Məlumat

M9 nə deməkdir

M9 nə deməkdir


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Kim mənə nə deyə bilər M9 M9 orta üçün dayanır?

Mən googling cəhd etdim, amma hələ də tapa bilmirəm.


Mühəndislik Escherichia coli metanol çevrilməsi üçün

Metilotrof bakteriyalar metanol və digər azaldılmış bir karbonlu birləşmələri yeganə karbon və enerji mənbəyi kimi istifadə edirlər. Bu məqsədlə bu bakteriyalar bir sıra xüsusi fermentlər və yollar inkişaf etdirdilər. Burada bir sıra "metilotrofiya genlərini" seçmək və tətbiq etmək üçün sintetik biologiya yanaşmasından istifadə etdik. Escherichia coli əsasən silisiumda metanol dissimilyasiyasını və assimilyasiyasını təmin etmək üçün mülahizələr və axın balansının təhlili. Müəyyən etdik ki, metanolun istifadəsinə imkan verən ən perspektivli yanaşma NAD-dən asılı metanol dehidrogenazanın həyata keçirilməsi və heksuloza-6-fosfat sintaza (Hps) və 6-fosfo-3- genlərini ifadə etməklə ribuloz monofosfat dövrünün qurulmasıdır. hekzuloizomeraz (Phi). Heteroloji hostda ən yaxşı performans göstərən fermentləri sınamaq üçün müxtəlif donor orqanizmlərdən bir sıra ferment namizədləri seçilmiş və sistematik olaraq onların xüsusiyyətlərinə görə təhlil edilmişdir. in vitroin vivo fəaliyyətləri E. coli. Bunlar arasında Mdh2, Hps və Phi mənşəli Bacillus metanolicus ən təsirli olduğu müəyyən edilmişdir. 13 C metanol istifadə edərək etiketləmə təcrübələri E. coli bu fermentlərin istehsalı metanolun mərkəzi metabolitlərə 40% -ə qədər daxil olduğunu göstərdi. Endogen glutatyona bağlı formaldehid oksidləşmə yolunun olması E. coli metanolun çevrilmə sürətinə mənfi təsir göstərməmişdir. Birlikdə götürdükdə, bu tədqiqatın nəticələri gen transferi ilə sintetik metilotrofların yaradılması istiqamətində böyük irəliləyişdir.


2014 – Next Generation M Series üçün YENİ

Redaktorun qeydi: Aşağıdakı məlumat İstehsalçının veb saytından gəlir və maşınlara baxışımız məlumatı təsdiqləyir.

YENİ 2014 M9 Life Ionizer, onların məşhur LIFE 9100-ü əvəz edən tam yenidən dizayndır. M-Seriyadakı "M" Maksimum – deməkdir və HƏYAT bu deməkdir! Yeni M-9 bütün digər ionlaşdırıcılardan üstündür:

  • 11,5-ə qədər tənzimləyən pH ilə qələvi su
  • -800 ORP-ə qədər tənzimləyən ən yüksək antioksidant potensialı
  • SMPS MAX Yield Power™ – 252 ilə 504 vata qədər tənzimləyir*

Ağac növlərinin zənginliyi subtropik meşələrdə ekosistemin karbon ehtiyatını artırır

Meşə ekosistemləri qlobal karbon dövriyyəsinin ayrılmaz tərkib hissəsidir, çünki onlar qısa müddət ərzində (C axını) böyük miqdarda C qəbul edir və buraxır və ya daha uzun müddət ərzində (C ehtiyatı) toplayır. Bununla belə, yüksək və aşağı növ zənginliyi olan meşələr arasında C axınlarının və xüsusilə C ehtiyatlarının fərqli olub-olmaması və hansı istiqamətdə olub-olmaması ilə bağlı qeyri-müəyyənlik qalır. Sahə əsaslı ölçmələrdən əldə edilən hərtərəfli məlumat toplusuna əsaslanaraq, biz növ zənginliyinin (3-20 ağac növü) və yetişmə yaşının (22-116 yaş) yerüstü və yeraltı C ehtiyatlarının altı bölməsinə və dörd komponentə təsirini sınaqdan keçirdik. Çinin cənub-şərqindəki subtropik meşələrdə C axını. Meşə dayaqları arasında ümumi C ehtiyatı 149 ± 12 Mg ha -1 olub, zənginlik 28,5% və yaş bu ölçüdəki variasiyanın 29,4%-ni izah edir. Növlərlə zəngin olan trikotajlarda C ehtiyatları və axınları az zəngin olan tribunalara nisbətən daha yüksək idi və əlavə olaraq, köhnə trikotajlarda cavanlara nisbətən daha yüksək C ehtiyatları var idi. Ümumilikdə, hər bir əlavə ağac növü üçün ümumi C ehtiyatı 6,4% artmışdır. Nəticələrimiz Çinin cənub-şərqindəki növlərlə zəngin subtropik meşələrdə müxtəliflik vasitəçiliyi ilə yerüstü və yeraltı C sekvestrasiyası üçün hərtərəfli sübutlar təqdim edir. Buna görə də, bu regionda və başqa yerlərdə meşəsalma siyasətləri C fiksasiyasını artırmaq və beləliklə də atmosfer CO-nun yavaş artması üçün monokulturalara cari diqqətdən çoxnövlü plantasiyalara dəyişməyi nəzərə almalıdır.2 konsentrasiyalar və qlobal istiləşmə.

Açar sözlər: Həmişəyaşıl enliyarpaqlı meşə meşə biomüxtəlifliyində fəaliyyət göstərən BEF-Çin karbon axını karbon saxlama ekosistemi.


Materiallar və metodlar

Kimyəvi maddələr və reagentlər

Bütün kimyəvi maddələr və həlledicilər başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə Sigma-Aldrich-dən alınmışdır. Məhdudiyyətli endonükleazlar və DNT-ni dəyişdirən fermentlər New England Biolabs-dan idi. DNT plazmidi GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) istifadə edərək çıxarıldı. DNT ardıcıllığı Eurofins SAS (Ebersberg, Almaniya) ilə subpodratçı olmuşdur.

Plazmid konstruksiyası

Expressys ®-dən pZA23, pZA33, pZE23 və pZS23 vektorlarından istifadə edilmişdir, çünki onlar IPTG tərəfindən induksiya olunur və yüngülləşdirilmiş struktura malikdirlər. lacI ölçüsünü azaldan gen (2 358-dən 3 764 bp) və modullaşdırıla bilir (replikasiya mənşəyini, müqavimət markerini və vektor promotorunu məhdudlaşdırma/bağlama ilə dəyişmək asandır). Bu tədqiqatda pZA33-də PA1lac0-1 promotoru konstitusiya promotoru proC və induksiya olunan promotor P ilə əvəz edilmişdir.tac, müvafiq olaraq pZA37 və pZA36 yaradır. Eynilə, pZS23-ün promotoru PA1lac0-1 proD yaradan pZS28 ilə əvəz edilmişdir.

Gen klonlaşdırılması NEBuilder HIFI DNT Assembly Master Mix (NEB E2621) istifadə edərək həyata keçirilib. Bu üsul bir addımda bir neçə fraqmenti yığmaq imkanı verir. New England Biolabs tərəfindən təqdim edilən kommersiya qarışığı (a) bir ardıcıl tamamlayıcılığı paylaşan fraqmentlərin yığılmasını asanlaşdıran 3 tək zəncir ucları yaradan eksonukleazdan ibarətdir (b) fraqmentlərdən sonra boş yerləri dolduran polimeraz yığılmış və (c) fraqmentləri bir-birinə bağlayan ligaza. The E. coli kdsD, fsaAaldA genlər ekstraksiya edilmiş genom DNT-dən gücləndirilmişdir E. coli K12 MG1655 Cədvəl S1-də təsvir olunan primerlərdən istifadə edərək PCR ilə. Fraqmentlər (kdsD + fsaA və ya aldA) sonra HiFi montajı ® tərəfindən MCS-nin hər iki tərəfində hibridləşən primerlərlə əvvəlcədən xəttiləşdirilmiş pZ-yə daxil edilmişdir. Bütün plazmidlər ardıcıllıqla yoxlanılır. Nəticəni daşıyan plazmidlər kdsD, fsaA və aldA genlər Cədvəl 2-də verilmişdir.

Cədvəl 2. Bu tədqiqatda istifadə edilən və ya qurulan plazmidlər.

Gərginliyin qurulması və çevrilməsi

The E. coli bu işdə istifadə edilən ştammlar Cədvəl 3-də verilmişdir. Gen silinməsi (yəni, glcD, fucA, mgsA, pfkA, ptsG) P1vir faqından istifadə edərək transduksiya yolu ilə hazırlanmışdır. P1vir lizatlarının hazırlanması və ötürülmə prosedurları Bremer və digərlərində təsvir olunduğu kimi həyata keçirilmişdir. (1984) kiçik dəyişikliklərlə. KEIO kolleksiyasından (Murakami et al., 2007) tək silinmə və kanamisin antibiotik müqavimətli kaset daşıyan ştammlar (donor ştammı) 0,2% olan 5 ml LB-də peyvənd edilmişdir (LB-də hazırlanmış bir gecəlik prekulturadan 200 BCl) D-qlükoza və 5 mM CaCl2 37ºC-də 30 dəqiqə. Sonra, hər bir donor kulturasına 100 º º1vir lizat (~ 5 × 10 8 faq/ml) əlavə edildi və kultura aydınlaşana və hüceyrələr tamamilə olana qədər 37ºC-də 2-3 saat inkubasiya edildi. lysed (Baba et al., 2006). Lizatlar 0,2 ½ BCm dayaq membranı (Pall) ilə 25 mm steril şpris filtrlərindən istifadə edərək filtrasiya yolu ilə bərpa edildi və 4ºC-də saxlanıldı. Maraqlanan geni silmək üçün qəbul edən ştam kanamisin müqavimətinə malik donor geninin silinməsi kasetini daşıyan P1virlə yoluxmuşdur. Bu məqsədlə qəbuledici ştam əvvəllər 5 ml LB mühitdə 37ºC temperaturda kultivasiya edilmiş, 1500 q-da 10 dəqiqə ərzində sentrifuqasiya yolu ilə toplanmış və 1,5 ml 10 mM MgSO-da yenidən dayandırılmışdır.4 və 5 mM CaCl2. Donor ştamından gen silmə kasetini daşıyan P1vir Lizat qəbuledici ştamın süspansiyonuna əlavə edildi (0,1 ml) və 30 dəqiqə 37°C-də inkubasiya edildi. Sonra 0,1 ml 1 M natrium sitrat, sonra 1 mL LB əlavə edildi və bu hüceyrə süspansiyonu müvafiq antibiotiklə bərk LB mühitinə yayılmazdan əvvəl 1 saat 37ºC, 200 rpm-də inkubasiya edildi. Uğurlu transduksiya hadisələrini təcrid etmək üçün koloniyalar PCR ilə yoxlanıldı. Antibiotik kasetinin çıxarılması bakteriya ştammlarının FLP rekombinazını daşıyan pCP20 plazmidi ilə transformasiyası, sonra isə PCR yoxlanılması yolu ilə həyata keçirilib.

Cədvəl 3. E. coli bu işdə istifadə edilən və qurulan ştamlar.

Səlahiyyətli qeyri-kommersiya ştammları Chung və digərlərinin protokoluna uyğun olaraq hazırlanmışdır. (1989) aşağıdakı kimi kiçik dəyişikliklərlə. Bir gecədə LB-də bir gecədə əvvəlcədən mədəniyyət edildi. Təzə LB mədəniyyəti daha sonra bir DO-da hüceyrələrlə aşılandı600 0,1. Nə zaman DO600 təqribən 0,5-ə çatır, 2 ml kultura toplanır və nəticədə alınan qranul 300 º BCl TSS buferində yenidən dayandırılır [2,5%(w/v) PEG 3350, 1 M MgCl2, 5%(cild/cild) DMSO]. Buz üzərində 10 dəqiqə qaldıqdan sonra hüceyrə süspansiyonuna maraq plazmidi əlavə edildi və bu da buz üzərində 30 dəqiqə inkubasiya edildi. Bu addımı 90 s ərzində 42°C-də istilik şoku izlədi. Transformasiya edilmiş hüceyrələr 10 dəqiqə ərzində buzun üzərinə qoyuldu, sonra 400 ½ LB əlavə edildi və kultura 1 saat 200 rpm-də 30ºC-də inkubasiya edildi. 8 000 rpm-də 2,5 dəqiqə sentrifuqa edildikdən sonra hüceyrə qranulları 600 º LB-də yenidən dayandırıldı və 150 ​​º BCl müvafiq antibiotiklə bərk LB plitələrinə yayıldı.

Mədəniyyətlərin şərtləri

Molekulyar biologiya üsulları üçün bakteriya ştammları LB mühitində (10 q/L tripton, 5 q/L maya ekstraktı və 5 q/L NaCl) becərildi və petri qablarında bərk mühit üçün 5 q/L agar əlavə edildi. GA istehsalı üçün mineral mühit M9 istifadə edilmişdir. Başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə, hər litrdə: 18 q Na2 HPO 4 * 12H2O, 3 q KH2PO4, 0,5 q NaCl, 2 q NH4Cl, 0,5 q MgSO 4 * 7H2O, 0,015 CaCl 2 * 2H2O, 1 ml 0,06 M FeCl3 konsentratlaşdırılmış HCl-də 1000 ½ ehtiyat məhlulundan, 2 ml 10 mM tiamin HCl ehtiyat məhlulundan, 20 q MOPS və 1 ml mikroelement məhlulundan (1000 º 0,5 q Na məhlulu)2EDTA * 2H2O, 0,18 q CoCl 2 * 6H2O, 0,18 q ZnSO 4 * 7H2O, 0,4 q Na2 MoO 4 * 2H2O, 0,1 q H3BO3, 0,12 q MnSO 4 * H2O, 0,12 q CuCl2 × H2O). Karbon mənbəyi D-qlükoza, L-arabinoza və ya D-ksiloza 10 q/l yekun konsentrasiyada əlavə edildi, pH 3-(N-morfolino) propansulfonik (MOPS) turşusu ilə 7-yə düzəldildi və sonra filtr vasitəsilə sterilizasiya edildi. 0,2 μm membranlar. Antibiotiklər ampisilin, kanamisin və xloramfenikol müvafiq olaraq 100, 50 və 25 mq/l konsentrasiyalarda tələb olunduqda əlavə edildi. Üçün E. coli transketolaza aktivliyində qüsurlu suşlar (ΔtktA ΔtktB), M9 mühiti 500 μM L-fenilalanin, 250 μM L-tirozin, 200 μM L-triptofan, 6 μM p-aminobenzoat, 6 μM p-aminobenzoat, 6 μM p-den, &hidroksi280 & #x003BCM şikimat və LB izi (20%) V/V). Qliseraldehid-3-fosfatdehidrogenaz aktivliyində qüsurlu suşlar üçün (Δ)boşluqA), M9 mühiti KOH ilə pH 7-də tənzimlənmiş 0,4 q/L malik turşu ilə tamamlandı. Tələb olunduqda, uyğun antibiotiklər ampisilin üçün 100 BCg/mL, kanamisin üçün 50 BCg/mL və ya xloramfenikol üçün 25 BCg/mL nisbətində mühitə əlavə edilir. Bakteriya kulturaları 200 rpm-də və 37°C-də fırlanan çalkalayıcıya yerləşdirildi. Böyümə spektrofotometr (Biochrom Libra S11) ilə 600 nm-də absorbansın ölçülməsi ilə izlənildi.

Fermentlərin istehsalı, təmizlənməsi və təhlilləri

The kdsD, fsaA, və aldA genlər Cədvəl S1-dəki primerlərdən istifadə etməklə gücləndirilmiş və pET28a (Novagen) ifadə vektorunda klonlaşdırılmışdır. The E. coli bu genləri daşıyan plazmid ilə transformasiya olunmuş BL21 (DE3) ştammı 600 nm (DO) dalğasında 200 mL LB-kanamisin içində LB-kanamisin (50 mq/L) içərisində hazırlanmış əvvəlcədən kulturadan aşılanmışdır.600) 0,1-dən 16ºC-də fırlanan çalkalayıcıda 200 rpm-də. Nə zaman DO600 0.6𠄰.8-ə çatdı, maraq zülalının ifadəsi 1 mM son konsentrasiyada 1 mM IPTG-də IPTG əlavə edilməklə induksiya edildi. 16 saatdan sonra 16°C-də kultura 4800 rpm-də 15 dəqiqə 4°C-də sentrifuqasiya yolu ilə toplandı. Hüceyrə qranulları 1,5 mL yuyucu tamponda (50 mM HEPES, pH 7,5 0,3 M NaCl) yenidən dayandırıldı və buz üzərində 30% gücdə dörd dəfə (hər biri 30 s) sonikasiya edildi. HIS etiketli zülallar kobalt qatranından istifadə edərək kommersiya dəstində (Clontech) təsvir edilmiş protokola uyğun olaraq təmizlənmişdir. Zülalın təmizlənməsi SDS-PAGE elektroforezi ilə yoxlanıldı və zülal konsentrasiyası Bradford üsulu ilə ölçüldü (Bradford, 1976)

Ferment analizləri Tris-Cl, 100 mM pH 7.5/10 mM MgCl-də aparılmışdır.2 37ºC-də tampon. Başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə, KdsD aktivliyi 3 mM NAD + və 5 mM D-Ribu-5P-nin iştirakı ilə 10 BCg/ml FsaA və AldA-nın iştirakı ilə birləşdirilmiş analizdə ölçüldü. FSA, 3 mM Ara5P-nin parçalanmasından əldə edilən GAP-ın 340 nm-də 0,2 mM NADH oksidləşməsi ilə 1 U/ml trioz izomeraza və qliserol-3-P dehidrogenazın iştirakı ilə birləşdirilməsi ilə ölçüldü. AldA eyni tamponda 5 mM qlikolaldehidin iştirakı ilə 340 nm-də NAD + (3 mM) azaldılması ilə ölçüldü.

Analitik üsullar

Hüceyrədənkənar metabolitlər Ultimate 3000 xromatoqrafı (Dionex, Sunnyvale, ABŞ) ilə yüksək performanslı maye xromatoqrafiya (HPLC) ilə müəyyən edilmişdir. HPLC sistemi kation mübadiləsi sütunu (Aminex, HPX87H 300 × 7,8 mm, 9 μm, BioRad), avtomatik injektor (WPS-3000RS, Dionex), IR detektoru (RID 10A, Shimadzu) və UV detektoru (SPD-20A, Shimadzu). Nümunənin enjeksiyon həcmi 20 ºBCL idi və birləşmələr Micro-Guard Cation H ön sütunu (BioRad, ABŞ) ilə qorunan Aminex HPX-87H sütununda ayrıldı. Ayırma 1,25 mM H ilə 35ºC-də aparıldı2BELƏ Kİ4 mobil faza olaraq 0,5 mL min 𢄡. Bütün nümunələr sentrifuqadan keçirildi (10.000 q-da 2 dəqiqə) və şprislə süzüldü (0,2 ½BCm) və nəticədə yaranan supernatant analiz edilənə qədər º221220ºC-də saxlanıldı.

Genom-miqyaslı modelləşdirmə və axın balansının təhlili

iJO1366 genom miqyası E. coli model (Orth et al., 2011) qlikoptimus yolu vasitəsilə GA istehsalını simulyasiya etmək üçün uyğunlaşdırılmışdır. Qeyd edək ki, dəyişdirilmiş fsaA arabinoza-5P-nin qliseraldehid-3P və qlikolaldehidə çevrilməsinə imkan verən reaksiya modelə əlavə edilmişdir. Parsimon axın balansı analizləri (pFBA) OptFlux proqram təminatından (Rocha et al., 2010) istifadə edərək karbon mənbəyi kimi D-qlükoza, L-arabinoza və ya D-ksilozdan istifadə etməklə həyata keçirilmişdir. Hər bir simulyasiya üçün karbon mənbəyinin udma dərəcəsi ixtiyari olaraq 10 mmol olaraq təyin edilmişdir. g CDW - 1 .h 𢄡 . Qeyri-böyümə ilə əlaqəli baxım 3,15 mmol olaraq təyin edildiATP. g CDW - 1 .h 𢄡 𢄡 , və elektron nəql sistemində iştirak edən reaksiyalar, əvvəllər təsvir edildiyi kimi, real P/O nisbətini simulyasiya etmək üçün məhdudlaşdırılmışdır (Orth et al., 2011). pFBA simulyasiyaları maksimuma çatdırmaq üçün məqsəd funksiyası kimi GA ixracından istifadə etməklə həyata keçirilmişdir.

Statistik üsullar

Statistik təhlillər Analysis ToolPak paketindən istifadə etməklə Microsoft Excel ®-də aparılmışdır. İki quyruqlu cütləşməmiş t-test flüoresan induksiya səviyyələrini müqayisə etmək üçün istifadə edilmişdir, hansı bir alfa səviyyəsi səh Əhəmiyyət üçün < 0,05 təyin edildi.


Müəllif məlumatı

Bu müəlliflər bərabər töhfə verdilər: Yuxin Chen, Yuanyuan Huang.

Əlaqələr

Sürix Universiteti, Təkamül Biologiyası və Ətraf Mühitin Tədqiqatları Departamenti, Sürix, İsveçrə

Yuxin Chen, Yuanyuan Huang, Pascal A. Niklaus və Nadia Castro-Izaguirre

Sahil və Bataqlıq Ekosistemlərinin Əsas Laboratoriyası (Təhsil Nazirliyi), Ətraf Mühit və Ekologiya Kolleci, Xiamen Universiteti, Xiamen, Çin

Həyat Elmləri Məktəbi/Dövlət Əsas Bionəzarət Laboratoriyası, Sun Yat-sen Universiteti, Quançjou, Çin

Fizioloji Müxtəliflik Departamenti, Helmholtz Ətraf Mühitin Tədqiqatları Mərkəzi (UFZ), Leypsiq, Almaniya

Alman İnteqrativ Biomüxtəliflik Araşdırma Mərkəzi (iDiv) Halle—Jena—Leypsiq, Leypsiq, Almaniya

Adam Thomas Clark və Helge Bruelheide

Martin Lüter Universiteti Halle-Vittenberq, Halle (Saale), Almaniya

Bitki örtüyü və ətraf mühitin dəyişməsi üzrə dövlət əsas laboratoriyası, Botanika İnstitutu, Çin Elmlər Akademiyası, Pekin, Çin

Coğrafiya fakültəsi, Sürix Universiteti, Sürix, İsveçrə

Ekologiya İnstitutu, Şəhər və Ətraf Mühit Elmləri Kolleci, Pekin Universiteti, Pekin, Çin

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Töhfələr

Y.C. və B.S. tədqiqatı düşündü. Y.C. və A.T.C. analitik proseduru işləyib hazırlamışdır. Y.C. analizləri Y.H. və B.S. H.B., N.C.-İ., Y.C., K.M., Y.H., P.A.N. və B.S. məlumatların toplanmasına töhfə verdi. Bütün müəlliflər təhlil nəticələrini müzakirə etdilər və məqaləni yazmağa kömək etdilər.

Müəllif


Müzakirə

Bioloji sistemlərin nanoölçülü strukturunun funksiya ilə necə əlaqəli olduğunu başa düşmək çətin və davamlı bir axtarışdır. Bir çətinlik ondan ibarətdir ki, yalnız bir neçə zond bu miqyasda strukturu birbaşa sorğulaya bilir: elektronlar, rentgen şüaları və neytronlar. Elektronlar hüceyrə biologiyasında ən geniş tətbiqdən həzz aldılar və EM hüceyrə ultrastrukturunu öyrənmək üçün yeganə ən güclü vasitə olaraq qalır. ilə bağlı B. subtilis membran, bölmələrə bölünmüş, dondurularaq əvəzlənmiş hüceyrələrin kriyo-EM tədqiqatı hüceyrə divarı da daxil olmaqla hüceyrə arxitekturasının heyrətamiz mənzərəsini təqdim etdi.[56] Bununla belə, plazma membranının strukturu yaxşı müəyyən edilməmişdir və onun qalınlığı 66 ± 8 Å, təəccüblü dərəcədə böyük bir dəyər olaraq qiymətləndirilmişdir. Nəticələrimiz fizioloji şəraitdə əldə edilən yüksək rezolyusiyaya malik hidrofobik qalınlığın təyinini təmin etməklə hüceyrə zərfinin bu EM şəklini tamamlayır.

Rentgen şüaları və neytronların səpilməsi müəyyən edilmiş lipid qarışıqlarından[3-5,28,29,46] və ya təbii lipid ekstraktlarından ibarət model membranların strukturunu öyrənmək üçün geniş şəkildə istifadə edilmişdir.[6-12] X-şüalarının səpilməsi də olmuşdur. Bu yaxınlarda hüceyrə membranlarının ex vivo tədqiqi üçün istifadə edilmişdir, lakin onun bütöv hüceyrələrə tətbiqi sudan və biomolekullardan fon səpilməsi məsələsi ilə qarışıqdır. Neytron səpilməsi izotopik kontrast dəyişkənliyi şəklində fon probleminin həllini unikal şəkildə təmin edir. Biz burada göstərdik ki, metabolik etiketləmə vasitəsilə in vivo kontrast dəyişkənliyi mürəkkəb hüceyrə mühitindən səpilməni effektiv şəkildə yatıra bilər, eyni zamanda maraq doğuran spesifik xüsusiyyətləri vurğulayır, hətta onlar lipidlər kimi kiçik komponentlərdən (hüceyrə yaş kütləsinin təxminən 1%-i) yarandıqda belə. Bundan əlavə, səpilmə təcrübələri üçün istifadə edilən soyuq neytronlar yüksək enerjili rentgen və elektron şüalarından (>5000) fərqli olaraq, aşağı kinetik enerjisi (

Neytronların in vivo səpilməsinin əvvəlki tətbiqləri yalnız xarici həlledici kontrastına əsaslanırdı ki, bu da bəzi hallarda tilakoid membranlardakı[57,58] və mitoxondrilərdəki təkrar strukturlardan Braqq səpilməsini müşahidə etmək üçün kifayət edirdi.[59] Bu tədqiqatlar özlüyündə membran quruluşunu aşkar etməmişdir, lakin sıx şəkildə yığılmış membranların düzülüşü haqqında məlumat vermişdir. Daxili kontrast yaratmaqla, yəni spesifik hüceyrə komponentlərini differensial şəkildə etiketləməklə biz ilk dəfə olaraq bir membranda yüksək rezolyusiyaya malik ultrastruktur ölçmələrə imkan verdik. Bu işdə biz selektiv daxili kontrast yaratmaq üçün kimyəvi-biologiyaya əsaslanan yanaşmanın gücünü nümayiş etdirdik və bununla da in vivo membran qalınlığının yüksək dəqiqliklə ölçülməsinə imkan verdik.

Bizim in vivo kontrastlı variasiya yanaşmamız həm də canlı hüceyrələrdə yanal membran quruluşunu öyrənmək üçün yeni alət təqdim edir. Neytron əsaslı struktur metodlar fərqli üstünlüklər təklif edir ki, onlar modellərə və ya xarici zondlara ehtiyac olmadan nanoskopik lipid strukturu haqqında birbaşa məlumat verirlər. Plazma membranı daxilində qeyri-bərabər qarışmanın göstəriciləri[60,61] 1972-ci ildə təklif edilən əlamətdar maye-mozaika modeli ilə eyni vaxtda ortaya çıxdı,[16] membran domenləri anlayışı 1970-ci illərin ortalarında yaxşı quruldu,[62] və lipid sal. hipotez 1997-ci ildə rəsmiləşdirilmişdir.[21] Buna baxmayaraq, lipid domenlərinin mövcudluğu mübahisəli olaraq qalır[63] və onların həm keçici, həm də işığın difraksiya həddindən (200 nm) kiçik olduğuna inanıldığı üçün onlar adi mikroskopik üsullarla müşahidədən yayındılar. Lakin bu yaxınlarda, siçovulların böyrək epitel hüceyrələrinin plazma membranında 20 nm miqyasda diffuziya ilə məhdudlaşan adaları müəyyən etmək üçün ultra rezolyusiyaya malik flüoresan mikroskopiyadan istifadə edilmişdir.[6] Plazma membranında müqayisə edilə bilən miqyasda lipid seqreqasiyasını müşahidəmiz B. subtilis bakteriyalarda analoji lipid domenlərinin mövcudluğu ilə uyğundur və nanoskopik lipid birləşmələrinin bioloji membranların ayrılmaz xüsusiyyəti olması fikrini dəstəkləyir.

Yüksək rezolyusiyaya malik neytron səpilmə üsullarının in vivo tətbiqinə mane olan kritik maneə daxili kontrast yaratmaq üçün vasitənin olmaması idi. Bu işdə biz baryeri keçdik və bunu göstərdik B. subtilis neytron kontrastının dəyişməsi strategiyalarının tətbiqi üçün ideal in vivo model sistemidir. Xüsusi böyümə şərtləri və seçilmiş genotiplər vasitəsilə biz qlobal olaraq hüceyrə kontrastı zəiflədə bildik və kontrastı membrana dəqiq şəkildə yenidən daxil edə bildik. Membran lipidlərinin həm kimyəvi, həm də izotopik xüsusiyyətlərini idarə etmək qabiliyyəti ilə biz həm eninə, həm də yanal membran quruluşunu sorğulaya bildik. Selektiv kontrasta eyni ümumi yanaşma potensial olaraq membran arenasından kənar tətbiqlər üçün digər biomolekullara və model orqanizmlərə də şamil edilə bilər. Daha dərhal, in vivo eksperimental platforma plazma membranının müxtəlif fiziki, kimyəvi, genetik və ətraf mühit stimullarına reaksiyasını araşdırmaq üçün istifadə edilə bilər. Biz gözləyirik ki, bu qabiliyyət antibiotiklərin inkişafı, bioyanacaq istehsalı, membran zülalının funksiyası və qoruyucu, uyğunlaşa bilən, çoxfunksiyalı interfeys yaratmaqda membran, sitoskelet və hüceyrə divarı arasındakı qarşılıqlı əlaqəni başa düşmək kimi bir çox sahələrdə dəyərli olacaq.


LB Media

LB rekombinant yetişdirmək üçün istifadə edilən ən çox yayılmış mühitdir Escherichia coli (E. coli). LB mediası Cüzeppe Bertani tərəfindən lizogenez üzərində apardığı araşdırmaya görə “lizogen bulyon” adlandırılmışdır. LB adətən səhv olaraq Luria-Bertani mediasına, Luria Broth və ya Lennox Broth-a istinad edilir. LB media, həmçinin bir sıra digər fakültativ orqanizmlərin yetişdirilməsi üçün istifadə olunur.

LB Media komponentləri

LB-nin tez-tez istifadə edilməsinin bir səbəbi, yalnız bir neçə inqrediyent, tripton, maya ekstraktı və natrium xlorid (NaCl) ilə hazırlanmasının sadə olmasıdır. Tripton, kazeinin mədəaltı vəzi fermenti tripsin ilə həzm edilməsi nəticəsində yaranan peptidlərin qarışığı azot və karbon təmin edir. Maya ekstraktı vitaminlər (o cümlədən B vitaminləri) və bəzi iz elementləri təmin edir. NaCl nəqliyyat və osmotik tarazlıq üçün natrium ionlarını təmin edir. E. coli Ən çox istifadə edilən valideyn suşlarından biri olan K-12 ştammından əldə edilmişdir E. coli Bu gün molekulyar biologiyada istifadə edilən B vitamini istehsalında əskiklik var.

LB-nin tarixi fonu

LB, 1950-ci illərdən Enterobacteriaceae yetişdirmək və bakteriofaq lövhə analizləri üçün istifadə edilən qida baxımından zəngin bir mühitdir. LB bir çox növ üçün yaxşı böyümə məhsuldarlığı ilə sürətli böyüməyə imkan verir. 1951-ci ildə Cüzeppe Bertani a.də lövhə əmələ gəlməsini optimallaşdırmaq üçün LB inkişaf etdirdi Şigella Enterobacteriaceae-nin göstərici ştammı. Bu gün LB mediası rekombinant suşlarının böyüməsi üçün ən çox yayılmış mediadır E. coli. LB-nin üç ümumi formulası var: LB Miller, LB Lennox və LB Luria. LB Miller formulası LB-nin ümumi və ya daha çox standart formulası olsa da, hamısına bəzən LB deyilir. LB-nin alternativ formulaları NaCl konsentrasiyasında dəyişir (Cədvəl 1).

Cədvəl 1. LB-nin formulaları.

Tərkibi % Luriya (q/L) Lennox (q/l) Miller (q/L)
Tripton 1.0% 10 10 10
Maya ekstraktı 0.5% 5 5 5
Natrium xlorid (NaCl) 0,05, 0,5 və ya 1,0% 0.5 5 10

LB adı ilə bağlı çaşqınlıq Bertani, Luria və Lennoks tarixini nəzərə alaraq başa düşüləndir. Cüzeppe Bertani LB mediasını tərtib edərkən İndiana Universitetində Luria laboratoriyasının üzvü idi. Ed Lennoks həm də Luria laboratoriyasının üzvü idi və Bertani ilə bəzi erkən lizogeniya təcrübələri üzərində işləmişdir. Şigella. Salvador Luria 1955-ci ildə Bertaninin orijinal formulunu köçürdüyü bir məqalə nəşr etdi və LB bəzən elmi boyuna görə səhv olaraq Luriyaya aid edilir və buna görə də səhv olaraq Luria Bulyonu olaraq adlandırıla bilər. Orijinal Bertani formulası 1.0% Bacto tripton (10.0 q/L), 0.5% maya ekstraktı (5.0 q/L), 1.0% NaCl (10.0 q/L), 0.1% qlükoza (1.0 q/L) pH 7.0-ə uyğunlaşdırılmışdır. 1 N NaOH ilə. Avtoklavdan sonra qlükoza əlavə edildi. Vaxt keçdikcə qlükoza əlavə edilməsi LB-nin bütün formulalarından çıxdı. Miller adı kitabdakı ifadədən gəlir Molekulyar Biologiyada Təcrübələr Jeffery Miller tərəfindən 1972-ci ildə nəşr edilmiş, tərkibində qlükoza yoxdur. LB-nin orijinal və ən çox yayılmış formulası Miller, 1,0% NaCl ehtiva edir. 1955-ci ildə Ed Lennoks suşlarından istifadə edərək DNT sintezi mexanizmlərini öyrənirdi. E. coli osmotik stresə həssas olan, orijinal formulanın yarısının duzunu, yəni 0,5% NaCl ehtiva edən LB formulasını hazırladı. Bu formula LB Lennox adlanır. Bu gün LB Lennox becərilməsi üçün istifadə olunur E. coli Blasticidin, Puromycin və Zeocin kimi duza həssas antibiotiklərdən istifadə edərkən. Tərkibində ən az duz olan LB-nin üçüncü formuluna LB Luria deyilir. Bu formulanın tərkibində 0,05% NaCl var. LB Luria kimi dəniz orqanizmlərini təcrid etmək üçün istifadə olunur Vibrio vəba.

LB-də böyümə mexanizmləri

LB media əvvəlcə aşağı sıxlıqda bakteriyaların böyüməsi üçün nəzərdə tutulmuşdur. Eksponensial artımın, sabit vəziyyətli böyümə dövrünün, OD olduqda sona çatacağı təxmin edilir600 (600 nm-də optik sıxlıq) 0,6 ilə 1,0 arasındadır. artımı məlumdur E. coli LB-də OD adətən dayanır600 normal böyümə şəraitində təxminən 2,0-a çatır, təxminən 0,6 mq-a uyğundur E. coli (quru çəki) mL başına. 2007-ci ildə D'Ari və həmkarları LB-nin fiziologiyasına xüsusi olaraq baxaraq, böyümə xüsusiyyətlərinin hərtərəfli öyrənilməsini həyata keçirdilər. E. coli K-12, bu gün molekulyar biologiyada istifadə edilən ən çox yayılmış suşlardan biridir. Onlar K-12 hüceyrələrinin son OD ilə LB Millerdə böyüdüyünü nümayiş etdirdilər600 0,6-1,0 həmişə eyni fizioloji vəziyyətdə olmur. D'Ari və iş yoldaşları LB-də diauxik artımın (iki mərhələdə artım) əvvəlki müşahidələrini təsdiqlədilər və eksponensial artımın 2009-cu ildə dayandırıldığını qeyd etdilər.

OD600 0.3, ümumi hesab ediləndən xeyli əvvəl. Məlumdur ki E. coli məlumdur ki, pH 9.0-dan çox olduqda zəif inkişaf olur və LB mediasının 9.0-a yaxın pH-a dəyişməsi qeyri-adi deyil. Bununla belə, D'Ari və iş yoldaşları LB-nin pH səviyyəsini tənzimlədikdə böyümə əyrisinə heç bir təsir göstərmədi, halbuki mediaya qlükoza əlavə edildikdə, mədəniyyətlər OD-yə qədər böyüyə bilərdi.600 6.49. Bu, artımın olduğunu göstərir E. coli LB-də karbon məhduddur. Qeyd edildiyi kimi, Bertani tərəfindən LB-nin orijinal formulunda 0,1% qlükoza var idi. Bu araşdırma göstərir ki, LB müntəzəm böyümə üçün yaxşı bir mühit olsa da, təkrarlanma qabiliyyəti və uzun eksponensial böyümə dövrü tələb olunan fizioloji tədqiqatlar üçün istifadə edilməməlidir.

LB və Seçim

Orqanizmlərin populyasiyasının identifikasiyası və ya seçilməsi üçün LB mühitinə əlavə edilə bilən bir sıra əlavələr var. Bir və ya daha çox antibiotikə qarşı müqavimət göstərmək üçün hazırlanmış hüceyrələri seçmək üçün tez-tez LB mühitinə antibiotiklər əlavə edilir. X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-qalaktopiranosid) və ya Bluo-Gal (halogenləşdirilmiş indolil-β-qalaktozid) ardıcıllığın daxil edilməsi üçün mavi-ağ tarama üçün LB mühitinə əlavə edilə bilər. β-qalaktosidaza geninin α fraqmentini ehtiva edən plazmiddə çoxlu klonlama yeri (MCS). Lak promotoru tərəfindən idarə olunan genlərin ifadəsini stimullaşdırmaq üçün mühitə metabolizə olunmayan laktoza analoq IPTG (izopropil-beta-D-tioqalaktopiranozid) əlavə edilir. Plazmid MCS-ə daxil edilmiş ardıcıllığın olmadığı bakteriyalarda X-Gal və ya Bluo-Gal 5-bromo-4-xloro-indoksil yaratmaq üçün β-qalaktosidaza ilə parçalanacağından, MCS koloniyaları mavi olacaq. Yerləşdirmə olan plazmidlər üçün funksional β-qalaktosidaza olmayacaq və koloniyalar ağ qalacaq.


İnvaziv qarışqa tərəfindən mutualizmin pozulması təməl Şərqi Afrika qarışqa bitkisi üçün karbon fiksasiyasını azaldır

İnvaziv qarışqalar yerli növlərin birləşmələrini və qarşılıqlı əlaqəsini formalaşdırır, lakin onların fundamental ekoloji proseslərə təsiri zəif başa düşülür. Şərqi Afrikada, Pheidole megacephala qarışqalar qarışqa ağacının monodominant dayaqlarını işğal ediblər Akasiya drepanolobium, yerli qarışqa müdafiəçilərini məhv etmək və ağacları onurğalı ot yeyən heyvanlar tərəfindən örtüyə zərər vermək üçün həssas edir. İnvaziv qarışqaların və böyük ot yeyənlərin birbaşa və interaktiv təsirlərini ölçmək üçün təcrübə və müşahidələrdən istifadə etdik. A. drepanolobium 2 il ərzində fotosintez. ≥ 5 il ərzində işğal olunmuş ağaclar, yarpaq və örtük səviyyəsində fotosintezin azalmasına səbəb olan invaziv qarışqalar və onurğalı otyeyənlər arasında qarşılıqlı təsir nəticəsində əsas vegetasiya mövsümlərində 69% daha az bütün ağac fotosintezi nümayiş etdirdi. Biz həmçinin işğaldan qısa müddət əvvəl və sonra ağacları araşdırdıq və gördük ki, son işğal yarpaq fiziologiyasında yalnız kiçik dəyişikliklərə səbəb oldu. Fərdi ağaclardan əldə etdiyimiz nəticələr, ehtimal ki, böyüyərək invaziv növlərin ekosistem səviyyəsində karbon fiksasiyasını və digər biogeokimyəvi dövrləri dəyişdirmək potensialını vurğulayır.


Bu müəlliflər bərabər töhfə verdilər: Fernanda Pinheiro, Omar Warsi.

Əlaqələr

Bioloji Fizika İnstitutu, Köln Universiteti, Köln, Almaniya

Fernanda Pinheiro və Michael Lässig

Uppsala Universiteti, Uppsala, İsveç, Tibbi Biokimya və Mikrobiologiya Departamenti

Ömər Varsi və Dan I. Andersson

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Töhfələr

Bütün müəlliflər təhqiqatda, orijinal layihənin yazılmasında, yekun əlyazmanın nəzərdən keçirilməsində və redaktəsində iştirak etmişlər.

Müvafiq müəlliflər


Təşəkkürlər

Oksigen qəbulu təcrübələrində köməyə görə J.R.Luque-Orteqaya təşəkkür edirik. Əlyazmanı tənqidi oxuduqlarına görə M. Abrahams, M. Mo və S. Burning-ə təşəkkür edirik. JN San Dieqoda qaldığınız müddətdə göstərdiyiniz köməyə görə T. Konrada, metabolik rekonstruksiya zamanı dəyərli kömək və təkliflərinə görə E. Diaz və M.A. Prietoya minnətdardır. JN, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) tərəfindən I3P predoctoral Təqaüdün alıcılarıdır və JN San Dieqoda qalması qısamüddətli I3P təqaüdü ilə dəstəkləndi.


Videoya baxın: Реакция друга на новый нож (BiləR 2022).