar-Joseph, Z. STEM: qısa zaman seriyası gen ifadə məlumatlarının təhlili üçün bir vasitədir. BMC Bioinformatika 7, 191 (2006).

Schliep, A., Steinhoff, C. & amp Schönhuth, A. HMM-lərin qarışıqlarından istifadə edərək, gen ifadəsi zaman kurslarında qrupların möhkəm nəticəsi. Bioinformatika 20, i283–i289 (2004).

Magni, P., Ferrazzi, F., Sacchi, L. & amp Bellazzi, R. TimeClust: gen ifadəsi zaman seriyası üçün klasterləşdirmə vasitəsi. Bioinformatika 24, 430–432 (2008).

Sivriver, J., Habib, N. & Friedman, N. Dinamik gen ifadəsi məlumatları üçün inteqrativ klasterləşdirmə və modelləşdirmə alqoritmi. Bioinformatika 27, i392–i400 (2011).

Sinha, A. & amp Markatou, M. A. Qısa Zaman Seriyalarının İfadəsinin Emalı üçün Platforma (PESTS). BMC Bioinformatika 12, 13 (2011).

Bonneau, R. et al. Inferelator: sistem-biologiya məlumat dəstlərindən tənzimləyici şəbəkələri öyrənmək üçün alqoritm de novo. Genom Biol. 7, R36 (2006).

Galbraith, S. J., Tran, L. M. & amp Liao, J. C. Məhdud mikroarray məlumatları ilə transkriptom şəbəkə komponentinin təhlili. Bioinformatika 22, 1886–1894 (2006).

Schaffter, T., Marbach, D. & Floreano, D. GeneNetWeaver: silisiumda benchmark yaradılması və şəbəkə nəticə çıxarma üsullarının performans profili. Bioinformatika 27, 2263–2270 (2011).


MATERİALLAR VƏ METODLAR

Gen ifadə əyriləri - hamarlaşdırıcı spline modeli

Qarışıq effektli modeldən istifadə edərək ifadə əyrilərinin klasterləşdirilməsi

Parametrləri qiymətləndirmək üçün maksimum cəzalandırılmış ehtimal yanaşması

EM alqoritminin bir variantından istifadə edərək modelin uyğunlaşdırılması

Biz qiymətləri seçmək üçün GCV ( 17, 18) adlı zərif buraxılmış çarpaz doğrulama prosedurundan istifadə edirik.

Rəddetmə ilə idarə olunan EM (RCEM)

Minlərlə gen nəzərə alınmaqla, dəqiq EM alqoritmini həyata keçirmək çox baha başa gəlir, çünki M-addımı bütün qruplardakı bütün genlərin cəmi olan funksiyanı maksimuma çatdırmağı nəzərdə tutur (çəkilərlə, Tənlik 9). Nəticə alqoritm çox qeyri-sabitdir və səhvlərə meyllidir. Hesablama xərclərini azaltmaq və alqoritmi sabitləşdirmək üçün biz aşağıdakı RCEM alqoritmini təklif edirik [bax. (19) imtinaya nəzarət metodunun təfərrüatları üçün].

Əvvəlcə "aşağı" həddi təyin etdik c (məs. c = 0,05) gendən çoxluğa üzvlük ehtimalları üçün. Bu hədddən çox klasterə üzvlük ehtimalı olan genlər təsirlənmir. Ancaq genlərin çoxluq üzvlüyü ehtimalı daha azdır c ya sıfır ehtimalı, ya da ehtimalı yenidən təyin edilir c əlindəki xüsusi klasterə aid olmaq. Əvvəlki tapşırıq 1 − ehtimalı ilə edilir P (genik)/c ikincisi isə ehtimalla P (genik)/c. Bir çox "aşağı ehtimallı" genləri sıfıra təyin etməklə biz 9-cu tənlikdəki cəmləmə xərclərini xeyli azaldırıq.

Qeyd edək ki, nə vaxt c = 0, təklif olunan alqoritm tam olaraq EM alqoritmidir, halbuki təklif olunan alqoritm Monte Karlo EM alqoritminə (20, 21) azalır. c = 1. Bu yolla, M pilləsinin maya dəyərini xeyli azaldaraq E-addım zamanı çox dəqiq təxminlər etmək olar. Nəhayət, yerli optimallığın qarşısını almaq üçün RCEM çoxlu zəncirlərlə idarə olunur.

Klasterlərin son sayının seçilməsi

Sadə klasterləşdirmə alqoritmindən əldə edilən iki klasterdən ibarət ilkin dəstdən başlayaraq, məsələn k-o deməkdir ki, biz hər klaster və onunla əlaqəli parametrlər üçün orta əyrini hesablayırıq. Sonra, EM alqoritmindən istifadə edərək, biz həm gen-klaster təyinatını, həm də təxmin edilən ifadə əyrisi parametrlərini birləşənə qədər bütün genlər üçün iterativ olaraq yeniləyirik. Konvergensiyadan sonra parametr təxminlərinə əsaslanaraq, BIC-i hesablaya bilərik. Sonra artırırıq K və yuxarıdakı addımları təkrarlayın. Bu proses BIC dəyəri yüksəlməyə başlayana qədər təkrarlanır və nəticədə təxminən U formalı BIC əyrisi yaranır. BIC-in ən kiçik dəyəri daha sonra yekun sayını müəyyən etmək üçün istifadə olunur K klasterlər. Şəkil 3 alqoritmin əsas addımlarını təsvir edir. SSC alqoritmini həyata keçirən proqram təminatı və mənbə kodu, SS Clust, sərbəst şəkildə mövcuddur (http://genemerge.bioteam.net/SSClust.html).

Klasterlərin gücünün ölçülməsi

Əyri klasterləşdirmə prosedurumuzda hər bir orta əyrinin təxmini seçmə dəyişməsi 95% etibarlılıq intervalları/zolağı yaratmaq üçün istifadə edilən RCEM alqoritmi vasitəsilə hesablana bilər (15, 17). Başqa bir tədbir, R 2 , analoqu R Xətti reqressiyada 2, qarışıq təsir modeli ilə izah oluna bilən hər bir çoxluq daxilində variasiya hissəsini təxmin edir. Dəyər nə qədər yüksək olarsa, klaster bir o qədər sıx olar.


Real vaxtda ələ keçirilən gen ifadəsində əsas ilk addımlar

Şəkil 1: Tək genlərdə endogen RNAP2 transkripsiya dövrünün təsviri üçün sistem. Kimdən: Canlı hüceyrə təsviri bir gendə endogen RNT polimeraza II fosforilasiyasının məkan-zaman təşkilini aşkar edir

Gözümüzün görə bilməyəcəyi qədər kiçik tərəzilərdə həyatın işi hüceyrələrimizə həm quruluş, həm də funksiya verən zülalların istehsalı ilə baş verir. Hüceyrə zülalları hərəkət əmrlərini DNT-də kodlanmış genetik təlimatlardan alır, onların ardıcıllığı ilk olaraq transkripsiya deyilən çox mərhələli prosesdə kopyalanır və RNT-yə çevrilir.

Kolorado Dövlət Universitetində tədqiqat əməkdaşlığı yüksək ayırdetmə qabiliyyətinə malik flüoresan mikroskopiya və hesablama modelləşdirməsi üzrə ixtisaslaşır ki, bu cür həyati prosesləri incə detallarda, real vaxtda, tək genlər səviyyəsində vizuallaşdırmaq və təsvir etmək. İndi, doktoranturadan sonrakı tədqiqatçı Linda Forero-Quintero-nun rəhbərlik etdiyi elm adamları, ilk dəfə olaraq, RNT polimeraza fermentlərinin bir DNT ardıcıllığına bağlanaraq transkripsiyanı harada, nə vaxt və necə başlatdığını qeyd edərək, erkən RNT transkripsiya dinamikasını müşahidə etdilər.

Jurnalda təfərrüatlı sıçrayış texnologiyası Təbiət Əlaqələri, saysız-hesabsız mümkün fəsadlara malikdir, bunlara əsas bioloji prosesləri daha yaxşı başa düşmək, müəyyən xəstəliklərin genetik əsaslarını açmaq daxildir.

Monfort professoru və biokimya üzrə dosent Tim Staseviç və dosent Brayan Munski ilə məsləhətləşdiyi postdoktoral tədqiqatçı Forero, "Bu, ilk dəfədir ki, kimsə tək nüsxəli gendə RNT polimerazının fosforlaşma dinamikasına baxır" dedi. kimya və biologiya mühəndisliyi üzrə professor. Keçmişdə bu cür erkən transkripsiya fəaliyyəti yalnız bir genin yüzlərlə nüsxəsindən ibarət olan və ümumiyyətlə hüceyrə nüvəsində tapılmayan süni strukturlar olan gen massivlərindən istifadə etməklə vizuallaşdırıla bilərdi.

Stasevich və Munsky W.M. tərəfindən maliyyələşdirilən əməkdaşlığa rəhbərlik edirlər. Keck Fondu və Milli Ümumi Tibb Elmləri İnstitutu (iki Maksimləşdirici Müstəntiqlərin Tədqiqat Mükafatı vasitəsilə) canlı, tək hüceyrələrdə real vaxtda genetik ifadəni ortaya çıxarmaq və kəmiyyətini müəyyənləşdirmək istəyir. Əməkdaşlığın himayəsi altında hər iki laboratoriyada işləyən Forero, əvvəllər nevroloji vəziyyətlərlə əlaqəli hüceyrə membranlarında olan zülalları və daşıyıcıları tədqiq etmişdi.

Erkən transkripsiya fəaliyyəti

Nature Communications-da təsvir edildiyi kimi, Forero et al. ilkin transkripsiya prosesini canlı rənglərdə: mavi, yaşıl və qırmızıda çəkmək üçün müəyyən edilmiş məməli hüceyrə xətti, mühəndis flüoresan antikor fraqmentləri və xüsusi super rezolyusiyaya malik mikroskopdan istifadə edərək bir üsul hazırladı. Daha dəqiq desək, onlar RNT polimeraza II (RNAP2) transkripsiya fermentinin amin turşusu quyruğunda fosforilləşdiyi və ya fosfat qrupları ilə bəzədildiyi zaman baş verən transkripsiya dövrünün başlanğıcını müşahidə etdilər.

Əməkdaşlığın hesablama aspektlərinə nəzarət edən Munski dedi: "Burada fənlərarası elm yeni eksperimental imkanların və təkhüceyrəli dinamikanın mexaniki hesablama modelləşdirilməsi üçün yeni yanaşmanın fantastik qarışığıdır, hər ikisi öz sahələrində çox yenidir" dedi. .

Laboratoriyada tədqiqatçılar antikor fraqmentlərini transkripsiya edildikdə flüoresan işarəli zülal tərəfindən işıqlandırılan müxbir geni ehtiva edən müəyyən edilmiş məməli hüceyrə xəttinə yüklədilər. Staseviçin bir neçə il əvvəl inkişafına kömək etdiyi antikor fraqmentləri, RNAP2 quyruğunda xüsusi hədəflərini işıqlandıran flüoresan molekullarla işarələnmişdir. Bu etiketləmə texnologiyalarından birlikdə istifadə edərək, tədqiqatçılar transkripsiya dövründə müxtəlif rənglərlə qeyd olunan üç fərqli addımı ayıra bildilər. Bu sistemlə əldə edilən şəkillər flüoresan intensivliyinin dəyişməsinə çevrilir. Tədqiqatçılar daha sonra bu siqnallardan tək nüsxəli gendə transkripsiya dövrü boyunca RNAP2 fosforilasiyasının məkan-zaman təşkilini şərh etmək üçün istifadə etdilər.

Hesablama modeli vasitəsilə yeni məlumatlar

Aspirant Uilyam Raymondun rəhbərlik etdiyi Munskinin komandası Forero və Staseviçin mikroskop məlumatlarını götürdü və stoxastik diferensial tənliklərə əsaslanan hesablama modelinə çevirdi. Bütün eksperimental nəticələrin təkrar istehsalı üçün bu statistik modeli uyğunlaşdıraraq, hesablama qrupu daha sonra transkripsiya prosesi vasitəsilə müxtəlif molekullar və onların vəziyyətləri haqqında yeni mexaniki və kəmiyyət məlumatları toplamaq üçün təhlillərini genişləndirdi.

Məsələn, onlar DNT-nin promotoru bölgəsində keçici qruplar yaratmaq üçün neçə fərdi RNT polimeraza molekulunun toplandığını, bu qrupların nə qədər davam etdiyini və polimerazaların DNT boyunca necə, nə vaxt və harada paylandığını təxmin etdilər. Onlar, məsələn, aşkar etdilər ki, transkripsiya fəaliyyətinin hər bir partlayışı genin promotor bölgəsi ətrafında əmələ gəlmək üçün beş ilə 40 arasında RNT polimerazadan ibarət klaster əmələ gətirir və onların 46%-i sonda RNT-ni transkripsiya etməyi bacarır. Onlar həmçinin aşkar ediblər ki, hər bir RNT-nin buraxılmadan əvvəl tam transkripsiyaya və emal edilməsinə təxminən beş dəqiqə vaxt lazımdır.

Forero deyir ki, bu texnologiya, xüsusən də xüsusi genlərin seçilə və manipulyasiya edilə biləcəyi CRISPR kimi yeni texnologiyalarla birlikdə geniş potensiala malikdir. Maraqlanan müəyyən bir genin seçilməsi, deyək ki, xəstəliyə aid olan bir genin seçilməsi və CSU tədqiqatçılarının transkripsiya dövrünün real vaxt rejimində oxunuşunu tətbiq etmək tədqiqatçılara tək genlərin fəaliyyət səviyyəsində baş verən xəstəlik proseslərini izləməyə imkan verə bilər.

Forero, "Transkripsiya dövrünün məkan və zaman dinamikasını bir gendə həll etmək qabiliyyəti bu işin ən maraqlı tərəfidir" dedi.


Biologiyada Zaman, Zamanlama və Zaman Ölçüsü

Biologiyada həm son (niyə?), həm də yaxın (necə?) suallar var və vaxt və vaxt miqyası anlayışları hər ikisinə uyğundur. Darvin, məsələn, təkamülü növlər arasında zamanla inkişaf etmiş əlaqələri təmsil edən “həyat ağacı” kimi təsəvvür edirdi və beləliklə, filogenezin son mənşəyi ilə bağlı “niyə” suallarına cavab verir (36, 37). Təbii seçmə fərdlər, populyasiyalar və növlər arasında DNT ardıcıllığı fərqləri ilə nəticələnir (38). Zamanla populyasiyanın genetik variasiyasındakı dəyişikliklər, məsələn, istər uzun, minillik zaman genişliyi, istərsə də laboratoriya təcrübələrində iştirak edən qısa fasilələr - Darvinin təkamül vizyonunun əsas göstərişidir. Fenotipik dəyişkənliyi proqnozlaşdıran G-E qarşılıqlı təsirləri zamanla dəyişmənin sürətindən və müddətindən təsirlənir (39, 40). İki növün niyə bir yerdə mövcud olması və ya bölünmüş yaşayış mühitlərində növlərin qorunması strategiyalarının necə tətbiq oluna biləcəyi kimi ekologiyada fundamental suallar da zaman və məkanın mülahizələrini tələb edir (41).

Daha yaxın nöqteyi-nəzərdən zaman və məkan həm də davranış və risklə bağlı “necə” suallarında diqqəti cəlb edən hüceyrə bölünməsi, metabolizm, inkişaf, sinir siqnalının ötürülməsi və gen ifadəsi kimi bioloji proseslərdə kritik elementlərdir (42). Bu proseslərin əsasında duran dinamik qarşılıqlı təsirlər zamanla dəyişir və orqanizmin daxili və xarici mühitləri tərəfindən idarə olunur. Zamanla tənzimlənən proseslərə misal olaraq beyin plastisiyasında kritik dövrlərin açılması və bağlanması (43, 44) və sürətli göz hərəkətinin (REM) və qeyri-REM yuxusunun (yəni, ultradian ritmlərinin), yuxu-oyanma dövrünün bioloji dövriliklərini göstərmək olar. (sirkadian) və mövsümi qışlama və miqrasiya davranışları (yəni, sirkannual) (45). İnkişafın özü də, tərifinə görə, hər hansı bir inkişaf mərhələsi üçün tələb olunan vaxtın ətraf mühit faktorlarından asılı olaraq uzadıla və ya qısaldıla biləcəyi müvəqqəti bir prosesdir. Qidalanma və sosial-emosional amillər, məsələn, yetkinlik dövrünə (46) elə təsir göstərə bilər ki, inkişaf vaxtı xronoloji vaxta (47) bağlı deyil. İnkişafda həssas pəncərələr zamanı baş verən ətraf mühitə məruz qalmalar (məsələn, sosial-emosional çətinliklər və ya ekoloji toksinlər) yetkinlik yaşına qədər uzun, davamlı təsir göstərə bilər və ömür boyu sağlamlıq və rifah halına təsir edə bilər (48).

Yaddaşda iştirak edən hüceyrə sistemləri də müxtəlif vaxt diapazonlarında fəaliyyət göstərir (30, 49). Məsələn, nevroloji tədqiqatlar zamanla bağlı çoxsaylı sualları həll edir. Fərqli zaman şkalalarında mövcud olan əvvəlki təcrübələr millisaniyə səviyyəsində və daha uzun müddət ərzində baş verən proseslərlə idarə olunan sinaptik plastisiyanı birlikdə necə dəyişir? Sinaptik və şəbəkə fəaliyyətinin vaxtı necə idarə olunur? Xüsusi xatirələr necə kodlaşdırılır və günlər, aylar və illər sonra əldə edilir? Bu proseslərdə iştirak edən zaman çərçivələri fəaliyyət potensialının yayılmasında (yəni, millisaniyələrdən saniyəyə qədər), nüvədə gen ifadəsi dəyişikliklərinin siqnalizasiyasında (dəqiqələrdə) və ya gen məhsullarının başqa yerə daşınmasında iştirak edən müxtəlif sürətlərdə işləyə bilər. mobil yerlər (dəqiqələrdən saatlara qədər) (49). Fəaliyyətdən asılı olan bu dəyişikliklərin salınan beyin fəaliyyəti ilə necə modullaşdırıldığı, özü də təcrübədən asılı ola bilər, Reh et al. (45). Nəhayət, gen ifadəsindəki dəyişikliklər daha uzun müddətə (günlərdən həftələrə) malik ola bilər (30) və epigenetik modifikasiyalar daha uzun müddət ərzində (aylardan illərə qədər) transkripsiya dəyişiklikləri ilə nəticələnə bilər (31).


NƏTİCƏLƏR

Simulyasiyalar

Alqoritmin nə qədər yaxşı bərpa edə bildiyini müəyyən etmək üçün 100 simulyasiya edilmiş məlumat dəstinin hər birinə SSC tətbiq etdik: (i) klasterlərin həqiqi sayı, (ii) hər bir funksiya üçün orta əyri və (iii) ifadə profillərinin həqiqi təsnifatı ( əyrilər). Bunlar səhv təsnifat dərəcəsinin müəyyən edilməsi yolu ilə qiymətləndirilib: səhv təsnif edilmiş əyrilərin sayı/əyrilərin ümumi sayı və müvafiq olduqda, ümumi müvəffəqiyyət dərəcəsi: alqoritmin düzgün klaster sayını bərpa etməsinin payı × (1 - səhv təsnifat dərəcəsi) . SSC alqoritmini ilə müqayisə etdik k-alqoritm (1), MCLUST (4), CAGED (5) və FCM (6) deməkdir. Çoxluq nömrəsi ilə a priori göstərilməlidir k-vasitələri və qismən tətbiq olunan FCM proqram təminatına əhəmiyyətli bir başlanğıc üstünlüyü verdik k-Vasitələr və FCM alqoritmləri klasterlərin sayını buraxaraq k klasterlərin həqiqi sayı (dörd) olsun. ildən k-alqoritmin asanlıqla yerli optimada ilişib qalması deməkdir, biz onu təsadüfi ilkin klaster konfiqurasiyaları ilə beş dəfə işlədik və ən aşağı səhv təsnifat dərəcəsini bildirdik. MCLUST üçün müxtəlif kovariasiya strukturlarına malik səkkiz model məlumatlara uyğunlaşdırılmışdır. Optimal BIC ilə modeldən klasterləşdirmə nəticəsi bildirildi.

Bu araşdırmada CAGED və MCLUST müvafiq olaraq 100 dəfədən 14-ü (14%) və 100 dəfədən 77-ni (77%) düzgün klaster sayını seçdi, halbuki SSC 100 dəfədən 100-nü (100) düzgün seçdi. %). Hər klaster üçün SSC-dən istifadə edərək təxmin edilən orta əyri əsl orta əyrilərə (funksiyalara) çox yaxşı uyğun gəlir (Şəkil 4). Biz tapdıq ki, 100 arasında orta səhv təsnifat nisbətlərini təkrarlayır k-Evklid məsafəsi və Pearsondan istifadə edən alqoritm deməkdir r, və FCM-dən istifadə müvafiq olaraq 9,73, 2,64 və 0,75%, SSC-nin isə cəmi 0,13%, ümumi müvəffəqiyyət nisbəti 98,7% idi. CAGED klasterlərin düzgün sayını seçdiyi 14 təkrar üçün orta səhv təsnifat dərəcəsi 11,07% olub və ümumi müvəffəqiyyət nisbəti 2,93% təşkil edib. MCLUST-un düzgün klaster sayını seçdiyi 77 təkrar üçün orta səhv təsnifat dərəcəsi 0,38% olub və ümumi müvəffəqiyyət nisbəti 69,5% təşkil edib. Yuxarıdakı təhlil tam məlumatdan istifadə edərək bütün alqoritmlər üçün təkrarlandı (çatışmayan məlumat yoxdur). Biz SSC-nin hələ də ən aşağı səhv təsnifat dərəcəsinə (0,13%) və ən yüksək ümumi müvəffəqiyyət nisbətinə (98,7%) sahib olduğunu gördük. Bu nəticələr SSC-nin daha yaxşı olduğunu göstərir k-vasitələri və FCM (hətta ideal ssenari altında düzgün sayı olduğu k klasterlərə verilir k-vasitələr və FCM a priori), həmçinin MCLUST və CAGED. SSC-nin bir iterasiyasının hesablama mürəkkəbliyi təxminəndir O (n 2 × t 2 ).

Drosophila ifadə vaxtı kursu məlumatları

Əvvəlki araşdırmada vəhşi milçəklərdə 4028 genin mRNT səviyyələri (Drosophila melanogaster) gübrələmə zamanı başlayan və embrion, sürfə, pupa mərhələləri və yetkinliyin ilk 30 gününü əhatə edən ~70 zaman nöqtəsində cDNA mikroarraylarından istifadə etməklə əldə edilmişdir (23). mRNT qarışıq kişi və qadın populyasiyalarından yetkinlik yaşına qədər çıxarıldı, burada kişilər və qadınlar ayrıca nümunə götürüldü. Hər bir eksperimental nümunə həyat dövrünün bütün mərhələlərində toplanmış mRNT-dən ümumi istinad nümunəsinə hibridləşdirildi.

İlkin klasterdən başlayaraq k = 2 əsasında k- klasterləşmə deməkdir, massivdəki 3873 artıq olmayan gen SSC tərəfindən 17 klasterdən ibarət son optimal dəstdə qruplaşdırıldı. k = 28 klaster. Hər bir gen ifadəsi klasteri üçün onun orta ifadə əyrisini və əlaqəli 95% nöqtəli inam intervalını və R 2 dəyər. Hər klasterdəki genlərin tam siyahısı, bütün 17 klaster üçün xam və orta ifadə əyriləri Əlavə Məlumatda tapıla bilər. Yetkin milçəklərdə cinslər arasında ifadə fərqlərinə uyğunlaşmaq üçün biz metamorfozdan sonra iki budaqdan istifadə etdik ki, yetkin erkək və dişi milçəklərin ifadəsini ayrı-ayrılıqda budaqlanan splinelardan istifadə etdik (24) (Əlavə məlumat).

Əldə edilən klasterlərin bioloji etibarlılığını yoxlamaq üçün biz GeneMerge-dən (25) istifadə etdik ki, hər bir məlumat dəstində hər hansı xüsusi funksional kateqoriyaların statistik olaraq həddindən artıq təmsil olunub-olunmadığını müəyyən etmək üçün 17 klasterin hər birində bütün genlərin şərh edilmiş funksiyalarını müəyyən etdik. “Bioloji proses” kateqoriyasındakı gen funksiyaları Gen Ontologiya Konsorsiumundan (26) əldə edilib və GeneMerge üçün giriş kimi istifadə edilib. Qeyd edək ki, hər bir gen üçün gen ontologiyası terminlərinin bütün iyerarxiyası funksional həddindən artıq təmsili qiymətləndirərkən istifadə edilmişdir, buna görə də çox vaxt eyni gen dəstlərini ehtiva edən iç içə kateqoriyalar bildirilir. Bonferroni düzəliş etdi P-qiymətlər başqa cür qeyd edilmədikdə verilir. Bu şərh edilmiş funksiyalar nəticələrin bioloji etibarlılığını yoxlamaq üçün zamanla təxmin edilən klaster orta gen ifadə profilləri ilə birlikdə istifadə edilmişdir.

Biz SSC istifadə edərək aşkar edilmiş gen ifadə qrupları ilə məlum və ya gözlənilən bioloji funksiyalar arasında yaxşı uyğunluq tapdıq və əvvəllər bildirilməyən bir neçə yeni, bioloji cəhətdən mənalı gen ifadə modellərini kəşf etdik. Aşkar edilmiş 17 klasterdən 12 klaster (70%) milçəkdə məlum bioloji prosesləri olan genlərin əhəmiyyətli dərəcədə funksional həddindən artıq təmsil olunmasını nümayiş etdirdi.P < 0.05, Əlavə məlumat).

Hər klaster üçün SSC tərəfindən əldə edilən orta ifadə əyriləri də hər klasterin bioloji şərhində istifadə edilmişdir. Bu klasterlərdən dördü üçün orta gen ifadə əyriləri və onların 95% nöqtəli inam zolaqları Şəkil 5-də verilmişdir. Orta əyriləri və xam ifadə profilləri olan bütün klasterləri Əlavə Məlumatda tapmaq olar.

5A klasterinin orta ifadə əyrisi (R 208 gen ehtiva edən 2 = 0,560) yaşlı qadınlarda və erkən embrionda gen ifadəsinin zirvəsini göstərir (Şəkil 5). Daha əvvəl təsvir edilən bu nümunənin (23) qadın yumurta istehsalını və inkişaf etməkdə olan embrionda hüceyrə proliferasiyasını təmsil etdiyi düşünülür. Bu fikrə uyğun olaraq, DNT replikasiyasında iştirak edən genlərin həddindən artıq təmsil olunması (P < 10 −18 ), mitoz (P < 10 −9 ) və hüceyrə proliferasiyası (P < 10 −12 ) bu klasterdə (Cədvəl 1) digər əlaqəli funksiyalar (Əlavə Məlumat) arasında mövcud idi.

5B klasterinin təxmin edilən orta əyrisindən (Şəkil 5) embriogenez zamanı yuxarı tənzimlənən bir çox genin metamorfoz zamanı da yuxarı tənzimləndiyini müşahidə etmək olar ki, bu da embriogenez (yumurtadan keçid) zamanı nümunənin formalaşması üçün istifadə edilən bir çox genin istifadə olunduğunu göstərir. sürfələrə) metamorfoz zamanı (larvadan uçmağa keçid) yenidən yerləşdirilir. Təəccüblü deyil ki, bu klaster (R 2 = 0,557) ilk növbədə inkişafda iştirak edən genlər üçün zənginləşdirilmişdir (P < 10 −14 ) ( Cədvəl 1). Oxşar iki zirvəli ifadə nümunəsi statistik əhəmiyyət kəsb etmədən (23) tərəfindən zirvə tapma alqoritmindən istifadə edərək tapıldı. Bu klasterdəki 109 gendən 47-nin morfogenezdə iştirak etdiyi məlumdur (P < 10 −18 ), 27 neyrogenezdə (P < 10 −10 ) və 8 hüceyrə taleyinin spesifikasiyasında iştirak edir (P < 10 −5), həmçinin milçək nümunəsinin formalaşmasının bir sıra digər aspektləri (Əlavə məlumat). Gen ifadəsinin bu modeli həm bioloji cəhətdən mənalıdır, həm də statistik cəhətdən möhkəmdir.

5C klasterində SSC istifadə edərək gen ifadəsinin demək olar ki, əks nümunəsi tapıldı, burada gen ifadəsi sürfə və yetkin həyatda zirvəyə çatır və inkişaf dövrlərində minimum səviyyədədir (Şəkil 5C). Bu çoxluqdakı 295 gen (R 2 = 0,593) oksidləşdirici fosforlaşma üçün əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirilmişdir (P < 10 −14 ), enerjinin ATP şəklində yarandığı bir prosesdir. Bundan əlavə, 5C klasterində karbohidratların, lipidlərin və amin turşularının metabolizmində iştirak edən genlərin həddindən artıq təmsilçisi var.P < 0,01, hamı üçün) ( Cədvəl 1). Sürfə və yetkinlik dövründə enerji istehsalı və maddələr mübadiləsi genlərinin bu şəkildə tənzimlənməsi gözlənilir, çünki bunlar ətraf mühitdən qida maddələrinin alındığı, morfogenez və çoxalma üçün saxlandığı və hərəkət üçün istifadə edildiyi mərhələlərdir. Bu maraqlı nümunə əvvəllər təsvir edilməmişdir və nə SOM, nə də (23) istifadə edilən iyerarxik klasterləşdirmə metodlarından istifadə etməklə aşkar edilməmişdir.

Nəhayət, bir çox gen müşahidə etdik (n = 122) ifadədə pik nöqtəsi əsasən yetkin kişilərdə (Şəkil 5D). Maraqlıdır ki, bu klaster (R 2 = 0,553) fototransduksiyada iştirak edən genlərlə zənginləşdirilmişdir (P < 5 × 10 −6 ) ( Cədvəl 1). Bu prosesdə iştirak etdiyi bilinən massivdəki 17 gendən cəmi 8-i 5D klasterində tapıldı. Bu yeni model nə SOM, nə də Arbeitman tərəfindən istifadə edilən iyerarxik klasterləşdirmə üsulları ilə aşkar edilməyib. və b. (23), müxtəlif cDNA mikroarraylarından istifadə edərək yetkin erkək və dişi milçəklər üzərində aparılan ayrı-ayrı mikroarray analizləri ilə müstəqil olaraq təsdiq edilmişdir (27). Bu təcrübələrin təhlili göstərdi ki, fototransduksiya şəbəkəsindəki genlər kişilərdə qadınlara nisbətən daha yüksək ifadə olunur (məlumatlar göstərilmir).

Caenorhabditis elegans ifadə vaxtı kursu məlumatları

( 23)-də milçək inkişafının zaman kursu xüsusilə sıx şəkildə seçilmişdir, ona görə də biz SSC-nin daha seyrək seçilmiş vaxt kursu məlumatlarına tətbiq edildikdə eyni dərəcədə güclü olub-olmayacağını bilməkdə maraqlı idik. Nematodun həyat dövrü ərzində 17 871 gen üçün cDNA mikroarray ifadə məlumatları toplanmışdır. C.elegans Jiang tərəfindən və b. (28) və yumurtalar, sürfə mərhələləri daxil olmaqla 6 vaxt nöqtəsi var: L1, L2, L3 və L4 və gənc yetkinlər. Hamarlaşdırıcı splayn üsulları 5-dən az vaxt nöqtəsi üçün tövsiyə edilmədiyinə görə, bu verilənlər bazası SSC alqoritminin aşağı həddinə meydan oxuyur. Jiang məlumatlarından bəri və b. ( 28) seyrəkdir və heç bir nəzarət elementi yoxdur ( 28) biz onları yalnız zaman ərzində χ 2 kriteriyası ilə əhəmiyyətli dərəcədə modulyasiya edilmiş genləri daxil etmək üçün süzdük.P < 0,01) ( 29). Süzgəcdən sonra, cəmi 3118 genin əhəmiyyətli dərəcədə modulyasiya edildiyi və SSC istifadə edərək qruplaşdırıldığı aşkar edildi. İlkin klasterdən başlayaraq k = 2 yuxarıda olduğu kimi, 3118 gen 16 klasterdən ibarət son optimal dəstdə toplandı. Bu klasterlərdən üçü üçün orta ifadə əyriləri və əlaqəli 95% nöqtəli Bayes etimad zolaqları Şəkil 6-da verilmişdir. Hər klasterdəki genlərin tam siyahısı və bütün 16 klaster üçün xam və orta ifadə əyriləri Əlavə Məlumatda tapıla bilər. .

Bir daha, biz SSC əsaslı gen ifadə qrupları ilə məlum və ya gözlənilən bioloji funksiyalar arasında yaxşı razılıq tapdıq və əvvəllər bildirilməyən gen ifadəsinin bir neçə yeni və mənalı nümunəsini kəşf etdik. SSC tərəfindən aşkar edilmiş 16 klasterdən 8-i (50%) məlum bioloji proseslərin əhəmiyyətli dərəcədə funksional həddindən artıq təmsil olunmasını nümayiş etdirdi (P < 0.05, Əlavə məlumat).

Məsələn, 6A klasterindəki 596 gendən (Şəkil 6) (R 2 =0,505), 165 gen ontologiyası annotasiyalarına uyğun olaraq qurdların böyüməsi prosesində iştirak etmişdir ki, bu da bu klasterdə gen funksiyasının yüksək dərəcədə zənginləşməsini göstərir (P < 10 −49 ) (Əlavə məlumat). Bu ifadə klasterində inkişaf, metabolizm və çoxalmada iştirak edən genlər də zənginləşdirilmişdir (P << 10 −20 hamı üçün) (Əlavə məlumat). 6A klasterinə aid genlərin ekspressiyasının yumurtadan başlayaraq son sürfə mərhələsinə (L4) qədər gənc yetkinlərdə cüzi azalma ilə sabit artımı, yetkin qurdların normal böyüməsi, inkişafı və eyni vaxtda metabolik xərcləri ilə uyğun gəlir. onların həyat dövrü. Bu və bütün digər qruplar üçün əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirilmiş gen funksiyalarının tam siyahısını Əlavə Məlumatda tapa bilərsiniz.

6B klasterində (R Yalnız 67 gendən ibarət olan 2 = 0,760) gen ifadəsi L2 ilə L4 arasında maksimumdur (Şəkil 6B). Burada lokomotor davranışda iştirak edən genlərin həddindən artıq təmsil olunmasını tapırıq (P < 10 −7 ), böyümənin tənzimlənməsi (P < 10 −3 ) və cuticle biosintezi (P < 0,007) (Əlavə məlumat). Gen ifadəsinin oxşar nümunəsi (28) tərəfindən SOM qruplarından birində tapıldı. Bu SOM klasteri burada olduğu kimi funksional həddən artıq təmsil olunma üçün yoxlanıldıqda, funksional zənginləşdirmənin oxşar nümunəsi tapıldı (məlumatlar göstərilmir).

Klaster 6C (R 2 = 0.323) xüsusilə maraqlıdır ki, o, meyvə milçəyindəki 5A klasterinə bənzər ifadə nümunəsi olan genləri ehtiva edir (Şəkil 5). Milçəkdə olduğu kimi, 6C klasteri də hüceyrə proliferasiyası, hüceyrə sikli və DNT replikasiyasında iştirak edən genlər üçün əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirilmişdir.P < 0,01, P < 0,01 və P < 0,0003, müvafiq olaraq düzəldilməyib) (Əlavə məlumat). Bu funksional zənginləşdirmə nümunəsi (28) tərəfindən bildirilmiş SOM qruplarının heç birində tapılmadı (məlumatlar göstərilmir). Nümunə alınan gənc yetkinlərin mRNT hasilatı zamanı “yumurtasız” toplandığı bildirilsə də (28), spermatogenez L3, oogenez isə L4 zamanı başlayır. C.elegans (30) hermafroditdir. Beləliklə, çox güman ki, qurdların toplanması zamanı gametogenez davam etmiş və nəticədə 6C klasterinin müşahidə nümunəsi yaranmışdır.

Həqiqətən də bu klasterdə gametogenezdə iştirak etdiyi bilinən 20 gen aşkar edilmişdir (P < 0,0078, düzəldilməmiş) və 5 gendən 2-si C.elegans Qadın gametlərinin nəslində iştirak etdiyi bilinən genom da bu klasterdə tapıldı (P < 0,0053, düzəldilməyib). Beləliklə, ehtimal görünür ki, hermafrodit qurdlarda gametogenez, dişi milçəklərdə olduğu kimi, yetkinlərdə hüceyrə proliferasiyasında iştirak edən genlərin gen ifadəsində zirvədən məsuldur.

Ümumilikdə, Ciang'ın seyrək nümunəli nematod inkişaf zamanı kurs məlumatlarında və b. (28), SSC əvvəllər təsvir edilmiş və yeni gen ifadə nümunələrinin avtomatik aşkarlanmasını asanlaşdırdı.Ümumilikdə DSK tərəfindən aşkar edilmiş klasterlərin 50%-i statistik cəhətdən əhəmiyyətli funksional zənginləşmə nümayiş etdirdi, bu, daha sıx seçmə ifadə məlumatlarında əhəmiyyətli funksional zənginləşməsi olan klasterlərin 70%-i ilə müsbət müqayisə olunur. D.melanoqaster (23). Bu, SSC-nin həm sıx, həm də seyrək seçilmiş zaman kursu məlumatlarında gen ifadəsinin verilənlərə əsaslanan nümunələrinin aşkar edilməsində təsirli olduğunu göstərir.


Stimuldan gen ifadəsinə qədər vaxt - Biologiya

a Zernike Təkmil Materiallar İnstitutu, Polimer Kimyası Departamenti, Qroningen Universiteti, Nijenborq 4, 9747 AG Qroningen, Hollandiya
E-poçt: [email protected]

b DWI-Leibniz İnteraktiv Materiallar İnstitutu, Forckenbeckstr. 50, 52056 Aachen, Almaniya
E-poçt: [email protected]

c Kimya Departamenti, İllinoys Universiteti, Çikaqo, Çikaqo, İllinoys 60607, ABŞ

d Kimya Departamenti, El Paso, Texas Universiteti, El Paso, Texas 79968-0513, ABŞ

e Fizika Departamenti, İllinoys Universitetinin Çikaqo, Çikaqo, İllinoys 60607, ABŞ

f Biofarmasevtika Elmləri Bölməsi, İllinoys Universitetinin Çikaqo, Çikaqo, İllinoys 60612, ABŞ

g Texniki və Makromolekulyar Kimya İnstitutu, RWTH Aachen Universiteti, Worringerweg 2, 52074 Aachen, Almaniya

Mücərrəd

İncə məkan-zaman ayırdetmə qabiliyyəti ilə gen ifadəsini işıqla idarə etmək nəinki əsas bioloji prosesləri başa düşməyə və manipulyasiya etməyə imkan verir, həm də yeni terapevtik strategiyaların inkişafına təkan verir. Optogenetik vasitələrin istifadəsinə əlavə olaraq, fotokimyəvi strategiyalar əsasən foto cavab verən kiçik molekulların müvafiq biomakromolekulyar strukturlara daxil edilməsinə əsaslanır. Buna görə də, ümumiyyətlə, böyük sintetik səy tələb olunur və gen ifadəsinin bir sistem daxilində hər iki istiqamətdə dəyişdirilməsi problem olaraq qalır. Budur, a trans kiçik foto-dəyişdirilə bilən siqnal molekullarının nəzarəti altında dizayn edilmiş tRNA-nı təqlid edən strukturdan (TMS) ibarət olan kodlaşdırılmış ribo açar. Siqnal molekulları bir-birinə bağlı olan iki amin qlikozid molekulundan ibarətdir vasitəsilə azobenzol vahidi. Sistemimizin işığa həssaslığı siqnal molekulu ilə TMS keçidi arasında foto-dəyişdirilə bilən qeyri-kovalent qarşılıqlı təsirlərdən qaynaqlanır və iki fərqli genin fotokimyəvi şəkildə idarə olunan ifadəsinin nümayişinə gətirib çıxarır. İnanırıq ki, bu modul dizayn işığı stimul kimi istifadə edən yüksək məkan-zaman ayırdetmə qabiliyyətinə malik digər funksional zülalların ifadəsini idarə etmək üçün güclü platforma təmin edəcək.


İçindəkilər

Transkripsiya Redaktəsi

DNT zəncirindən RNT nüsxəsinin istehsalına transkripsiya deyilir və nukleotid əsaslarının tamamlayıcılıq qanununa uyğun olaraq böyüyən RNT zəncirinə hər dəfə bir ribonukleotid əlavə edən RNT polimerazları tərəfindən həyata keçirilir. Bu RNT şablon 3′ → 5′ DNT zəncirinə tamamlayıcıdır, [7] istisna olmaqla, RNT-də timinlər (T) urasillərlə (U) əvəzlənir.

Prokaryotlarda transkripsiya bir növ RNT polimerazı tərəfindən həyata keçirilir ki, bu da transkripsiyaya başlamaq üçün siqma faktoru zülalının (σ faktoru) köməyi ilə Pribnow qutusu adlanan DNT ardıcıllığını bağlamalıdır. Eukariotlarda transkripsiya nüvədə üç növ RNT polimerazı tərəfindən həyata keçirilir, onların hər birinə promotor adlanan xüsusi DNT ardıcıllığı və prosesi başlatmaq üçün DNT-ni bağlayan bir sıra zülallar - transkripsiya faktorları lazımdır (aşağıda transkripsiyanın tənzimlənməsinə baxın) . RNT polimeraza I ribosomal RNT (rRNT) genlərinin transkripsiyasından məsuldur. RNT polimeraza II (Pol II) bütün zülal kodlayan genləri, eyni zamanda bəzi kodlaşdırmayan RNT-ləri transkripsiya edir.məs., snRNA-lar, snoRNA-lar və ya uzun kodlaşdırmayan RNT-lər). RNT polimeraza III 5S rRNT-ni, transfer RNT (tRNT) genlərini və bəzi kiçik kodlaşdırmayan RNT-ləri transkripsiya edir.məs., 7SK). Transkripsiya polimeraza terminator adlanan ardıcıllıqla qarşılaşdıqda başa çatır.

MRNA emalı Redaktə edin

Prokaryotik zülal kodlayan genlərin transkripsiyası zülala çevrilməyə hazır olan xəbərçi RNT (mRNT) yaratsa da, eukaryotik genlərin transkripsiyası RNT-nin (pre-RNT) ilkin transkriptini buraxır, bu da RNT-yə çevrilmək üçün əvvəlcə bir sıra modifikasiyalardan keçməli olur. yetkin RNT. Yetişmə proseslərində iştirak edən növlər və addımlar kodlayan və kodlaşdırılmayan preRNA-lar arasında dəyişir yəni. həm mRNT, həm də tRNT üçün preRNT molekulları bir-birinə yapışdırılsa da, iştirak edən addımlar və mexanizmlər fərqlidir. [8] Qeyri-kodlaşdıran RNT-nin emalı aşağıda təsvir edilmişdir (qeyri-mənəvi RNT yetişməsi).

PremRNT-nin emalına 5′ daxildir qapaq, pre-mRNT-nin 5′ ucuna 7-metilquanosini (m 7 G) əlavə edən və beləliklə RNT-ni eksonükleazlar tərəfindən deqradasiyadan qoruyan fermentativ reaksiyalar toplusudur. m 7 G qapağı daha sonra qapaq bağlayan kompleks heterodimer (CBC20/CBC80) ilə bağlanır, bu mRNT-nin sitoplazmaya ixracına kömək edir və həmçinin RNT-ni qapağın açılmasından qoruyur.

Digər modifikasiya 3′ parçalanma və poliadenilləşmə. Onlar adətən zülal kodlaşdırma ardıcıllığı ilə terminator arasında olan pre-mRNT-də poliadenilləşmə siqnal ardıcıllığı (5′- AAUAAA-3′) olduqda baş verir. Pre-mRNT əvvəlcə parçalanır, sonra bir sıra

RNT-ni deqradasiyadan qoruyan poli(A) quyruğu yaratmaq üçün 200 adenin (A) əlavə edilir. Poli(A) quyruğu mRNT ixracı və tərcümənin yenidən başlaması üçün zəruri olan çoxlu poli(A) bağlayan zülallar (PABP) ilə bağlanır. Deadenilasiyanın tərs prosesində poli(A) quyruqları CCR4-Not 3′-5′ eksonükleaz tərəfindən qısaldılır ki, bu da çox vaxt tam transkript çürüməsinə səbəb olur.

Eukaryotik pre-mRNT-nin çox əhəmiyyətli bir modifikasiyasıdır RNT-nin birləşdirilməsi. Eukaryotik pre-mRNA-ların əksəriyyəti ekzonlar və intronlar adlanan alternativ seqmentlərdən ibarətdir. Birləşmə prosesi zamanı spliceosoma kimi tanınan RNT-protein katalitik kompleksi iki transesterifikasiya reaksiyasını katalizləyir, bu reaksiyalar bir intronu çıxarır və onu lariat quruluşu şəklində buraxır, sonra isə qonşu ekzonları birləşdirir. Müəyyən hallarda bəzi intronlar və ya ekzonlar ya çıxarıla, ya da yetkin mRNT-də saxlanıla bilər. Bu sözdə alternativ splicing tək gendən yaranan müxtəlif transkriptlər seriyasını yaradır. Bu transkriptlər potensial olaraq müxtəlif zülallara çevrilə bildiyinə görə, splicing eukaryotik gen ifadəsinin mürəkkəbliyini və növün proteomunun ölçüsünü genişləndirir.

Geniş RNT emalı eukaryotların nüvəsi ilə mümkün olan təkamül üstünlüyü ola bilər. Prokaryotlarda transkripsiya və tərcümə birlikdə baş verir, eukaryotlarda isə nüvə membranı iki prosesi ayırır və RNT emalına vaxt verir.

Qeyri-kodlaşdıran RNT yetişməsi Redaktə edin

Əksər orqanizmlərdə kodlaşdırmayan genlər (ncRNA) sonrakı emaldan keçən prekursorlar kimi transkripsiya edilir. Ribosomal RNT (rRNA) vəziyyətində, onlar tez-tez bir və ya daha çox rRNA ehtiva edən pre-rRNT kimi transkripsiya edilir. Pre-rRNT snoRNA adlanan təxminən 150 müxtəlif kiçik nüvə məhdudlaşdırılmış RNT növləri tərəfindən xüsusi yerlərdə parçalanır və dəyişdirilir (2′-O-metilasiya və psevduridin əmələ gəlməsi). SnoRNA-lar zülallarla birləşərək snoRNP-ləri əmələ gətirir. SnoRNA hissəsi hədəf RNT ilə əsas cütləşir və beləliklə modifikasiyanı dəqiq bir yerdə yerləşdirərkən, zülal hissəsi katalitik reaksiyanı həyata keçirir. Eukariotlarda, xüsusən də RNase adlı snoRNP-də MRP 45S pre-rRNT-ni 28S, 5.8S və 18S rRNA-lara parçalayır. rRNT və RNT emal faktorları nüvəcik adlanan böyük aqreqatlar əmələ gətirir. [9]

Transfer RNT (tRNA) vəziyyətində, məsələn, 5′ ardıcıllığı RNase P [10] tərəfindən, 3′ ucu isə tRNase Z fermenti [11] və şablonlaşdırılmamış 3′ CCA quyruğu tərəfindən çıxarılır. nukleotidil transferaz tərəfindən əlavə edilir. [12] Mikro RNT (miRNA) vəziyyətində, miRNA-lar əvvəlcə qapaqlı və poli-A quyruğu olan ilkin transkriptlər və ya pri-miRNA kimi transkripsiya edilir və pre-miRNA kimi tanınan qısa, 70-nukleotidli kök döngə strukturlarına işlənir. Droşa və Paşa fermentləri tərəfindən hüceyrə nüvəsi. İxrac edildikdən sonra o, daha sonra Arqonaut zülalından ibarət olan RNT-nin səbəb olduğu susdurucu kompleksin (RISC) əmələ gəlməsinə səbəb olan endonukleaza Dicer ilə qarşılıqlı əlaqədə sitoplazmada yetkin miRNA-lara işlənir.

Hətta snRNA və snoRNA-ların özləri funksional RNP kompleksinin bir hissəsi olmamışdan əvvəl bir sıra modifikasiyadan keçirlər. Bu, ya nukleoplazmada, ya da Cajal cisimləri adlanan xüsusi bölmələrdə edilir. Onların əsasları strukturca snoRNA-lara bənzəyən kiçik Cajal bədənə xas RNT (scaRNA) qrupu tərəfindən metilləşdirilmiş və ya psevdouridinilləşdirilmişdir.

RNT ixracı Redaktə edin

Eukariotlarda ən yetkin RNT nüvədən sitoplazmaya ixrac edilməlidir. Bəzi RNT-lər nüvədə fəaliyyət göstərdiyi halda, bir çox RNT nüvə məsamələri vasitəsilə və sitozolun içinə daşınır. [13] RNT-lərin ixracı ixracinlər kimi tanınan xüsusi zülallarla əlaqə tələb edir. Xüsusi eksportin molekulları müəyyən bir RNT növünün ixracına cavabdehdir. mRNA nəqli həmçinin Exon Junction Complex (EJC) ilə düzgün əlaqəni tələb edir ki, bu da ixracdan əvvəl mRNT-nin düzgün işlənməsinin tamamlanmasını təmin edir. Bəzi hallarda RNT-lər əlavə olaraq sitoplazmanın müəyyən bir hissəsinə, məsələn sinapsa daşınır, sonra onlar RNT-də xüsusi ardıcıllıqla (“poçt kodları” adlanır) bağlayıcı zülallar vasitəsilə bağlanan motor zülalları tərəfindən çəkilir. [14]

Tərcümə Redaktəsi

Bəzi RNT (kodlaşdırmayan RNT) üçün yetkin RNT son gen məhsuludur. [15] Messenger RNT (mRNA) vəziyyətində RNT bir və ya daha çox zülalın sintezi üçün kodlaşdıran məlumat daşıyıcısıdır. Tək bir zülal ardıcıllığını daşıyan mRNT (eukariotlarda ümumi) monosistronik, çoxlu protein ardıcıllığını daşıyan mRNT isə (prokaryotlarda ümumi) polikistronik olaraq tanınır.

Hər mRNT üç hissədən ibarətdir: 5′ tərcümə olunmamış bölgə (5′UTR), zülal kodlayan bölgə və ya açıq oxu çərçivəsi (ORF) və 3′ tərcümə olunmamış bölgə (3′UTR). Kodlaşdırma bölgəsi, üçlük yaratmaq üçün genetik kodla kodlanmış zülal sintezi üçün məlumat daşıyır. Kodlaşdıran bölgənin nukleotidlərinin hər üçlüyü kodon adlanır və köçürmə RNT-də antikodon üçlüyünü tamamlayan bağlanma yerinə uyğun gəlir. Eyni antikodon ardıcıllığına malik transfer RNT-ləri həmişə eyni tipli amin turşusu daşıyır. Daha sonra amin turşuları kodlama bölgəsindəki üçlülərin sırasına uyğun olaraq ribosom tərəfindən bir-birinə zəncirlənir. Ribosom ötürücü RNT-nin messenger RNT-yə bağlanmasına kömək edir və hər transfer RNT-dən amin turşusunu götürür və ondan struktursuz bir zülal yaradır. [16] [17] Hər bir mRNT molekulu orta hesabla bir çox protein molekuluna çevrilir.

Prokaryotlarda tərcümə ümumiyyətlə transkripsiya nöqtəsində (birgə transkripsiya) baş verir, çox vaxt hələ yaradılma prosesində olan bir mesajçı RNT istifadə olunur. Eukariotlarda tərcümə yazılan zülalın harada olmasından asılı olaraq hüceyrənin müxtəlif bölgələrində baş verə bilər. Əsas yerlər həll olunan sitoplazmatik zülallar üçün sitoplazma və hüceyrədən ixrac və ya hüceyrə membranına daxil olmaq üçün olan zülallar üçün endoplazmatik retikulumun membranıdır. Endoplazmik retikulumda ifadə edilməli olan zülallar tərcümə prosesi vasitəsilə qismən tanınır. Bu, ribosoma bağlanan və böyüyən (yetişməkdə olan) amin turşusu zəncirində siqnal peptidi tapdıqda onu endoplazmatik retikuluma yönəldən bir zülal olan siqnalın tanınması hissəciyi ilə idarə olunur. [20]

Qatlanan Redaktə

Hər bir zülal mRNT ardıcıllığından amin turşularının xətti zəncirinə çevrildikdə açılmamış polipeptid və ya təsadüfi sarğı şəklində mövcuddur. Bu polipeptiddə hər hansı inkişaf etmiş üçölçülü struktur yoxdur (qonşu fiqurun sol tərəfi). Daha sonra polipeptid təsadüfi bir rulondan öz xarakterik və funksional üçölçülü quruluşuna bükülür. [21] Amin turşuları bir-biri ilə qarşılıqlı əlaqədə olur və dəqiq müəyyən edilmiş üçölçülü struktur, doğma vəziyyət kimi tanınan qatlanmış zülal (şəklin sağ tərəfi) əmələ gətirir. Yaranan üçölçülü quruluş amin turşusu ardıcıllığı (Anfinsen dogması) ilə müəyyən edilir. [22]

Düzgün üçölçülü quruluş işləmək üçün vacibdir, baxmayaraq ki, funksional zülalların bəzi hissələri açılmamış qala bilər. [23] Nəzərdə tutulan formaya bükülməməsi adətən zəhərli prionlar da daxil olmaqla müxtəlif xassələrə malik qeyri-aktiv zülallar əmələ gətirir. Bir sıra neyrodegenerativ və digər xəstəliklərin yığılmasının nəticəsi olduğuna inanılır səhv qatlanmış zülallar. [24] Bir çox allergiyaya zülalların qatlanması səbəb olur, çünki immunitet sistemi müəyyən protein strukturları üçün antikor istehsal etmir. [25]

Şaperonlar adlanan fermentlər yeni əmələ gələn zülalın işləməsi üçün lazım olan 3 ölçülü quruluşa çatmasına (qatlanmasına) kömək edir. [26] Eynilə, RNT şaperonları RNT-lərin funksional formalarını əldə etmələrinə kömək edir. [27] Protein qatlanmasına kömək etmək eukariotlarda endoplazmatik retikulumun əsas rollarından biridir.

Translokasiya Redaktəsi

Eukariotların və ya prokaryotların ifrazat zülalları ifrazat yoluna daxil olmaq üçün köçürülməlidir. Yeni sintez edilmiş zülallar siqnal peptidləri ilə eukaryotik Sec61 və ya prokaryotik SecYEG translokasiya kanalına yönəldilir. Eukariotlarda zülal ifrazının effektivliyi istifadə olunan siqnal peptidindən çox asılıdır. [28]

Protein nəqli Redaktə edin

Bir çox zülal hüceyrənin sitozoldan başqa digər hissələri üçün nəzərdə tutulub və geniş diapazonlu siqnal ardıcıllığı və ya (siqnal peptidləri) zülalları olması lazım olan yerə yönəltmək üçün istifadə olunur. Prokaryotlarda bu, hüceyrənin məhdud bölünməsi səbəbindən adətən sadə bir prosesdir. Bununla birlikdə, eukariotlarda zülalın düzgün orqanellə çatmasını təmin etmək üçün çox sayda müxtəlif hədəfləmə prosesləri var.

Bütün zülallar hüceyrədə qalmır və bir çoxları, məsələn, həzm fermentləri, hormonlar və hüceyrədənkənar matris zülalları ixrac olunur. Eukariotlarda ixrac yolu yaxşı inkişaf etmişdir və bu zülalların ixracı üçün əsas mexanizm endoplazmatik retikuluma köçürmə, ardınca isə Qolji aparatı vasitəsilə nəqldir. [29] [30]

Gen ifadəsinin tənzimlənməsi bir genin funksional məhsulunun miqdarının və görünmə vaxtının idarə edilməsinə aiddir. İfadə nəzarəti hüceyrənin öz növbəsində ehtiyac duyduğu gen məhsullarını istehsal etməsinə imkan vermək üçün həyati əhəmiyyət kəsb edir, bu, hüceyrələrə dəyişən mühitə, xarici siqnallara, hüceyrənin zədələnməsinə və digər stimullara uyğunlaşmaq üçün çeviklik verir. Ümumiyyətlə, gen tənzimlənməsi hüceyrəyə bütün quruluş və funksiya üzərində nəzarəti verir və hüceyrə diferensiasiyası, morfogenez və hər hansı bir orqanizmin çox yönlü və uyğunlaşma qabiliyyəti üçün əsasdır.

Necə tənzimlənməsindən asılı olaraq gen növlərini təsvir etmək üçün çoxlu terminlər istifadə olunur, bunlara aşağıdakılar daxildir:

  • A konstitusiya gen fakultativ gendən fərqli olaraq davamlı olaraq transkripsiya edilən gendir və yalnız lazım olduqda transkripsiya edilir.
  • A ev təsərrüfatı geni əsas hüceyrə funksiyasını qorumaq üçün tələb olunan bir gendir və buna görə də adətən orqanizmin bütün hüceyrə tiplərində ifadə edilir. Nümunələrə aktin, GAPDH və ubiquitin daxildir. Bəzi ev təsərrüfatı genləri nisbətən sabit sürətlə transkripsiya edilir və bu genlər digər genlərin ifadə sürətlərini ölçmək üçün təcrübələrdə istinad nöqtəsi kimi istifadə edilə bilər.
  • A fakultativ gen konstitusiya genindən fərqli olaraq yalnız lazım olduqda transkripsiya edilən gendir.
  • An induksiya olunan gen ifadəsi ya ətraf mühitin dəyişməsinə cavab verən, ya da hüceyrə siklindəki mövqedən asılı olan bir gendir.

DNT-RNT transkripsiyası mərhələsindən tutmuş zülalın translasiyadan sonrakı modifikasiyasına qədər gen ifadəsinin istənilən mərhələsi modullaşdırıla bilər. Son gen məhsulunun sabitliyi, istər RNT, istərsə də zülal olsun, genin ifadə səviyyəsinə də kömək edir - qeyri-sabit məhsul aşağı ifadə səviyyəsi ilə nəticələnir. Ümumiyyətlə, gen ifadəsi DNT-nin [33] transkripsiyasına və RNT-nin tərcüməsinə kollektiv şəkildə təsir edən molekullar arasında qarşılıqlı təsirlərin sayı və tipində [31] dəyişikliklərlə tənzimlənir [32]. [34]

Gen ifadəsinin vacib olduğu bəzi sadə nümunələr bunlardır:

  • İnsulinin ifadəsinə nəzarət, beləliklə qan qlükoza tənzimlənməsi üçün bir siqnal verir. dişi məməlilərdə ehtiva etdiyi genlərin "aşırı dozasının" qarşısını almaq üçün. ifadə səviyyələri eukaryotik hüceyrə dövrü ilə irəliləyişi idarə edir.

Transkripsiya tənzimləməsi Redaktə edin

Transkripsiyanın tənzimlənməsi üç əsas təsir yoluna bölünə bilər: genetik (nəzarət amilinin genlə birbaşa qarşılıqlı təsiri), nəzarət faktorunun transkripsiya mexanizmi ilə modulyasiya qarşılıqlı əlaqəsi və epigenetik (transkripsiyaya təsir edən DNT strukturunda ardıcıl olmayan dəyişikliklər) .

DNT ilə birbaşa qarşılıqlı əlaqə zülalın transkripsiya səviyyəsini dəyişdirdiyi ən sadə və birbaşa üsuldur. Genlər tez-tez kodlaşdırma bölgəsi ətrafında transkripsiyanı tənzimləyən xüsusi funksiya ilə bir neçə protein bağlayan yerlərə malikdirlər. Gücləndiricilər, izolyatorlar və səsboğucular kimi tanınan tənzimləyici DNT-ni bağlayan yerlərin bir çox sinifləri var. Transkripsiyanın tənzimlənməsi mexanizmləri çox müxtəlifdir, RNT polimeraz üçün DNT-də əsas bağlanma yerlərinin bloklanmasından tutmuş aktivator rolunu oynamağa və RNT polimerazanın bağlanmasına kömək etməklə transkripsiyanı təşviq etməyə qədər.

Transkripsiya faktorlarının fəaliyyəti daha da hüceyrədaxili siqnallarla modullaşdırılır ki, bu da zülalın translyasiyadan sonrakı modifikasiyasına səbəb olur, o cümlədən fosforlanmış, asetilləşdirilmiş və ya qlikosilləşdirilmişdir. Bu dəyişikliklər transkripsiya faktorunun birbaşa və ya dolayı yolla DNT-ni promotorla bağlamaq, RNT polimerazını işə götürmək və ya yeni sintez edilmiş RNT molekulunun uzanmasına kömək etmək qabiliyyətinə təsir göstərir.

Eukariotlarda nüvə membranı onların strukturunda geri dönən dəyişikliklərlə və digər zülalların bağlanması ilə tənzimlənən nüvədə mövcud olma müddəti ilə transkripsiya faktorlarını daha da tənzimləməyə imkan verir. [35] Ətraf mühitin stimulları və ya endokrin siqnallar [36] tənzimləyici zülalların modifikasiyasına səbəb ola bilər [37] hüceyrədaxili siqnalların kaskadlarını meydana gətirərək, [38] gen ifadəsinin tənzimlənməsi ilə nəticələnir.

Bu yaxınlarda aydın oldu ki, transkripsiyaya qeyri-DNT ardıcıllığına xas təsirlərin əhəmiyyətli təsiri var. Bu təsirlər epigenetik adlanır və DNT-nin daha yüksək səviyyəli strukturunu, ardıcıl olmayan spesifik DNT bağlayıcı zülalları və DNT-nin kimyəvi modifikasiyasını əhatə edir. Ümumiyyətlə epigenetik təsirlər DNT-nin zülallara əlçatanlığını dəyişdirir və beləliklə transkripsiyanı modullaşdırır.

Eukariotlarda histon kodu ilə idarə olunan xromatinin strukturu euxromatin və heterokromatin bölgələrində genlərin ifadəsinə əhəmiyyətli təsir göstərərək DNT-yə girişi tənzimləyir.

Məməli transkripsiyasında gücləndiricilər, transkripsiya faktorları, Mediator kompleksi və DNT ilmələri

Məməlilərdə gen ifadəsi bir çox cis-tənzimləyici elementlər, o cümlədən genlərin transkripsiya başlanğıc yerlərinin yaxınlığında, DNT-nin yuxarı hissəsində (hiss zəncirinin 5' bölgəsinə doğru) yerləşən əsas promotorlar və promotor-proksimal elementlər ilə tənzimlənir. Digər mühüm cis-tənzimləyici modullar transkripsiyanın başlanğıc yerlərindən uzaq olan DNT bölgələrində lokallaşdırılmışdır.Bunlara gücləndiricilər, səsboğucular, izolyatorlar və bağlama elementləri daxildir. [39] Elementlərin bu bürcləri arasında gücləndiricilər və onlarla əlaqəli transkripsiya faktorları gen ifadəsinin tənzimlənməsində aparıcı rola malikdir. [40]

Gücləndiricilər genomun əsas gen tənzimləyici elementləri olan bölgələridir. Gücləndiricilər, hədəf genlərinin promotorları ilə fiziki yaxınlıqda olmaq üçün çox vaxt uzun məsafələrdən keçərək hüceyrə tipinə xas gen ifadə proqramlarına nəzarət edirlər. [41] Çoxsaylı gücləndiricilər, hər biri tez-tez hədəf genlərindən uzaq olan on və ya yüz minlərlə nukleotidlər, öz hədəf gen promotorlarına çevrilir və ümumi hədəf geninin ifadəsini idarə etmək üçün bir-biri ilə əlaqələndirirlər. [41]

Soldakı sxematik təsvir, hədəf genin promotoru ilə yaxın fiziki yaxınlığa gəlmək üçün ətrafa dönən gücləndiricini göstərir. Döngə birləşdirici zülalın dimeri (məsələn, CTCF və ya YY1 dimeri) ilə sabitləşir, dimerin bir üzvü gücləndiricidə öz bağlama motivinə, digər üzvü isə promotorda bağlanma motivinə lövbərlənir (təsdiqlənir). təsvirdə qırmızı ziqzaqlar). [42] Hüceyrə funksiyasının bir neçə spesifik transkripsiya faktoru (insan hüceyrəsində təxminən 1600 transkripsiya faktoru [43]) bir gücləndiricidə [44] xüsusi motivlərə və yaxınlaşdıqda bu gücləndirici ilə əlaqəli transkripsiya faktorlarının kiçik birləşməsinə bağlanır. bir DNT döngəsi ilə promotora, hədəf genin transkripsiya səviyyəsini idarə edir. Mediator (adətən qarşılıqlı təsir göstərən strukturda təxminən 26 zülaldan ibarət kompleks) gücləndirici DNT ilə əlaqəli transkripsiya faktorlarından tənzimləyici siqnalları birbaşa promotorla əlaqəli RNT polimeraza II (pol II) fermentinə ötürür. [45]

Gücləndiricilər aktiv olduqda, ümumiyyətlə, Şəkildə göstərildiyi kimi iki eRNA istehsal edərək, iki fərqli istiqamətdə fəaliyyət göstərən RNT polimerazaları ilə DNT-nin hər iki zəncirindən transkripsiya edilir. [46] Aktiv olmayan gücləndirici qeyri-aktiv transkripsiya faktoru ilə bağlana bilər. Transkripsiya amilinin fosforilasiyası onu aktivləşdirə bilər və bu aktivləşdirilmiş transkripsiya faktoru daha sonra onun bağlı olduğu gücləndiricini aktivləşdirə bilər (şəkildə gücləndirici ilə bağlı transkripsiya amilinin fosforilləşməsini təmsil edən kiçik qırmızı ulduza baxın). [47] Aktivləşdirilmiş gücləndirici hədəf genindən messenger RNT transkripsiyasını aktivləşdirməzdən əvvəl RNT-nin transkripsiyasına başlayır. [48]

Transkripsiya tənzimlənməsində DNT metilasiyası və demetilasiyası Edit

DNT metilasiyası gen ifadəsinə epigenetik təsir üçün geniş yayılmış mexanizmdir və bakteriyalarda və eukaryotlarda müşahidə olunur və irsi transkripsiyanın susdurulmasında və transkripsiyanın tənzimlənməsində rol oynayır. Metilləşmə ən çox sitozində baş verir (Şəkilə bax). Sitosinin metilasiyası ilk növbədə dinukleotid ardıcıllığında baş verir, burada sitosinin ardınca guaninin, bir CpG yeridir. İnsan genomunda CpG saytlarının sayı təxminən 28 milyondur. [49] Hüceyrə növündən asılı olaraq, CpG yerlərinin təxminən 70%-də metilləşdirilmiş sitozin var. [50]

DNT-də sitozinin metilasiyası gen ifadəsinin tənzimlənməsində böyük rol oynayır. Bir genin promotor bölgəsində CpG-lərin metilasiyası adətən gen transkripsiyasını sıxışdırır [51], bir genin bədənində CpG-lərin metilasiyası ifadəni artırır. [52] TET fermentləri metilləşdirilmiş sitozinlərin demetilizasiyasında mərkəzi rol oynayır. TET fermentinin aktivliyi ilə bir gen promotorunda CpG-lərin demetilasiyası genin transkripsiyasını artırır. [53]

Öyrənmə və yaddaşda transkripsiya tənzimlənməsi Redaktə edin

Bir siçovulda kontekstli qorxu kondisioneri (CFC) ağrılı bir öyrənmə təcrübəsidir. CFC-nin yalnız bir epizodu ömür boyu qorxulu yaddaşla nəticələnə bilər. [54] CFC epizodundan sonra sitozin metilasiyası siçovulun hipokampus neyron DNT-sindəki bütün genlərin təxminən 9,17%-nin promotor bölgələrində dəyişdirilir. [55] Hipokampus ilkin olaraq yeni xatirələrin saxlandığı yerdir. CFC-dən sonra təxminən 500 gen transkripsiyanı artırdı (çox vaxt promotor bölgədə CpG sahələrinin demetilasiyası səbəbindən) və təxminən 1000 gen transkripsiyanı azaldı (çox vaxt bir promotor bölgədəki CpG sahələrində yeni əmələ gələn 5-metilsitozinə görə). Neyronlarda induksiya edilmiş və sıxışdırılmış genlərin nümunəsi, siçovulların beyninin hipokampusunda bu təlim hadisəsinin ilk müvəqqəti yaddaşının formalaşması üçün molekulyar əsas təmin edir. [55]

Xüsusilə, beyindən əldə edilən neyrotrofik faktor geni (BDNF) "öyrənmə geni" kimi tanınır. [56] CFC-dən sonra yuxarı tənzimlənmə oldu BDNF gen ifadəsi, genin müəyyən daxili təşviqatçılarının CpG metilasyonunun azalması ilə əlaqədardır və bu, öyrənmə ilə əlaqələndirilir. [56]

Xərçəngdə transkripsiya tənzimlənməsi Edit

Gen promotorlarının əksəriyyətində çoxsaylı CpG saytları olan bir CpG adası var. [57] Bir çox genin promotor CpG saytları metilləşdirildikdə, gen susdurulur. [58] Kolorektal xərçənglər adətən 3-6 sürücü mutasiyasına və 33-66 avtostop və ya sərnişin mutasiyasına malikdir. [59] Bununla belə, transkripsiyanın susdurulması xərçəngin inkişafı üçün mutasiyadan daha əhəmiyyətli ola bilər. Məsələn, kolorektal xərçənglərdə təxminən 600-800 gen CpG adasının metilasiyası ilə transkripsiyalı olaraq susdurulur (bax: xərçəngdə transkripsiyanın tənzimlənməsi). Xərçəngdə transkripsiya repressiyası digər epigenetik mexanizmlərlə də baş verə bilər, məsələn, mikroRNT-lərin dəyişdirilmiş ifadəsi. [60] Döş xərçəngində BRCA1-in transkripsiya repressiyası BRCA1 promotorunun hipermetilasiyası ilə müqayisədə həddindən artıq ifadə edilmiş mikroRNT-182 ilə daha tez-tez baş verə bilər (bax: Döş və yumurtalıq xərçənglərində BRCA1-in aşağı ifadəsi).

Transkripsiyadan sonrakı tənzimləmə Redaktə edin

Tərcümə mümkün olmamışdan əvvəl RNT-nin ixracının tələb olunduğu eukariotlarda nüvə ixracının gen ifadəsi üzərində əlavə nəzarət təmin etdiyi düşünülür. Nüvəyə daxil olan və ondan çıxan bütün daşınmalar nüvə məsaməsi vasitəsilə həyata keçirilir və daşınma geniş çeşiddə idxal və ixrac zülalları tərəfindən idarə olunur.

Bir zülal üçün kodlaşdıran bir genin ifadəsi yalnız kodu daşıyan xəbərçi RNT tərcümə oluna biləcək qədər uzun müddət sağ qaldıqda mümkündür. Tipik bir hüceyrədə bir RNT molekulu yalnız deqradasiyadan xüsusi olaraq qorunduğu təqdirdə sabitdir. RNT deqradasiyası eukaryotik hüceyrələrdə ifadənin tənzimlənməsində xüsusi əhəmiyyət kəsb edir, burada mRNT tərcümə olunmazdan əvvəl əhəmiyyətli məsafələr qət etməlidir. Eukariotlarda RNT müəyyən post-transkripsiya dəyişiklikləri, xüsusən də 5′ qapaq və poliadenillənmiş quyruqla sabitləşir.

mRNT-nin qəsdən deqradasiyası təkcə xarici RNT-dən (adətən viruslardan) müdafiə mexanizmi kimi deyil, həm də mRNT-nin yolu kimi istifadə olunur. sabitliyin pozulması. Əgər mRNT molekulunun kiçik bir müdaxilə edən RNT-yə tamamlayıcı ardıcıllığı varsa, o zaman RNT müdaxilə yolu ilə məhv edilməsi hədəflənir.

Üç əsas tərcümə edilməmiş bölgə və mikroRNT Redaktə edin

Messenger RNT-lərin (mRNA) üç əsas tərcümə olunmamış bölgəsi (3′UTR) tez-tez gen ifadəsinə post-transkripsiyaya təsir edən tənzimləyici ardıcıllıqları ehtiva edir. Belə 3′-UTR-lər tez-tez həm mikroRNA-lar (miRNA-lar), həm də tənzimləyici zülallar üçün bağlama yerlərini ehtiva edir. 3′-UTR daxilində spesifik saytlara bağlanaraq, miRNA-lar müxtəlif mRNA-ların gen ifadəsini ya tərcüməni maneə törətməklə, ya da birbaşa transkriptin deqradasiyasına səbəb olmaqla azalda bilər. 3′-UTR də mRNT ifadəsini maneə törədən repressor zülalları bağlayan səsboğucu bölgələrə malik ola bilər.

3′-UTR tez-tez mikroRNT cavab elementlərini (MRE) ehtiva edir. MRE-lər miRNA-ların bağlandığı ardıcıllıqlardır. Bunlar 3′-UTR daxilində yayılmış motivlərdir. 3′-UTR-lərdə (məsələn, səsboğucu bölgələr daxil olmaqla) bütün tənzimləyici motivlər arasında MRE motivlərin təxminən yarısını təşkil edir.

2014-cü ilə olan məlumata görə, miRBase internet saytı [61] miRNA ardıcıllığı və annotasiyaların arxivi, 233 bioloji növdə 28,645 girişi sadaladı. Bunlardan 1,881 miRNA-sı annotasiya edilmiş insan miRNA lokuslarında idi. miRNA-ların orta hesabla dörd yüzə yaxın hədəf mRNA-ya malik olacağı proqnozlaşdırılırdı (bir neçə yüz genin ifadəsinə təsir göstərir). [62] Fridman və başqaları. [62] təxmin edir ki, insan mRNA 3′UTR-lərində >45,000 miRNA hədəf saytları fon səviyyələrindən yuxarı qorunub saxlanılır və insan zülal kodlaşdıran genlərin >60%-i miRNA-larla cütləşməni davam etdirmək üçün selektiv təzyiq altındadır.

Birbaşa təcrübələr göstərir ki, bir miRNT yüzlərlə unikal mRNT-nin sabitliyini azalda bilər. [63] Digər təcrübələr göstərir ki, tək bir miRNT yüzlərlə zülalın istehsalını repressiya edə bilər, lakin bu repressiya çox vaxt nisbətən yüngül olur (2 dəfədən az). [64] [65]

MiRNA-nın gen ifadəsinin pozulmasının təsiri xərçəngdə əhəmiyyətli görünür. [66] Məsələn, mədə-bağırsaq xərçənglərində doqquz miRNA epigenetik olaraq dəyişdirilmiş və DNT təmiri fermentlərini aşağı tənzimləməkdə təsirli olduğu müəyyən edilmişdir. [67]

MiRNA-nın gen ifadəsinin tənzimlənməsinin pozulmasının təsiri şizofreniya, bipolyar pozğunluq, böyük depressiya, Parkinson xəstəliyi, Alzheimer xəstəliyi və autizm spektri pozğunluqları kimi nöropsikiyatrik xəstəliklərdə də əhəmiyyətli görünür. [68] [69]

Tərcümə tənzimləməsi Redaktə edin

Tərcümənin birbaşa tənzimlənməsi transkripsiyaya və ya mRNT sabitliyinə nəzarətdən daha az yayılmışdır, lakin bəzən istifadə olunur. Zülalın tərcüməsinin qarşısının alınması toksinlər və antibiotiklər üçün əsas hədəfdir, ona görə də onlar hüceyrənin normal gen ifadə nəzarətini üstələməklə onu öldürə bilərlər. Protein sintezi inhibitorlarına antibiotik neomisin və toksin risin daxildir.

Tərcümə sonrası dəyişikliklər Redaktə edin

Post-translational modifikasiyalar (PTM) zülalların kovalent modifikasiyasıdır. RNT splicing kimi, onlar proteomun əhəmiyyətli dərəcədə şaxələndirilməsinə kömək edir. Bu dəyişikliklər adətən fermentlər tərəfindən kataliz edilir. Bundan əlavə, amin turşusu yan zəncirinin qalıqlarına kovalent əlavələr kimi proseslər tez-tez digər fermentlər tərəfindən geri qaytarıla bilər. Bununla belə, bəziləri, zülal onurğasının proteolitik parçalanması kimi, geri dönməzdir. [70]

PTM-lər hüceyrədə çox mühüm rol oynayır. [71] Məsələn, fosforlaşma ilk növbədə zülalların aktivləşdirilməsi və deaktiv edilməsində və siqnal yollarında iştirak edir. [72] PTM-lər transkripsiyanın tənzimlənməsində iştirak edirlər: asetilasiya və metilasiyanın mühüm funksiyası DNT-nin transkripsiya üçün nə qədər əlçatan olduğunu dəyişdirən histon quyruğunun modifikasiyasıdır. [70] Onlar həmçinin qlikozilləşmənin əsas rol oynadığı immunitet sistemində də görünə bilər. [73] Bir növ PTM başqa bir növ PTM başlata bilər, bunu ubikitinasiyanın proteoliz vasitəsilə deqradasiya üçün zülalları necə işarələdiyini görmək olar. [70] Proteoliz, zülalların parçalanmasında iştirak etməkdən başqa, onların aktivləşdirilməsi və deaktiv edilməsində, DNT transkripsiyası və hüceyrə ölümü kimi bioloji proseslərin tənzimlənməsində də vacibdir. [74]

Gen ifadəsinin ölçülməsi bir çox həyat elmlərinin mühüm hissəsidir, çünki müəyyən bir genin hüceyrə, toxuma və ya orqanizmdə ifadə olunduğu səviyyəni kəmiyyətcə müəyyən etmək bacarığı çoxlu qiymətli məlumat verə bilər. Məsələn, gen ifadəsini ölçmək:

  • Hüceyrənin viral infeksiyasını müəyyən edin (viral protein ifadəsi).
  • Bir insanın xərçəngə qarşı həssaslığını təyin edin (onkogen ifadəsi).
  • Bakteriyanın penisillinə (beta-laktamaz ifadəsi) davamlı olub olmadığını tapın.

Eynilə, zülal ifadəsinin yerinin təhlili güclü bir vasitədir və bu, orqanizm və ya hüceyrə miqyasında edilə bilər. Lokalizasiyanın tədqiqi çoxhüceyrəli orqanizmlərdə inkişafın öyrənilməsi və tək hüceyrələrdə zülal funksiyasının göstəricisi kimi xüsusilə vacibdir. İdeal olaraq, ifadənin ölçülməsi son gen məhsulunun aşkarlanması ilə həyata keçirilir (bir çox genlər üçün bu, zülaldır), lakin prekursorlardan birini, adətən mRNT-ni aşkar etmək və bu ölçmələrdən gen ifadə səviyyələrini çıxarmaq çox vaxt daha asandır.

MRNA kəmiyyətinin təyini Redaktə edin

mRNT səviyyələri mRNT molekulları haqqında ölçü və ardıcıllıqla məlumat verən şimal blotlama ilə kəmiyyətcə ölçülə bilər. RNT nümunəsi agaroz geldə ayrılır və hədəf ardıcıllığını tamamlayan radioaktiv etiketli RNT zonduna hibridləşdirilir. Radioaktiv etiketli RNT daha sonra avtoradioqraf tərəfindən aşkar edilir. Radioaktiv reagentlərin istifadəsi proseduru vaxt aparan və potensial təhlükəli olduğu üçün digoksigenin və biotin kimyası kimi alternativ etiketləmə və aşkarlama üsulları işlənib hazırlanmışdır. Northern blotting-in qəbul edilən çatışmazlıqları ondan ibarətdir ki, böyük miqdarda RNT tələb olunur və kəmiyyət göstəricisi tam dəqiq olmaya bilər, çünki o, gel təsvirində zolaq gücünü ölçməyi nəzərdə tutur. Digər tərəfdən, Northern blotdan gələn əlavə mRNT ölçüsü məlumatı alternativ olaraq birləşdirilmiş transkriptlərin ayrı-seçkiliyinə imkan verir.

mRNA bolluğunu ölçmək üçün başqa bir yanaşma RT-qPCR-dir. Bu texnikada əks transkripsiyadan sonra kəmiyyət PCR aparılır. Əks transkripsiya ilk olaraq mRNA-dan bir DNT şablonu yaradır, bu tək zəncirli şablon cDNA adlanır. Daha sonra cDNT şablonu kəmiyyət mərhələsində gücləndirilir, bu müddət ərzində etiketli hibridləşmə zondları və ya interkalasiya edən boyalar tərəfindən buraxılan flüoresans DNT gücləndirmə prosesi irəlilədikcə dəyişir. Diqqətlə qurulmuş standart əyri ilə qPCR orijinal mRNT-nin nüsxələrinin sayının mütləq ölçülməsini yarada bilər, adətən homogenləşdirilmiş toxumanın nanolitrinə düşən nüsxə vahidləri və ya hüceyrə başına nüsxələr. qPCR çox həssasdır (tək bir mRNT molekulunun aşkarlanması nəzəri cəhətdən mümkündür), lakin flüoresan etiketli oliqonukleotid zondlarından istifadə edilən reportyorun növündən asılı olaraq bahalı ola bilər.

Nümunə daxilində bir çox genin ifadə profilinin yaradılması və ya yüksək məhsuldarlıq analizi üçün aşağı sıxlıqlı massivlər vəziyyətində eyni vaxtda yüzlərlə gen üçün kəmiyyət PCR həyata keçirilə bilər. İkinci yanaşma hibridləşmə mikroarrayıdır. Tək massiv və ya "çip" bir və ya bir neçə orqanizmin genomunda hər bir məlum gen üçün transkript səviyyələrini təyin etmək üçün zondlardan ibarət ola bilər. Alternativ olaraq, müxtəlif mRNA-ların hüceyrə konsentrasiyasının nisbi ölçülməsini təmin edə bilən gen ifadəsinin seriya analizi (SAGE) və RNT-Seq kimi "etiket əsaslı" texnologiyalardan istifadə edilə bilər. Etiket əsaslı metodların üstünlüyü məlum və ya naməlum ardıcıllıqla istənilən transkriptin dəqiq ölçülməsinə imkan verən “açıq arxitekturadır”. RNT-Seq kimi yeni nəsil ardıcıllıq (NGS) başqa bir yanaşmadır və istinad genomuna uyğunlaşdırıla bilən böyük miqdarda ardıcıllıq məlumatı istehsal edir. NGS nisbətən vaxt aparan, bahalı və resurs tutumlu olmasına baxmayaraq, o, tək nukleotidli polimorfizmləri, splice-variantları və yeni genləri müəyyən edə bilər və həmçinin az və ya heç bir ardıcıllıq məlumatı olmayan orqanizmlərdə ifadəni profil etmək üçün istifadə edilə bilər. .

Vikipediya redaktəsində RNT profilləri

Bu kimi profillər Vikipediyada sadalanan demək olar ki, bütün zülallar üçün tapılır. Onlar Novartis Tədqiqat Fondunun Genomik İnstitutu və Avropa Bioinformatika İnstitutu kimi təşkilatlar tərəfindən yaradılır. Əlavə məlumatı onların verilənlər bazalarını axtararaq tapmaq olar (burada göstərilən GLUT4 daşıyıcısının nümunəsi üçün sitata baxın). [75] Bu profillər müəyyən bir toxumada müəyyən bir zülalın DNT ifadəsinin (və beləliklə də RNT istehsal olunduğu) səviyyəsini göstərir və hər bir Vikipediya səhifəsinin sağ tərəfindəki Zülal Qutusunda yerləşən şəkillərdə müvafiq olaraq rənglə kodlanır.

Protein miqdarının təyini Redaktə edin

Zülalları kodlayan genlər üçün ifadə səviyyəsi mRNT-nin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üsullarına aydın bənzətmələrlə bir sıra üsullarla birbaşa qiymətləndirilə bilər.

Ən çox istifadə edilən üsullardan biri maraq zülalına qarşı Western blot etməkdir. [76] Bu, zülalın şəxsiyyətindən əlavə onun ölçüsü haqqında da məlumat verir. Nümunə (çox vaxt hüceyrəli lizat) bir poliakrilamid geldə ayrılır, membrana köçürülür və sonra maraq zülalına antikorla sınanır. Antikor görüntüləmə və/yaxud kəmiyyətin müəyyən edilməsi üçün ya flüorofora, ya da horseradish peroksidazasına birləşdirilə bilər. Bu analizin gel əsaslı təbiəti kəmiyyəti daha az dəqiq edir, lakin onun üstünlüyü zülalda sonrakı dəyişiklikləri, məsələn, proteoliz və ya ubiquitinasiyanı ölçüdəki dəyişikliklərdən müəyyən edə bilməkdir.

MRNA-protein korrelyasiyası Redaktə edin

Protein və mRNT-nin kəmiyyətinin təyini iki səviyyənin korrelyasiyasını təmin edir. Protein səviyyələrinin onların müvafiq transkript səviyyələri ilə nə qədər yaxşı əlaqəli olması sualı çox müzakirə olunur və bir çox amillərdən asılıdır. Gen ifadəsinin hər bir addımının tənzimlənməsi, tərcümənin tənzimlənməsi [19] və ya zülal sabitliyi üçün göstərildiyi kimi korrelyasiyaya təsir göstərə bilər. [77] Yüksək qütblü hüceyrələrdə zülal daşınması kimi post-translational amillər [78] ölçülən mRNT-zülal korrelyasiyasına da təsir göstərə bilər.

Lokallaşdırma Redaktəsi

İfadənin təhlili kəmiyyətlə məhdudlaşmır lokalizasiyası da müəyyən edilə bilər. mRNT uyğun olaraq etiketlənmiş tamamlayıcı mRNT zəncirinin köməyi ilə aşkar edilə bilər və zülal etiketli antikorlar vasitəsilə aşkar edilə bilər. Daha sonra mRNT və ya zülalın harada olduğunu müəyyən etmək üçün yoxlanılan nümunə mikroskopla müşahidə edilir.

Geni yaşıl flüoresan zülal (və ya oxşar) markerlə birləşdirilən yeni versiya ilə əvəz etməklə canlı hüceyrələrdə ifadə birbaşa olaraq ölçülə bilər. Bu, flüoresan mikroskopdan istifadə edərək görüntüləmə yolu ilə edilir. GFP ilə əridilmiş zülalın ekspressiya səviyyələrinə təsir etmədən genomdakı yerli yerinə klonlaşdırmaq çox çətindir, ona görə də bu üsul endogen gen ifadəsini ölçmək üçün çox vaxt istifadə edilə bilməz. Bununla belə, hüceyrəyə süni şəkildə daxil edilmiş bir genin ifadəsini ölçmək üçün geniş istifadə olunur, məsələn, ifadə vektoru vasitəsilə. Qeyd etmək vacibdir ki, hədəf zülalı flüoresan müxbirə birləşdirməklə zülalın davranışı, o cümlədən hüceyrə lokalizasiyası və ifadə səviyyəsi əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirilə bilər.

Fermentlə əlaqəli immunosorbent analizi quyuya əlavə edilmiş nümunələrdən maraq doğuran zülalları tutmaq üçün mikrotitr lövhəsində immobilizasiya edilmiş antikorlardan istifadə etməklə işləyir. Bir fermentə və ya flüorofora konyuqasiya edilmiş aşkarlama antikorundan istifadə edərək, bağlı zülalın miqdarı flüorometrik və ya kolorimetrik aşkarlama ilə dəqiq ölçülə bilər. Aşkarlama prosesi Western blot prosesinə çox bənzəyir, lakin gel addımlarından qaçmaqla daha dəqiq kəmiyyətə nail olmaq olar.

İfadə sistemi xüsusi olaraq seçilmiş gen məhsulunun istehsalı üçün nəzərdə tutulmuş bir sistemdir. Bu, adətən zülaldır, baxmayaraq ki, tRNT və ya ribozim kimi RNT də ola bilər. İfadə sistemi normal olaraq DNT tərəfindən kodlanan gendən və DNT-ni mRNT-yə köçürmək və təqdim olunan reagentlərdən istifadə edərək mRNT-ni proteinə çevirmək üçün tələb olunan molekulyar mexanizmdən ibarətdir. Geniş mənada bu, hər canlı hüceyrəni əhatə edir, lakin termin daha çox laboratoriya aləti kimi ifadəyə istinad etmək üçün istifadə olunur. Buna görə bir ifadə sistemi tez-tez hansısa şəkildə süni olur. İfadə sistemləri, lakin, kökündən təbii prosesdir. Viruslar, ana hüceyrəni viral zülallar və genom üçün ifadə sistemi kimi istifadə edərək çoxaldıqları üçün əla nümunədir.

İnduksiya olunan ifadə Redaktə edin

Təbiətdə Edit

Bu bioloji vasitələrə əlavə olaraq, DNT-nin təbii olaraq müşahidə edilən müəyyən konfiqurasiyaları (genlər, promotorlar, gücləndiricilər, repressorlar) və əlaqəli mexanizmlərin özü ifadə sistemi kimi istinad edilir. Bu termin adətən bir gen və ya genlər dəsti yaxşı müəyyən edilmiş şərtlər altında işə salındıqda istifadə olunur, məsələn, Lambda faqında sadə repressor keçid ifadə sistemi və bakteriyalarda lak operator sistemi. Bir neçə təbii ifadə sistemi birbaşa istifadə olunur və ya dəyişdirilir və Tet-on və Tet-off ifadə sistemi kimi süni ifadə sistemləri üçün istifadə olunur.

Genlər bəzən bir şəbəkədəki qovşaqlar kimi qəbul edilir, girişlər transkripsiya faktorları kimi zülallar və çıxışlar gen ifadə səviyyəsidir. Düyün özü bir funksiyanı yerinə yetirir və bu funksiyaların işləməsi hüceyrələr daxilində bir növ məlumat emalını həyata keçirmək və hüceyrə davranışını müəyyən etmək kimi şərh edilmişdir.

Gen şəbəkələri açıq səbəb modelini tərtib etmədən də qurula bilər. Bu, çox vaxt böyük ifadə məlumat dəstlərindən şəbəkələrin yığılması zamanı baş verir. [79] İfadənin kovariasiyası və korrelyasiyası böyük nümunə nümunəsi və ölçmələr (çox vaxt transkriptom və ya proteom məlumatları) üzrə hesablanır. Dəyişiklik mənbəyi həm eksperimental, həm də təbii (müşahidə) ola bilər. Gen ifadə şəbəkələrini qurmağın bir neçə yolu var, lakin ümumi yanaşmalardan biri şərtlər, zaman nöqtələri və ya fərdlər üzrə ifadənin bütün cüt-mütənasib korrelyasiyalarının matrisini hesablamaq və matrisi (bəzi kəsilmə dəyərində həddi keçdikdən sonra) aşağıdakılara çevirməkdir. qovşaqların genləri, transkriptləri və ya zülalları təmsil etdiyi qrafik təsvir və bu qovşaqları birləşdirən kənarlar birləşmənin gücünü təmsil edir (bax [1]). [80]

Aşağıdakı eksperimental üsullar gen ifadəsini ölçmək üçün istifadə olunur və köhnə, daha çox qurulmuş texnologiyalardan başlayaraq təxminən xronoloji ardıcıllıqla sadalanır. Çoxsaylılıq dərəcələrinə görə iki qrupa bölünürlər.


Videoya baxın: Mən Zənginlər və Məşhurlar üçün Şəxsi Muzeydə işləyirəm. Dəhşət hekayələri. Dəhşət. (Iyun 2022).