Məlumat

8.7: DNT Analizi- Blotting və Hybridization - Biologiya

8.7: DNT Analizi- Blotting və Hybridization - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Elektroforetik geldə DNT zolaqları yalnız DNT molekullarının əksəriyyəti eyni ölçüdə olduqda əmələ gəlir, məsələn, PCR reaksiyasından sonra və ya plazmidin həzmini məhdudlaşdırır. Digər hallarda, məsələn, xromosomal (genomik) DNT-nin məhdudlaşdırılmış həzmindən sonra, həzmdə çoxlu sayda dəyişkən ölçülü fraqmentlər olacaq və o, fərqli zolaqlar deyil, DNT-nin davamlı yaxması kimi görünəcək. Bu halda, elektroforetik gel üzərində ayrılmış DNT-nin yaxması daxilində xüsusi DNT ardıcıllığının mövcudluğunu aşkar etmək üçün əlavə üsullardan istifadə etmək lazımdır. Bu, "Cənub Ləkəsi" ilə edilə bilər.

Cənubi Blots

A Cənub ləkəsi (həmçinin adlanır Cənub transferi) onun ixtiraçısı Ed Southern-in adını daşıyır. Birinci mərhələdə DNT məhdudlaşdırıcı fermentlərlə həzm olunur və gel elektroforezi ilə ayrılır (yuxarıda müzakirə edildiyi kimi). Sonra bir vərəq və ya membran neylon və ya oxşar material gelin altına qoyulur və DNT ayrılmış vəziyyətdə (zolaqlar və ya yaxma) jeldən maye çəkilərək membrana ötürülür. ləkələmə (Şəkil (PageIndex{1})). Ləkələnmiş DNT adətən neylon membrana qısa müddət ərzində UB işığına məruz qalaraq kovalent şəkildə yapışdırılır. DNT-nin möhkəm membrana köçürülməsi zəruridir, çünki prosesin növbəti iki addımı zamanı kövrək gel parçalanacaq. Bundan sonra, membran bir həll ilə yuyulur denatürasiya etmək (iki telli tək zəncirli) birləşdirilmiş DNT. Sonra a hibridləşmə az miqdarda tək telli olan həll prob Membrandakı hədəf molekula ardıcıl olaraq tamamlayıcı olan DNT. Bu zond DNT-si flüoresan və ya radioaktiv molekullardan istifadə etməklə etiketlənir və hibridləşmə düzgün aparılarsa, zond DNT-si yalnız membranda tam olaraq onu tamamlayan DNT molekulları ilə sabit dupleks əmələ gətirir. Sonra hibridləşdirilməmiş zond yuyulur və müvafiq olaraq aşkar edildikdə, qalan radioaktiv və ya flüoresan siqnal fərqli bir diapazonda görünəcək. Qrup DNT fraqmentlərinin qarışığı içərisində müəyyən bir DNT ardıcıllığının mövcudluğunu təmsil edir.

Prob ardıcıllıqla spesifikdir (tamamlayıcılıq tələb edir). Bununla belə, hibridləşmə temperaturunda və yuyulma məhlullarında dəyişikliklər dəyişə bilər sərtlik probun. Maksimum sərtlikdə (daha yüksək temperaturda) hibridləşmə şəraitində zondlar yalnız mükəmməl tamamlayıcı olan dəqiq hədəf ardıcıllıqla hibridləşəcək (maksimum hidrogen bağlarının sayı). Daha aşağı temperaturlarda zondlar tam uyğun gəlməyən, ancaq ardıcıllığın bir hissəsi üçün təqribən tamamlayıcı olan hədəflərə hibridləşə biləcəklər.

Southern blotting yalnız DNT molekullarının qarışığı daxilində DNT ardıcıllığının mövcudluğunu aşkar etmək üçün deyil, həm də DNT nümunəsində məhdudlaşdırıcı fraqmentin ölçüsünü müəyyən etmək üçün faydalıdır. Southern blots normal olaraq PCR ilə gücləndirilmiş fraqmentlərdən daha böyük fraqmentləri aşkar etmək üçün faydalıdır və yalnız məlum ardıcıllıqla uzaqdan əlaqəli ola bilən fraqmentləri aşkar etməyə çalışarkən. Southern blotting tətbiqləri sonrakı fəsildə molekulyar markerlər kontekstində daha ətraflı müzakirə olunacaq. Southern blotting PCR-dən əvvəl icad edilmişdir, lakin PCR sadəliyi, sürəti və rahatlığı səbəbindən bir çox tətbiqlərdə blotlamanı əvəz etmişdir. Southern blotun inkişafının ardınca digər növ ləkələmə üsulları icad edilmişdir.

Şimal ləkələri

The Şimal ləkəsi DNT kimi gellərdə RNT-nin ölçüdə ayrılmasını nəzərdə tutur. Çünki biz RNT transkriptinin yerli ölçüsünü müəyyən etmək istəyirik (və RNT tək zəncirli olduğundan) heç bir məhdudlaşdırıcı ferment istifadə edilmir. Əksər RNT tək zəncirli olduğundan və molekuldaxili əsas cütləşməsi yolu ilə müxtəlif konformasiyalara qatlana bildiyindən, elektroforezin ayrılması ikiqat zəncirli DNT ilə müqayisədə daha təsadüfi olur və lentlər çox vaxt daha az kəskin olur.

Western Blots

Bir Qərb ləkəsi, zülal membrana köçürməzdən əvvəl jeldə (adətən akrilamid gel) ayrılan ölçüdür, daha sonra hədəf zülalda antigenik sahəyə xüsusi olaraq bağlanan antikorla yoxlanılır. Bu antikor daha sonra bəzi flüoresan və ya rəngli istehsal marker sistemi ilə digər antikorlar tərəfindən aşkar edilir. O, həmçinin hədəf zülalın miqdarına və ölçüsünə mütənasib zolaqlar verəcək (Şəkil (PageIndex{2})).

Hər üç ləkələmə üsulunun müqayisəsi Şəkil (PageIndex{3})-də göstərilmişdir.


Slot Blot Hybridization

Birbaşa HRP-etiketli zondlarla ECL sistemindən istifadə edərək DNT hibridizasiyası analizlərinə slot blot hibridləşmə analizində iribuynuzlu bağırsaq koronavirusunun aşkarlanması daxildir ( Collomb və b., 1992) və HBV DNT (Urdea) üçün məhlul fazalı hibridləşmə analizi və b., 1987 , 1990 ). Yerində 16-cı tip insan papillomavirusunun (HPV) aşkarlanması üçün hibridləşdirmə dolayı etiketli prob ilə həyata keçirilmişdir (Hawkins və Cumming, 1990). ECL sistemləri həmçinin bir neçə virusun, o cümlədən üzüm klosterovirusunun ( Pollini ) immunoassay aşkarlanması üçün istifadə edilmişdir. və b., 1993) və parvovirus B 19 (O'Neill və Coyle, 1992).


DNT-nin Aşkarlanmasında İstifadə Edilən Ən Yaxşı 7 Blotting Texnikası

Aşağıdakı məqamlar DNT-nin aşkarlanmasında istifadə edilən ilk yeddi ləkələmə üsulunu vurğulayır. Texnikalar bunlardır: 1. Southern Blotting 2. Şimal Blotting 3. Western Blotting 4. Cənub-Qərb Blotting 5. Şimal-Qərb Blotting 6. Nöqtələrin ləkələnməsi 7. Zoo Blotting.

Texnika № 1. Cənubi Blotting:

Southern blot hibridizasiyası gel elektroforezi ilə ölçülərə bölünmüş hədəf DNT fraqmentlərini aşkar edir. Bu texnika 1975-ci ildə E.M. Southern tərəfindən icad edilmişdir.

Prinsip:

Bu texnikada biz tək zəncirli DNT ilə radio işarəli zondun xüsusiyyətindən istifadə edirik. Qarışıq DNT nümunəmizdə müəyyən bir ardıcıllığın varlığını aşkar etmək istəyiriksə, buna uyğun olaraq hədəf ardıcıllığımızı tamamlayan ardıcıllığa malik olan zond dizayn edəcəyik.

Prosedur:

Southern blot adlanan bu prosedurda nümunədən alınan DNT məhdudlaşdırıcı endonükleaz ilə məhdudlaşdırıcı və şitli fraqmentlərə bölünür və fraqmentlər gel elektroforezi ilə bir-birindən ayrılır. Daha sonra hər bir DNT fraqmentinin iki zəncirli spiralı gelin pH-ını əsaslaşdırmaqla tək zəncirlərə denaturasiya edilir və gel “blotted” nitrosellu və şiloz vərəqi ilə DNT zəncirlərinin bir hissəsini təbəqəyə köçürür.

Sonra vərəqin üzərinə spesifik genə (yaxud həmin gendən transkripsiya edilmiş mRNT) uyğun gələn təmizlənmiş, tək zəncirli DNT-dən ibarət zond tökülür.

Zondun ardıcıllığını tamamlayan nukleotid ardıcıllığına malik olan hər hansı fraqment zondla hibridləşəcək (əsas cütü). Əgər zond 32 P ilə işarələnibsə, o, radioaktiv olacaq və vərəqdə zondun tamamlayıcı və şitar fraqmenti ilə hibridləşdiyi radioaktivlik zolağı göstəriləcək.

Southern Blot­ting-dən əldə edilən məlumat:

Southern blotting texnikasından aşağıdakı məlumatları əldə edə bilərik

1. Orqanizmin ge&şinomunda müəyyən bir genin olub-olmaması və neçə nüsxənin olması.

2. Xro&şimosomal gen və zond ardıcıllığı arasında oxşarlıq dərəcəsi.

3. Xüsusi re&shistriksiya endonükleazları üçün tanınma yerlərinin gendə olub-olmaması. Fərqli və utancaq endonukleazlarla və ya endonükleazların kombinasiyaları ilə həzmi həyata keçirməklə, genin məhdudlaşdırıcı xəritəsini, yəni genin klonlaşdırılmasına kömək edəcək, genin daxilində və ətrafında məhdudlaşdırma fermentlərinin yerləri haqqında fikir əldə etmək mümkündür.

4. Klonlaşdırma prosesi zamanı yenidən tənzimləmələrin olub-olmaması.

Southern Blotting tətbiqi:

1. DNT-nin minlərlə fraqmenti arasında tək bir geni müəyyən etmək və orqanizmin genomunda DNT-nin ardıcıllıqlarını aşkar etmək.

2. Gen kəşfində və gen xəritəsində istifadə olunur.

3. Orqanizmin DNT-sindəki genetik nümunələri təhlil etmək.

4. Xəstəliklərdə iştirak edən gen mutasiyası, silinməsi, dupli­kasiyası və genlərin yenidən qurulmasını müəyyən etmək.

5. Orqanizmin genomunda təqdim olunan müəyyən DNT ardıcıllığının nüsxələrinin sayını müəyyən etmək.

6. Genomda əlaqəli DNT ardıcıllığını müəyyən etmək və gen ailəsinin (oxşar genlər qrupu) olub olmadığını müəyyən etmək.

7. Müəyyən xərçəng və genetik xəstəlikləri aşkar etmək üçün, məsələn:

a. Monoklonal lösemi əhali

8. Aşağıdakı kimi testlər üçün DNT barmaq izi, genetik mühəndislik və utancaqlıq və məhkəmə tibb elmlərində istifadə olunur:

b. Şəxsi identifikasiya

Texnika № 2. Şimal Blotting:

Northern blotting Southern blotting-in sadə bir uzantısıdır və adını əvvəlki texnikadan götürür. O, molekulyar biologiyanın əsas texnologiyalarından biridir və onun əsas məqsədi RNT-nin (xüsusilə mRNT) ölçülməsidir.

Prinsip:

RNT molekulları ölçülərinə görə ayrılır və hədəf RNT ardıcıllığının hamısını və ya bir hissəsini tamamlayan əsas ardıcıllığı olan hibridləşmə zondundan istifadə edərək membran üzərində deşifr edilir.

Prosedur:

RNT maraq doğuran hüceyrələrdən çıxarılır, lakin dəridə və şüşə qablarda olan ribonukleaza (RNase) tərəfindən tək zəncirli RNT-nin deqrasiya və şidasiyası qarşısını almaq üçün ehtiyat tədbirləri görülməlidir. Təsadüfən ribonukleazanın ekstraksiya hazırlığına daxil olmasının qarşısını almaq üçün əlcəklər taxmaq üçün xüsusi işlənmiş plastik və şüşə qablardan istifadə edin.

Di-etil-piro-karbonatın (DEPC) reklamı və təmizlənməsi ribonukleaza fəaliyyətini maneə törədir və həmçinin yüksək temperaturda çörəkçilik ribonukleaza fəaliyyətini məhv edir (yalnız şüşə qablar kimi istiliyədavamlı avadanlıqların və utancaqların müalicəsi üçün faydalıdır).

Aşağıdakı addımlarla həyata keçirilir:

RNT bir neçə bioloji və utancaq nümunədən (məsələn, müxtəlif toxumalar, eyni toxumaların müxtəlif və utancaq inkişaf mərhələləri və s.)

RNT nümunələri agaroza geldə ölçülərinə uyğun olaraq ayrılır.

Sonra gel neylon membran və ya nitroselüloz filtrində ləkələnir.

Membran la­belled zond ilə hibridləşdirmə tamponuna yerləşdirilir. RNT ləkələri ən çox cDNA fraqmentləri ilə yoxlanılır.

Bağlanmamış zond çıxarmaq üçün membran yuyulur.

Etiketli zond au­torradiography (əgər radioaktiv zond istifadə edilirsə) və ya kimilüminesans re­action vasitəsilə (kimyəvi etiketli zond istifadə edilirsə) aşkar edilir. Hər iki halda bu, rentgen filmində qaranlıq bir zolaq meydana gəlməsi ilə nəticələnir.

Northern Blot­ting-dən əldə edilən məlumat:

Southern blotting texnikasından aşağıdakı məlumatları əldə edə bilərik

1. Par&şitikulyar genin diferensial ifadə nümunələri.

(a) Hansı toxumalarda ifadə olunur.

b) inkişafın müəyyən mərhələlərində ifadə edilirsə.

(c) Hüceyrənin müxtəlif şərtləri/müalicələri altında ifadə dəyişirsə.

2. Mövcud mRNT-nin miqdarı — Ləkələr radioaktiv hesablama ilə dəqiq ölçülə bilər.

3. Genomik DNT zondunun transkripsiya edilmiş bölgələrə malik olub-olmaması.

Northern Blotting tətbiqi:

1. Northern blotting tədqiqatçılara gen ifadə nümunələrinin aradan qaldırılmasına imkan verir. Bu, tədqiqatçılara toxumaların hüceyrələrində, müalicə alan xəstələrin hüceyrələrində və müxtəlif inkişaf mərhələlərinin hüceyrələrində gen ifadəsinin nümunələrini müqayisə etməyə imkan verən çoxsaylı praktik tətbiqlərdən xəbər verir.

2. Northern blot analizi xərçəngli mədəaltı vəzi hüceyrələrini və düyünləri aşkar etmək üçün də istifadə edilə bilər. Bir araşdırmada tədqiqatçılar mədəaltı vəzi xərçənglərinin müəyyən reseptorun mRNA-sında 3, 10 və 15 dəfə artım nümayiş etdirdiyini nəzərdən keçirirlər ki, bu da ilk dəfə olaraq bu reseptorun mədəaltı vəzi xərçənginin kanserogenezində iştirak etdiyini göstərir. Bu məlumat Northern blotting texnikasından istifadə etməklə əldə edilmişdir.

3. Şimal ləkəsi həm də elm adamlarına naməlum zülalların funksiyasını bilməyə imkan verə bilər.

4. Bu texnika alimlərə RNT-nin ölçüsünü ayırd etmək imkanı verir.

5. O, həmçinin onlara qismən homologiyalı zondlardan istifadə edərək, alter­nate splice məhsullarını müşahidə etməyə imkan verir.

Texnika №3. Western Blotting:

Western Blot, müəyyən bir toxuma homogenatı və ya ekstraktı nümunəsində xüsusi zülalları aşkar etmək üçün istifadə edilən analitik üsuldur. Bir müddətdir ki, immun blotting adlandırılan bu texnologiya, polipeptidin uzunluğuna (denaturasiyaya uğrayan şərait) və ya zülalın 3 ölçülü strukturuna (doğma/denaturasiyaya uğramayan şərait) görə na və ya denaturasiya olunmuş zülalları ayırmaq üçün gel elektroforezindən istifadə edir.

Digər əlaqəli üsullara immun boyanma və en&şizimlə əlaqəli immun sorbent analizi (ELISA) ilə toxumalarda və hüceyrələrdə zülalları aşkar etmək üçün antikorların istifadəsi daxildir. Bu üsul Stenfordda Corc Starkın laboratoriyasından yaranmışdır. Western blot adı texnikaya W. Neal Burnette tərəfindən verilmişdir və əvvəllər Edwin Southern tərəfindən hazırlanmış DNT aşkarlanması üçün bir texnika olan Southern Blot adı üzərində bir oyundur.

Prinsip:

Bu, zülal nümunəsinin SDS-PAGE-də elektroforezləşdirildiyi və nitroselüloz membranına elektroforezlə ötürüldüyü analitik üsuldur. Köçürülmüş zülal xüsusi birincil antikor və ikinci və utancaq ferment etiketli antikor və substratdan istifadə edərək aşkar edilir.

Prosedur:

Bu texnikada ilk növbədə SDS-PAGE və ya ikiölçülü elektroforezdən istifadə etməklə pro&şiteinlərin nümunəsi onların molekulyar və şil kütləsi əsasında ayrılır. Elektroforez zülalları geldən və zülalların yapışdığı nitrosellu və şilozaya köçürür.

Spesifik zülal aşkar etmək üçün həmin zülala qarşı antikor mövcud olmalıdır. Nitroselüloz membranının özü zülalları bağlaya bilən bir çox qeyri-spesifik sahələrə malikdir, o cümlədən təkrar nəmləndirilmiş süd tozu kimi qeyri-spesifik protein məhlulu ilə bloklanmalı olan antikorlar.

Pri­mary antikor süd məhluluna əlavə edilir və maraq zülalına bağlanır. Anti­body zülal kompleksi üzərinə etiket yapışdırılmış se­condary antikordan istifadə etməklə aşkar edilir (şək. 3.27). Tez-tez qələvi fosfataza kimi bir reportyor ferment ikinci və şidari antikorla əlaqələndirilir və ləkəyə lumifos və ya X-fosun əlavə edilməsi protein zolağının aşkarlanmasına imkan verir.

Western Blot­ting-dən əldə edilən məlumat:

Western blot sizə fol­lowing haqqında məlumat verir:

b. Proteinin ifadə miqdarı.

Western Blotting istifadələri:

Western blotting əsasən tibbi diaqnostika üsulu kimi istifadə olunur. Müsbət Western blot adətən HİV infeksiyasını təsdiqləyə bilər. Təsdiqləyici HİV testi insan serum nümunəsində anti-HİV antikorunu aşkar etmək üçün Western blotdan istifadə edir.

Western blot, həmçinin iribuynuzlu süngərvari ensefa və şilopatiya (BSE, adətən “dəli inək xəstəliyi” olaraq adlandırılır) üçün de­lopatiya testi kimi istifadə olunur. Western blotting Lyme dis­ease-nin bəzi formalarının diaqnozunda da faydalıdır.

Texnika № 4. Cənub-Qərb Blotting:

Cənub-qərb blotlama, Southern blotting və Western blotting birləşməsidir. Bu, ilk dəfə Bowen və başqaları tərəfindən təsvir edilmişdir. və seçilmiş DNT fraqmenti ilə ardıcıllıqla spesifik şəkildə qarşılıqlı əlaqədə olan DNT bağlayan zülalları müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir.

Bu texnikada, xam nüvə ekstraktları və ya qismən təmizlənmiş preparatlar kimi zülalların qarışıqları əvvəlcə natrium dodesil sulfat (SDS) denaturasiya geli üzərində fraksiyalaşdırılır, daha sonra gel təmizləyici və qıcıqlandırıcı maddələri və zülalları elektro blotting vasitəsilə çıxarmaq üçün SDS-siz tamponda tarazlaşdırılır və şibratlaşdırılır. immobilizasiya edən membrana.

Köçürmə zamanı zülallar yenidən təbiətə çevrilir və beləliklə, DNT-ni bağlayan zülallar radio-etiketli DNT-ni bağlamaq qabiliyyətinə görə membranda təsbit edilə bilər.

Xam nüvə ekstraktlarının bir SDS gelində fraksiya və şinasiyası, ardınca elektro blotting və ardıcıllıqla xüsusi DNT-nin birbaşa ləkə üzərində bağlanması üçün analiz yüksək rezolyusiyaya malik fraksiyalaşdırma mərhələsinin üstünlüklərini çoxlu sayda fərqli və utancaq DNT-ni sürətli analiz etmək qabiliyyətini birləşdirir. spesifikasiyalar.

Texnika № 5. Şimal-Qərb Blotting:

Şimal-qərb ləkələmə texnikası şimal blot və qərb ləkəsi və şitləşdirmənin birləşməsidir. Bu texnika zülalın gel üzərində işlədildiyi, ləkələndiyi və maraq doğuran la­belled RNT ilə yoxlanıldığı zülal-RNT qarşılıqlı təsirlərinin müəyyən edilməsi üçün istifadə olunur. Qarşılıqlı təsirlər filtrdə qaynar nöqtələr kimi silinir.

Texnika № 6. Nöqtələrin ləkələnməsi:

Bu, maraq doğuran zülalın identifikasiyası və təhlili üçün istifadə edilən Western blotunun dəyişdirilmiş versiyasıdır. Nöqtə ləkəsi metodologiyası zülal nümunələrini ayırmamaq və elektroforezdən çəkinməklə ənənəvi Western blot texnologiyasından və shiniklərdən fərqlənir. Nümunə zülalları membranlara yapışdırılır və antikor zondu ilə hibridləşir.

Texnika № 7. Zoo Blotting:

Zoo blotting South­ern blotting prinsiplərinə əsaslanır. Hər hansı bir orqanizmin genomunda kodlaşdırma və kodlaşdırmayan iki bölgə var. Müəyyən bir zülalın genetik məlumatı ilə əlaqəli olduğu üçün tədqiqatçıların əksəriyyətinin marağına səbəb olan kodlaşdırma bölgəsidir.

Ancaq problem DNT bölgələrinin əksəriyyətinin kodlaşdırılmamasıdır. Sual çox miqdarda kodlaşdırılmayan DNT-də kodlaşdırma bölgələrini necə müəyyən etməkdir.

Zoo blotting dəqiqdir. Kodlaşdıran DNT-ni kodlaşdırılmayan bölgələrdən ayırmaq üçün istifadə olunur. Təkamül zamanı kodlaşdırmayan DNT-nin əsas ardıcıllığı mutasiyaya uğrayır və sürətlə dəyişir, halbuki kodlaşdırma ardıcıllığı daha yavaş dəyişir və iki növ arasında milyonlarla il davam edən fərqdən sonra yenə də yenidən tanınır.

Buna görə də, insan, meymun, siçan, hamster, inək və s. kimi bir sıra əlaqəli heyvanlardan DNT çıxarılır. Bu DNT-dəki nümunələr “zoopark” hər biri uyğun bir məhdudlaşdırıcı və şitil fermenti ilə kəsilir və fraqmentlər bir gel üzərində işlədilir və neylon membrana köçürülür. Onlar insan DNT kodlamasından və utandığından şübhələnilən DNT-dən istifadə edərək araşdırılır.

Əgər DNT nümunəsi yenidən və utancaq şəkildə kodlaşdırma ardıcıllığını ehtiva edərsə, o, çox güman ki, bir çox digər yaxın qohum heyvanların bəzi DNT fraqmenti ilə hibridləşəcək (Şəkil 3.29). Əgər DNT kodlaşdırmayan DNT-dirsə, çox güman ki, yalnız insan DNT-si ilə hibridləşəcək.


8.7: DNT Analizi- Blotting və Hybridization - Biologiya

DNT-nin Southern Blot analizi

Sol panel bir elektroforetik gel etidium bromid ilə boyanmışdır. Ümumi DNT 9 plazmid klonundan (№1-9 zolaqdan) çıxarılıb, xüsusi məhdudlaşdırıcı endonükleazla həzm olunub və elektroforez yolu ilə ölçüsünə görə ayrılıb. Heç bir DNT ardıcıllığı birdən çox nüsxədə olmadığı üçün DNT diskret zolaqlar olmadan ləkələnmiş görünür. Molekulyar çəki standartı (a "L toplayıcı") silsiləsi var DNT məlum ölçülü fraqmentlər. Klonlanmış DNT fraqment 10-cu zolağa yüklənib: çəki standartı təxminən 400bp ölçüsünü göstərir.

Orta panel a Southern Blot avtoradioqramı -nin eyni gel. The DNT geldə köçürüldü ("ləkələnmiş") filtrə, sonra filtr radioaktiv olaraq işarələnmiş bir filtrə məruz qalır (" zondlanmış ") DNT (a "prob") 10-cu zolağa yüklənmiş DNT-dən hazırlanır. Sonra filtrə məruz qalır Rentgen filmi. Prob harada DNT ləkədə homoloji ardıcıllıq tapır, ona əsas cütləşir (“hibridləşir”) DNT. Daha sonra radioaktivlik filmi ifşa edir və rentgen filmində qaranlıq zolaq əmələ gətirir.

Sağ panel Southern Blot avtoradioqramının sxematik şərhidir: məlumat məzmunu zolaqların olması və ya olmaması və onların ölçüləridir. Qrupun olması onu göstərir ki, a DNT ilə homolog olan ardıcıllıq DNT-ni araşdırın edir indiki №# 3, 4, & 8 klonlarda, zondla eyni ölçüdə və yox #1 ,2, 5, & 9 klonlarında. Zond gözlənildiyi kimi #10-da özünə yapışır. №6 zolaqda homoloji ardıcıllıq mövcuddur, lakin bir ilə əlavə məhdudiyyət saytı bu fraqmenti 300bp və 100bp olan iki kiçik fraqmentə kəsir. Bu təhlil göstərir ki, maraq doğuran genin müəyyən plazmidlər dəstində uğurla klonlaşdırılıb və 6-cı klonda genetik variasiya var. Bu gen indi daha ətraflı təhlil edilə bilər.


Heyvan Taksonomiyasında DNT Hibridləşməsi: Birinci Prinsiplərdən Tənqid

DNT hibridləşməsi filogenetik rekonstruksiya üçün "məsafə üsulu"dur və bu səbəbdən xarakter məlumatlarını birbaşa istifadə etməyən digər üsullarla bir sıra fərziyyələri, üstünlükləri və problemləri bölüşür. Texnika növlərin tək nüsxəli genomları arasında homolog nukleotid ardıcıllığının orta faiz uyğunsuzluğunu ölçmək məqsədi daşıyır. Bu ölçü, hər hansı digər kimi, dəqiqlik və dəqiqlik mülahizələrinə tabedir. Təkrarlanan ölçmələr və texniki modifikasiyalar dəqiqliyi artıra bilsə də, bu cür ölçmələrin dəqiqliyi müqayisə edilən genomların ekvivalentliyi ilə məhdudlaşır. Genom təkamülündə genlərin təkrarlanması və silinməsi kimi rutin hadisələr DNT hibridləşmə məsafələrinin şərhini çətinləşdirə bilər. Ölçmə məhdudiyyətlərindən kənarda, məsafələrin ən ciddi potensial təhrifləri qərəzli ardıcıllıqla seçmə və homoplaziya ilə bağlıdır. Bununla belə, bu problemlər filogenetik rekonstruksiyanı mütləq istisna etmir və onların təsirləri ədədi düzəlişlərlə azaldıla bilər. Xüsusilə homoplaziya, filogenetik nəticə çıxarmağın bütün üsullarının üzləşdiyi bir çətinlikdir. Əgər belə təhrifləri aradan qaldırmaq, düzəliş yolu ilə yumşaltmaq və ya əhəmiyyətsiz olduğunu göstərmək olarsa, qoşa ağac qurma strategiyaları filogenezin etibarlı hesablamalarını təmin etməlidir.


17.1 Biotexnologiya

Bu bölmənin sonunda siz aşağıdakıları edə biləcəksiniz:

  • Gel elektroforezini təsvir edin
  • Molekulyar və reproduktiv klonlaşdırmanı izah edin
  • Biotexnologiyanın tibb və kənd təsərrüfatında istifadəsini təsvir edin

Biotexnologiya texnoloji tərəqqi üçün bioloji agentlərin istifadəsidir. Biotexnologiya insanlar bu texnikanın elmi əsaslarını başa düşməmişdən çox əvvəl heyvandarlıq və bitki yetişdirmək üçün istifadə edilmişdir. 1953-cü ildə DNT strukturunun kəşfindən bəri biotexnologiya sahəsi həm akademik tədqiqatlar, həm də özəl şirkətlər vasitəsilə sürətlə inkişaf etmişdir. Bu texnologiyanın əsas tətbiqləri tibbdə (peyvənd və antibiotik istehsalı) və kənd təsərrüfatında (məhsuldarlığı artırmaq üçün məhsulun genetik modifikasiyası) istifadə olunur. Biotexnologiya həm də fermentasiya, neft dağılmalarının təmizlənməsi və bioyanacaq istehsalı kimi bir çox sənaye tətbiqlərinə malikdir (Şəkil 17.2).

Genetik materialı (DNT və RNT) manipulyasiya etmək üçün əsas üsullar

Nuklein turşuları ilə işləmək üçün istifadə olunan əsas texnikaları başa düşmək üçün unutmayın ki, nuklein turşuları fosfodiester bağları ilə bağlanmış nukleotidlərdən (şəkər, fosfat və azotlu əsas) ibarət makromolekullardır. Bu molekullardakı fosfat qruplarının hər birinin xalis mənfi yükü var. Nüvədəki DNT molekullarının bütün dəsti genom adlanır. DNT-də qoşalaşmış əsaslar arasında hidrogen bağları ilə əlaqəli iki tamamlayıcı zəncir var. Yüksək temperaturlara məruz qalma (DNT denaturasiyası) iki ipi ayıra bilər və soyutma onları yenidən qızdıra bilər. DNT polimeraza fermenti DNT-ni təkrarlaya bilir. Eukaryotik hüceyrələrin nüvəsində yerləşən DNT-dən fərqli olaraq, RNT molekulları nüvəni tərk edir. Tədqiqatçıların təhlil etdiyi ən çox yayılmış RNT növü messenger RNT-dir (mRNA), çünki o, aktiv şəkildə ifadə olunan zülal kodlaşdıran genləri təmsil edir. Bununla belə, RNT molekulları DNT-dən daha az dayanıqlı olduqları üçün analiz üçün bəzi digər çətinliklər də yaradır.

DNT və RNT çıxarılması

Nuklein turşularını öyrənmək və ya manipulyasiya etmək üçün əvvəlcə hüceyrələrdən DNT və ya RNT-ni təcrid etmək və ya çıxarmaq lazımdır. Tədqiqatçılar müxtəlif növ DNT çıxarmaq üçün müxtəlif üsullardan istifadə edirlər (Şəkil 17.3). Nuklein turşusunun çıxarılması üsullarının əksəriyyəti hüceyrəni açmaq və arzuolunmaz bütün makromolekulları (məsələn, arzuolunmaz molekulun deqradasiyası və DNT nümunəsindən ayrılması) məhv etmək üçün enzimatik reaksiyalardan istifadə etmək üçün addımları əhatə edir. Lizis tamponu (əsasən yuyucu vasitə olan məhlul) hüceyrələri parçalayır. Qeyd edək ki, lizis "parçalamaq" deməkdir. Bu fermentlər hüceyrə membranlarında və nüvə membranlarında lipid molekullarını parçalayır. Zülalları parçalayan proteazlar kimi fermentlər makromolekulları və RNT-ni parçalayan ribonukleazları (RNT) təsirsizləşdirir. Spirtdən istifadə DNT-ni çökdürür. İnsan genomik DNT adətən jelatinli, ağ kütlə şəklində görünür. -80°C-də dondurulmuş DNT nümunələrini bir neçə il saxlamaq olar.

Alimlər hüceyrələrdə gen ifadə nümunələrini öyrənmək üçün RNT analizi aparırlar. RNT təbii olaraq çox qeyri-sabitdir, çünki RNT-lər təbiətdə adətən mövcuddur və inaktivləşdirilməsi çox çətindir. DNT-yə bənzər olaraq, RNT hasilatı makromolekulları təsirsiz hala gətirmək və RNT-ni qorumaq üçün müxtəlif tamponlardan və fermentlərdən istifadə edir.

Gel elektroforezi

Nuklein turşuları sulu mühitdə neytral və ya əsas pH-da mənfi yüklü ionlar olduğundan, elektrik sahəsi onları hərəkətə gətirə bilər. Gel elektroforezi elm adamlarının bu yükdən istifadə edərək molekulları ölçü əsasında ayırmaq üçün istifadə etdikləri bir texnikadır. Nuklein turşularını bütöv xromosomlar və ya fraqmentlər kimi ayırmaq olar. Nuklein turşuları yarı bərk, məsaməli gel matrisinin mənfi elektrodunun yaxınlığındakı yuvaya yüklənir və gelin əks ucunda müsbət elektroda doğru çəkilir. Kiçik molekullar gelin məsamələrindən daha böyük molekullara nisbətən daha sürətli hərəkət edir. Miqrasiya nisbətindəki bu fərq fraqmentləri ölçü əsasında ayırır. Tədqiqatçıların ölçü müqayisəsini təmin etmək üçün molekullarla yanaşı işləyə biləcəyi molekulyar çəki standart nümunələri var. Müxtəlif flüoresan və ya rəngli boyalardan istifadə edərək nuklein turşularını gel matrisində müşahidə edə bilərik. Fərqli nuklein turşusu fraqmentləri ölçülərinə əsasən gelin yuxarı hissəsindən (mənfi elektrod ucu) müəyyən məsafələrdə lentlər şəklində görünür (Şəkil 17.4). Müxtəlif ölçülü genomik DNT fraqmentlərinin qarışığı uzun yaxma şəklində görünür, kəsilməmiş genomik DNT isə adətən geldən keçmək üçün çox böyükdür və gelin yuxarı hissəsində tək böyük zolaq əmələ gətirir.

Polimeraza zəncirvari reaksiya ilə nuklein turşusu fraqmentinin gücləndirilməsi

Genomik DNT toplu olaraq çıxarıldıqda çılpaq gözlə görünsə də, DNT analizi çox vaxt bir və ya bir neçə spesifik genom bölgəsinə diqqət yetirməyi tələb edir. Polimeraza zəncirvari reaksiya (PCR) elm adamlarının sonrakı analiz üçün xüsusi DNT bölgələrini gücləndirmək üçün istifadə etdikləri texnikadır (Şəkil 17.5). Tədqiqatçılar laboratoriyalarda bir çox məqsədlər üçün PCR-dən istifadə edirlər, məsələn, genetik xəstəlikləri təhlil etmək üçün gen fraqmentlərinin klonlaşdırılması, nümunədə çirkləndirici xarici DNT-nin müəyyən edilməsi və ardıcıllıq üçün DNT-nin gücləndirilməsi. Daha praktik tətbiqlərə atalığın müəyyən edilməsi və genetik xəstəliklərin aşkarlanması daxildir.

DNT fraqmentləri də əks transkriptaz PCR (RT-PCR) adlanan prosesdə RNT şablonundan gücləndirilə bilər. İlk addım DNT nukleotidlərini mRNT-yə tətbiq etməklə orijinal DNT şablon zəncirini (cDNA adlanır) yenidən yaratmaqdır. Bu proses əks transkripsiya adlanır. Bunun üçün əks transkriptaza adlı bir fermentin olması lazımdır. cDNA hazırlandıqdan sonra onu gücləndirmək üçün adi PCR istifadə edilə bilər.

Öyrənməyə keçid

Bu videoya baxaraq polimeraza zəncirvari reaksiya haqqında anlayışınızı dərinləşdirin.

Hibridləşmə, Cənubi Blotting və Northern Blotting

Alimlər müəyyən ardıcıllığın mövcudluğu üçün parçalanmış genomik DNT və RNT ekstraktları kimi nuklein turşusu nümunələrini yoxlaya bilərlər. Alimlər aşkarlamağa kömək etmək üçün qısa DNT fraqmentləri və ya radioaktiv və ya flüoresan boyalarla zondlar dizayn edir və etiketləyirlər. Gel elektroforezi nuklein turşusu fraqmentlərini ölçülərinə görə ayırır. Elm adamları daha sonra geldəki fraqmentləri blotting adlandırdığımız prosedurla neylon membrana köçürür (Şəkil 17.6). Elm adamları daha sonra xüsusi radioaktiv və ya flüoresan işarəli zond ardıcıllığı ilə membranın səthinə bağlanmış nuklein turşusu fraqmentlərini araşdıra bilərlər. Elm adamları DNT-ni neylon membrana köçürdükdə, texnikanı Southern blotting adlandırırlar. RNT-ni bir neylon membrana köçürdükdə, onu Northern blotting adlandırırlar. Elm adamları müəyyən genomda müəyyən DNT ardıcıllığının mövcudluğunu aşkar etmək üçün Southern blotlardan, gen ifadəsini aşkar etmək üçün isə Northern blotlardan istifadə edirlər.

Molekulyar klonlama

Ümumiyyətlə, "klonlaşdırma" sözü mükəmməl bir replikanın yaradılması deməkdir, lakin biologiyada bütöv bir orqanizmin yenidən yaradılması "reproduktiv klonlama" adlanır. Bütün bir orqanizmi klonlaşdırmaq cəhdlərindən çox əvvəl tədqiqatçılar genomun istənilən bölgələrini və ya fraqmentlərini çoxaltmağı öyrəndilər, bu proses molekulyar klonlaşdırma adlanır.

Kiçik genom fraqmentlərinin klonlanması tədqiqatçılara spesifik genləri (və onların zülal məhsullarını) və ya kodlaşdırılmayan bölgələri ayrı-ayrılıqda manipulyasiya etməyə və öyrənməyə imkan verir. Plazmid və ya vektor xromosom DNT-dən asılı olmayaraq təkrarlanan kiçik dairəvi DNT molekuludur. Klonlaşdırmada elm adamları plazmid molekullarından istifadə edərək istənilən DNT fraqmentini daxil etmək üçün "qovluq" yarada bilərlər. Plazmidlər adətən çoxalmaq üçün bakteriya sahibinə daxil edilir. Bakteriya kontekstində elm adamları insan genomundan (və ya başqa tədqiq edilmiş orqanizmin genomundan) DNT fraqmentini bakteriyanın DNT-sindən və ya ev sahibi DNT-dən fərqləndirmək üçün xarici DNT və ya transgen adlandırırlar.

Plazmidlər təbii olaraq bakteriya populyasiyalarında olur (məsələn Escherichia coli) və antibiotiklərə qarşı müqavimət (antibiotiklərdən təsirlənməmək qabiliyyəti) kimi orqanizmə müsbət xüsusiyyətlər verə bilən genlərə malikdir. Elm adamları molekulyar klonlaşdırma və insulin və insan böyümə hormonu kimi mühüm reagentlərin geniş miqyaslı istehsalı üçün vektorlar kimi plazmidləri dəyişdirmiş və dizayn etmişlər. Plazmid vektorlarının mühüm xüsusiyyəti elm adamlarının çoxlu klonlama yeri (MCS) vasitəsilə xarici DNT fraqmentini təqdim edə bilmələrinin asanlığıdır. MCS müxtəlif geniş yayılmış məhdudlaşdırıcı endonükleazların kəsə bildiyi çoxlu yerləri ehtiva edən qısa DNT ardıcıllığıdır. Məhdudiyyətli endonükleazlar xüsusi DNT ardıcıllığını tanıyır və onları proqnozlaşdırıla bilən şəkildə kəsirlər. Onlar təbii olaraq xarici DNT-yə qarşı müdafiə mexanizmi kimi bakteriyalar tərəfindən istehsal olunur. Bir çox məhdudlaşdırıcı endonükleazlar iki DNT zəncirində pilləli kəsiklər edir ki, kəsilmiş uclarda 2 və ya 4 əsaslı tək zəncirli çıxıntı olur. Bu çıxıntılar bir-birini tamamlayan çıxıntılarla yumşalmağa qadir olduğundan, biz onları “yapışqan uclar” adlandırırıq. DNT liqaz fermentinin əlavə edilməsi fosfodiester bağları vasitəsilə DNT fraqmentlərini daimi olaraq birləşdirir. Bu yolla elm adamları məhdudlaşdırıcı endonükleaza parçalanması nəticəsində yaranan istənilən DNT fraqmentini plazmid DNT-nin eyni məhdudlaşdırıcı endonükleaza ilə kəsilmiş iki ucu arasında birləşdirə bilər (Şəkil 17.7).

Rekombinant DNT molekulları

İçərisinə yad DNT daxil edilmiş plazmidlərə rekombinant DNT molekulları deyilir, çünki onlar süni yaradılmışdır və təbiətdə baş vermir. Onlara kimerik molekullar da deyilir, çünki molekulların müxtəlif molekul hissələrinin mənşəyi müxtəlif növ bioloji orqanizmlərə və ya hətta kimyəvi sintezə qədər izlənilə bilər. Rekombinant DNT molekullarından ifadə olunan zülalları rekombinant zülallar adlandırırıq. Bütün rekombinant plazmidlər genləri ifadə etməyə qadir deyil. Rekombinant DNT-nin gen ifadəsi üçün daha yaxşı hazırlanmış fərqli vektora (yaxud host) keçməsi lazım ola bilər. Alimlər həmçinin plazmidləri zülalları ifadə etmək üçün yalnız müəyyən ətraf mühit faktorları onları stimullaşdırdıqda düzəldə bilər ki, onlar rekombinant zülalların ifadəsini idarə edə bilsinlər.

Vizual əlaqə

Siz molekulyar biologiya laboratoriyasında işləyirsiniz və sizdən xəbərsiz olaraq laboratoriya partnyorunuz klonlamağı planlaşdırdığınız yad genomik DNT-ni dondurucuda saxlamaq əvəzinə bir gecədə laboratoriya skamyasında qoyub. Nəticədə nükleazlar tərəfindən parçalandı, lakin təcrübədə hələ də istifadə edildi. Plazmid, əksinə, yaxşıdır. Molekulyar klonlaşdırma təcrübənizdən hansı nəticələri gözləyirsiniz?

  1. Bakterial lövhədə koloniyalar olmayacaq.
  2. Yalnız mavi koloniyalar olacaq.
  3. Mavi və ağ koloniyalar olacaq.
  4. Yalnız ağ koloniyalar olacaq.

Öyrənməyə keçid

DNT Tədris Mərkəzindən klonlaşdırmada rekombinasiya animasiyasına baxın.

Hüceyrə Klonlaması

Bakteriya və maya kimi birhüceyrəli orqanizmlər ikili parçalanma yolu ilə aseksual olaraq çoxaldıqları zaman təbii olaraq öz klonlarını yaradırlar, buna hüceyrə klonlaşdırılması deyilir. Nüvə DNT-si mitoz prosesi ilə çoxalır, bu da genetik materialın dəqiq surətini yaradır.

Reproduktiv klonlaşdırma

Reproduktiv klonlaşdırma elm adamlarının bütün çoxhüceyrəli orqanizmi klonlaşdırmaq və ya eyni surətdə kopyalamaq üçün istifadə etdiyi üsuldur. Çoxhüceyrəli orqanizmlərin əksəriyyəti cinsi yolla çoxalır ki, bu da iki fərdin (valideynlərin) genetik hibridləşməsini nəzərdə tutur, bu da valideynlərdən hər hansı birinin eyni surətini və ya klonunu yaratmaq qeyri-mümkün edir. Biotexnologiyanın son nailiyyətləri laboratoriyada məməlilərin aseksual çoxalmasını süni şəkildə induksiya etməyə imkan verdi.

Partenogenez və ya "bakirə doğuş" bir embrion yumurta mayalanmadan böyüdükdə və inkişaf etdikdə baş verir. Bu aseksual çoxalmanın bir formasıdır. Partenogenez nümunəsi dişinin yumurta qoyduğu növlərdə baş verir və yumurta döllənirsə, bu diploid yumurtadır və fərd dişiyə çevrilir. Yumurta döllənməsə, haploid yumurta olaraq qalır və erkək yumurtaya çevrilir. Döllənməmiş yumurta partenogen və ya bakirə yumurtadır. Bəzi böcəklər və sürünənlər partenogen yumurta qoyur və bu yumurtalar yetkinlərə çevrilə bilər.

Cinsi çoxalma iki hüceyrə tələb edir. Haploid yumurta və sperma hüceyrələri birləşdikdə diploid ziqot əmələ gəlir. Zigot nüvəsi yeni bir fərd yaratmaq üçün genetik məlumatı ehtiva edir. Bununla belə, erkən embrional inkişaf yumurta hüceyrəsində olan sitoplazmik material tələb edir. Bu fikir reproduktiv klonlaşdırmanın əsasını təşkil edir. Buna görə də, yumurta hüceyrəsinin haploid nüvəsini eyni növdən olan hər hansı bir fərdin (donor) hüceyrəsindən diploid nüvəsi ilə əvəz etsək, o, genetik olaraq donorla eyni olan ziqota çevriləcəkdir. Somatik hüceyrə nüvəsinin ötürülməsi diploid nüvəni enukle edilmiş yumurtaya köçürmə üsuludur. Alimlər ondan ya terapevtik klonlaşdırma, ya da reproduktiv klonlaşdırma üçün istifadə edə bilərlər.

İlk klonlaşdırılmış heyvan 1996-cı ildə anadan olmuş qoyun Dolli idi. O dövrdə reproduktiv klonlaşdırma uğuru çox aşağı idi. Dolly yeddi il yaşadı və tənəffüs yollarının ağırlaşmalarından öldü (Şəkil 17.8). Hüceyrə DNT-si daha yaşlı bir insana aid olduğu üçün, DNT-nin yaşı klonlanmış şəxsin ömrünə təsir edə biləcəyi ilə bağlı fərziyyələr var. Dollydən bəri elm adamları atlar, öküzlər və keçilər kimi bir neçə heyvanı uğurla klonladılar, baxmayaraq ki, bu heyvanlar tez-tez üz, əza və ürək anomaliyalarını nümayiş etdirirlər. Terapevtik məqsədlər üçün embrion kök hüceyrələrinin mənbəyi kimi klonlaşdırılmış insan embrionlarının istehsalı cəhdləri olmuşdur. Terapevtik klonlaşdırma, zərərli xəstəlikləri və ya qüsurları aradan qaldırmaq üçün kök hüceyrələri istehsal edir (bir orqanizmi çoxaltmaq məqsədi daşıyan reproduktiv klonlaşdırmadan fərqli olaraq). Yenə də bəziləri bioetik mülahizələrə görə terapevtik klonlaşdırma səylərini müqavimətlə qarşıladılar.

Vizual əlaqə

Sizcə Dolly Finn-Dorset idi, yoxsa Şotland Blackface qoyunu?

Genetika Mühəndisliyi

Genetik mühəndislik, arzu olunan əlamətlərə nail olmaq üçün orqanizmin DNT-sini dəyişdirmək üçün rekombinant DNT texnologiyasından istifadə edərək orqanizmin genotipinin dəyişdirilməsidir. The addition of foreign DNA in the form of recombinant DNA vectors generated by molecular cloning is the most common method of genetic engineering. The organism that receives the recombinant DNA is a genetically modified organism (GMO). If the foreign DNA comes from a different species, the host organism is transgenic . Scientists have genetically modified bacteria, plants, and animals since the early 1970s for academic, medical, agricultural, and industrial purposes. In the US, GMOs such as Roundup-ready soybeans and borer-resistant corn are part of many common processed foods.

Gene Targeting

Although classical methods of studying gene function began with a given phenotype and determined the genetic basis of that phenotype, modern techniques allow researchers to start at the DNA sequence level and ask: "What does this gene or DNA element do?" This technique, reverse genetics, has resulted in reversing the classic genetic methodology. This method would be similar to damaging a body part to determine its function. An insect that loses a wing cannot fly, which means that the wing's function is flight. The classical genetic method would compare insects that cannot fly with insects that can fly, and observe that the non-flying insects have lost wings. Similarly, mutating or deleting genes provides researchers with clues about gene function. We collectively call the methods they use to disable gene function gene targeting. Gene targeting is the use of recombinant DNA vectors to alter a particular gene's expression, either by introducing mutations in a gene, or by eliminating a certain gene's expression by deleting a part or all of the gene sequence from the organism's genome.

Biotechnology in Medicine and Agriculture

It is easy to see how biotechnology can be used for medicinal purposes. Knowledge of the genetic makeup of our species, the genetic basis of heritable diseases, and the invention of technology to manipulate and fix mutant genes provides methods to treat the disease. Biotechnology in agriculture can enhance resistance to disease, pest, and environmental stress, and improve both crop yield and quality.

Genetic Diagnosis and Gene Therapy

Scientists call the process of testing for suspected genetic defects before administering treatment genetic diagnosis by genetic testing . Depending on the inheritance patterns of a disease-causing gene, family members are advised to undergo genetic testing. For example, doctors usually advise women diagnosed with breast cancer to have a biopsy so that the medical team can determine the genetic basis of cancer development. Doctors base treatment plans on genetic test findings that determine the type of cancer. If inherited gene mutations cause the cancer, doctors also advise other female relatives to undergo genetic testing and periodic screening for breast cancer. Doctors also offer genetic testing for fetuses (or embryos with in vitro fertilization) to determine the presence or absence of disease-causing genes in families with specific debilitating diseases.

Gene therapy is a genetic engineering technique used to cure disease. In its simplest form, it involves the introduction of a good gene at a random location in the genome to aid the cure of a disease that is caused by a mutated gene. The good gene is usually introduced into diseased cells as part of a vector transmitted by a virus that can infect the host cell and deliver the foreign DNA (Figure 17.9). More advanced forms of gene therapy try to correct the mutation at the original site in the genome, such as is the case with treatment of severe combined immunodeficiency (SCID).

Production of Vaccines, Antibiotics, and Hormones

Traditional vaccination strategies use weakened or inactive forms of microorganisms to mount the initial immune response. Modern techniques use the genes of microorganisms cloned into vectors to mass produce the desired antigen. Doctors then introduce the antigen into the body to stimulate the primary immune response and trigger immune memory. The medical field has used genes cloned from the influenza virus to combat the constantly changing strains of this virus.

Antibiotics are a biotechnological product. Microorganisms, such as fungi, naturally produce them to attain an advantage over bacterial populations. Cultivating and manipulating fungal cells produces antibiotics.

Scientists used recombinant DNA technology to produce large-scale quantities of human insulin in E. coli as early as 1978. Previously, it was only possible to treat diabetes with pig insulin, which caused allergic reactions in humans because of differences in the gene product. In addition, doctors use human growth hormone (HGH) to treat growth disorders in children. Researchers cloned the HGH gene from a cDNA library and inserted it into E. coli cells by cloning it into a bacterial vector.

Transgenic Animals

Although several recombinant proteins in medicine are successfully produced in bacteria, some proteins require a eukaryotic animal host for proper processing. Bu səbəbdən arzu olunan genlər klonlaşdırılaraq qoyun, keçi, toyuq və siçan kimi heyvanlarda ifadə edilir. We call animals that have been modified to express recombinant DNA transgenic animals. Several human proteins are expressed in transgenic sheep and goat milk, and some are expressed in chicken eggs. Scientists have used mice extensively for expressing and studying recombinant gene and mutation effects.

Transgenic Plants

Manipulating the DNA of plants (i.e., creating GMOs) has helped to create desirable traits, such as disease resistance, herbicide and pesticide resistance, better nutritional value, and better shelf-life (Figure 17.10). Plants are the most important source of food for the human population. Farmers developed ways to select for plant varieties with desirable traits long before modern-day biotechnology practices were established.

We call plants that have received recombinant DNA from other species transgenic plants. Because they are not natural, government agencies closely monitor transgenic plants and other GMOs to ensure that they are fit for human consumption and do not endanger other plant and animal life. Xarici genlər ətraf mühitdəki digər növlərə yayıla bildiyi üçün ekoloji sabitliyi təmin etmək üçün geniş sınaq tələb olunur. Staples like corn, potatoes, and tomatoes were the first crop plants that scientists genetically engineered.

Transformation of Plants Using Agrobacterium tumefaciens

Gen transferi təbii olaraq mikrob populyasiyalarında növlər arasında baş verir. Xərçəng kimi insan xəstəliklərinə səbəb olan bir çox virus, öz DNT-lərini insan genomuna daxil edərək hərəkət edir. In plants, tumors caused by the bacterium Agrobacterium tumefaciens occur by DNA transfer from the bacterium to the plant. Although the tumors do not kill the plants, they stunt the plants and they become more susceptible to harsh environmental conditions. A. tumefaciens affects many plants such as walnuts, grapes, nut trees, and beets. Artificially introducing DNA into plant cells is more challenging than in animal cells because of the thick plant cell wall.

Researchers used the natural transfer of DNA from Aqrobakteriya to a plant host to introduce DNA fragments of their choice into plant hosts. In nature, the disease-causing A. tumefaciens have a set of plasmids, Ti plasmids (tumor-inducing plasmids), that contain genes to produce tumors in plants. DNA from the Ti plasmid integrates into the infected plant cell’s genome. Tədqiqatçılar şiş yaradan genləri çıxarmaq və bitki genomuna köçürmək üçün istədiyiniz DNT fraqmentini daxil etmək üçün Ti plazmidləri ilə manipulyasiya edirlər. The Ti plasmids carry antibiotic resistance genes to aid selection and researchers can propagate them in E. coli hüceyrələr də.

The Organic Insecticide Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis (Bt) bitkilərə təsir edən bir çox həşərat növləri üçün zəhərli olan sporulyasiya zamanı zülal kristalları istehsal edən bakteriyadır. Insects need to ingest Bt toxin in order to activate the toxin. Insects that have eaten Bt toxin stop feeding on the plants within a few hours. After the toxin activates in the insects' intestines, they die within a couple of days. Müasir biotexnologiya bitkilərə həşəratlara qarşı fəaliyyət göstərən öz kristal Bt toksinini kodlamağa imkan verdi. Scientists have cloned the crystal toxin genes from Bt and introduced them into plants. Bt toxin is safe for the environment, nontoxic to humans and other mammals, and organic farmers have approved it as a natural insecticide.

Pomidor ləzzəti

The first GM crop on the market was the Flavr Savr Tomato in 1994. Scientists used antisense RNA technology to slow the softening and rotting process caused by fungal infections, which led to increased shelf life of the GM tomatoes. Additional genetic modification improved the tomato's flavor. Flavr Savr pomidoru məhsulun saxlanması və daşınmasında problemlər ucbatından bazarda uğurla qalmadı.


Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues

Investigation of gene expression significantly contributes to our knowledge of the regulation and function of genes in many areas of biology. In this protocol, we describe how northern blot analysis is used to identify gene expression patterns at the RNA level in human cancer cells as well as in cancerous and normal tissues. RNA molecules are separated by gel electrophoresis and are subsequently transferred to a porous membrane by capillary action. Specific sequences in the RNA are detected on the membrane by molecular hybridization with radiolabeled nucleic acid probes. Despite the development of newer methods, such as real-time PCR, nuclease protection assays and microarrays, northern blot analysis is still a standard technique used in the detection and quantification of mRNA levels because it allows a direct comparison of the mRNA abundance between samples on a single membrane. This entire northern blotting protocol takes ∼ 4 d to complete.


Fon

maya, Saccharomyces cerevisiae, is a simple eukaryotic organism well suited as a tool for analysis of mammalian gene regulation. Development of yeast artificial chromosomes (YACs) [1] greatly facilitated analysis of complex mammalian genetic loci by allowing cloning, maintenance, and manipulation of large stretches of exogenous DNA in yeast. More recently, YACs have been used to generate transgenic mice [2–4]. Introduction of mutations into YACs by homologous recombination coupled with the ability to produce transgenics provided a system to analyze the effect of the mutation in the context of the whole locus within an animal model.

One of the steps in the process is the identification of yeast isolates containing mutant YACs. For quick analysis of yeast DNA, it is possible to perform PCR directly on yeast colonies [5]. However, the utility of this method is limited, because often it does not confirm conclusively whether the mutation is located correctly within the YAC. Southern blot hybridization is more useful to confirm the correct targeting of the desired mutation. This protocol requires good quality genomic DNA, but a rapid isolation method is desirable to facilitate screening large numbers of colonies. The "smash and grab" rapid yeast genomic DNA isolation protocol utilizes disruption of the yeast cell wall by enzymatic digestion or physical fractionation of cells with small glass beads [6]. DNA is subsequently purified using a mixture of phenol-chloroform, followed by ethanol precipitation. However, when processing a large number of samples, use of glass beads becomes cumbersome, or large quantities of enzyme must be used, which is expensive. Thus, we developed a protocol for rapid isolation of yeast genomic DNA from overnight liquid cultures or directly from colonies. Repeated freeze-thawing of cells in a lysis buffer is used to disrupt the cell wall and release genomic DNA, circumventing the need for enzymes or glass beads. Cell lysis is followed by extraction with chloroform and ethanol precipitation. Approximately 200 ng – 3 μg of genomic DNA can be isolated directly form a large colony on a plate or from 1.5 ml of an overnight liquid culture, with liquid cultures giving the higher yield. Resultant DNAs may be resuspended directly in a restriction enzyme/RNase cocktail mixture for Southern blot hybridization, or used in several standard PCR reactions. It is possible to isolate DNA from large number of clones and analyze these by PCR on the same day, or in a few days by Southern blot hybridization and phosphorimaging.


İstinadlar

Snow RW, Guerra CA, Noor AM, Myint HY, Hay SI: The global distribution of clinical episodes of Plasmodium falciparum malaria. Təbiət. 2005, 434: 214-217. 10.1038/nature03342.

Yamey G: Roll Back Malaria: a failing global health campaign. BMJ. 2004, 328: 1086-1087. 10.1136/bmj.328.7448.1086.

Kooij TW, Janse CJ, Waters AP: Plazmodium post-genomics: better the bug you know?. Nat Rev Mikrobiol. 2006, 4: 344-357. 10.1038/nrmicro1392.

Bozdech Z, Llinas M, Pulliam BL, Wong ED, Zhu J, DeRisi JL: The transcriptome of the intraerythrocytic developmental cycle of Plasmodium falciparum. PLoS Biol. 2003, 1: E5-10.1371/journal.pbio.0000005.

Llinas M, Bozdech Z, Wong ED, Adai AT, DeRisi JL: Comparative whole genome transcriptome analysis of three Plasmodium falciparum suşlar. Nuklein turşuları Res. 2006, 34: 1166-1173. 10.1093/nar/gkj517.

Coulson RM, Hall N, Ouzounis CA: Comparative genomics of transcriptional control in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genom Res. 2004, 14: 1548-1554. 10.1101/gr.2218604.

Garneau NL, Wilusz J, Wilusz CJ: The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007, 8: 113-126. 10.1038/nrm2104.

Cao D, Parker R: Computational modeling of eukaryotic mRNA turnover. Rna. 2001, 7: 1192-1212. 10.1017/S1355838201010330.

Collart MA: Global control of gene expression in yeast by the Ccr4-Not complex. Gen. 2003, 313: 1-16. 10.1016/S0378-1119(03)00672-3.

Meyer S, Temme C, Wahle E: Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 2004, 39: 197-216. 10.1080/10409230490513991.

Estevez AM, Kempf T, Clayton C: The exosome of Trypanosoma brucei. EMBO J. 2001, 20: 3831-3839. 10.1093/emboj/20.14.3831.

Estevez AM, Lehner B, Sanderson CM, Ruppert T, Clayton C: The roles of intersubunit interactions in exosome stability. J Biol Chem. 2003, 278: 34943-34951. 10.1074/jbc.M305333200.

Newbury SF: Control of mRNA stability in eukaryotes. Biochem Soc Trans. 2006, 34: 30-34. 10.1042/BST0340030.

Wang Y, Liu CL, Storey JD, Tibshirani RJ, Herschlag D, Brown PO: Precision and functional specificity in mRNA decay. Proc Natl Acad Sci ABŞ. 2002, 99: 5860-5865. 10.1073/pnas.092538799.

Lam LT, Pickeral OK, Peng AC, Rosenwald A, Hurt EM, Giltnane JM, Averett LM, Zhao H, Davis RE, Sathyamoorthy M, et al: Genomic-scale measurement of mRNA turnover and themechanisms of action of the anti-cancer drug flavopiridol. Genom Biol. 2001, 2: RESEARCH0041-10.1186/gb-2001-2-10-research0041.

Garcia-Martinez J, Aranda A, Perez-Ortin JE: Genomic run-on evaluates transcription rates for all yeast genes and identifies gene regulatory mechanisms. Mol hüceyrəsi. 2004, 15: 303-313. 10.1016/j.molcel.2004.06.004.

Reich E, Franklin RM, Shatkin AJ, Tatumel : Action of actinomycin D on animal cells and viruses. Proc Natl Acad Sci ABŞ. 1962, 48: 1238-1245. 10.1073/pnas.48.7.1238.

Militello KT, Patel V, Chessler AD, Fisher JK, Kasper JM, Gunasekera A, Wirth DF: RNA polymerase II synthesizes antisense RNA in Plasmodium falciparum. Rna. 2005, 11: 365-370. 10.1261/rna.7940705.

Bozdech Z, Zhu J, Joachimiak MP, Cohen FE, Pulliam B, DeRisi JL: Expression profiling of the schizont and trophozoite stages of Plasmodium falciparum with a long-oligonucleotide microarray. Genom Biol. 2003, 4: R9-10.1186/gb-2003-4-2-r9.

DeRisi Lab Malaria Transcriptome Database. [http://malaria.ucsf.edu]

Yang E, van Nimwegen E, Zavolan M, Rajewsky N, Schroeder M, Magnasco M, Darnell JE: Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genom Res. 2003, 13: 1863-1872. 10.1101/gr.997703.

Ruvolo V, Altszuler R, Levitt A: The transcript encoding the circumsporozoite antigen of Plasmodium berghei utilizes heterogeneous polyadenylation sites. Mol Biochem Parasitol. 1993, 57: 137-150. 10.1016/0166-6851(93)90251-R.

Oguariri RM, Dunn JM, Golightly LM: 3' gene regulatory elements required for expression of the Plasmodium falciparum developmental protein, Pfs25. Mol Biochem Parasitol. 2006, 146: 163-172. 10.1016/j.molbiopara.2005.12.004.

Beissbarth T, Speed TP: GOstat: find statistically overrepresented Gene Ontologies within a group of genes. Bioinformatika. 2004, 20: 1464-1465. 10.1093/bioinformatics/bth088.

Kim CC, Falkow S: Significance analysis of lexical bias in microarray data. BMC Bioinformatika. 2003, 4: 12-10.1186/1471-2105-4-12.

Martin RE, Henry RI, Abbey JL, Clements JD, Kirk K: The 'permeome' of the malaria parasite: an overview of the membrane transport proteins of Plasmodium falciparum. Genom Biol. 2005, 6: R26-10.1186/gb-2005-6-3-r26.

de Rojas MO, Wasserman M: Temporal relationships on macromolecular synthesis during the asexual cell cycle of Plasmodium falciparum. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1985, 79: 792-796. 10.1016/0035-9203(85)90119-1.

Gritzmacher CA, Reese RT: Protein and nucleic acid synthesis during synchronized growth of Plasmodium falciparum. J Bakteriol. 1984, 160: 1165-1167.

Cleary MD, Meiering CD, Jan E, Guymon R, Boothroyd JC: Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotexnol. 2005, 23: 232-237. 10.1038/nbt1061.

Lotan R, Bar-On VG, Harel-Sharvit L, Duek L, Melamed D, Choder M: The RNA polymerase II subunit Rpb4p mediates decay of a specific class of mRNAs. Genes Dev. 2005, 19: 3004-3016. 10.1101/gad.353205.

Duttagupta R, Tian B, Wilusz CJ, Khounh DT, Soteropoulos P, Ouyang M, Dougherty JP, Peltz SW: Global analysis of Pub1p targets reveals a coordinate control of gene expression through modulation of binding and stability. Mol Cell Biol. 2005, 25: 5499-5513. 10.1128/MCB.25.13.5499-5513.2005.

Web supplement for Expression Profiling the Schizont and Trophozoite Stages of Plasmodium falciparum with a Long Oligonucleotide Microarray. [http://derisilab.ucsf.edu/data/falciparum]

Mor'e J, (editor): The Levenberg-Marquardt Algorithm: Implementation and Theory. 1978, Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag

Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D: Cluster analizi və genom geniş ifadə nümunələrinin nümayişi. Proc Natl Acad Sci ABŞ. 1998, 95: 14863-14868. 10.1073/pnas.95.25.14863.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular cloning, a Laboratory Manual. 1989, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press, 2


8.7: DNA Analysis- Blotting and Hybridization - Biology

Southern Blot analysis of DNA

The left panel is an elektroforetik gel stained with ethidium bromide . Ümumi DNT has been extracted from nine bacterial DNA clones (lanes ##1-9), digested with a particular restriction endonuclease, and separated by electrophoresis. Starting about one-third of the way from the top, a bright smear is present, indicating the presence of a random collection of restriction fragments of various sizes. There are no discrete bands, as no one DNA sequence is present in more than one copy. The lane marked (L) is a molecular weight standard (a "Ladder"), with a series of DNT fragments at 100bp intervals. A cloned DNT fragment has been loaded in lane #10: its mobility corresponding to the four rung of the ladder indicates a size of about 400bp.

The middle panel is a Southern Blot autoradiogram -nin same gel. The DNT in the gel is transferred ("blotted") to a filter. The filter is then hybridized with a radioactively-labelled DNT (a "prob") made from the DNA loaded in lane #10. The filter is then exposed to X-ray film. Where the probe DNT finds a complementary sequence in the blot, it base-pairs ("sticks") to that DNT. The radioactivity then exposes the film and produces a dark band on the X-ray film.

The right panel is a schematic representation of the autoradiogram: the information content is the presence or absence of bands, and the size of the fragments. The bands in the autoradiogram show that a DNT sequence homologous to the probe DNA edir indiki in clones ## 3, 4, & 8, with the expected size, and absent in clones ##1, 2, 5, & 9. [The probe sticks to itself in #10, as expected]. This analysis indicates that the gene of interest has been successfully cloned in the first set of plasmids, which can now be analyzed further.

Figure modified from © 2000 by Griffiths və b. text material © 2009 by Steven M. Carr


Videoya baxın: DNT (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Fadil

    Mən susacağam bəlkə də

  2. Gobar

    Bəli, uşaqlar çıxdı: o)

  3. Vikree

    Mənim fikrimcə, burada kimsə vəsvəsəlidir

  4. Brennus

    Eh this crisis spoils everything for us

  5. Finian

    çox yaxşı fikir



Mesaj yazmaq