Məlumat

Ev Tapşırığı Problemləri - Ədəbiyyatın Öyrənilməsi Modulu: CRISPR/Cas 9 KEY - Biologiya

Ev Tapşırığı Problemləri - Ədəbiyyatın Öyrənilməsi Modulu: CRISPR/Cas 9 KEY - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

araşdırma kağızı: Cas9 RNT ilə idarə olunan Endonukleazın İki Nukleaz Sahəsi ilə Yer Seçimini Kəsdirin. Hongfan Chen, Jihoon Choi və Scott Bailey. The Journal of Biological Chemistry, 289, 13284-13294 (2014)

Ümumi məlumat və baxış

Çox müxtəlif orqanizmlərdə genom manipulyasiyası və tənzimlənməsi üçün perspektivli vasitə bu yaxınlarda CRISPR-Cas sisteminin (müntəzəm aralıqlı qısa palindromik təkrar – CRISPR ilə əlaqəli) RNT ilə idarə olunan DNT endonükleaz fəaliyyətində müəyyən edilmişdir. İrsi prokaryotik immun sistemi olan CRISPR-Cas, RNT-nin idarə etdiyi hədəf susdurulması vasitəsilə bakteriyaları və arxeyləri mobil genetik elementlərdən qoruyur. CRISPR-Cas sistemləri dəyişən işğalçıdan əldə edilən ardıcıllıqlar (aralıqlar) və cas operonu ilə kəsişən qısa birbaşa təkrarlar massivindən ibarətdir. İşğal zamanı faj və ya plazmidlərdən (protospacers) işğalçı DNT-nin kiçik fraqmentləri ana CRISPR lokuslarına daxil edilir, transkripsiya edilir və kiçik CRISPR RNT-lərini (crRNA) yaratmaq üçün işlənir. İşğalçı nuklein turşusu daha sonra crRNA-lar tərəfindən idarə olunan Cas zülalları tərəfindən tanınır və susdurulur. Üç növ CRISPR-Cas sisteminin hər biri bir imza geninin olması ilə xarakterizə olunur.

Proqramlaşdırılmış DNT parçalanması II tip CRISPR-Cas sistemində ən az komponent tələb edir, yalnız crRNA, trans-aktivləşdirici crRNA (tracrRNA) və II tip sistemin imza geni olan Cas9 endonükleazı tələb edir. Yetkin crRNA və tracrRNA-nı tək bələdçi RNT-yə (sgRNA) birləşdirərək sistem daha da sadələşdirilə bilər. Hədəf parçalanmasındakı rolundan əlavə, tracrRNA həm də ilkin crRNA transkriptləri ilə RNT hibridləri yaratmaqla crRNA olgunlaşmasına vasitəçilik edir və hər iki RNT-nin endogen RNase III tərəfindən birgə emalına gətirib çıxarır. Cas9, birlikdə hədəf DNT-də cüt zəncirli (ds) qırılması yaradan iki nukleaza domenini ehtiva edir. HNH nukleaz domeni tamamlayıcı zəncirini, RuvC kimi nukleaz domeni isə tamamlayıcı olmayan ipi parçalayır.

Protospacer bitişik motivi (PAM) adlı qısa imza ardıcıllığı I və II tip CRISPR-Cas sistemləri tərəfindən hədəf alınan işğalçı DNT üçün xarakterikdir. PAM iki funksiyanı yerinə yetirir. Bu, yeni boşluq ardıcıllığının əldə edilməsi ilə əlaqələndirilmişdir və bu, hədəf DNT-nin sonrakı tanınması və susdurulması üçün lazımdır. PAM-ın ardıcıllığı, uzunluğu və mövqeyi CRISPR-Cas növündən və orqanizmindən asılı olaraq dəyişir. II tip sistemlərdən olan PAM-lar protospacerin aşağı axınında yerləşir və 2-5 bp qorunmuş ardıcıllığı ehtiva edir. 4 bp-ə qədər dəyişən ardıcıllıq PAM-ın qorunan ardıcıllığını protospacerdən ayırır. Bu dəyişən bölgə çox vaxt PAM ardıcıllığının tərifinə daxil edilir, lakin sadəlik üçün biz bu dəyişən bölgəyə bağlayıcı, qorunan ardıcıllığa isə PAM kimi istinad edirik. Bu günə qədər Streptococcus pyogenes-dən Cas9, Streptococcus thermophilus DGCC7710-dan Cas9 və Neisseria meningitidis-dən Cas9 genomun redaktəsi və ya tənzimlənməsi üçün alətlər kimi istifadə edilmişdir. Bu Cas9 orfoloqları üçün PAM-lar GG, GGNG və GATT, əlaqələndiricilər isə müvafiq olaraq 1, 1 və 4 bp-dir.

sgRNA dizaynının sadəliyi və ardıcıllıqla xüsusi hədəfləmə o deməkdir ki, RNT ilə idarə olunan Cas9 mexanizmi proqramlaşdırıla bilən genom mühəndisliyi üçün böyük potensiala malikdir. Cas9, dsDNA fasilələri təqdim edərək hüceyrələrdə mutasiyalar yaratmaq üçün istifadə edilə bilər. Cas9-un imkanları nikaza (iki nukleaz domenindən birinin təsirsizləşdirilməsi ilə yaradılan) və ya nukleaz null variantları ilə transkripsiyanın repressiyası və ya aktivləşdirilməsi kimi müxtəlif genom mühəndisliyi məqsədləri üçün genişləndirilə bilər. Cas9 sistemi üçün başqa bir cazibədar imkan, bir çox hədəf saytlara, məsələn, bir genin transkripsiya repressiyası, digərinin aktivləşdirilməsi kimi müxtəlif Cas9 vasitəçiliyi ilə fəaliyyətləri hədəfləməkdir. Buna nail olmaq üçün birdən çox Cas9 orfoloqundan istifadə edilməlidir, çünki tək bir orfoloq eyni vaxtda birdən çox saytda müxtəlif fəaliyyətlərə vasitəçilik edə bilməz. Buna görə də Cas9 zülalları haqqında anlayışımızı genişləndirmək üçün biz LMG18311 Cas9 kimi istinad etdiyimiz S. thermophilus LMG18311-dən Cas9 ortoloqunu xarakterizə etdik.


Suallar:

1. Tədqiqatçılar S. thermophilus LMG18311-in II tip CRISPR-Cas sistemini tədqiq ediblər.

a. Şəkil A, Cas9, Cas9 D9A, Cas9 D9A, D599A və Cas9 D9A, D599A-nın Coomassie Mavi ləkəli SDS-poliakrilamid gelini göstərir, burada D aspartik turşudur, A isə alanindir və D#A D-nin dəyişdirildiyi xüsusi mutasiya yerini əks etdirir. A. Nə üçün onlar bu təcrübəni həyata keçirdilər?

Cavab: mutantların eyni molekulyar çəkiyə malik olduğunu və denaturasiya gel elektroforezində oxşar davrandıqlarını yoxlamaq üçün.

b. LMG18311 Cas9 üçün PAM ardıcıllığını təsdiqləmək üçün müəlliflər CRISPR-1-dən 33 spacer ardıcıllığından hər hansı birinə uyğun gələn viral və plazmid genomlarında potensial protospacerləri müəyyən etmək üçün BLAST axtarışları həyata keçirdilər. Bu axtarış S. thermophilusa yoluxduğu məlum olan bakteriofaqların genomlarından 41 unikal hədəf ardıcıllığı yaratdı. Daha sonra 30-nukleotid protospacer və 10-nukleotid yan bölgələri daxil olmaqla, müəyyən edilmiş hədəf genomlardan 50-nükleotid seqmentlərini uyğunlaşdırdıq. Şəkil b, LMG18311 Cas9 üçün PAM-ı göstərən B, loqo planını göstərir. Protospacer, PAM və linkerin mövqeləri göstərilir.

PAM ardıcıllığının ən çox ehtimal olunan konsensus ardıcıllığı hansıdır? Protospacerdən nə qədər uzaqdır:

Cavab: GYAAA, dəyişməz olaraq 2 bp məsafədə yerləşir.

c. Şəkil C-də CRISPR nuklein turşusu komplekslərinin sxematik təsviri göstərilir. Hədəf DNT, crRNA, tracrRNA,, protospacer, PAM və bağlayıcını etiketləyin. Həm crRNA, həm də tracRNA-dan ibarət tək bələdçi RNT yaratmaq istəyirsinizsə, RNT-nin birləşdirici parçasını çəkin. Bu şəkildəki xüsusi PAM ardıcıllığı nədir.

Cavab verin

41 hədəf ardıcıllığından 7-də tapılan ən çox müşahidə edilən PAM ardıcıllığı GCAAA idi.

2. Müəyyən edilmiş PAM-ın funksional olduğunu təsdiqləmək üçün müstəntiqlərə seçim sistemi lazım idi. Onlar ekzogen tip II CRISPR-Cas sistemini ehtiva edən E. coli hüceyrələrinin plazmid transformasiyasına davamlı olduğu, sistemə malik olmayan hüceyrələrin transformasiya üçün səriştəli olduğu bir transformasiya analizindən istifadə etdilər. Xüsusi PAM-ın işlək olub olmadığını müəyyən etmək üçün bu sistemin necə istifadə oluna biləcəyini izah edin?

Cavab: Əlavə edilmiş CRISRP-Cas sistemi olan E.Coli hüceyrələri hüceyrə tərəfindən alınan istənilən plazmid DNT-ni parçalaya bilməlidir, çünki plazmid DNT faj DNT-si kimi “hədəf” rolunu oynayacaqdır. Ekzogen CRISRP-Cas sistemi olmayan hüceyrələr hüceyrə tərəfindən qəbul edilən plazmidi parçalaya bilmədi, bu da bütöv plazmidi olan hüceyrələrin plazmid tərəfindən gətirilən və ifadə edilən xüsusi genlər tərəfindən çevrilməsinə imkan verə bilər.

a. Şəkil A transformasiya analizinin sxematik təsvirini göstərir.

Hədəf plazmidində protospacer-1 (ardıcıllığı CRISPR-1-in ilk spacer ilə eyni idi), 2-bp birləşdiricisi və müəyyən edilmiş PAM var idi. Birinci nəzarət plazmidində yalnız protospacer-1, ikinci nəzarət plazmidində isə həm protospacer-1, həm də PAM yox idi. Hədəf və nəzarət plazmidləri sonra transformasiya edilmiş hüceyrələr üçün istifadə edilmişdir. IPTG və müvafiq antibiotiklərin iştirakı ilə.

Müstəntiqlər IPTG-ni niyə əlavə etdilər? Sol paneldəki hüceyrələrdə onların analizində sağ ilə müqayisədə hansı fərqi tapacağını gözləyirdiniz?

Cavab: Cas9 zülalının zülal ifadəsi CRISPR sisteminin funksiyası üçün lazımdır. Güman ki, zülal laktoza, allolaktoza və ya IPTG ilə ortaya çıxan lak promotorun nəzarəti altındadır. Funksional Cas9 zülalına və sgRNA-ya malik olan sol tərəfdəki hüceyrələr hüceyrə transformasiyasını təhrik edən plazmidi parçalaya biləcək və buna görə də transformasiya olunmayacaqlar.

b. Şəkil 2B E. coli hüceyrələrində LMG18311 Cas9 və sgRNA tərəfindən plazmid transformasiyasını göstərir. Transformasiya səmərəliliyi plazmid DNT-nin 5 ng-i üçün cfu ilə ifadə edilir. Ən azı üç bioloji təkrarın orta dəyərləri 1 S.D-ni təmsil edən xəta çubuqları ilə göstərilir. Nəticələri şərh edin və izah edin.

Cavab: Nəzarət plazmidləri eyni effektivliyə malik hər iki ştama çevrildi (Şəkil 2B). Hədəf plazmid CRISPR+ hüceyrələrinə çevrilə bilmədi, lakin CRISPR−-ə çevrildi. bu göstərir ki, Cas9 zülalının plazmidi parçalaması və transformasiyanı bloklaması üçün PAM ardıcıllığı funksiyası tələb olunur.

c. Şəkil C üçün müstəntiqlər CRISPR+ plazmidinin PAM ardıcıllığında tək nukleotid dəyişiklikləri etdi və plazmid transformasiyasının effektivliyinə təsirini öyrəndilər. Nəticələri şərh edin.

Cavab: . Yalnız 1-ci guanozin mövqeyində mutasiya olan plazmid (yəni protospacerə ən yaxın olan PAM nukleotidi) pozulmamış PAM ardıcıllığı ilə müqayisədə transformasiya effektivliyi azalmış (təxminən 66%) çevrilmişdir. Digər dörd mövqedən hər hansı birinə tək mutasiyaları olan plazmidlər transformasiyaya davamlı idi. Bu nəticələr göstərir ki, 1-ci mövqedəki guanozin PAM funksiyası üçün vacibdir, lakin ayrı-ayrılıqda digər dörd mövqe PAM funksiyasına az təsir göstərir.

d. Şəkil D üçün bağlayıcı uzunluğunun uzunluğunun plazmid transformasiyasının səmərəliliyinə təsiri öyrənilmişdir. PS protospacer ardıcıllığını bildirir. Nəticələri şərh edin.

CRISPR+ hüceyrələri 2 bp və ya 3 bp bağlayıcı uzunluğu olan plazmid hədəfi tərəfindən transformasiyaya eyni dərəcədə davamlı idi. Digər bağlayıcı uzunluqlu plazmidlər idarəetmə plazmidinə daha çox oxşar effektivliklə çevrildi və bu, bu bağlayıcıları olan plazmidlərin CRISPR-Cas susdurulmasından qaça bildiyini göstərir.

3. Sonra müstəntiqlər onların sistemini tədqiq etdilər in vitro komponentlərin yenidən qurulması ilə. Onlar aktivlik ölçüsü kimi LMG18311 Cas9 tərəfindən DNT parçalanmasını izlədilər.

a. Şəkil 3A 5 nm hədəf plazmid, 25 nm Cas9, 25 nm crRNA (CRISPR-1-in birinci ayırıcısından əldə edilən ardıcıllığı ehtiva edən 42-nukleotid crRNA), 25 nm (42-nukleotid) və tracr olan reaksiya qarışıqlarının elektroforez gelini göstərir. 10 mm Mg2+ 30 dəqiqə 37-də inkubasiya edilmişdiroC. Agaroz gelləri etidium bromidlə boyandı. Nəticələri şərh edin. Niyə xətti idarəetmə kəsilməmiş plazmiddən daha az miqrasiya edir?

Cavab: Plazmid hədəfinin parçalanması Cas9, tracrRNA, crRNA və Mg-nin iştirakı ilə baş verir.2+. Kəsilmiş plazmid superdolaqlı dairəvi plazmiddən daha böyük hidrodinamik radiusa malikdir.

b. Şəkil B-də ayrı-ayrı crRNA və tracrRNA molekulları üçün qohum sgRNA əvəz edilmişdir. Gel nəticələrini şərh edin.

Cavab: sgRNT tracrRNA və crRNA ilə əvəz olunduqda da parçalanma baş verdi.

c. Şəkil C-də onlar müxtəlif sgRNA ardıcıllıqlarının mövcudluğunda parçalanmağı öyrəndilər. Nəticələri izah edin.

Cavab: plazmid hədəfinin parçalanması sgRNA ardıcıllığı ilə diktə olunur.

d. Şəkil D üçün, Cas 9-un müxtəlif aktiv sahə mutantlarından istifadə edilmişdir. (D9A) mutant RuvC kimi domendə, H599A mutant isə HNH domenində idi Nəticələri izah edin. İkiqat mutantın fəaliyyətə hansı təsiri var?

Cavab: RuvC-yə bənzər domendə (D9A) və ya HNH domenində (H599A) aktiv sayt mutasiyaları olan Cas9 variantları plazmid hədəflərini vurdu, ikiqat mutasiyaya malik variant isə (D9A, H599A) heç bir fəaliyyət göstərmədi.

e. Şəkil E-də müəlliflər hədəf DNT-nin hər bir zəncirinin (bələdçi DNT-ni tamamlayan və ya tamamlayıcı olmayan zəncir) parçalanmasında hansı domenin iştirak etdiyini öyrəndilər. dsDNT tamamlayıcı zəncirinin (sol əl geli) və ya tamamlayıcı olmayan zəncirinin (sağ əl geli) 5′ ucunda radio ilə işarələnmişdir. Reaksiyalar A-da olduğu kimi aparıldı və məhsullar 10% denaturasiya edən PAGE ilə ayrıldı. Parçalanma yerləri sxematik diaqramda (aşağıda) oxlarla göstərilmişdir. 50 nt, 50 nukleotid; 37 nt, 37 nukleotid. Nəticələri şərh edin.

Cavab: Qısa oliqonukleotid substratlarından istifadə edərək parçalanma analizləri təsdiq etdi ki, HNH domeni (H599A) bələdçi RNT-yə tamamlayıcı zəncir parçalayır, halbuki RuvC kimi domen (D9A) tamamlayıcı olmayan ipi parçalayır. Kəsilmiş yerlərin yerinin xəritələşdirilməsi, digər Cas9 ortoloqlarında göründüyü kimi, hər iki ipin parçalanmasının protospacer daxilində, onun PAM proksimal ucundan 3 bp məsafədə baş verdiyini və küt ucluq dsDNA qırılması meydana gətirdiyini aşkar etdi.

f. PAM-dakı mutasiyalar və ya bağlayıcı uzunluğundakı dəyişikliklər DNT müdaxiləsinə eyni təsir göstərir in vitro etdikləri kimi in vivo? Tədqiqatçılar bu variant plazmidlərin rekombinant LMG18311 Cas9 tərəfindən parçalanmasını izlədilər. Şəkil F-dəki nəticələri şərh edin.

Cavab: Quanosinin 1-ci mövqedə mutasiyası ən böyük təsirə malik idi və PAM-ın digər dörd mövqeyinə fərdi mutasiyalar plazmid parçalanmasına yalnız təvazökar təsir göstərmişdir. Müxtəlif bağlayıcı uzunluqları olan plazmid hədəflərinin parçalanması 2 və ya 3 bp-də optimal idi və sonra artan və ya azalan uzunluqlarla davamlı olaraq azaldı.

g. Şəkil G-də göstərilən bağlayıcı uzunluqları ehtiva edən plazmid hədəflərinin parçalanması tədqiq edilmişdir. A–C və E–F-də mənfi superdolaqlı (nSC), xətti (L) və nicked və ya açıq dairə (OC) plazmidin mövqeləri göstərilir. Xətti nəzarət plazmid hədəfinin AgeI məhdudlaşdırıcı fermenti ilə həzm edilməsidir

Cavab: Müxtəlif bağlayıcı uzunluqlu plazmid hədəflərinin parçalanması 2 və ya 3 bp-də optimal idi və sonra uzunluqların artması və ya azalması ilə davamlı olaraq azaldı.

h. Mutasiya analizində onlar alanin əvəzinə asparatik turşu ilə əvəz etdilər. D və A-nın yan zəncirlərinin strukturlarını çəkin. Nə üçün onlar D-ni əvəz etmək üçün A-nı seçdilər? Yabanı tip zülalda katalizdə D hansı rola malik ola bilər?

Cavab:

Alaninin yan zənciri aspartik turşudan böyük deyil, böyük və hidrofobikdir ki, bu da yan zəncirlərin qablaşdırılmasına və buna görə də zülalın qatlanmasına potensial müdaxilə edə bilər ki, bu da ümumi şəkildə fermentin fəaliyyətinə təsir göstərə bilər. Vəhşi tipli zülalda aspartik turşu H bağının qarşılıqlı təsiri ilə substratın bağlanmasında iştirak edə bilər. Çox güman ki, hədəf zəncirinin parçalanmasının faktiki katalitik mexanizmində ümumi turşu/əsas rolunu oynayır.

4. Mg2+ ilə yanaşı digər ikivalentli kationların Cas9 tərəfindən DNT parçalanmasını aktivləşdirib-aktiv edə bilməsini qiymətləndirmək üçün müəlliflər aşağıdakı ikivalent kationlardan birinin iştirakı ilə plazmid parçalanma analizlərini həyata keçirdilər: Ca2+, Mn2+, Co2+, Ni2+, və Cu2+.

a. Şəkil A, heç bir metal və ya göstərilən metal ionlarının 1 mm-i olmadan Cas9 tərəfindən hədəf plazmidin parçalanmasını göstərir. Bütün reaksiyalar metal əlavə edilməzdən əvvəl 0,5 mm EDTA ilə işlənmişdir. Nəticələri şərh edin.

Cavab: Tərkibində Ca olan reaksiyalar2+ xətti plazmid əvəzinə nicked verdi, Ca2+ Cas9 nukleaz domenlərindən yalnız birini aktivləşdirir

b. Hansı domenin aktivləşdirildiyini müəyyən etmək üçün biz Ca ehtiva edən reaksiya tamponunda Cas9-un (D9A və ya H599A) tək aktiv sayt mutantlarını təhlil etdik.2+. Hər iki paneldə mənfi supercoiled (nSC), xətti (L) və nicked və ya açıq dairə (OC) plazmid mövqeləri göstərilir. Xətti nəzarət plazmid hədəfinin AgeI məhdudlaşdırıcı fermenti ilə həzm edilməsidir.

Cavab: HNH mutantında (H599A) kiçik parçalanma olub, lakin RuvC-yə bənzər mutant (D9A) ilə möhkəm parçalanma, HNH-nin RuvC kimi domeni deyil, Ca tərəfindən aktivləşdirildiyini göstərir.2+ .

5. PAM ardıcıllığının və bağlayıcı uzunluğunun LMG18311 Cas9-un DNT hədəflərinə bağlanmasına təsirini müəyyən etmək üçün müəlliflər yerli gel elektroforezindən istifadə edərək Cas9-sgRNA kompleksinin 5′ son etiketli dsDNA hədəflərinə bağlanma yaxınlığını (Kd) təyin etdilər.

a. Niyə SDS-ni gelə daxil etmədilər?

Cavab: SDS güclü denaturantdır və Cas9-u denatürasiya edib kompleksi ayırardı.

b. Mg varlığında Cas9-un (D9A, H599A) nukleaza çatışmazlığı mutantı ilə bağlanma təcrübələri aparılmışdır.2+. dsDNA hədəflərinin sabit konsentrasiyaları Cas9-sgRNA kompleksinin artan konsentrasiyası ilə inkubasiya edilmişdir. Niyə Cas9-un ikiqat mutantından istifadə etdilər?

Cavab: fermentin kompleksin aşkarlanmasına mane olan hədəf DNT-ni parçalamasının qarşısını almaq.

c. Aşağıdakı Şəkil A Cas9-sgRNA üçün təmsil olunan gel dəyişmə analizini və analizdən ölçülən bağlama əyrisini göstərir. Qrafikin təftişindən sonra qarşılıqlı təsir üçün təxmini Kd nə qədərdir? Üst paz Cas9-sgRNA-nın artan konsentrasiyasını göstərir.

Cavab: təqribən 2 nM Cas9-sgRNA (əyrinin yarım maksimal bağlanmasında liqand konsentrasiyası həqiqətən hiperboladır.

b. PAM mutasiyaları (qırmızı ilə işarələnmiş) olan DNT hədəfləri üçün Kd dəyərlərini göstərən bar qrafiki aşağıda göstərilmişdir (B) . Ən azı üç təkrardan orta dəyərlər göstərilir, xəta çubuqları 1 SD-ni təmsil edir. Bağlanmanın müşahidə olunmadığı hədəflər aşağı həddə (> 1000 nm) Kd dəyərləri ilə göstərilir. Nəticələri şərh edin.

Cavab: Tamamlayıcı protospacer, 2-bp əlaqələndiricisi və 0,94 � 0,27 nm yaxınlığı ilə Cas9-sgRNA ilə əlaqəli funksional PAM-dan ibarət hədəf. Tədqiqatçılar tamamlayıcı olmayan protospacer ehtiva edən hədəfə və ya PAM olmayan bir hədəfə bağlanmağı aşkar edə bilmədilər. PAM-ın 1-ci mövqeyində guanosinin mutasiyası təxminən 100 dəfə artımla nəticələndi. Kd, halbuki 2-dən 5-ə qədər mövqelərdəki mutasiyalar yaxınlığı əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirməmişdir (hamısı PAM konsensusunda təxminən 4 dəfə).

c. Sonra onlar bağlayıcı uzunluğunu və bağlanmasını araşdırdılar. Şəkil C, müxtəlif bağlayıcı uzunluqları (qırmızı ilə işarələnmiş) olan DNT hədəfləri üçün Kd dəyərlərini göstərən bar qrafikini göstərir (C). Nəticələri şərh edin.

Cavab: Bağlayıcı uzunluğundakı dəyişikliklər bağlama yaxınlığına daha çox təsir etdi. Test edilmiş şərtlər altında, 0, 4 və ya 5 bp (Kd > 1000 nm) birləşdirici uzunluqları olan plazmid hədəflərinə bağlanmağı aşkar edə bilmədik, halbuki 1 və 3 bp-lik bağlayıcılar yaxınlığı təxminən 400 və təxminən 20 dəfə azaldıb. , müvafiq olaraq.


İzahçı: CRISPR necə işləyir

Alimlər DNT-ni redaktə etmək üçün CRISPR/Cas9 adlı alətdən istifadə edirlər.

Bunu paylaşın:

Alimlər adətən bu sözü işlətməkdən çəkinirlər möcüzə. CRISPR adlı gen redaktə vasitəsi haqqında danışmırlarsa, yəni. Bəziləri "CRISPR ilə hər şeyi edə bilərsiniz" deyir. Digərləri bunu sadəcə heyrətamiz adlandırırlar.

Həqiqətən, bu, bir çox insanı heyran etdi və o qədər sürətlə ki, kəşf etdikdən cəmi səkkiz il sonra Cennifer Doudna və Emmanuelle Şarpentier 2020-ci il kimya üzrə Nobel Mükafatını aldılar.

CRISPR "klasterləşdirilmiş müntəzəm interspased qısa" deməkdir palindromik təkrar edir.” Bu təkrarlar bakteriyaların DNT-sində olur. Onlar əslində virusların kiçik hissələrinin surətləridir. Bakteriyalar onlardan pis virusları müəyyən etmək üçün stəkan çəkiliş kolleksiyaları kimi istifadə edirlər. Cas9 bir ferment DNT-ni parçalaya bilər. Bakteriyalar, kolleksiyada bir kupa vurulmuş virusları doğramaq üçün Cas9 fermentini göndərərək viruslarla mübarizə aparır. Alimlər bu yaxınlarda bakteriyaların bunu necə etdiyini anladılar. İndi laboratoriyada tədqiqatçılar mikrobun virusla mübarizə sistemini ən isti yeni laboratoriya alətinə çevirmək üçün oxşar yanaşmadan istifadə edirlər.

Bu CRISPR/Cas9 aləti ilk dəfə 2012 və 2013-cü illərdə təsvir edilmişdir. Dünyadakı elmi laboratoriyalar tezliklə ondan orqanizmin genomunu – onun DNT təlimatlarının bütün dəstini dəyişmək üçün istifadə etməyə başladılar.

Tərbiyəçilər və Valideynlər, Fırıldaq Vərəqinə Qeydiyyatdan Keçin

İstifadəyə kömək etmək üçün həftəlik yeniləmələr Tələbələr üçün Elm Xəbərləri öyrənmə mühitində

Bu alət istənilən bitki və ya heyvanda demək olar ki, istənilən geni tez və səmərəli şəkildə düzəldə bilər. Tədqiqatçılar artıq ondan heyvanlarda genetik xəstəlikləri düzəltmək, viruslarla mübarizə və ağcaqanadları sterilizasiya etmək üçün istifadə ediblər. Bundan əlavə, insan transplantasiyası üçün donuz orqanlarını hazırlamaq və beagle'lərin əzələlərini gücləndirmək üçün istifadə etdilər.

İndiyə qədər CRISPR-ın ən böyük təsiri əsas biologiya laboratoriyalarında hiss olunub. Bu ucuz gen redaktorundan istifadə etmək asandır. Bu, tədqiqatçılara həyatın əsas sirlərini kəşf etməyə imkan verdi. Və onlar bunu əvvəllər çətin, hətta qeyri-mümkün olan üsullarla edə bilərlər.

Robert Rid Nyu-Yorkun İthaka şəhərindəki Kornell Universitetində inkişaf bioloqudur. O, CRISPR-ni kompüter siçanına bənzədir. "Siz sadəcə onu genomdakı bir yerə yönəldə bilərsiniz və bu yerdə istədiyiniz hər şeyi edə bilərsiniz."

Əvvəlcə bu, DNT-nin kəsilməsini nəzərdə tutan hər şey demək idi. Orijinal formada CRISPR/Cas9 molekulyar qayçı (Cas9 fermenti) DNT-nin hədəf hissəsinə istiqamətləndirən təyinatlı cihazdır (CRISPR hissəsi). Birlikdə, onlar geni sıradan çıxaran və ya təmir edən və ya Cas9 qayçısının bəzi kəsiklər etdiyi yerə yeni bir şey daxil edən bir gen mühəndisliyi qanadlı raket kimi işləyirlər. CRISPR-in daha yeni versiyaları “baza redaktorları” adlanır. Bunlar genetik materialı kəsmədən bir-bir düzəldə bilər. Onlar qayçıdan daha çox qələmə bənzəyirlər.

Budur necə işləyir

Alimlər RNT ilə başlayırlar. Bu, DNT-dəki genetik məlumatları oxuya bilən bir molekuldur. RNT yerindəki yeri tapır nüvə bəzi redaktə fəaliyyətinin həyata keçirilməli olduğu xananın. (Nüvə genetik materialın böyük hissəsinin saxlandığı hüceyrədəki bölmədir.) Bu bələdçi RNT Cas9-u DNT-də kəsilmə tələb olunan dəqiq yerə aparır. Cas9 daha sonra cüt zəncirli DNT-yə bağlanır və onu açır.

Bu, bələdçi RNT-nin hədəf aldığı DNT-nin bəzi bölgəsi ilə cütləşməyə imkan verir. Cas9 bu nöqtədə DNT-ni kəsir. Bu, DNT molekulunun hər iki zəncirində qırılma yaradır. Hüceyrə problemi hiss edərək, fasiləni düzəldir.

Fasilənin düzəldilməsi geni sıradan çıxara bilər (ən asan iş). Alternativ olaraq, bu təmir bir səhvi düzəldə və ya hətta yeni bir gen daxil edə bilər (daha çətin bir proses).

Hüceyrələr, adətən, boş uclarını bir-birinə yapışdıraraq, DNT-lərindəki qırıqları düzəldirlər. Bu axmaq bir prosesdir. Çox vaxt bəzi geni sıradan çıxaran bir səhvlə nəticələnir. Bu faydalı görünməyə bilər - amma bəzən belədir.

Alimlər gen dəyişikliyi etmək üçün CRISPR/Cas9 ilə DNT-ni kəsdilər və ya mutasiyalar. Mutasiya olan və olmayan hüceyrələri müqayisə edərək, alimlər bəzən zülalın normal rolunun nə olduğunu anlaya bilirlər. Və ya yeni mutasiya onlara genetik xəstəlikləri anlamağa kömək edə bilər. CRISPR/Cas9 həmçinin müəyyən genləri - məsələn, irsi xəstəliklərdə rol oynayanları sıradan çıxararaq insan hüceyrələrində faydalı ola bilər.

"Orijinal Cas9 yalnız bir tətbiqi olan İsveçrə ordusu bıçağına bənzəyir: Bu, bıçaqdır" dedi Gene Yeo. O, Kaliforniya Universitetində, San Dieqoda RNT bioloqudur. Ancaq Yeo və başqaları digər zülalları və kimyəvi maddələri tutqun bıçaqlara bağladılar. Bu, bıçağı çoxfunksiyalı bir alətə çevirdi.

CRISPR/Cas9 və əlaqəli alətlər indi tək nukleotid bazasını - genetik koddakı tək hərfi dəyişdirmək və ya elm adamlarının izləmək istədiyi DNT-də bir nöqtəni işarələmək üçün flüoresan zülal əlavə etmək kimi yeni üsullarla istifadə edilə bilər. Alimlər həmçinin bu genetik kəsib-yapışdır texnologiyasından genləri açmaq və ya söndürmək üçün istifadə edə bilərlər.

CRISPR-dən istifadə etməyin yeni yollarının bu partlayışı hələ bitməyib. Feng Zhang Kembricdəki Massaçusets Texnologiya İnstitutunda molekulyar bioloqdur. O, Cas9 qayçısını istifadə edən ilk alimlərdən biri idi. "Sahə çox sürətlə inkişaf edir" deyir. "Nə qədər irəli getdiyimizə baxsaq... Düşünürəm ki, növbəti bir neçə ildə görəcəyimiz şeylər sadəcə heyrətamiz olacaq."

Bu hekayə 8 oktyabr 2020-ci ildə Nobel komitəsinin CRISPR-in kəşfinə kimya üzrə 2020 mükafatı vermək qərarını qeyd etmək üçün yeniləndi.

Güclü Sözlər

tətbiq Bir şeyin xüsusi istifadəsi və ya funksiyası.

əsas (genetikada) Nukleobaz termininin qısaldılmış versiyası. Bu əsaslar DNT və RNT molekullarının tikinti bloklarıdır.

biologiya Canlıların öyrənilməsi. Onları tədqiq edən alimlər kimi tanınırlar bioloqlar.

Cas9 Genetiklərin indi genləri redaktə etmək üçün istifadə etdiyi bir ferment. O, DNT-ni kəsərək qırılmış genləri düzəltməyə, yenilərini birləşdirmək və ya müəyyən genləri sıradan çıxarmağa imkan verir. Cas9, genetik bələdçilərin bir növü olan CRISPR-lər tərəfindən kəsiklər etməli olduğu yerə sürülür. Cas9 fermenti bakteriyalardan gəldi. Viruslar bir bakteriyaya daxil olduqda, bu ferment mikrobların DNT-sini parçalaya bilər və onu zərərsiz edir.

hüceyrə Orqanizmin ən kiçik struktur və funksional vahidi. Tipik olaraq çılpaq gözlə görmək üçün çox kiçikdir, membran və ya divarla əhatə olunmuş sulu mayedən ibarətdir. Heyvanlar ölçülərindən asılı olaraq minlərlə hüceyrədən trilyonlara qədər hüceyrədən ibarətdir. Mayalar, kiflər, bakteriyalar və bəzi yosunlar kimi bəzi orqanizmlər yalnız bir hüceyrədən ibarətdir.

kimyəvi Sabit nisbətdə və quruluşda birləşən (bir-birinə bağlanan) iki və ya daha çox atomdan əmələ gələn maddə. Məsələn, su bir oksigen atomuna bağlanmış iki hidrogen atomundan ibarət kimyəvi maddədir. Onun kimyəvi simvolu H2O-dur.

CRISPR İxtisar - "crisper" kimi tələffüz olunur - "klasterləşdirilmiş müntəzəm aralıqlı qısa palindromik təkrarlar" termini üçün. Bunlar məlumat daşıyan bir molekul olan RNT parçalarıdır. Onlar bakteriyaları yoluxduran virusların genetik materialından kopyalanır. Bir bakteriya əvvəllər məruz qaldığı virusla qarşılaşdıqda, həmin virusun genetik məlumatını ehtiva edən CRISPR-ın RNT nüsxəsini istehsal edir. Daha sonra RNT virusu parçalamaq və onu zərərsiz etmək üçün Cas9 adlı bir fermentə rəhbərlik edir. Alimlər indi CRISPR RNT-lərinin öz versiyalarını qururlar. Laboratoriyada hazırlanmış bu RNT-lər fermenti digər orqanizmlərdə xüsusi genləri kəsmək üçün istiqamətləndirir. Elm adamları onlardan, genetik qayçı kimi, spesifik genləri redaktə etmək və ya dəyişdirmək üçün istifadə edirlər ki, sonra genin necə işlədiyini öyrənə, pozulmuş genlərə ziyan vura, yeni genlər daxil edə və ya zərərli olanları sıradan çıxara bilsinlər.

inkişaf etdirici (biologiyada) Bir orqanizmin konsepsiyadan yetkinliyə qədər məruz qaldığı dəyişikliklərə aid olan sifət. Bu dəyişikliklər tez-tez kimya, ölçü və bəzən hətta forma daxildir.

DNT (dezoksiribonuklein turşusunun qısaltması) Genetik təlimatları daşıyan əksər canlı hüceyrələrin içərisində uzun, ikiqat zəncirli və spiral formalı molekul. O, fosfor, oksigen və karbon atomlarının onurğa sütunu üzərində qurulub. Bitki və heyvanlardan mikroblara qədər bütün canlılarda bu təlimatlar hüceyrələrə hansı molekulları əmələ gətirəcəklərini bildirir.

mühəndislik Praktiki problemləri həll etmək üçün riyaziyyat və elmdən istifadə edən tədqiqat sahəsi.

sahə Tədqiqat sahəsi, kimi: Onun tədqiqat sahəsi biologiya idi. Həmçinin dənizdə, meşədə, dağın başında və ya şəhər küçəsində bəzi tədqiqatların aparıldığı real dünya mühitini təsvir edən bir termindir. Tədqiqat laboratoriyası kimi süni mühitin əksidir.

floresan İşığı udmaq və təkrar yaymaq qabiliyyətinə malikdir. Bu təkrar yayılan işıq flüoresans kimi tanınır.

gen (adj. genetik) Zülal istehsal etmək üçün kodlaşdıran və ya təlimatları saxlayan DNT seqmenti. Nəsillər genləri valideynlərindən miras alırlar. Genlər orqanizmin görünüşünə və davranışına təsir göstərir.

genom Hüceyrə və ya orqanizmdə genlərin və ya genetik materialın tam dəsti. Hüceyrələrdə yerləşən bu genetik mirasın öyrənilməsi genomika kimi tanınır.

əzələ Əzələ lifləri olaraq bilinən hüceyrələrini büzərək hərəkət etmək üçün istifadə edilən bir toxuma növü. Əzələ zülalla zəngindir, buna görə də yırtıcı növlər bu toxumanın çoxunu ehtiva edən ov axtarırlar.

mutasiya (v. mutasiya) Orqanizmin DNT-sindəki gendə baş verən bəzi dəyişiklik. Bəzi mutasiyalar təbii olaraq baş verir. Digərləri çirklənmə, radiasiya, dərmanlar və ya pəhrizdəki hər hansı bir şey kimi kənar amillər tərəfindən tetiklene bilər. Bu dəyişikliyə malik gen mutant adlanır.

nüvə Çoxluq nüvədir. (biologiyada) Bir çox hüceyrədə mövcud olan sıx quruluş. Tipik olaraq bir membranın içərisindəki tək yuvarlaq bir quruluş, nüvə genetik məlumatı ehtiva edir.

orqan (biologiyada) Bir və ya bir neçə xüsusi funksiyanı yerinə yetirən orqanizmin müxtəlif hissələri. Məsələn, yumurtalıq yumurta istehsal edən bir orqandır, beyin sinir siqnallarını şərh edən bir orqandır və bitkinin kökləri qida və nəm qəbul edən orqanlardır.

palindrom (adj. palindromik) İrəli və ya geri oxunduqda hərflərin eyni sırasına malik olan söz, ad və ya ifadə. Məsələn, ataana hər ikisi palindromdur.

protein Bir və ya bir neçə uzun amin turşusu zəncirindən əmələ gələn birləşmə. Zülallar bütün canlı orqanizmlərin vacib hissəsidir. Canlı hüceyrələrin, əzələlərin və toxumaların əsasını təşkil edirlər, həmçinin hüceyrələrin daxilində də işləri görürlər. Qandakı hemoglobin və infeksiyalarla mübarizə aparmağa çalışan antikorlar daha yaxşı tanınan, müstəqil zülallardır. Dərmanlar tez-tez zülallara bağlanaraq işləyir.

RNT DNT-də olan genetik məlumatı “oxumağa” kömək edən molekul. Hüceyrənin molekulyar mexanizmi RNT yaratmaq üçün DNT-ni oxuyur, sonra isə zülal yaratmaq üçün RNT-ni oxuyur.

etiket (biologiyada) Heyvana bir qədər möhkəm bant və ya alətlər bağlamaq. Bəzən etiket hər bir şəxsə unikal identifikasiya nömrəsi vermək üçün istifadə olunur. Bir məxluqun ayağına, qulağına və ya bədəninin digər hissəsinə yapışdırıldıqdan sonra o, effektiv şəkildə heyvanın "adı" ola bilər. Bəzi hallarda etiket heyvanın ətrafındakı mühitdən də məlumat toplaya bilər. Bu, elm adamlarına həm ətraf mühiti, həm də heyvanın içindəki rolunu anlamağa kömək edir.

Sitatlar

Jurnal: S. Wang et al. RNT-aptamer əsaslı iki rəngli CRISPR etiketləmə sistemi. Elmi Hesabatlar. Cild. 6, 27 may 2016-cı il, səh. 26857. doi: 10.1038/srep26857.

Jurnal: A. C. Komor və başqaları. İki zəncirli DNT parçalanması olmadan genomik DNT-də hədəf bazanın proqramlaşdırıla bilən redaktəsi. Təbiət. Cild. 533, 19 may 2016, onlayn nəşr 20 aprel 2016, səh. 420. doi:10.1038/nature17946.

Jurnal: D. A. Nelles və başqaları. CRISPR/Cas9 ilə canlı hüceyrələrdə proqramlaşdırıla bilən RNT izləmə. Hüceyrə. Cild. 165, 7 aprel 2016-cı il, səh. 488. doi: 10.1016/j.cell.2016.02.054.

Tina Hesman Saey haqqında

Tina Hesman Saey baş işçi yazıçıdır və molekulyar biologiya üzrə hesabat verir. Onun elmlər namizədi var. Sent-Luisdəki Vaşinqton Universitetində molekulyar genetika və Boston Universitetində elmi jurnalistika üzrə magistr dərəcəsi.

Bu Məqalə üçün Sinif Resursları Ətraflı məlumat əldə edin

Bu məqalə üçün pulsuz pedaqoq resursları mövcuddur. Giriş üçün qeydiyyatdan keçin:


Dərsin Öyrənmə Məqsədləri

Bu dərsin sonunda tələbələr olacaq.

  • CRISPR/Cas9 tərs genetik təcrübələri üçün molekulyar alətlərin layihələndirilməsi üçün mövcud bioinformatika vasitələrindən necə istifadə olunacağını başa düşmək.
  • daha dərin bilik və ya aşağıdakı təlim məqsədlərinə yiyələnmək.

Genetikanın əsas səlahiyyətlərindən:

  • Şagirdlər elmin fənlərarası təbiətindən istifadə etməyi bacarmalıdırlar.
  • Tələbələr tədqiqat işləri yazmaq və təqdimatlar vermək də daxil olmaqla, eksperimental nəticələri effektiv şəkildə çatdıra bilməlidirlər.

COVID-19 aşkarlanması üçün CRISPR/Kas əsaslı sistemlər

CRISPR sistemi tədqiqatçılara gen funksiyasını dəyişə biləcək genomik ardıcıllıqlarda istənilən dəyişiklikləri etməyə imkan verən sadə, səmərəli və etibarlı sistemdir. Molekulyar qayçı kimi fəaliyyət göstərən və DNT zəncirlərini kəsə bilən bu sistem, bakteriya və arxeya kimi prokaryotlarda olan DNT ardıcıllığı ailəsidir. 54� Ümumiyyətlə, CRISPR sistemi iki əsas sinifə və altı növə bölünür.

SHERLOCK və DETECTR iş axınının və CRISPR əsaslı diaqnostika sistemlərində iştirak edən əsas mexanizmlərin sxematik təsviri.

SARS-CoV-2-nin aşkarlanması üçün ən çox istifadə edilən CRISPR sistemlərinin, CRISPR-Cas-ın (Cas3, Cas9, Cas12 və Cas13) sxematik təsviri.

Cədvəl 1-də COVID-19-un sürətli və həssas diaqnostikası üçün CRISPR-əsaslı diaqnostika sistemlərinin inkişafı və dizaynı üzrə tədqiqatlar ümumiləşdirilmişdir.

Cədvəl 1

sistemiCas növüsınaq vaxtıüstünlükləriçatışmazlıqlarrefer
DETEKTRCas12a30� dəqdəqiq, asan həyata keçirilə bilən, sürətli dönüş müddəti, termosiklə ehtiyac yoxdur, tək nukleotid hədəf spesifikliyi və mürəkkəb laboratoriya infrastrukturuna ehtiyac yoxdurnuklein turşusunun çıxarılması ehtiyacları, ekstraksiyaya məhdud çıxış, dəstlər və reagentlər, fərdi mühafizə vasitələrinə ehtiyaclar(16)
AIOD-CRISPRCas12a40਍əqsürətli, yüksək həssas, yüksək spesifik, bir qazan reaksiyası, ayrıca əvvəlcədən gücləndirmə və gücləndirilmiş məhsulun ötürülməsinə ehtiyac yoxdur, nəticələrin çılpaq gözlə görünməsi, həm DNT, həm də RNT vəziyyətlərində nuklein turşusunun aşkarlanması, bir addımda, tək molekulda yerinə yetirilə bilər həssas və möhkəmdirnuklein turşusunun çıxarılması ehtiyacları, ekstraksiyaya, dəstlərə və reagentlərə məhdud çıxış(75)
CRISPR-Cas12 əsasındaCas12a60਍əqdən azportativ, həssas, sürətli və aşağı qiymətxəstə nümunələri istifadə edilmir və müəyyən dəstlər tələb olunur(76)
CRISPR/Cas12a-NERCas12a45਍əqportativ, sadə, həssas, spesifik, xüsusi alətə ehtiyac yoxdur, sürətli və çılpaq gözlə nəticələrin görünməsinuklein turşusunun çıxarılması ehtiyacları, ekstraksiyaya, dəstlərə və reagentlərə məhdud çıxış(77)
CRISPR-FDSCas12a� minhəssas, möhkəm, sürətli və mövcud avadanlıqla edilə bilərnuklein turşusu ekstraksiyasına ehtiyac var, viral yükün miqdarını təyin etmək üçün uyğun deyil(78)
PARLAKCas13a50਍əqhəssas, spesifik, tək addımlı reaksiya, xəstəxana və laboratoriyalardan kənarda istifadə edilə bilər və nuklein turşusunun çıxarılmasına ehtiyac yoxdur (79)
CONANCas340਍əqsürətli, həssas, aşağı qiymətli, alətsiz və tək əsaslı cüt ayrı-seçkiliknuklein turşusunun çıxarılması ehtiyacları, ekstraksiyaya, dəstlərə və reagentlərə məhdud çıxış(80)
iSCANCas12a1 hhəssas, spesifik, səmərəli, sürətli, istifadəçi dostu, dəqiq, sahəyə yerləşdirilə bilən və geniş miqyaslı üçün uyğunnuklein turşusunun çıxarılması, ekstraksiyaya məhdud giriş, dəstlər və reagentlər tələb olunur(81)
CASdetecCas12b1 hçarpaz reaktivliyin olmaması, yalançı müsbət nisbətin azalması və dəqiqliknuklein turşusunun çıxarılması ehtiyacları, ekstraksiyaya, dəstlərə və reagentlərə məhdud çıxış(82)
VaNGuardCas12a30਍əqmöhkəm, sürətli, həssas, əlverişli, spesifik (83)
CRESTCas13a𢏂 hmiqyaslana bilən, aşağı qiymətli, xüsusi alətlərə ehtiyac yoxdur, yüksək həssas, yerləşdirilməsi asannuklein turşusunun çıxarılması, ekstraksiyaya məhdud giriş, dəstlər və reagentlər tələb olunur(84)
STOPCovidCas12b1 hsadə, qayğı nöqtəsi (POC) analizi üçün uyğun, həssas, aşağı qiymət, test komponentlərinin mövcudluğu, RNT ekstraksiyasına ehtiyac yoxdur (85)
ITP-CRISPRCas12a30਍əqavtomatlaşdırmaya və minimum həcmdə reagentlərin istifadəsinə uyğundur (86)
ŞERLOKCas13a1 saatdan azdırsürətli, həssas və mürəkkəb avadanlıqlara ehtiyac yoxdurklinik nümunələri sınaqdan keçirmək üçün uyğun deyil(87)

Genomun redaktəsi üçün hədəflənmiş nükleazların inkişafı

Tədqiqatçılar yuxarıda qeyd olunan məhdudiyyətləri aradan qaldırmaq üçün alternativ yanaşmalar axtardılar. İlkin irəliləyişlərdən biri, hədəf saytda ikiqat zəncirli qırılmanın (DSB) tətbiqinin hədəflənmiş gen inteqrasiyasının tezliyində bir neçə dəfə böyük artımla nəticələndiyini başa düşməkdən gəldi 9,10 . Buna görə də, bir çox tədqiqat qrupları hədəflənmiş DSB-lərə nail olmaq üçün müxtəlif strategiyaların işlənib hazırlanmasına diqqət yetirdilər. İlkin tədqiqatlarda tədqiqatçılar 18-bp kəsici kimi nadir kəsici endonükleaz fermentlərindən istifadə etdilər. I-SceI, siçan genomunda xüsusi DSB-ləri təqdim etmək 10 . Baxmayaraq ki, bu cür meqanükleazlar (14-40 bp DNT-nin uzun uzantılarını tanıyan endonükleazlar) genomun redaktə effektivliyini artırsa da, yanaşma iki əsas çatışmazlıq ilə məhdudlaşdırıldı. Birincisi, təbii olaraq tapılan yüzlərlə meqanükleazın olmasına baxmayaraq, onların hər birinin özünəməxsus tanınma ardıcıllığı var. Beləliklə, istənilən lokusu hədəf alan meqanükleazın tapılma ehtimalı hələ də aşağı idi. İkincisi və daha kritik olaraq, induksiya edilmiş DSB-lərin əksəriyyəti səhvə meylli qeyri-homoloji son birləşmə (NHEJ) DNT təmir mexanizmi vasitəsilə təmir olunur. Beləliklə, yalnız ekzogen olaraq təqdim edilmiş DNT şablonu DSB-lərə daxil ola bilməz, həm də NHEJ təmir mexanizmi təsadüfi olaraq DNT parçalarını qırılma yerlərinə daxil edə və ya silə bilər 11 . Bu cür çətinliklərin öhdəsindən gəlmək üçün tədqiqatçılar təbii olaraq mövcud olan meqanükleazların DNT-ni hədəf alma xüsusiyyətlərini dəyişdirmək üçün yenidən dizayn etməyə başladılar 12,13,14. Baxmayaraq ki, bu səylər məqsədyönlü redaktə imkanlarını əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırsa da, genomların yalnız çox kiçik bir hissəsi meqanukleazlardan istifadə edərək xüsusi olaraq hədəfə alına bilərdi.

Bu məqsədlə, eukaryotik sink barmaq zülallarının kəşfi və istifadəsi genomun hədəflənməsi və redaktə edilməsində yeni bir dövr başlatdı. Sink barmaqları DNT-yə ardıcıllıqla xüsusi bir şəkildə bağlanan sink ionu ilə tənzimlənən kiçik protein motivləridir. Hər sink barmaq modulu 3-bp DNT ardıcıllığını tanıyır 15 . Buna görə də, meqanükleazlardan fərqli olaraq, daha yüksək DNT bağlama spesifikliyinə nail olmaq üçün çoxlu sink barmaq modulları daha böyük kompleksə yığıla bilər. Sink barmaqlarının quruluşu aşkar edildikdən qısa müddət sonra tədqiqatçılar sink barmaq zülallarını sink barmaqlarının DNT parçalanma sahəsi ilə birləşdirərək proqramlaşdırıla bilən nukleaza zülalları yaratmağa başladılar. Fok İ endonükleaza 16. Fok I məhdudlaşdırıcı fermentin seçimi bir neçə səbəbə görə yaxşı düşünülmüş, düşünülmüş seçim idi. Birincisi, bir çox digər məhdudlaşdırıcı fermentlərdən fərqli olaraq, Fok I fərqli DNT tanınması və DNT parçalanma sahəsinə malikdir. Bunu bilən tədqiqatçılar Fok I-in DNT ardıcıllığının tanınması sahəsini çıxardılar və yalnız DNT parçalanma domenini sink barmaq protein modullarına birləşdirdilər. Digər kritik mülahizə odur ki, Fok I DNT-ni parçalamaq üçün hədəf yerində homodimerizasiya tələb edir. Buna görə də, bir-birinin yanında iki proksimal sahəni hədəf alan iki ayrı sink barmaq modulunun dizaynı Fok I-nin homodimerləşməsinə və hədəf yerlərdə DNT zəncirinin qırılmasına səbəb olmasına imkan verir. Sink barmaq nukleazlarının (ZFNs) yalnız model orqanizmlərdə deyil, həm də insan hüceyrələrində hədəflənmiş homoloji rekombinasiyanı əhəmiyyətli dərəcədə artırdığı göstərilmişdir 17,18 . ZFN-lərin dizaynında təkmilləşdirilmiş səmərəlilik, canlı hüceyrələrin genomlarını xüsusi olaraq hədəflənmiş yerlərdə redaktə etmək imkanlarını çox artırdı və bu cür genomu redaktə vasitələrinin terapevtik tətbiqləri üçün qapıları açdı 19,20 . Hər bir sink barmağı 3-bp-lik DNT kodunu tanıdığından, unikal 64-barmaq hovuzundan 6-7 sink barmağının kombinator yığılması (4 3 kombinasiya) istənilən 18-21 bp genomik ardıcıllığı unikal şəkildə hədəfləyə bilər 21. ZFN-lər genom mühəndisliyi vasitəsi kimi əhəmiyyətli həyəcan yaratsa da, kəşf transkripsiya aktivatoruna bənzər effektor (TALE) zülallarının Ksantomonas Bakteriyalar üç əsas yerinə xüsusi olaraq tək bir baza tanıya bilirlər. Sink barmaqları kimi, Fok I DNT parçalanma sahəsinin TALE modullarının birləşməsinə kimerik birləşməsi TALEN 24,25,26,27 adlanan effektiv proqramlaşdırıla bilən nüvə rolunu oynayır (Şəkil 1).


Kral Cəmiyyəti tərəfindən nəşr edilmişdir. Bütün hüquqlar qorunur.

İstinadlar

. 2018 Genom redaktəsi və ondan kənar üçün CRISPR alət dəsti. Nat. Kommun. 9, 1911. (doi:10.1038/s41467-018-04252-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2015 CRISPR əsaslı texnologiyalar və qida elminin gələcəyi. J. Qida Elmi. 80, R2367-R2372. (doi: 10.1111/1750-3841.13094). Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Pursey E, Sunderhauf D, Gaze WH, Westra ER, van Houte S.

2018 CRISPR-Cas antimikrobları: problemlər və gələcək perspektivlər. PLoS Pathog. 14, e1006990. (doi:10.1371/journal.ppat.1006990). Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Noble C, Adlam B, Church GM, Esvelt KM, Nowak MA

. 2018 Mövcud CRISPR gen sürücü sistemlərinin vəhşi populyasiyalarda yüksək invaziv olması ehtimalı var. Elife 7, e33423. (doi:10.7554/eLife.33423) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Webber BL, Raghu S, Edwards OR

. 2015 Rəy: CRISPR əsaslı gen sürücülük bionəzarət gümüş gülləsi və ya qlobal mühafizə təhlükəsidir? Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 112, 10 565-10 567. (doi:10.1073/pnas.1514258112) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2015 BIOSTƏHLÜKƏSİZLİK. Laboratoriyada gen sürücüsü təcrübələrinin qorunması. Elm 349, 927-929. (doi:10.1126/science.aac7932) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2019 CRISPR etikası: güclü alətin tətbiqi üçün əxlaqi mülahizələr. J. Mol. Biol. 431, 88-101. (doi:10.1016/j.jmb.2018.05.044) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Mojica FJ, Diez-Villasenor C, Garcia-Martinez J, Soria E

. 2005 Müntəzəm aralıqlı prokaryotik təkrarların ardıcıl ardıcıllığı yad genetik elementlərdən yaranır. J. Mol. Təkamül. 60, 174-182. (doi:10.1007/s00239-004-0046-3) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, Ehrlich SD

. 2005 Çoxluqlu müntəzəm interspased qısa palindrom təkrarları (CRISPRs) ekstraxromosom mənşəli boşluqlara malikdir. Mikrobiologiya 151, 2551-2561. (doi:10.1099/mic.0.28048-0) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G

. 2005 CRISPR elementləri Yersinia pestis bakteriofaq DNT-nin üstünlüklə qəbulu ilə yeni təkrarlar əldə edin və təkamül tədqiqatları üçün əlavə vasitələr təmin edin. Mikrobiologiya 151, 653-663. (doi:10.1099/mic.0.27437-0) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Makarova KS, Grishin NV, Shabalina SA, Wolf YI, Koonin EV

. 2006 Prokaryotlarda ehtimal olunan RNT-müdaxilə əsaslı immun sistemi: proqnozlaşdırılan enzimatik mexanizmin hesablama analizi, eukaryotik RNT ilə funksional analogiyalar və hipotetik fəaliyyət mexanizmləri. Biol. Birbaşa 1, 7. (doi: 10.1186/1745-6150-1-7) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C

. 2007 CRISPRdb verilənlər bazası və CRISPR-ləri göstərmək və boşluqlar və təkrarlar lüğətlərini yaratmaq üçün alətlər. BMC Bioinf. 8, 172. (doi:10.1186/1471-2105-8-172) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P

. 2007 CRISPR prokaryotlarda viruslara qarşı qazanılmış müqavimət təmin edir. Elm 315, 1709-1712. (doi:10.1126/science.1138140) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Marraffini LA, Sontheimer EJ

. 2008 CRISPR müdaxiləsi DNT-ni hədəf alaraq stafilokoklarda üfüqi gen transferini məhdudlaşdırır. Elm 322, 1843-1845. (doi:10.1126/science.1165771) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2016 CRISPR-Cas uyğunlaşması: fəaliyyət mexanizminə dair fikirlər. Nat. Rev. Mikrobiol. 14, 67-76. (doi:10.1038/nrmicro.2015.14) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Westra ER, Dowling AJ, Broniewski JM, van Houte S.

2016 CRISPR-in təkamülü və ekologiyası. Annu. Rev. Ecol. Təkamül. Sistem. 47, 307-331. (doi:10.1146/annurev-ecolsys-121415-032428) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2010 CRISPR vasitəçiliyi ilə faq müqaviməti və keçmiş birgə təkamülün xəyalı. Proc. R. Soc. B 277, 2097-2103. (doi:10.1098/rspb.2010.0055) Link, ISI, Google Scholar

Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM

. 2002 Prokaryotlarda DNT təkrarları ilə əlaqəli genlərin müəyyən edilməsi. Mol. Mikrobiol. 43, 1565-1575. (doi:10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Şmakov SA, Makarova KS, Wolf YI, Severinov KV, Koonin EV.

. 2018 Gen qonşuluq analizi ilə CRISPR-Cas sistemləri ilə funksional olaraq əlaqəli genlərin sistematik proqnozu. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 115, E5307-E5316. (doi:10.1073/pnas.1803440115) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2017 2-ci sinif CRISPR–Cas sistemlərinin müxtəlifliyi və təkamülü. Nat. Rev. Mikrobiol. 15, 169-182. (doi:10.1038/nrmicro.2016.184) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Koonin EV, Makarova KS, Zhang F

. 2017 CRISPR-Cas sistemlərinin müxtəlifliyi, təsnifatı və təkamülü. Curr. Rəy. Mikrobiol. 37, 67-78. (doi:10.1016/j.mib.2017.05.008) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2015 CRISPR-Cas sistemlərinin yenilənmiş təkamül təsnifatı. Nat. Rev. Mikrobiol. 13, 722-736. (doi:10.1038/nrmicro3569) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

van der Oost J, Westra ER, Jackson RN, Wiedenheft B.

2014 CRISPR–Cas sistemlərinin struktur və mexaniki əsaslarının açılması. Nat. Rev. Mikrobiol. 12, 479-492. (doi:10.1038/nrmicro3279) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2015 CRISPR – Prokaryotlarda Cas immuniteti. Təbiət 526, 55-61. (doi:10.1038/nature15386) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Jackson SA, McKenzie RE, Fagerlund RD, Kieper SN, Fineran PC, Brouns SJ

. 2017 CRISPR-Cas: dəyişikliyə uyğunlaşma. Elm 356, aa15056. (doi:10.1126/science.aal5056) Crossref, ISI, Google Scholar

Charpentier E, Richter H, van der Oost J, White MF.

2015 Arxeal və bakterial CRISPR-Cas adaptiv toxunulmazlığında RNT bələdçilərinin biogenez yolları. FEMS Mikrobiol. Rev. 39, 428-441. (doi:10.1093/femsre/fuv023) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Weinberger AD, Wolf YI, Lobkovsky AE, Gilmore MS, Koonin EV

. 2012 Prokaryotlarda adaptiv toxunulmazlıq üçün virus müxtəlifliyi həddi. MBio 3, e00456-12. (doi:10.1128/mBio.00456-12) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Iranzo J, Lobkovsky AE, Wolf YI, Koonin EV

. 2013 Açıq ekoloji kontekstdə CRISPR-Cas prokaryotik adaptiv immunitet sisteminin təkamül dinamikası. J. Bakteriol. 195, 3834-3844. (doi:10.1128/JB.00412-13) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Anderson RE, Brazelton WJ, Baross JA

. 2011 CRISPR-lərdən diffuz axın hidrotermal ventilyasiya viral birləşməsinin mikrob sahiblərini müəyyən etmək üçün metagenomik vasitə kimi istifadə edilməsi. FEMS Mikrobiol. Ekol. 77, 120-133. (doi:10.1111/j.1574-6941.2011.01090.x) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Burstein D, Sun CL, Brown CT, Sharon I, Anantharaman K, Probst AJ, Thomas BC, Banfield JF

. 2016 Əsas bakteriya nəsilləri mahiyyətcə CRISPR-Cas viral müdafiə sistemlərindən məhrumdur. Nat. Kommun. 7, 10613. (doi:10.1038/ncomms10613) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Weissman J, Laljani R, Fagan W, Johnson P

. 2018 Ekologiya mikrob immun strategiyasını formalaşdırır: temperatur və oksigen CRISPR adaptiv toxunulmazlığının hallarının müəyyənediciləri kimi. biorxiv. (doi:10.1101/326330) Google Scholar

Van Houte S, Buckling A, Westra ER.

2016 Prokaryotik immun mexanizmlərin təkamül ekologiyası. Mikrobiol. Mol. Biol. Rev. 80, 745-763. (doi:10.1128/MMBR.00011-16) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2015 Parazitlərə məruz qalma konstitutiv və induksiya olunan müdafiənin seçici təkamülünə təkan verir. Curr. Biol. 25, 1043-1049. (doi:10.1016/j.cub.2015.01.065) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Chabas H, van Houte S, Hoyland-Kroghsbo NM, Buckling A, Westra ER.

2016 Həssas ev sahiblərinin immiqrasiyası alternativ parazit müdafiə strategiyalarının təkamülünə təkan verir. Proc. R. Soc. B 283, 20160721. (doi:10.1098/rspb.2016.0721) Link, ISI, Google Scholar

2013 CRISPR/Cas sistemləri tərəfindən sitotoksik xromosomların hədəflənməsi bakterial genomları yenidən formalaşdıra və patogenlik adalarını xaric edə və ya dəyişdirə bilər. PLoS Genet. 9, e1003454. (doi:10.1371/journal.pgen.1003454) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Stern A, Keren L, Wurtzel O, Amitai G, Sorek R

. 2010 CRISPR tərəfindən özünü hədəfləmə: gen tənzimlənməsi və ya otoimmünite? Trendlər Genet. 26, 335-340. (doi:10.1016/j.tig.2010.05.008) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Bikard D, Hatoum-Aslan A, Mucida D, Marraffini LA

. 2012 CRISPR müdaxiləsi in vivo bakterial infeksiya zamanı təbii transformasiyanın və virulentliyin əldə edilməsinin qarşısını ala bilər. Hüceyrə Host Mikrob 12, 177-186. (doi:10.1016/j.chom.2012.06.003) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

van Sluijs L, van Houte S, van der Oost J, Brouns SJ, Buckling A, Westra ER

. Mətbuatda. Asılılıq sistemləri bakterial adaptiv toxunulmazlığı antaqonlaşdırır. FEMS Mikrobiol. Lett. Google Alim

Bernheim A, Calvo-Villamanan A, Basier C, Cui L, Rocha E.PC, Touchon M, Bikard D

. 2017 Bakteriyalarda II-A CRISPR-Cas sistemləri ilə NHEJ təmirinin qarşısının alınması. Nat. Kommun. 8, 2094. (doi:10.1038/s41467-017-02350-1) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Levy A, Goren MG, Yosef I, Auster O, Manor M, Amitai G, Edgar R, Qimron U, Sorek R

. 2015 CRISPR uyğunlaşma meylləri xarici DNT-nin əldə edilməsinə üstünlük verilməsini izah edir. Təbiət 520, 505-510. (doi:10.1038/nature14302) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Paez-Espino D, Sharon I, Morovic W, Stahl B, Thomas BC, Barrangou R, Banfield JF

. 2015 CRISPR toxunulmazlığı, fag genomunun sürətli təkamülünü sürətləndirir Streptococcus thermophilus . MBio 6, e00262-15. (doi:10.1128/mBio.00262-15) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2016 Prokaryotik adaptiv immun sisteminin müxtəliflik yaradan faydaları. Təbiət 532, 385-388. (doi:10.1038/nature17436) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2008 Virus populyasiyasının dinamikası və təbii mikrob icmalarında qazanılmış virus müqaviməti. Elm 320, 1047-1050. (doi:10.1126/science.1157358) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

NL, Herrera A, Whitaker RJ keçirilib

. 2013 CRISPR təkrar-spacer lokuslarının yenidən çeşidlənməsi Sulfolobus islandicus . Ətraf. Mikrobiol. 15, 3065-3076. (doi:10.1111/1462-2920.12146) PubMed, ISI, Google Scholar

. 2008 Mikroorqanizmlərin viruslara qarşı qazanılmış müqavimətində iştirak edən sürətlə inkişaf edən CRISPRs. Ətraf. Mikrobiol. 10, 200-207. (doi:10.1111/j.1462-2920.2007.01444.x) PubMed, ISI, Google Scholar

NL, Herrera A, Cadilo-Quiroz H, Whitaker RJ keçirilib

. 2010 CRISPR əhali daxilində müxtəlifliyi əlaqələndirdi Sulfolobus islandicus . PLoS BİR 5, e0012988. (doi:10.1371/journal.pone.0012988) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Emerson JB, Andrade K, Thomas BC, Norman A, Allen EE, Heidelberg KB, Banfield JF

. 2013 Arxeyanın üstünlük təşkil etdiyi hipersalin Tyrrell gölündə Virus sahibi və CRISPR dinamikası, Viktoriya, Avstraliya. Arxeya 2013, 370871. (doi:10.1155/2013/370871) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Tomida J, Morita Y, Şibayama K, Kikuchi K, Sawa T, Akaike T, Kawamura Y

. 2017 CRISPR lokuslarının müxtəlifliyi və mikrotəkamülü Helicobacter cinaedi . PLoS BİR 12, e0186241. (doi:10.1371/journal.pone.0186241) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

İngiltərə WE, Kim T, Whitaker RJ

. 2018-ci ildə CRISPR-Cas toxunulmazlığının metapopulyasiya strukturu Pseudomonas aeruginosa və onun virusları. mSystems 3, e00075-18. (doi:10.1128/mSystems.00075-18) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Mətbuatda. Meqafaqlar yoluxur Prevotella və variantlar bağırsaq mikrobiomlarında geniş yayılmışdır. Nat. Mikrobiol. (doi:10.1038/s41564-018-0338-9) Google Scholar

. 2019 CRISPR təkamülü və əhalinin darboğazları kontekstində bakteriofaqların davamlılığı. RNT Biol. 5, 1-7. (doi:10.1080/15476286.2019.1578608) Crossref, Google Scholar

. 2010 Kiçik, yavaş və ixtisaslaşmış CRISPR və anti-CRISPR EscherichiaSalmonella . PLoS BİR 5, e11126. (doi:10.1371/journal.pone.0011126) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Semenova E, Jore MM, Datsenko KA, Semenova A, Westra ER, Wanner B, van der Oost J, Brouns SJ, Severinov K.

2011 Çoxluqlu müntəzəm aralıqlı qısa palindromik təkrar (CRISPR) RNT ilə müdaxilə toxum ardıcıllığı ilə idarə olunur. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 108, 10 098-10 103. (doi:10.1073/pnas.1104144108) Crossref, ISI, Google Scholar

Deveau H, Barrangou R, Garneau JE, Labonte J, Fremaux C, Boyaval P, Romero DA, Horvath P, Moineau S

. 2008-ci ildə CRISPR ilə kodlanmış müqavimətə faq reaksiyası Streptococcus thermophilus . J. Bakteriol. 190, 1390-1400. (doi:10.1128/JB.01412-07) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Levin BR, Moineau S, Bushman M, Barrangou R

. 2013 CRISPR vasitəçiliyi ilə toxunulmazlığı olan fag və bakteriyaların populyasiyası və təkamül dinamikası. PLoS Genet. 9, e1003312. (doi:10.1371/journal.pgen.1003312) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Childs LM, England WE, Young MJ, Weitz JS, Whitaker RJ

. 2014 Mikrob populyasiyalarında CRISPR-in səbəb olduğu paylanmış toxunulmazlıq. PLoS BİR 9, e101710. (doi:10.1371/journal.pone.0101710) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Chabas H, Lion S, Nicot A, Meaden S, van Houte S, Moineau S, Wahl LM, Westra ER, Gandon S.

2018 Heterojen ev sahibi populyasiyalarda yoluxucu xəstəliklərin təkamül yolu ilə ortaya çıxması. PLoS Biol. 16, e2006738. (doi:10.1371/journal.pbio.2006738) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Westra ER, Sunderhauf D, Landsberger M, Buckling A

. 2017 Müxtəliflik yaradan immun strategiyalarının mexanizmləri və nəticələri. Nat. Rev. İmmunol. 17, 719-728. (doi:10.1038/nri.2017.78) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Bondy-Denomy J, Pawluk A, Maxwell KL, Davidson AR

. 2013 CRISPR/Cas bakterial immun sistemini təsirsiz hala gətirən bakteriofaq genləri. Təbiət 493, 429-432. (doi:10.1038/nature11723) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Borges AL, Zhang JY, Rollins MF, Osuna BA, Wiedenheft B, Bondy-Denomy J

. 2018 Bakteriofaq əməkdaşlığı CRISPR-Cas3 və Cas9 toxunulmazlığını boğur. Hüceyrə 174, 917-925. (doi:10.1016/j.cell.2018.06.013) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Landsberger M, Gandon S, Meaden S, Rollie C, Chevallereau A, Chabas H, Buckling A, Westra ER, van Houte S.

2018 Anti-CRISPR faqları CRISPR-Cas toxunulmazlığını aradan qaldırmaq üçün əməkdaşlıq edir. Hüceyrə 174, 908-916. (doi:10.1016/j.cell.2018.05.058) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Vale PF, Lafforgue G, Gatchich F, Gardan R, Moineau S, Gandon S

. 2015-ci ildə CRISPR-Cas vasitəçiliyi ilə müqavimətin xərcləri Streptococcus thermophilus . Proc. R. Soc. B 282, 20151270. (doi:10.1098/rspb.2015.1270) Link, ISI, Google Scholar

. 2010 Çox dərmana davamlı enterokoklarda CRISPR- yoxdurcas . MBio 1, e00227-10. (doi:10.1128/mBio.00227-10) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Jiang W, Maniv I, Arain F, Wang Y, Levin BR, Marraffini LA

. 2013 CRISPR toxunulmazlığının təkamül mənfi tərəfi ilə məşğul olmaq: bakteriyalar və faydalı plazmidlər. PLoS Genet. 9, e1003844. (doi:10.1371/journal.pgen.1003844) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2014 Yaxşı və pis infeksiyalara qarşı müqavimətin təkamülü. J. Evol. Biol. 27, 303-312. (doi:10.1111/jeb.12291) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Paez-Espino D, Morovic W, Sun CL, Thomas BC, Ueda K, Stahl B, Barrangou R, Banfield JF

. 2013 Faqlara toxunulmazlıq verən bakterial CRISPR elementlərində güclü meyl. Nat. Kommun. 4, 1430. (doi:10.1038/ncomms2440) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2014 Effektiv şəkildə çatdırılan RNT ilə idarə olunan nükleazlardan istifadə edərək, ardıcıllıqla spesifik antimikroblar. Nat. Biotexnol. 32, 1141-1145. (doi:10.1038/nbt.3011) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Gomaa AA, Klumpe HE, Luo ML, Selle K, Barrangou R, Beisel CL

. 2013 Genomu hədəfləyən CRISPR-Cas sistemlərindən istifadə etməklə bakteriya ştammlarının proqramlaşdırıla bilən çıxarılması. MBio 5, e00928–13. (doi:10.1128/mBio.00928-13) Crossref, ISI, Google Scholar

Bikard D, Euler CW, Jiang W, Nussenzweig PM, Goldberg GW, Duportet X, Fischetti VA, Marraffini LA

. 2014 Ardıcıllığa xas antimikroblar istehsal etmək üçün CRISPR-Cas nukleazlarından istifadə. Nat. Biotexnol. 32, 1146-1150. (doi:10.1038/nbt.3043) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Dong H, Xiang H, Mu D, Wang D, Wang T

. 2019 Konyuqativ CRISPR/Cas9 sisteminin istifadəsi mcr-1 gendən Escherichia coli . Int. J. Antimikrob. Agentlər 53, 1-8. (doi:10.1016/j.ijantimicag.2018.09.017) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Buchthal J, Evans SW, Lunshof J, Telford SR, Esvelt KM

. 2019 Siçanlar Gənələrə Qarşı: Ortaq mühiti dəyişdirərək gənə yoluxucu xəstəliklərin qarşısını almaq üçün icma tərəfindən idarə olunan eksperimental səy. Fil. Trans. R. Soc. B 374, 20180105.(doi:10.1098/rstb.2018.0105) Link, ISI, Google Scholar

Esvelt KM, Smidler AL, Catteruccia F, Church GM

. 2014 Vəhşi populyasiyaların dəyişdirilməsi üçün RNT ilə idarə olunan gen sürücüləri ilə bağlı. Elife 3, e03401. (doi:10.7554/eLife.03401) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Godfray H.CJ, North A, Burt A

. 2017 Endonükleaz genlərini idarə edən zərərvericilər və xəstəlik daşıyıcıları ilə mübarizə üçün necə istifadə edilə bilər. BMC Biol. 15, 81. (doi:10.1186/s12915-017-0420-4) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

DiCarlo JE, Chavez A, Dietz SL, Esvelt KM, Church GM

. 2015 Mayada CRISPR–Cas9 gen sürücülərinin qorunması. Nat. Biotexnol. 33, 1250-1255. (doi:10.1038/nbt.3412) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Gantz VM, Jasinskiene N, Tatarenkova O, Fazekas A, Macias VM, Bier E, James AA

. 2015 Malyariya vektor ağcaqanadının populyasiyasının modifikasiyası üçün yüksək səmərəli Cas9 vasitəçiliyi ilə gen sürücüsü Anopheles Stephensi . Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 112, E6736-E6743. (doi:10.1073/pnas.1521077112) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2015 Genom redaktəsi. Mutagen zəncirvari reaksiya: heterozigot mutasiyaları homozigotlara çevirmək üçün bir üsul. Elm 348, 442-444. (doi:10.1126/science.aaa5945) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Grunwald HA, Gantz VM, Poplawski G, Xu XS, Bier E, Cooper KL

. Dişi siçan cücərti xəttində CRISPR–Cas9 vasitəçiliyi ilə 2019 Super-Mendel irsi. Təbiət 566, 105-109. (doi:10.1038/s41586-019-0875-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Champer J, Liu J, Oh SY, Reeves R, Luthra A, Oakes N, Clark AG, Messer PW

. 2018 CRISPR gen sürücüsündə müqavimət allelinin formalaşmasının azaldılması. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 115, 5522-5527. (doi:10.1073/pnas.1720354115) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Unckless RL, Clark AG, Messer PW

. 2017 CRISPR/Cas9 gen sürücüsünə qarşı müqavimətin təkamülü. Genetika 205, 827-841. (doi:10.1534/genetics.116.197285) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Noble C, Olejarz J, Esvelt K, Church G, Nowak M.

2017 CRISPR gen sürücülərinin təkamül dinamikası. Sci. Adv . 3, e1601964. (doi:10.1126/sciadv.1601964) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Kyrou K, Hammond AM, Galizi R, Kranjc N, Burt A, Beagton AK, Nolan T, Crisanti A

. 2018 CRISPR–Cas9 gen sürücüsünün hədəflənməsi ikiqat seks qəfəsdə əhalinin tam sıxışdırılmasına səbəb olur Anopheles gambiae ağcaqanadlar. Nat. Biotexnol. 36, 1062-1066. (doi:10.1038/nbt.4245) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2018 Sub-Sahara Afrikasında malyariyanın aradan qaldırılması üçün potensial bionəzarət vasitəsi kimi gen sürücüsü ağcaqanadlarının tətbiqi yolu: Elmi İşçi Qrupun tövsiyələri. am. J. Trop. Med. Hyg. 98(Əlavə 6), 1-49. (doi:10.4269/ajtmh.18-0083) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Min J, Smidler AL, Nəccar D, Esvelt KM

. 2018 Gen sürücüsünün işə salınması. J. Məsul Yenilik. 5(Əlavə 1), S40-S65. (doi:10.1080/23299460.2017.1415586) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2019 CRISPR-Cas sistemlərinin mənşəyi və təkamülü. Fil. Trans. R. Soc. B 374, 20180087. (doi:10.1098/rstb.2018.0087) Link, ISI, Google Scholar

Gurney J, Pleška M, Levin BR

. 2019 Müqavimət olduqda niyə toxunulmazlığa dözmək lazımdır: əhaliyə ekskursiya və məhdudlaşdırmanın təkamül dinamikası – modifikasiya və CRISPR-Cas . Fil. Trans. R. Soc. B 374, 20180096. (doi:10.1098/rstb.2018.0096) Link, Google Scholar

Bernheim A, Bikard D, Touchon M, Rocha EPC

. 2019 Arxa plan məsələsi: CRISPR-Cas sistemlərinin bakteriyalarda seyrək yayılmasının mümkün səbəbi kimi DNT təmir yolları. Fil. Trans. R. Soc. B 374, 20180088. (doi:10.1098/rstb.2018.0088) Link, Google Scholar

Chevallereau A, Meaden S, van Houte S, Westra ER, Rollie C.

2019 Bakterial mutasiya dərəcəsinin CRISPR-Cas adaptiv toxunulmazlığının təkamülünə təsiri. Fil. Trans. R. Soc. B 374, 20180094. (doi:10.1098/rstb.2018.0094) Link, Google Scholar

Bradde S, Mora T, Walczak AM

. 2019 Çoxluqlu müntəzəm interspaceed qısa palindromik təkrar spacer əldə edilməsinin dəyəri və faydaları. Fil. Trans. R. Soc. B 374, 20180095. (doi:10.1098/rstb.2018.0095) Link, Google Scholar

Lopatina A, Medvedeva S, Artamonova D, Kolesnik M, Sitnik V, İspolatov Y, Severinov K

. 2019 CRISPR spacers-in təbii müxtəlifliyi Termus: yerli spacer alınması və qlobal spacer mübadiləsi sübut . Fil. Trans. R. Soc. B 374, 20180092. (doi:10.1098/rstb.2018.0092) Link, Google Scholar

Pauly MD, Bautista MA, Black JA, Whitaker RJ

. 2019-un viruslarına qarşı şaxələndirilmiş yerli CRISPR-Cas immuniteti Sulfolobus islandicus . Fil. Trans. R. Soc. B 374, 20180093. (doi:10.1098/rstb.2018.0093) Link, Google Scholar

Hoikkala V, Almeida GMF, Laanto E, Sundberg L-R

. 2019 Akvakultura CRISPR-Cas və fag arasında birgə təkamül üçün empirik sübut mənbəyi kimi. Fil. Trans. R. Soc. B 374, 20180100. (doi:10.1098/rstb.2018.0100) Link, Google Scholar

Ümumi J, Morley D, Westra ER, van Houte S

. 2019 CRISPR-Cas toxunulmazlığı arasında birgə təkamüllü silah yarışına səbəb olur Streptococcus thermophilus və litik faq. Fil. Trans. R. Soc. B 374, 20180098. (doi:10.1098/rstb.2018.0098) Google Scholar

Chabas H, Nikot A, Meaden S, Westra ER, Tremblay DM, Pradier L, Lion S, Moineau S, Gandon S

. 2019 CRISPR-Cas toxunulmazlığının davamlılığında dəyişkənlik. Fil. Trans. R. Soc. B 374, 20180097. (doi:10.1098/rstb.2018.0097) Link, Google Scholar

Watson BNJ, Easingwood RA, Tong B, Wolf M, Salmond GPC, Staals RHJ, Bostina M, Fineran PC

. 2019 Tək və ya çoxlu CRISPR-Cas ayırıcıları tərəfindən hədəflənən faqlar üçün müxtəlif genetik və morfoloji nəticələr. Fil. Trans. R. Soc. B 374, 20180090. (doi:10.1098/rstb.2018.0090) Link, Google Scholar

McKitterick AC, LeGault KN, Angermeyer A, Alam M, Seed KD

. 2019 Mobil genetik elementlər arasında rəqabət faj kodlu CRISPR-Cas sisteminin optimallaşdırılmasına təkan verir: təbii silah yarışından anlayışlar. Fil. Trans. R. Soc. B 374, 20180089. (doi:10.1098/rstb.2018.0089) Google Scholar

Hatoum-Aslan A, Marraffini LA

. 2014 CRISPR toxunulmazlığının bakterial patogenlərin yaranmasına və virulentliyinə təsiri. Curr. Rəy. Mikrobiol. 17C, 82-90. (doi:10.1016/j.mib.2013.12.001) Crossref, ISI, Google Scholar

Gophna U, Kristensen DM, Wolf YI, Popa O, Drevet C, Koonin EV

. 2015 Təkamül zaman miqyasında CRISPR-Cas tərəfindən üfüqi gen transferinin maneə törədilməsinə dair heç bir dəlil yoxdur. ISME J. 9, 2021-2027. (doi:10.1038/ismej.2015.20) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Shehreen S, Chyou T-y, Fineran PC, Brown CM

. 2019 Genom miqyasında korrelyasiya təhlili müxtəlif növlərdə antibiotik müqavimət genlərinin əldə edilməsində CRISPR-Cas sistemlərinin fərqli rollarını təklif edir. Fil. Trans. R. Soc. B 374, 20180384. (doi:10.1098/rstb.2018.0384) Link, Google Scholar

. 2019 Mikrobiomun CRISPR üsulu ilə redaktə edilməsi. Fil. Trans. R. Soc. B 374, 20180103. (doi:10.1098/rstb.2018.0103) Link, Google Scholar

de Graeff N, Jongsma KR, Johnston J, Hartley S, Bredenoord AL.

2019 Qeyri-insan heyvanlarda genom redaktəsinin etikası: akademik ədəbiyyatda bildirilən səbəblərin sistematik nəzərdən keçirilməsi. Fil. Trans. R. Soc. B 374, 20180106. (doi:10.1098/rstb.2018.0106) Link, Google Scholar


Metodlar

Məlumatların toplanması və əvvəlcədən işlənməsi

Bu tədqiqatda istifadə edilən bütün Cas zülalları mövcud təsnif edilmiş arxa və bakterial CRISPR-Cas sistemlərindən seçilmişdir [2-4]. Biz Fasta [23] istifadə edərək bu məlumatlar üzərində hamıya qarşı ardıcıl oxşarlıq müqayisəsi apardıq. Sonradan biz xüsusi oxşarlıq meyarlarına [9, 16] əsaslanaraq Markov Cluster Alqoritmindən (MCL) [24] istifadə edərək zülalları qruplaşdırdıq. Bu meyarlar zülalların ölçüsünü, uzunluğunun uyğunluğunu və 2 müqayisə edilən zülal arasında oxşar bölgələrin nisbi yerlərini nəzərə alır. Müəyyən bir Cas zülal ailəsindən zülal ardıcıllıqlarını qruplaşdırdıqdan sonra MUSCLE [25] istifadə edərək çoxlu ardıcıl düzülmə yaratdıq. Sonra, hmmbuild [17] istifadə edərək, bu hizalamalar HMM profil modellərinə çevrildi. MCL istisna olmaqla, bütün digər alətlər defolt parametrlərlə işlədilib.

Mətn boyu təlim və sınaq məlumat dəstlərimizdəki hər bir kaset kasetin bütün genlərini ehtiva edən genom ardıcıllığından və bütün şərh edilmiş Cas zülallarının siyahısından ibarət bir dəst ilə təmsil olunur. Genomik ardıcıllıqları aşağıdakı kimi çıxardıq: Makarova və başqalarından Əlavə Cədvəl S7 götürdük. [2], “(alt)Növ / Koordinatlar” sütununda bütün gen lokuslarını (yəni, genomik mövqelər) ehtiva edir və ardıcıllıqları NCBI-dən endirir. İkinci hissə, yəni bütün Cas zülallarının siyahısı üçün biz hər bir qeyd edilmiş Cas zülalının genomik ardıcıllığını yenidən “koordinatlar” sütunundan çıxardıq və 50 kontekst əsasını əlavə etdik. Əlaqədar amin turşusu ardıcıllığı Prodigal aləti v2.6.3 [26] ilə müvafiq gen ardıcıllığı ilə işlənərək yaradılıb və “ sütunundan Cas annotasiyası ilə birlikdə saxlanılıb.cas gen” Cədvəl S7-də Makarova et al. [2].

Xüsusiyyət vektorlarını yaratmaq üçün hmmsearch istifadə edərək bütün HMM profil modellərini bütün kasetlərin ardıcıllığına qarşı işlətdik. Biz həmin alt tip üçün qeyd edilmiş bütün zülallar üçün hit olan kasetləri seçdik və bundan təsnifat boru kəməri üçün təlim və sınaq dəsti kimi istifadə etdik. Əvəzində itkin zülalı olan kasetlər reqressiya modellərimiz və bütün boru kəmərimiz üçün müstəqil sınaq nümunəsi kimi istifadə edildi.

Kaset kasetlərinin təsnifatı

Bu tapşırığı yerinə yetirmək üçün, məlumat matrisinin təsvirindən istifadə edərək, Cas kasetlərini müvafiq alt tiplərə təsnif edə bilən proqnozlaşdırıcı modelləri əldə etmək üçün CRISPR məlumatlarının sonlu nümunəsinə ML alqoritmlərini tətbiq edirik (Nəticələr və Müzakirələrə baxın). Beləliklə, verilənlərin sonlu nümunəsinə əsaslanaraq, kaset və onun alt növü arasında əlaqəni ümumiləşdirməyə qadir olan funksiyanı qiymətləndirən təsnifat alqoritmlərinin tətbiqini araşdırırıq. Nəticə etibarilə, biz bu funksiyadan təlim mərhələsində görünməyən yeni kasetləri yüksək dəqiqliklə öz alt tiplərinə təsnif etmək üçün istifadə etmək niyyətindəyik.

Çatışmayan Cas zülallarının proqnozu

Biz həmçinin normallaşdırılmış bit xallarını təxmin edərək, itkin Cas zülallarının proqnozlaşdırılması problemini araşdırırıq. Bu problem üçün biz onu aşağıdakı kimi modelləşdirdik. verilmiş m Cas zülalları, biz filtrasiya edirik, hər bir alt tip üçün onun dəsti l < m zülallar (yəni, alt növün ≥1 kaseti üçün bit hesabı >0 olan bütün Cas zülalları). Sonra məşq edirik l regressors, harada jci reqressor, j ∈ <1, ⋅⋅⋅, l>, bit xalını proqnozlaşdırır jth Cas protein qalan istifadə edərək l − 1 zülal giriş kimi.

ML alqoritmlərinin eksperimental qiymətləndirilməsi

Təsnifat və reqressiya modellərini hazırlamaq üçün əvvəlcədən işlənmiş verilənlər toplusuna üç ML alqoritmi tətbiq edilmişdir:

Təsnifat və Reqressiya Ağacları (CART) [27], qərar ağacı ilə təmsil olunan proqnozlaşdırıcı modeli öyrədir. Bu alqoritm təsnifat (təsnifat ağacları) və reqressiya (reqressiya ağacları) tapşırıqları üçün qərar ağaclarını öyrədə bilər. Qərar ağacı təlim verilənlər bazasından çıxarılan şərh edilə bilən qaydalar toplusundan ibarətdir. Bu qaydalar yeni, əvvəllər görünməmiş nümunələr üçün sinif və ya reqressiya dəyərini proqnozlaşdırmaq üçün model tərəfindən verilən qərarları izah edir.

Nümunələri maksimum mümkün ayırma marjası ilə 2 sinifdən ayıran hipertəpə ilə təmsil olunan ikili təsnifatı öyrədən Dəstək Vektor Maşınları (SVM) [28]. Kernel funksiyalarından istifadə etməklə, SVM qeyri-xətti ayrıla bilən problemlərə tətbiq edilə bilər. Çoxsınıflı təsnifat tapşırıqları üçün çoxsinifli verilənlər toplusu adətən əvvəlcə bir neçə təsnifat ikili verilənlər toplusuna parçalanır. SVM-lər daha sonra hər ikili verilənlər bazasına tətbiq oluna bilər və onların proqnozları çoxsinifli təsnifat üçün birləşdirilir.

Həddindən artıq Randomized Ağaclar (ERT) [29], qərar ağacları ansamblından istifadə edir, burada hər bir ağac orijinal xüsusiyyətlərin təsadüfi alt dəstindən istifadə etməklə öyrədilir. Klassik qərar ağacları üçün olduğu kimi, bölünmə üçün nəzərdə tutulan hər bir xüsusiyyət üçün ən yaxşı ayrı-seçkilik həddini seçmək əvəzinə, ERT təsadüfi həddi seçir. Son proqnozlar ansambldakı bütün qərar ağaclarının proqnozlarının ortasıdır. Təsnifat və ya reqressiya tapşırığında hər bir xüsusiyyətin əhəmiyyətini ansambldakı qərar ağaclarından çıxara bilərik. Əhəmiyyət, xüsusiyyəti bölən bir node səbəb olduğu çirkin azalması ilə təmsil olunur, belə bir qovşaqda olan nümunələrin sayı ilə ölçülür [30] və ansamblın bütün ağacları üzərində orta hesablanır.

Model seçimi və proqnozlaşdırıcı modellərin qiymətləndirilməsi ML ədəbiyyatında geniş şəkildə öyrənilən problemdir. Bir neçə əsər (məsələn, [31-33]) müxtəlif metodologiyaların üstünlüklərini və çatışmazlıqlarını araşdırır. Bu əvvəlki tədqiqatlar əsasında biz iç içə çarpaz doğrulama prosedurundan istifadə edirik. Verilənlər toplusunu nəzərə alaraq, klassik çarpaz doğrulama yanaşması məlumatları ikiyə bölür K kıvrımlar adlanan bir-birini istisna edən və oxşar ölçülü alt çoxluqlar. Sonra, hər iterasiyada, K − 1 qat ML modelini öyrətmək üçün, qalan qat isə onu sınaqdan keçirmək üçün istifadə olunur [34, 35]. İç içə çarpaz doğrulama yanaşması 2 müxtəlif çarpaz doğrulama döngəsindən istifadə etməklə model seçimi və qiymətləndirmə mərhələlərini ayırır: məlumatları aşağıdakılara bölən xarici döngə K1 qatlanır və modelin qiymətləndirilməsi və təlim məlumatlarını bölən daxili dövrə üçün istifadə olunur K2 qatlanır və model seçimi üçün istifadə olunur. Bu yazıda biz təyin etdik K1 = K2 = 10 və müxtəlif bölünmələri nəzərdən keçirərkən nəticələrin fərqliliyinə görə qiymətləndirmə prosedurunu 50 dəfə təkrarlayın [33]. Qeyd etmək vacibdir ki, təcrübələrimiz zamanı bütün siniflərdən nümunələrin hər bir xarici qatda olmasını təmin etmək üçün biz yalnız ≥10 nümunədən ibarət siniflərdən istifadə etdik.

Hər bir çarpaz doğrulama iterasiyası üçün, xüsusən də verilənlər bazası balanssız olduqda, yarana biləcək hər hansı ortalama problemin qarşısını almaq üçün bütün qatlardan olan proqnozları birləşdirir və vahid proqnozlaşdırıcı performans qiymətləndirməsini hesablayırıq [36]. Təsnifat təcrübələri üçün biz aşağıdakı qiymətləndirmə ölçülərindən istifadə etdik: düzəliş edilmiş balanslaşdırılmış dəqiqlik balı [37, 38], daha kiçik siniflərdən nümunələrə daha yüksək çəkilər verən orijinal dəqiqlik ölçüsünün uyğunlaşdırılması və makro-ortalama ilə F-balı [39] , bu, bütün siniflər arasında orta F-balıdır. Hər iki tədbir müxtəlif alt tiplərə bərabər yanaşır. Beləliklə, ən çox kaset sayına sahib olanlara üstünlük vermirlər. Reqressiya təcrübələri üçün biz gözlənilən və proqnozlaşdırılan hədəf dəyərləri arasında orta mütləq fərq olan orta mütləq xətadan [40] istifadə etdik.

İstifadə olunan hər bir ML alqoritminin model seçimi addımı ilə əlaqədar olaraq, scikit-learn paketinin [41] təlimatlarına əsaslanaraq, 20 müxtəlif hiperparametr birləşmələri üzərində şəbəkə axtarışı həyata keçirdik. Bu hiperparametr torlarını aşağıda təsvir edirik. CART alqoritmi üçün biz qərar ağacının maksimum dərinliyini və düyünün yarpağa çevrilməsi üçün lazım olan minimum nümunə sayını təyin edən hiperparametrləri dəyişdik. Birincisi üçün biz <5, 10, 15, max >-dəki dəyərləri nəzərdən keçirdik, burada maks ağacın mümkün qədər dərin böyüməsinə imkan verir. Sonuncu üçün biz <5, 6, 7, 8, 9>-da dəyərləri dəyişdik. SVM alqoritmi üçün qeyri-xətti qərar sərhədlərini modelləşdirmək qabiliyyətinə və başqa bir çox istifadə edilən qeyri-xətti nüvə ilə müqayisədə hiperparametrlərin sayının azaldılmasına görə Qauss nüvəsindən istifadə etdik [42]. Xərc hiperparametri üçün C, biz <1 10 100 1,000>-dəki dəyərləri nəzərdən keçirdik. γ ləpə əmsalı ilə bağlı qiymətləri <0.01, 0.1, 1, 10, 100>-də qiymətləndirdik. Nəhayət, ERT alqoritmi üçün biz <25, 50, 75, 100>-dəki dəyərlərdən istifadə edərək ansamblın ölçüsünü və |$lbrace 25-dəki qiymətlər dəstindən bölünmə həyata keçirərkən nəzərə alınacaq xüsusiyyətlərin miqdarını dəyişdik. %, 50\%, 75\%, 100\%, sqrt brace$|⁠ , harada m məlum Cas protein ailələrinin sayıdır.


5 NƏTİCƏ VƏ GƏLƏCƏK PERSPEKTİVİ

CRISPR-Cas sistemlərinin bioloji mexanizminin tədqiqi prokaryotik qazanılmış immun sisteminin müxtəlifliyini və mürəkkəbliyini göstərmişdir. Son onilliklərdə bir sıra tədqiqatlar öyrənməmiz üçün bir çərçivə yaratsa da, bu müdafiə sistemlərinin başa düşülməsi hələ də daha əhatəli təsvirlərə ehtiyac duyur.

Bakteriya və virusların plastikliyi gRNA hədəflərinin genetik polimorfizminə səbəb ola bilər ki, bu da CRISPR-Cas əsaslı müalicə və diaqnozu səmərəsiz edir. PAM ardıcıllığında mutasiyalar da aşkar edilmişdir ki, faglar CRISPR-Cas sistemlərindən uzaqlaşa bilirlər. Problemin müxtəlif hədəfləmə ardıcıllığı ilə müxtəlif gRNA-ların çatdırılması və qablaşdırılması ilə həll edilə biləcəyini görmək qalır.

Alətlər dəstində zəruri biomolekulların saxlanması və aktivləşdirilməsinin texniki problemləri kommersiyalaşma yolunda hələ də qaçılmazdır. RNT fermentlərinin geniş yayılmış olması səbəbindən RNT kövrəkdir, hədəf nuklein turşularının aşkarlanması asanlıqla təsirlənir. Burada, CRISPR-Cas sistemlərində siqnal gücləndirilməsi üçün istifadə edilən daha uzun sgRNA-ların hər yerdə olan RNase tərəfindən kəsilməməsi və ya deqradasiyasına əmin olmaq vacibdir ki, bu da mənfi yalana gətirib çıxarır. Bundan əlavə, in vivo CRISPR-Cas sistemlərinin hədəf dərman çatdırılması hədəfdə və ya hədəfdən kənarda aşkar toksikliyin olub-olmamasından asılı olmayaraq hələ də problemdir.

Xüsusi nuklein turşusu ardıcıllığını müəyyən etmək üçün fərqli xüsusiyyətləri ilə, DNT və ya RNT-də daha spesifik dəyişikliklərə cavab verən CRISPR-Cas əsaslı “ağıllı” materialların layihələndirilməsi də inkişafın gələcək istiqamətidir. Üstəlik, bu “ağıllı” materialların biosensasiya, tibbi implant, dərman buraxma və müalicə üçün istifadə olunan idarə olunan buraxılan örtüklər, cavab verən biomateriallar, öz-özünə yığılan hidrogellər, forma yaddaşı agentləri və sensor platformalar kimi tətbiqləri var. Məsələn, hidrogel nanosferi ilə yüklənmiş spesifik sirkulyasiya edən şiş DNT-yə cavab verən antitümör dərmanları, dövriyyədəki hədəf şiş DNT-sinə cavab olaraq dəqiq şəkildə sökülən və şiş hüceyrələrinin geniş metastazına nəzarət edən dizayn edilmiş gRNA-ların çarpaz əlaqəsi ilə hazırlana bilər. Bundan əlavə, xüsusi patogen nuklein turşusu ardıcıllığı sensoru və çevik maskalara inteqrasiya olunmuş rəng göstəricisi ilə ağıllı çevik sarğı da hazırlana bilər ki, bu da COVID-19 kimi tənəffüs yoluxucu xəstəliklər üçün intuitiv və həssas qoruyucu avadanlıq təmin edir. Daha dəqiq desək, hədəf nukleotid ardıcıllığının olması ilə Cas zülalının parçalanma funksiyası işə salınır, flüoresan məruzəçinin aktivləşdirilməsi və ya buraxılması və görünən rəng dəyişikliyi əmələ gəlir.


Mücərrəd

CRISPR-Cas arxe və bakteriyalarda yad genetik elementləri parçalayan adaptiv immun sistemləridir. İmmunitet funksiyalarını yerinə yetirərkən CRISPR-Cas sistemləri böyük ölçüdə RNT komponentlərinə güvənir. Bu CRISPR (cr) RNT-lər pre-crRNA-nın, CRISPR massivlərinin transkriptinin emalı ilə istehsal olunan təkrar boşluq vahidləridir və Cas zülal(lar)ını qohumlu işğalçı nuklein turşularına yönləndirərək, onların məhv edilməsinə şərait yaradır. Yalnız DNT ardıcıllığına əsaslanan CRISPR massivlərini aşkar etmək üçün bir neçə bioinformatika aləti hazırlanmışdır, lakin bütün bu alətlər CRISPR massivinin təkrarlarına uyğun ola biləcək təkrarlanan nümunələri axtarmaq üçün eyni strategiyadan istifadə edir. Müəyyən edilmiş nümunələr sabit, daxili qiymətləndirmə funksiyasından istifadə etməklə qiymətləndirilir və kəsmə dəyərini aşan massivlər haqqında məlumat verilir. Bunun əvəzinə biz bir neçə xüsusiyyətə əsaslanaraq həqiqi CRISPR massivlərini saxta olanlardan aşkar etmək və fərqləndirmək üçün maşın öyrənməsindən istifadə edən verilənlərə əsaslanan yanaşma təqdim edirik. Bizim CRISPR aşkarlama alətimiz CRISPRidentify üç addımı yerinə yetirir: aşkarlama, xüsusiyyətin çıxarılması və CRISPR massivlərinin müsbət və mənfi nümunələrinin əl ilə seçilmiş dəstləri əsasında təsnifat. Müəyyən edilmiş CRISPR massivləri daha sonra ətraflı annotasiya ilə birlikdə istifadəçiyə bildirilir. Biz nümayiş etdiririk ki, yanaşmamız təkcə əvvəllər aşkar edilmiş CRISPR massivlərini deyil, həm də digər alətlər tərəfindən aşkar edilməyən CRISPR massiv namizədlərini müəyyən edir. Digər üsullarla müqayisədə bizim alətimiz yanlış müsbət nisbətini kəskin şəkildə azaldır. Mövcud alətlərdən fərqli olaraq, bizim yanaşmamız istifadəçiyə nəinki müəyyən edilmiş CRISPR massivləri üzrə əsas statistikanı təqdim edir, həm də verilmiş genomik bölgənin CRISPR massivi olması ehtimalının praktiki ölçüsü kimi müəyyənlik xalını yaradır.


Öyrənmək üçün Case Studilərindən istifadə

Bir çox tələbələr deduktiv əsaslandırıcılardan daha induktivdirlər, bu o deməkdir ki, onlar əsas prinsiplərdən başlayaraq məntiqi inkişafdansa, nümunələrdən daha yaxşı öyrənirlər. Buna görə də, nümunə araşdırmalarından istifadə çox təsirli bir sinif texnikası ola bilər.

Keys tədqiqatları uzun müddətdir biznes məktəblərində, hüquq fakültələrində, tibb fakültələrində və sosial elmlərdə istifadə olunur, lakin təlimatçılar tələbələrin öyrəndiklərinin real dünya vəziyyətlərinə necə tətbiq olunduğunu araşdırmalarını istədikləri zaman onlardan hər hansı bir intizamda istifadə edilə bilər. Davalar bir çox formatda olur, sadə “Bu vəziyyətdə nə edərdiniz?” sualından situasiyanın təfərrüatlı təsvirinə və təhlil etmək üçün müşayiət olunan məlumatlara qədər. Sadə ssenari tipli işdən və ya mürəkkəb təfərrüatlı ssenaridən istifadə etməyiniz kursun məqsədlərindən asılıdır.

Əksər hallarda tapşırıqlar tələbələrdən açıq suala cavab vermələrini və ya çoxsaylı potensial həll yolları ilə açıq tipli problemin həllini inkişaf etdirmələrini tələb edir. Tələblər bir abzaslıq cavabdan tutmuş tam işlənmiş qrup fəaliyyət planına, təklif və ya qərara qədər dəyişə bilər.

Ümumi İş Elementləri

Əksər “tam işlənmiş” hallar bu ümumi elementlərə malikdir:

  • Həll edilməli olan bəzi sual və ya problemlə mübarizə aparan qərar verən şəxs.
  • Problemin kontekstinin təsviri (qanun, sənaye, ailə).
  • Məlumat cədvəllərindən tutmuş URL-lərə keçidlərə, sitat gətirilən ifadələrə və ya ifadələrə, dəstəkləyici sənədlərə, şəkillərə, videolara və ya audiolara qədər dəyişən dəstəkləyici məlumatlar.

Keys tapşırıqları fərdi və ya komanda halında edilə bilər ki, tələbələr həll yollarını müzakirə edə və iş yükünü bölüşə bilsinlər.

Bu mövzunun aşağıdakı müzakirəsi İdarəetmə Məktəbindən Robb Dixon və İctimai Sağlamlıq Məktəbindən Rob Şadtın CEIT seminarlarında təqdim etdiyi materialları özündə birləşdirir. Professor Dikson, həmçinin müzakirənin daxil olduğu bəzi yazılı şərhlər verdi.

Dərsdə keys tədqiqatlarından istifadənin üstünlükləri

Keys tədqiqatları ilə tədrisin əsas üstünlüyü ondan ibarətdir ki, tələbələr nümunələrdən mücərrəd çıxararaq prinsipləri müəyyən etməkdə fəal iştirak edirlər. Bu, onların bacarıqlarını inkişaf etdirir:

  1. Problemin həlli
  2. İşdən asılı olaraq kəmiyyət və/yaxud keyfiyyətcə analitik alətlər
  3. Mürəkkəb vəziyyətlərdə qərar qəbul etmək
  4. Qeyri-müəyyənliklərlə mübarizə

Sinifdə nümunə araşdırmalarından istifadə qaydaları

Ən sadə tətbiqdə nümunənin təqdimatı təhlil üçün çərçivə yaradır. Əgər işin ifadəsi tələbələrin həll yollarını tapmaq və sonra bu həlləri digər oxşar vəziyyətlərdə necə tətbiq edəcəyini müəyyən etmək üçün kifayət qədər məlumat təqdim edərsə faydalı olar. Təlimatçılar bir neçə hadisədən istifadə etməyi seçə bilər ki, tələbələr işlər arasında həm oxşarlıqları, həm də fərqləri müəyyən edə bilsinlər.

Kursun məqsədlərindən asılı olaraq, təlimatçı tələbələri onların təhlilinə sistemli yanaşmaya həvəsləndirə bilər. Misal üçün:

  • Məsələ nədir?
  • Təhlilin məqsədi nədir?
  • Problemin konteksti nədir?
  • Hansı əsas faktlar nəzərə alınmalıdır?
  • Qərar verən şəxs üçün hansı alternativlər mövcuddur?
  • Siz nəyi tövsiyə edərdiniz və nə üçün —?

İşin təhlilinə innovativ yanaşma tələbələrin işdə iştirak edən şəxslərin rolunu oynaması ola bilər. Bu, nəinki tələbələri fəal şəkildə cəlb edir, həm də onları hadisə personajlarının perspektivlərini həqiqətən anlamağa məcbur edir. İşin yerləşdiyi məkanı göstərən videolar və ya hətta çöl səfərləri tələbələrə təhlil etməli olduqları vəziyyəti vizuallaşdırmağa kömək edə bilər.

Müşayiət oxunuşları

Keys tədqiqatları, xüsusən də işə aid olan konsepsiya və ya analitik metodu təqdim edən və ya izah edən oxu tapşırığı ilə birləşdirildikdə təsirli ola bilər. Məsələnin müzakirəsi zamanı oxunun istifadəsinə verilən diqqətin miqdarı konsepsiyanın və ya metodun mürəkkəbliyindən asılıdır. Düzdürsə, müzakirənin əsasını analitik nəticələrin istifadəsinə yönəltmək olar. Metod daha mürəkkəbdirsə, təlimatçı tələbələri onun tətbiqi və nəticələrin şərhi ilə tanış etməli ola bilər.

İşin Müzakirəsinə rəhbərlik etmək və Fəaliyyətin Qiymətləndirilməsi

Qərar halları təsviri olanlardan daha maraqlıdır. Sinifdə müzakirəyə başlamaq üçün müəllim asan, mübahisəsiz sualla başlaya bilər ki, ona bütün tələbələr asanlıqla cavab verə bilsinlər. Bununla belə, ən yaxşı vəziyyət müzakirələrindən bəziləri tələbələri mövqe tutmağa məcbur etməklə başlayır. Bəzi müəllimlər tələbədən onun bütün təhlilini təsvir edərək işin rəsmi “açıq” olmasını xahiş edəcəklər. Digərləri tələbələri problemin müəyyənləşdirilməsindən həll yollarına aparan suallarla müzakirəyə rəhbərlik etməyi seçə bilərlər. Bacarıqlı təlimatçı, sinifi yolda saxlamaq və məqbul bir sürətlə hərəkət etmək üçün suallara və müzakirələrə rəhbərlik edir.

Tələbələri dərsdən əvvəl tapşırığı yerinə yetirməyə həvəsləndirmək, eləcə də dərs zamanı diqqətliliyi stimullaşdırmaq üçün müəllim işin müzakirəsi zamanı iştiraka qiymət verməlidir - kəmiyyət və xüsusilə keyfiyyət. Bu sadə yoxlama, yoxlama-plus, yoxlama-minus və ya sıfır ola bilər. Təlimatçı mümkün qədər çox tələbə cəlb etməlidir. Bütün tələbələri cəlb etmək üçün təlimatçı onları qruplara ayıra bilər, hər qrupa məsələ ilə bağlı suala necə cavab veriləcəyini müzakirə etmək üçün bir neçə dəqiqə vaxt verə bilər və sonra hər qrupdan təsadüfi seçilmiş şəxsdən qrupun cavabını təqdim etməsini xahiş edə bilər. və əsaslandırma. Təsadüfi seçim zarların yuvarlanması, qarışdırılmış indeks kartları, hər birində bir tələbənin adı, fırlanan təkər və s. vasitəsilə həyata keçirilə bilər.

Resurslar

Bu texnikadan elm kursunda istifadə etməkdə maraqlısınızsa, Buffalo Universitetində elmlərdə nümunə araşdırmalarından istifadəyə dair yaxşı bir vebsayt var.


Videoya baxın: CRISPR Cas9 (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Marquis

    Are you joking?

  2. Cymbelline

    Dəstəyiniz üçün sizə çox şey demək üçün forumda xüsusi olaraq qeydiyyatdan keçmişəm.

  3. Dushicage

    Wacker, möhtəşəm bir ifadədir və vaxtındadir



Mesaj yazmaq