Məlumat

Peptidlərin orta və monoizotopik kütlə hesablamaları arasında fərq nədir?

Peptidlərin orta və monoizotopik kütlə hesablamaları arasında fərq nədir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən tez-tez buradakı kimi kalkulyatorlardan istifadə edərək peptid ardıcıllığının kütləsini hesablamalı oluram.

Orta və monoizotop kütləni hesablamaq imkanım var, amma fərq nədir?


Adətən peptidləri və zülalları təşkil edən elementlər müxtəlif izotoplarda ola bilər. Məsələn, karbon 98,9%-ə qədər $ce{^12C}$, 1,1%-ə qədər isə $ce{^13C}$ şəklində mövcuddur.

Monoizotopik kütlə hər bir elementin ən bol izotopda mövcud olduğunu güman edir, orta kütlə isə izotopların təbiətdəki faktiki paylanmasından istifadə edir.

Kütləvi spektrinizdə kifayət qədər ayırdetmə qabiliyyətiniz varsa, molekulunuzun müxtəlif izotop tərkibinə uyğun gələn çoxsaylı siqnalları görə bilərsiniz.


UNM Kütləvi Spektrometriya Dərsliyi

Elektrosprey ionlaşma kütlə spektrometriyası (ESMS) Micromass Q-Tof kütlə spektrometrində molekulyar çəkisi 100-dən 100.000-dən çox olan nümunələrdə aparılır (Ətraflı məlumat). Bundan əlavə, bir çox başqa növ nümunələr (məsələn, karbohidratlar, lipidlər və polimerlər) Q-Tof-da təhlil edilə bilər.

Onu da qeyd etmək lazımdır ki, aşağıda verilmiş orta kütlə dəqiqliyi təxmin edilir və hər hansı bir nümunə üzrə kütlə xətası bu təxminlərdən ya yüksək, ya da aşağı ola bilər. Kütləsi 3 kDa-dan az olan molekullar üçün monoizotop kütlələr, daha böyük molekullar üçün isə orta kütlələr istifadə edilməlidir.


Peptidlərin orta və monoizotopik kütlə hesablamaları arasında fərq nədir? - Biologiya

Bu sənəd MS-Fit üçün təlimatları təmin edir.

MS-Fit Karl Clauser və Peter Bakerin birlikdə hazırladıqları ilk proqram idi. Adı proqramın gözlənilən istifadəsindən irəli gəlir: korrelyasiya Meşşək Sardıcıllıq verilənlər bazasında ən yaxşı olan zülal ilə pektometriya məlumatları (yalnız ana kütlələr, fraqment kütlələri deyil) Uyğuns məlumatlar. Qeyd edək ki, uyğun söz seçilib və müəyyən edən söz DEYİL. 1995-ci ilin yazında, ad seçildikdə, MS-Fit-in istifadəsindən əvvəl tipik peptid kütləsinin barmaq izinin alınması təcrübəsi fermentlə zülalı həzm etmək, sonra hər birinin kütlələrini təyin etmək üçün peptidlərin əldə edilən qarışığı üzərində MALDI kütlə spektrometriyasını həyata keçirmək idi. peptid. O zaman MALDI-dan davamlı çıxaran, reflektorlu uçuş vaxtı alətində istifadə edilən ən müasir kütlə dəqiqliyi +/- 0,5 Da idi. Bu kütləvi dəqiqlik səviyyəsi bir neçə onilliklər əvvəl maqnit sektoru alətləri ilə müəyyən edilmiş +/- 10 ppm standartı ilə müqayisədə zəif idi. Beləliklə, fikrimizcə, MS-Fit əlverişli hallarda (hər iki növ və təxmini bütöv protein molekulyar çəkisi məlum olduqda) sadəcə ola bilər. zülal eyniliyini təklif edir. Kimə zülal şəxsiyyətini təyin edin biri, fikrimizcə, bir sıra ardıcıl dəstəyə ehtiyac duydu. Bu dəstəyi MS/MS və bizim sonradan hazırlanmış proqramımızın birgə istifadəsindən əldə etmək olar.

1996-cı ildə gecikmiş ekstraksiya MALDI-nin inkişafı reflektor MALDI-TOF alətlərində kütlə ölçmə dəqiqliyini çox yaxşılaşdırdı. 5-100 ppm aralığında kütləvi dəqiqlik artıq mümkündür. Bu diapazonun aşağı ucu (ən yaxşı kütlə dəqiqliyi) daxili kalibrləmə və uzun uçuş boruları ilə, yüksək səviyyəyə isə xarici kalibrləmə və qısa uçuş boruları ilə daxil olmaq mümkündür.

Nəticə etibarı ilə, zülallar indi MS-Fit ilə tək kütlələrdən istifadə edərək peptid kütləsi barmaq izi ilə inamla müəyyən edilə bilər. İdentifikasiya əminliyi ilk növbədə kütləvi dəqiqlik səviyyəsinin funksiyasıdır.

Şəxsiyyətdən başqa istənilən axtarış rejiminin seçilməsi MS-Tag mutasiya matrisi rutinini işə salmaqla MS-Fit-i homoloji rejimə keçir. Bu rejimdə mümkün dəyişikliklər üçün MS-Fit rutinləri yan keçilir. Əvəzində MS-Tag Homology rejimində icazə verilən dəyişdirilmiş AA dəsti istifadə olunur.

Praktikada homologiya rejimi yalnız aşağıdakı şərtlərdən biri və ya bir neçəsi tətbiq edildikdə istifadə edilməlidir:

  • peptid kütlə məlumatları əla kütlə dəqiqliyinə malikdir (+/- 10 ppm və ya daha yaxşı)
  • dar bütöv protein MW filtri istifadə olunur
  • Xitlər saxlanacaq və MS-Tag vasitəsilə axtarılacaq

MS-Fit peptid kütlə filtrlərindən birindən keçən hesablanmış peptid kütləsi ilə verilənlər bazası ardıcıllığına uyğun gəlir. Normalda filtrlər istifadəçi tərəfindən təmin edilən peptid kütlələri +/- peptid kütləsinin tolerantlığı (standart filtr) ilə müəyyən edilir. Homologiya rejimində bu filtrlər istifadəçi tərəfindən təmin edilən peptid kütlələrinə +/- peptid kütləsinin sürüşməsinə yenidən konfiqurasiya edilir (tam təfərrüatlar üçün ana kütlənin dəyişməsi haqqında MS-Tag təlimatının bölməsinə baxın). Bununla belə, verilənlər bazasındakı xüsusi zülal girişi standart filtr axtarışında istifadəçi tərəfindən təmin edilən peptid kütlələrinin ilkin kəsilmiş sayı ilk dəfə uyğun gəlmədiyi halda, bu genişləndirilmiş homoloji filtrlərə məruz qalmır. Bu ilkin kəsmə parametrlə idarə olunur: Min. # AA əvəzetmə ilə uyğun gəlir.

Homoloji genişləndirilmiş peptid kütlə filtrindən keçən verilənlər bazası ardıcıllığı daha sonra verilənlər bazası ardıcıllığının hesablanmış kütləsini eksperimental olaraq müəyyən edilmiş kütləyə çevirəcək tək AA əvəzetməsini tapmaq və tapmaq üçün mutasiya matrisindən keçirilir. Çıxışda eksperimental peptid kütləsi məlumatlarına uyğun olan zəruri əvəzetmə və müvafiq ardıcıllıq göstərilir (bazada mövcud olan ardıcıllıq deyil).

Bu, homoloji zülallarla necə davranılacağını müəyyənləşdirir. Defolt "maraqlıdır", yəni homoloji zülal yalnız zülala uyğun gələn ən azı bir unikal peptid olduqda bildiriləcək. Bəzən homologiya səviyyəsi kifayət qədər aşağı olduqda (məsələn, zülallar arasında on peptiddən yalnız ikisi eynidir) zülallar homolog kimi bildirilir.

Verilənlər bazasında müəyyən bir zülalın hit yaratmaq üçün o, ən azı uyğun olmalıdır Uyğunlaşmaq üçün Tələb olunan Peptidlərin Minimum Sayı giriş məlumatlarından kütlələr.

MS-Fit tərəfindən bildirilən MOWSE balı Pappin et al, Current Biology, 1993, Vol 3, No 6, s 327-də təsvir olunan qiymətləndirmə sisteminə əsaslanır. MS-Fit MOWSE-nin ilkin versiyasında mövcud olmayan bir neçə variant təklif etdiyi üçün bir neçə dəyişiklik edilməli oldu.

Növləri və molekulyar çəkisini əvvəlcədən axtardıqdan sonra qalan zülallar nəzəri həzmdən keçir. Yaranan peptidlər daha sonra onların molekulyar çəkisi və mənşəyi həzm olunmamış zülalın bütöv molekulyar çəkisi əsasında qutulara yerləşdirilir. On bir bütöv molekulyar çəki qutusu var. 100000 Da altında eni 10000 Da olan 10 qutu var. Digər qutuda 100000 Da-dan çox olan bütün zülallar var. 0-3000 Da arasında eni 100 amu olan otuz peptid molekulyar çəkisi var. 3000 Da-dan yuxarı olan peptidlər yığılmır. Buraxılmış parçalanmaları olmayan peptidlər qutunun cəminə 1,0, buraxılmış parçalanmaları olan peptidlər isə töhfə verir. pfaktor (istifadəçi tərəfindən verilən parametr).

Bundan sonra zibil qutusunun tezliyi dəyərləri hər 10000 Da zülal intervalı üçün zibil qutusunun cəmlərinin cəminə bölünməklə hesablanır. Sonra zibil tezliyi dəyərləri 0 və 1 arasında tezlik dəyərləri əldə etmək üçün ən böyük bin tezliyi dəyərinə normallaşdırılır.

Verilənlər dəstindəki kütlələrə uyğun gələn nəzəri həzmdə kütlələr xallı uyğunluqlara və qolsuz uyğunluqlara bölünür. Qiymətləndirmə uyğunluqlarına dəyişdirilməmiş peptidlər və akrilamidlə dəyişdirilmiş Cys və N-terminal Gln-dən pyroGlu-ya və dəyişdirilməmiş peptidin iştirakı ilə Met oksidləşməsi daxildir. Qeyri-qiymətli uyğunluqlara pyroGlu və Met-in dəyişdirilməmiş peptid olmadığı halda oksidləşməsi, asetilləşdirilmiş N-terminalları, S, T və Y-nin fosforlaşması və tək amin turşusu əvəzetmələri daxildir. Bənzərsiz kütlələr nəzərə alınmır. Hər uyğun gələn kütlə üçün hesab müvafiq normallaşdırılmış paylanma tezliyi dəyəri kimi təyin edilir. Çoxlu uyğun kütlələr olduqda, xallar birlikdə vurulur. Yekun məhsul hesabı ters çevrilir və orta protein molekulyar çəkisi 50 kD-ə qədər normallaşdırılır.

Qiymətləndirmə seçilmədikdə MS-Fit sadə sıralama sistemindən istifadə edir. Nəticələr elə sıralanır ki, əgər birdən çox verilənlər bazası qeydləri uyğunlaşdırılarsa, daha çox ehtimal olunan ardıcıllıqlar siyahıda yuxarıda göstərilsin. Giriş məlumatlarına və parametrlərinə uyğun gələn bütün verilənlər bazası qeydləri aşağıdakı əsasda sıralanır:

  1. Ən az sayda bənzərsiz kütləyə malik verilənlər bazası girişləri daha yüksək sıralanır.
  2. Ekvivalent uyğunluqlar arasında (eyni dərəcəyə malik olanlar) nəticələr indeks sayının artması sırasına görə sıralanır.

Qeyd edək ki, sonuncu növ bunu edir YOX demək a YAXŞI sıralama, baxmayaraq ki, bir matç digərindən daha yüksək siyahıya alınacaq, lakin sadəcə siyahıya müəyyən bir təşkilat təmin etmək məqsədi daşıyır.

Çoxaldılmış yüklü ionlar bütün Protein Prospector proqramlarında oxşar şəkildə idarə olunur.

Monoizotop/Orta Bayraqlar indi kütlə/yük sütununun sağındakı sütunda təyin oluna bilər. Əvvəlcə təyin etməlisiniz Peptid kütlələri bunlardır: üçün monoizotop və sonra m/z dəyərinin monoizotop (0) və ya orta (1) olduğunu bildirmək üçün buraya 0 və 1 sütununu daxil edin. m/z dəyərləri ilə eyni sayda 0/1 olmalıdır. Sütun boş qalırsa, bütün dəyərlərin əvvəlki kimi monoizotop olduğu qəbul edilir.

Bu seçim hazırda yalnız lisenziya sahibləri üçün əlçatandır. MS-Fit HTML daxiletmə səhifəsində müvafiq elementlər adətən şərh edilir.

MS-Fit təfərrüatlı hesabatında hər vuruşun sonunda yalnız bənzərsiz kütlələrdən istifadə edərək sonrakı axtarışa imkan verən bir keçid var. Sonrakı axtarışlar orijinal axtarışda istifadə edildiyi kimi, uyğunluq üçün tələb olunan kütlələrə təqdim edilən kütlələrin eyni nisbətindən istifadə edir.

MS-Fit ətraflı hesabatında hər vuruşun sonunda bənzərsiz kütlələrin siyahısı var. Bu kütlələrdən birini klikləsəniz, kütlənin vurulmuş zülaldakı hər hansı peptidlərə uyğun olub olmadığını görə bilərsiniz. Adi ferment parçalanma qaydaları nəzərə alınmır.

TIC faizi, orta xəta, məlumat tolerantlığı və buraxılmış parçalanmaların orta sayı MS-Fit vurduqdan sonra çap olunur. İntensivliklər göstərilməyibsə, faiz TIC dəyəri uyğun gələn kütlə faizi ilə eyni olacaq. Orta səhv nəticələrdəki sistematik səhvlərin diaqnostikası üçün faydalıdır - kalibrləmə problemini göstərir. Məlumatların tolerantlığı nəticələrin standart sapmasından iki dəfə çoxdur və sistematik səhvlər olmadıqda tolerantlıq parametri kimi istifadə edilməli olan rəqəmdir. Ağlabatan sayda uyğun gələn zirvələr (məsələn, 10) olduqda bu rəqəm daha etibarlıdır. Həmçinin nömrə yalnız bütün uyğun gələn peptidlər real hit olduqda etibarlıdır.


Kütləvi Dəqiqlik və Qətnamə

Artan, ölçülən kütləvi dəqiqlikgörüntü imkanı indi erkən narkotik kəşfindən kənarda müxtəlif tətbiqlərdə struktur xarakteristikası üçün dominant vasitədir. Bu gün bir sıra istehsalçılar tərəfindən təklif olunan dördqütblü uçuş vaxtı (QTOF) alətləri geniş spesifiklik və faydalılıq imkanları ilə digər LCMS texnologiyalarını əvəz edir.

Daha yüksək səviyyəli alətlər mövcud olsa da, QTOF alətinin yüksək kütlə dəqiqliyi həqiqi, hesablanmış monoizotop dəyərinin milyonda bir neçə hissəsinə düşür və onun yüksək ayırdetmə qabiliyyəti (dördqütblü alətdən 10 dəfə yüksək) bizə empirik göstəriciləri müəyyən etməyə imkan verir. kütlə qüsuruna görə düsturlar (burada hidrogenin və mövcud digər atomların kritik kütlə dəyəri fərqləndirici rolunu oynayır). Spesifikasiya təhlili— məsələn, aldehid və sulfid arasındakı fərqi ayırd etmək — iki kütlənin 0,035 Da fərqləndiyi dördqütbün hüdudlarından 30 ppm-ə qədər kütlə dəqiqliyinin artması ilə mümkün olur. Bununla belə, metilasiya ilə əlaqəli metabolik proseslər arasında fərqləndirmə daha tələbkardır. CH əlavə etmək2 hidroksilləşməni (oksigenin əlavə edilməsini) əhatə edən iki mərhələli biotransformasiya və sonra ikiqat bağda oksidləşmə (H itkisi) ilə müqayisədə ölçülmüş kütlədə prekursordan (təkcə dərmana cavab) artım yaradır (yalnız dərmana reaksiya) +14,0157 Da2), bu da +13,9792 Da artıma səbəb olur. Bununla belə, hər iki ölçmə, nominal ayırdetmə ilə məhdudlaşdıqda - tipik dördqütblü reaksiya - +14 Da kimi görünəcəkdir.

Yüksək kütlə dəqiqliyi və aşağı qətnamə

Aşağı rezolyusiyaya malik dördqütblü alətlər zülalların təhlili üçün istifadə olunanlar kimi son dərəcə yüksək kütlə dəqiqliyi ölçmələri üçün yaxşı performans göstərir. İzotop zirvələri bir-birinə nisbətən həll edilmədikdə zülalların kütlələri ümumiyyətlə "orta" dəyərlər kimi müəyyən edilir. Orta kütlə bir molekuldakı bütün izotopik növlərin orta çəkisidir. Adətən dördqütblü alətlərdə istifadə edilən instrumental ayırdetmə 10 kDa zülal üçün həll edilmiş cavabı x1,27 faktoru ilə genişləndirir. Kütlə artdıqca bu amil əhəmiyyətli dərəcədə artır (məsələn, 100 kDa-da x2,65-ə qədər). Ancaq pik enini azaltmaqla m/z Tipik pik genişliyindən (m/z 0.6) vəziyyəti kəskin şəkildə yaxşılaşdırır.

Təcrübədə böyük molekulların ESI-MS analizləri çoxalmış yüklü ionlar istehsal edir. Beləliklə, kütlə-yük nisbəti miqyasında genişliyi vermək üçün genişlikləri iondakı yüklərin sayına bölmək lazımdır. Məsələn, üzərində 10 və ya 20 yük olan 20 kDa zülal 0,9 və ya 0,45 izotop zərfləri əmələ gətirəcək. m/z enində vahidlər m/z

Bu ionlar izotopları həll etmək üçün tələb olunandan (məsələn, 10.000 ayırdetmədən az) əhəmiyyətli dərəcədə aşağı ayırdetmə üçün quraşdırılmış alətdə müşahidə edildikdə, hər bir yük vəziyyəti üçün tək pik yaranır. Ümumi genişlik alətin pik eni ilə izotop zərfinin nəzəri eninin iondakı yüklərin sayına bölünməsi ilə müəyyən edilir. İnstrumental pik eni aşağı molekulyar ağırlıqlı birləşmənin ilk izotop zirvəsində müəyyən ediləcəkdir. m/z çoxaldılmış zülal zirvəsi kimi dəyər.

Nə qədər dəqiqliyə ehtiyacımız var və ya real şəkildə nail ola bilərik və güzəştlər nələrdir?

Amerika Kütləvi Spektrometriya Cəmiyyəti Jurnalının müəllif təlimatlarından (mart 2004) birmənalı xarakteristikaya dair tələbləri nəzərdən keçirin. C, H, O, N kompozisiyaları üçün (C0-100, H3-74, O0-4 və N0-4) 118-də nominal kütlədən yüklənməyə cavabın birmənalı olması üçün yalnız 34 ppm-dən çox olmayan xəta lazımdır, burada a m/z 750-də cavab "bütün kənar imkanları" aradan qaldırmaq üçün 0,018 ppm-dən daha yaxşı dəqiqlik tələb edir.

Birləşmələrin birmənalı identifikasiyası üçün artan kütlə dəqiqliyinin təsiri (Quenzer, TL, Robinson, JM, Bolanios, B., Milgram, E. and Greig, MJ, FTICR mass-spectrometry istifadə edərək avtomatlaşdırılmış dəqiq kütlə analizi, 50-ci İllik Konfransın materialları. Kütləvi Spektrometriya və Müttəfiq Mövzular, Orlando, FL, 2002).

Ölçmədə artan filtrasiya və ya xətanın məhdudlaşdırılması müəyyən bir nəticə üçün mümkün namizədləri azaldır

Alətdən alətə dəqiqliyin müqayisəsi: millikütlə vahidləri (mmu), ölçmə xətası (ppm) və ayırdetmə

Böyük Britaniyanın Milli Ölçmə Sisteminin bir hissəsini təşkil edən təşəbbüs olan VIMMS Proqramının Dəqiq Kütləvi Ən Yaxşı Təcrübə Bələdçisinə əsasən, dəqiq kütlə ölçmələri üçün istifadə edilən alətlərin əksəriyyəti 10 ppm və ya daha yaxşı dəqiqliyə nail olmaq iqtidarındadır.

Müasir bir kütlə spektrometri ilə 2 mmu dəqiqliklə ölçülən 118 Da hesablanmış kütlə 17 ppm xəta göstərəcək ki, bu da bu kütlənin kimyəvi düsturunu birmənalı şəkildə təyin etmək üçün bugünkü standartlara uyğundur:

Monoizotop hesablanmış dəqiq kütlə = 118 Da

Ölçülmüş dəqiq kütlə = 118.002 Da

Səhv [Fərq/dəqiq kütlə x 106] = 17 ppm

750 m/z-də cavab verə bilən, həmçinin 2 mmu çatışmazlığı olan bir cihaz 2,7 ppm-ə qədər dəqiq olardı. Birinci halda, Amerika Kütləvi Spektrometriya Cəmiyyətinin nəşr edilmiş standartlarına uyğun olaraq, ölçmə kimyəvi formulun birmənalı müəyyən edilməsi üçün kifayətdir. Lakin ikinci halda, ölçmə kifayət qədər dəqiq deyil. Yalnız ən yüksək dərəcəli Furye transformasiyalı ion siklotron rezonans kütlə spektrometriyası (FTICR) daha yüksək kütlələrdə belə dəqiqliyə nail ola bilər.

Nəzərdə tutulan istifadəyə bənzəyən alətin kütlə dəqiqliyini ölçmə qabiliyyətini qiymətləndirmək üçün hərtərəfli metod kök orta kvadratın və ya RMS xətası. Onun istifadəsini göstərmək üçün aşağıdakı kommersiya TOF kütlə spektrometrinin kütlə ölçmə dəqiqliyi spesifikasiyasından uyğunlaşdırılmışdır.

"Alətin kütlə ölçmə dəqiqliyi, normal iş şəraitində, daha yaxşı olacaq verilmiş ppm RMS veriləndən artıqdır m/z diapazonu, ardıcıl bir sıra əsasında ölçmələri təkrarlayın bir analit zirvəsi (verilmiş m/z), uyğun bir istinad pikindən (verilmiş m/z). Analit və istinad zirvələri kifayət qədər intensivliyə malik olmalı və digər kütlələrin müdaxiləsindən azad olmalıdır."

Bəzi vacib məqamlar və fərziyyələr nəzərə alınmalıdır:

  1. An alətin kalibrlənməsi artıq kalibrləmə standartından istifadə edərək məlum kütlənin zirvələri ilə yerinə yetirilmişdir. İstinad zirvəsi zamanla alətin kalibrləməsindəki hər hansı dəyişikliyi nəzərə almaq üçün istifadə olunur və kütlə ölçmə dəqiqliyi analit pikindən istifadə etməklə müəyyən edilir.
  2. Normal iş şəraiti - həmçinin xromatoqrafik şərtlərin təfərrüatlarını (LC/MS performans spesifikasiyası üçün) və hər hansı əlaqəli MS əməliyyat şərtlərini (məsələn, kütlə ayırdetmə qabiliyyəti, maraq dairəsi m/z və ya spektral əldəetmə dərəcəsi) daxil edə bilər.
  3. Kifayət qədər intensivlik - ionların sayının sözügedən alətin (kütlənin ölçülməsi) dəqiqliyi və dəqiqliyinin xarakteristikası üçün zərərli olmadığını qəbul edir. Həddindən artıq az ion zəif ion statistikasına gətirib çıxarır və çoxlu ionlar detektorun doymasına gətirib çıxara bilər ki, bunların hər ikisi təkrar ölçmələrin standart sapmasında daha çox dəyişikliklə nəticələnir və RMS xətasının hesablanmasına mənfi təsir göstərəcək (həmçinin alətin kalibrlənməsinə aiddir).
  4. Müdaxilələrdən azaddır - məlum kütlənin pikinin kütlə ölçülməsinin eyni və ya oxşar kütləli ionların müdaxiləsindən azad olduğunu qəbul edir. Üst-üstə düşən zirvələr zəif kütlə ölçmə dəqiqliyinə gətirib çıxarır ki, bu da alətin dəqiqliyini və ya dəqiqliyini düzgün xarakterizə etmək üçün zərərlidir (həmçinin alətin kalibrlənməsinə aiddir).
  5. The istinad ayaxşı təmsil xüsusi nümunə növünün təhlili üçün uyğun olan m/z diapazonunun.

RMS xətası aşağıdakı əlaqədən istifadə etməklə hesablanır, burada Eppm ppm xətasıdır və n nəzərə alınan kütlələrin sayıdır:

Qeyd etmək lazımdır ki, RMS xətası bəzi ölçmələrin “maraq pəncərəsi” (məsələn, 5 ppm RMS) səhvindən kənara çıxmasına imkan verir. Keyfiyyətli ölçmələri təmin etmək üçün yuxarıda təsvir edilmiş şərtləri (xüsusilə müdaxilələrin intensivliyi və təsiri ilə bağlı - spektrlərdə aydın pik tərifi ilə balanslaşdırılmış ion statistikası) bir sıra təkrar inyeksiyalar zamanı yerinə yetirmək lazımdır. Gördüyünüz bir çox bildirilən ayırdetmə və kütləvi dəqiqlik nömrələri RMS xəta nömrələri deyil, bunun əvəzinə bir seçilmiş (əlverişli) iondan qaynaqlanır.

Bütün tətbiqlərdə yadda saxlamaq vacibdir ki, a zəif siqnal (həddindən artıq yüksək qətnamə) zəif ion statistikası verə bilər və buna görə də istifadə edilə bilməz. Çox güclü siqnal eyni dərəcədə faydasız ola bilər və detektorun doymasına səbəb ola bilər. Məqsəd spektrlərdə dəqiqliklə ideal balanslaşdırılmış ion statistikasıdır.

Şəkillə əlaqədar bəzi müqayisələr:

  • yuxarı rəqəmdəki iki birləşməni fərqləndirmək üçün dördqütblü ayırdetmə kifayət deyil.
  • həlledici gücü ilə

Dəqiq-kütləvi dəqiqlikdə oynadığı müxtəlif qarşılıqlı əlaqəli rolları qiymətləndirmək vacibdir kütlənin tərifləri arasında keçid və artır görüntü imkanı və kimi amillər zirvə forması və ehtiyac kalibrləmə. Bunlar aydın başa düşülmədikdə və nəzərə alınmazsa, kütləvi səhvlər və digər arzuolunmaz nəticələr yarana bilər.

Üst-üstə düşən rəqəm, TOF məlumatında hər iki kütlə dəyərinin dəqiq kütlədən 1mDa daxilində olduğu dördqütblü və TOF cavabını göstərir.

Şəkildəki müxtəlif tərkibli iki fraqment eyni analitdəndir və buna görə də eyni vaxtda mənbədədir. Hətta ən yaxşı xromatoqrafiya belə bu vəziyyətdə kömək etməyəcək, buna görə də bu, yüksək ayırdetmənin xüsusilə naməlumların təhlilində faydalı olmasının səbəblərindən birini vurğulayır. Bu, QTof məhsul ionu məlumatlarına və üçlü dördlü məhsulun ion məlumatlarına eyni dərəcədə aiddir. Bu yüksək ayırdetmə dərəcəsi ilə əlavə bir üstünlük olaraq, hər birinin ekstraksiya edilmiş ion cərəyanı (XIC) sxemi dördlü məlumatların bu qabiliyyətin olmadığı xromatoqramlardan seçici olaraq oksigen və alkil ehtiva edən analitləri fərqləndirməyə imkan verir.

    Müzakirə Qətiyyəti və Kütləvi Dəqiqlik, Cild. 22 No 2, 118 – 130, fevral 2004-cü il
      Bu nə üçün vacibdir: İstifadənin praktiki aspektlərinin əsasını təşkil edən bir çox məsələlər, eləcə də sənaye mənbələrindən müqayisələr ilə məşğul olur.

    • Bu niyə vacibdir: Ən yüksək ayırdetmə qabiliyyətinə malik alətlərin faydasını müzakirə edir və onları real gözləntilərlə müqayisə edir.

      Kiçik Molekulların Dəqiq Kütləvi Ölçüsü Metodologiyası, K. Webb, T. Bristow, M. Sargent, B. Stein, Ticarət və Sənaye Departamentinin Böyük Britaniya Milli Ölçmə Sistemi çərçivəsində VIMMS Proqramı, (LGC Limited, Teddington, Böyük Britaniya 2004). VIMMS 2004 rəhbər sənədi
        Bu nə üçün vacibdir: Ölçülmüş, dəqiq-kütləvi iş ilə uğur üçün vacib olan məsələlərin qısa və qısa icmalı.

      • Bu niyə vacibdir: Kendrick kütləvi qüsuru və peptidlər və zülallar üçün etiketləmə daxil etmək üçün əsas mövzunu genişləndirir.

      Nominal Vahid kütlə.

      Sulfametazin Nominal = 278

      Orta kütlə Hər bir elementin bütün izotoplarından və onların təbii bolluğundan istifadə etməklə hesablanır.

      Sulfametazin ort. kütlə = 278.3313

      Hesablanmış dəqiq kütlə (Monoizotopik). Verilmiş ion üçün ayrı-ayrı izotopların kütlələrinin cəmlənməsi ilə müəyyən edilir.

      Sulfametazinin dəqiq kütləsi = 278.0837

      Dəqiq kütlə (Əslində “ölçülmüş dəqiq kütlə”). Alətlərimizlə nə edirik. Bu bir ölçüsüdür m/z (adətən) üç və ya dörd onluq yerlərə bildirilir.

      Kütlə artdıqca təriflər arasındakı fərqlər artır və pik forması daha böyük rol oynayır:

      Ubiquitin Nominal Dəqiq Orta

      Vahid 16.1, Kütləvi Spektrometriya ilə Peptid və Zülal Analizinə İcmal, S. Karr və R. Annan, Protein Elmində Mövcud Protokollarda, J. Wiley və Sons (1996)


      Proteomika və Kütləvi Spektrometriya Əsası

      Müəyyən edilmiş bütün peptidlərin ion xallarının cəmi.

      Peptid spektrinin sayı uyğun gəlir. PSM-lərin sayı zülal üçün uyğunlaşdırılmış müəyyən edilmiş peptid spektrlərinin ümumi sayıdır. PSM dəyəri yüksək ballı zülallar üçün müəyyən edilmiş peptidlərin sayından yüksək ola bilər, çünki peptidlər dəfələrlə müəyyən edilə bilər.

      Müəyyən edilmiş peptidlərin əhatə etdiyi protein ardıcıllığının faizi.

      Zülal qrupunda müəyyən edilmiş zülalların sayı, yəni Protein Qrupu Üzvləri görünüşündə göstərilən zülalların sayı.

      # Unikal peptidlər

      Bir protein qrupuna xas olan peptid ardıcıllığının sayı. Bunlar bir zülal qrupunun zülalları üçün ümumi olan və heç bir başqa qrupun zülallarında olmayan peptidlərdir. Zülal qrupunu təyin edən unikal peptidlərin sayı Proteome Discoverer-də təyin edilə bilər.

      Zülal qrupunda müəyyən edilmiş fərqli peptid ardıcıllıqlarının ümumi sayı.

      Xcorr (çarpaz korrelyasiya) eksperimental peptid fraqmentlərinin b və y ionları ardıcıllığından yaradılmış nəzəri spektrlərə uyğunluq yaxşılığının ölçüsüdür.

      Delta korrelyasiyası uyğunluğun spesifikliyinin ölçüsüdür. O, əsas namizədin ardıcıllığının eksperimental məlumatla ikinci dərəcəli namizədin ardıcıllığına nə qədər yaxşı uyğun gəldiyini təsvir edir. Daha kiçik bir rəqəm daha yaxşı uyğunlaşma deməkdir.

      Delta M (ppm)

      Delta Kütləsi ölçülmüş kütlənin peptidin nəzəri kütləsindən sapmasıdır, ppm ilə.

      q dəyəri identifikasiyanın düzgün hesab edildiyi minimal yanlış aşkarlama dərəcəsidir.

      Posterior Error Probability (PEP)

      Posterior səhv ehtimalı (PEP) müşahidə edilən PSM-nin səhv olma ehtimalıdır.


      Giriş seçimləri

      1 il ərzində jurnala tam giriş əldə edin

      Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.
      ƏDV daha sonra ödəniş zamanı əlavə olunacaq.
      Vergi hesablanması yoxlama zamanı yekunlaşacaq.

      ReadCube-da vaxt məhdud və ya tam məqaləyə giriş əldə edin.

      Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.


      NEUROPRED

      NeuroPred internet üçün Python ( http://www.python.org ) istifadə edərək yazılmışdır və ona http://neuroproteomics.scs.uiuc.edu/neuropred.html ünvanından daxil olmaq olar. NeuroPred alətinin əsas məqsədi eksperimental olaraq təsdiqlənmiş parçalanma məlumatı əsasında hazırlanmış logistik reqressiya modellərindən istifadə edərək neyropeptid prekursorlarının parçalanma yerlərini proqnozlaşdırmaqdır. Bundan əlavə, proqnozlaşdırılan parçalanma yerlərindən model dəqiqlik göstəriciləri və neyropeptid kütlələri hesablana bilər.

      NeuroPred üçün tələb olunan daxiletmə FASTA formatında təmin edilmiş, ya birbaşa səhifədəki mətn qutusuna daxil edilmiş və ya mətn faylı vasitəsilə yüklənmiş bir və ya bir neçə ardıcıllıqdır. Mövcud istifadəçi seçimlərinə “Model və Çıxış Seçimi”, “Modelləşdirmə və Kütləvi Hesablamalar üçün Seçimlər” və “Tərcümə Sonrası Dəyişikliklər” daxildir (Şəkil 1).

      Model seçimi

      Defolt model seçimi Məlum Motifdir ( 10 ), seçilə bilən digər modellər Mollyuska Əsas və Mollyuska Kompleksi ( 11 ), Məməlilər ( 12 ) və biri istifadə edərək öyrədilmiş iki həşərat modelidir. A.mellifera və digəri D.melanoqaster genomik məlumat (B. R. Southey, A. B. Hummon, T. A. Richmond, S. L. Rodriguez-Zas və J. V. Sweedler, əlyazması təqdim edilmişdir). Eyni ardıcıllıqla bölünməni proqnozlaşdırmaq üçün bir neçə model eyni vaxtda istifadə edilə bilər. Təlim, ardıcıllıq məlumatları və yekun şərtlər daxil olmaqla, müvafiq modellər haqqında xüsusi təfərrüatlar Hummon tərəfindən təmin edilir. və b . ( 11 ), Amare və b . ( 12 ) və Southey və b . [( 10 ), B. R. Southey, A. B. Hummon, T. A. Richmond, S. L. Rodriguez-Zas və J. V. Sweedler, əlyazması təqdim edildi].

      Çıxış seçimi

      "Yalnız Parçalanma Sahələrini Təxmin Et" defolt seçimi altında NeuroPred seçilmiş bütün modellər üçün daxil edilmiş hər ardıcıllıq üçün parçalanma ehtimalını hesablayaraq yalnız dekolte sahələrini proqnozlaşdıracaq. Bu addım bütün çıxış variantları üçün tamamlanır. Parçalanma yerlərini proqnozlaşdırdıqdan sonra NeuroPred seçilmiş variantlara uyğun olaraq ya model dəqiqliyi statistikasını hesablayacaq, ya da kütləvi hesablamalar aparacaq.

      Əvvəlcədən emal

      Parçalanma ehtimalını təxmin etməzdən əvvəl, bütün prekursor ardıcıllıqları Southey tərəfindən təfərrüatlı şəkildə təsvir edilən bir sıra ön emal addımlarından keçir. və b . (B. R. Southey, A. B. Hummon, T. A. Richmond, S. L. Rodriguez-Zas və J. V. Sweedler, əlyazması təqdim edilmişdir). Pəncərənin ölçüsü və pəncərə daxilində dekolte yerinin yeri seçilmiş modelə görə müəyyən edilir, dekolte ehtimalı yalnız əsas sahədə nəzərə alınır. İstifadəçi tərəfindən dəyişdirilə bilən ilkin emal komponentləri siqnal peptidinin uzunluğu və parçalanma yerini əhatə edən amin turşularının minimum sayıdır. Siqnal peptidinin uzunluğu istifadəçi tərəfindən təyin edilə bilər, bu uzunluq bütün prekursor ardıcıllıqları üçün istifadə olunan qlobal dəyərə çevrilir. Alternativ olaraq, siqnal peptidinin uzunluğu qlobal dəyəri ləğv edən və ardıcıllıqla dəyişə bilən hər bir ardıcıllığın FASTA etiketinə daxil edilə bilər. Geniş spektrli prekursorların və furinin strukturunun tədqiqi (14) deməyə əsas verir ki, parçalanmanın baş verməsi üçün parçalanma yerinin ətrafında minimum sayda amin turşusu tələb olunur, buna görə də parçalanma yerindən əvvəlki və sonrakı minimum sayda amin turşusu ola bilər. istifadəçi tərəfindən də müəyyən edilir.

      Parçalanma proqnozu

      Parçalanmanın proqnozlaşdırılması logistik reqressiyadan ( 15 ) və ya hər bir mümkün parçalanma sahəsi üçün məlum Motif modellərindən parçalanma ehtimalının hesablanması ilə əldə edilir. Təxmin edilən parçalanma ehtimalı əvvəlcədən müəyyən edilmiş hədd ilə müqayisə edilir və parçalanma və ya bölünməmiş proqnozlara çevrilir. Parçalanacağı proqnozlaşdırılan saytlar üçün 50% standart həddi ehtimalı və 95% standart etibar intervalı göstərilir. Asimmetrik etimad intervalı proqnozlaşdırılan hadisənin qeyri-qaus xarakterini və 0 ilə 1 (15) arasında olan ehtimalların parametr fəzasını əks etdirir. Həm eşik ehtimalı, həm də etibarlılıq intervalı əhatə dairəsi istifadəçi tərəfindən dəyişdirilə bilər.

      Proqnozlaşdırılan parçalanmanın çıxışı

      Əsas “Yalnız Yarılma Sahələrini Proqnoz Et” seçimini seçdikdən sonra, hər bir prekursor üçün əldə edilən nəticə ardıcıllığı və proqnozlaşdırılan parçalanma sahələrini özündə birləşdirən diaqramdır (Şəkil 2-yə bənzər). Amin turşusunun yerləşdiyi birləşmələrin altındakı "C" onu göstərir ki, həmin amin turşusunda proqnozlaşdırılan parçalanma ehtimalı istifadəçi tərəfindən müəyyən edilmiş parçalanma ehtimalı həddini keçib. Təxmin edilən parçalanma ehtimalı və əlaqəli 95% etimad intervalı hədləri parçalanacağı təxmin edilən amin turşusu yer birləşmələri üçün göstərilir. Qalan amin turşusu yer birləşmələri bölünməmiş proqnozu göstərmək üçün '.' işarəsi ilə işarələnir. Çoxsaylı modellər seçildikdə, hər bir yanaşma üçün proqnozlaşdırılan parçalanma sahələri eyni diaqramda bildirilir və bununla da proqnozlaşdırılan parçalanma sahələrinin birbaşa müqayisəsinə imkan yaradır.

      Modelin dəqiqliyi statistikası

      NeuroPred həmçinin seçilmiş yanaşmanın performansını qiymətləndirə bilər. Proqnozlaşdırılan parçalanmaları istifadəçi tərəfindən daxil edilmiş parçalanma məlumatı ilə müqayisə etməklə, hər bir fərdi prekursor ardıcıllığı və daxil edilmiş bütün prekursor ardıcıllıqları üzrə model dəqiqliyi statistikası təmin edilir.

      Bu dəqiqlik statistikası 'Yarılma sahələrini proqnozlaşdır və Model dəqiqlik statistikasını hesabla' çıxış seçimini seçməklə yaradılır. NeuroPred, proqnozlaşdırılan parçalanma yerləri və istifadəçi tərəfindən təmin edilən və ya “məlum olan” parçalanma məlumatı əsasında müxtəlif model dəqiqliyi statistikasını hesablayacaq. Məlum parçalanma məlumatı ardıcıllıqdan sonra sətir kimi daxil edilir, burada '0' heç bir parçalanmanı, '1' isə bölünməni bildirir. Nəzərə alın ki, bu çıxış seçimini seçərkən, istifadəçi tərəfindən verilən məlumat daxil edilmədikdə və ya səhv daxil edilərsə, NeuroPred parçalanma yerlərini proqnozlaşdıracaq, lakin dəqiqlik statistikasını təqdim etməyəcək.

      Modelin dəqiqliyi statistikası seçimindən əldə edilən nəticə “Yalnız Yarılma Sahələrini Təxmin Et” seçimindən əldə edilən nəticəyə bənzəyir, əlavə olaraq, istifadəçi tərəfindən daxil edilmiş parçalanma məlumatı da düzgün və yanlışın vizuallaşdırılmasına kömək etmək üçün çıxış diaqramında (Şəkil 2) təmsil olunur. proqnozlar. Müəyyən edilmiş hədd ehtimalını aşan parçalanma sahələri ya doğru, ya da yanlış proqnozlar kimi qeyd olunur. Bundan əlavə, müəyyən edilmiş hədd ehtimalını aşmayan məlum parçalanma yerləri üçün ehtimal və güvən intervalının hədləri nəzərdə tutulmuşdur.

      “Yırılma sahələrini proqnozlaşdırın və Model dəqiqliyi statistikasını hesablayın” seçimi 0,1 ilə 0,9 arasında dəyişən həddi ehtimallardan istifadə edərək, hər bir prekursor və bütün prekursorlar üzrə model dəqiqliyi statistikasını təqdim edir. Hər bir prekursor üçün model performansı düzgün parçalanma (həqiqi müsbət nəticə), yanlış parçalanma (yanlış müsbət nəticə), düzgün bölünməmə (həqiqi mənfi nəticə) və yanlış bölünməmə (yanlış mənfi nəticə) proqnozlarının sayından istifadə etməklə qiymətləndirilir. prekursorun uzunluğu boyunca. Bu dəyərlər daha sonra daxil edilmiş bütün prekursorlar üzərində ümumiləşdirilir. Modelin parçalanmasına yanaşmanın adekvatlığı aşağıdakı statistik məlumatlardan istifadə etməklə bütün prekursorlar üzrə qiymətləndirilir:

      Düzgün təsnifat dərəcəsi: düzgün proqnozlaşdırılan saytların sayı saytların ümumi sayına bölünür.

      Həssaslıq (bir mənfi yanlış müsbət nisbət): həqiqi müsbətlərin sayı bölünmüş saytların ümumi sayına bölünür.

      Spesifiklik (bir minus yalan mənfi nisbət): həqiqi neqativlərin sayı bölünməmiş saytların ümumi sayına bölünür.

      Positive predictive power (proportion of sites that are predicted to be cleaved that are true positives): number of true positives divided by the total number of sites predicted to be cleaved.

      Negative predictive power (proportion of sites that are not predicted to be cleaved that are true negatives): number of true negatives divided by the total number of sites predicted to not be cleaved.

      Correlation coefficient: Mathew's correlation coefficient ( 16 ) between observed and predicted cleavage.

      Area under the receiver operator characteristic or ROC curve relates sensitivity and 1-specificity ( 17 ). Area values lower than 0.7 indicate poor model performance.

      Peptide mass prediction

      The mass of predicted peptides for multiple precursors can be calculated by NeuroPred, where the masses of the peptides are calculated using common neuropeptide post-translational modifications. For applications using mass spectrometry, a list of the intermediate and final peptides and their associated masses offers more complete information about the precursor-derived peptides than a list of final peptide masses.

      The peptides are determined using the model results. Specifically, basic sites are predicted as non-cleaved when there is a consensus from the selected models for non-cleavage. The sequence, after removal of the specified signal peptide for each precursor, is cleaved at the remaining basic sites to provide peptides of different lengths. In order to account for any falsely predicted cleavages and different model predictions, the peptides that are adjacent in the sequence are joined (assuming that cleavage did not occur), and these additional masses are included in the output. This process of joining peptides can be extended up to, but not including, complete sequence after removal of the specified signal peptide.

      Options to control the output of the mass prediction include: the number of adjacent sites that can be joined, the range of mass sizes, and the maximum number of amino acids of a predicted peptide resulting from cleavage. The resulting peptides are then further processed using a variety of possible post-translational modifications—with the removal of terminal basic amino acids, amidation and pyroglutamination being selected by default. Other non-default modifications can be selected. The selected post-translational modifications are applied to each peptide where appropriate, resulting in additional peptides. The average and monoisotopic masses are calculated for every peptide.

      The output ( Figure 3 ) includes a list of peptides and the mass calculation table. The columns of the mass calculation table are the abbreviation of the sequence, the post-translational modifications applied to that sequence, the average and monoisotopic masses, and the full sequence. The user can sort the list of peptides by the combination of actual sequence location of the peptide and post-translational modification, or by either the average or monoisotopic mass.


      FYs 2013-2017 Regulatory Science Report: Complex Mixtures and Peptides

      Complex drug substances or complex active pharmaceutical ingredients (APIs) include peptides, heterogenous mixtures of small molecules, natural and synthetic polymers, and macromolecular complexes. Their compositional profile may not be easily characterized by current conventional methods and the active components may not be fully defined. Complex drug substances have become more common in approved pharmaceutical products in the past several years. In 2012, the peptide drug market in the United States was less than $11 billion and by 2016 it had grown to more than $18 billion. Complex drug substances are important in many different therapeutic areas and have been used to treat a wide range of conditions, from the use of conjugated estrogens for hormone replacement therapy in post-menopausal women to the use of liraglutide for the treatment of type II diabetes. Complex drug substances are identified in the Generic Drug User Fee Amendments reauthorization (GDUFA II) commitment letter as one of the categories of complex products that are eligible for the enhanced pre-abbreviated new drug application (ANDA) programs for complex products.

      Before the Generic Drug User Fee Amendments of 2012 (GDUFA I), research in complex drug substances was limited and focused on a narrow range of products such as synthetic salmon calcitonin and enoxaparin . Research on these products demonstrated that determining API sameness for complex molecules is feasible. In the case of synthetic salmon calcitonin, API sameness and comparability in product and process-related factors were identified as critically important for ensuring the comparability of immunogenicity between the proposed generic and reference listed drug (RLD) products. The approval of salmon calcitonin and enoxaparin became an important foundation for the approval of other generic products containing complex APIs.

      Complex active ingredients are diverse and may be mixed with a variety of inactive ingredients in a drug product and thus clear and properly defined API sameness criteria can accelerate the development of generic versions. For peptide drugs, while the active ingredient can be clearly defined and well characterized, characterizing the impurity profile of peptide-related substances and assessing the associated safety risks for things like immunogenicity, is challenging. For complex mixtures, identifying and characterizing active ingredients itself is a daunting task. Food and Drug Administration (FDA) research from the Office of Pharmaceutical Quality (OPQ) and the Office of Generic Drugs (OGD) has been focused on these areas for the past five years. Collectively, our research activities have advanced FDA’s understanding of complex drug products containing complex mixtures, helped establish product-specific guidance (PSG) on API sameness, and provided critical information for the regulatory review and decision-making processes.

      Through our research we have explored and applied modern analytical and quantitative methods to characterize product-specific attributes so that the sameness of the active ingredients can be established between RLDs and proposed generic drugs. During the first 5 years of GDUFA, FDA identified new analytical technologies and used them in the separation and characterization of complex API mixtures and impurities. This research has been performed both internally at the state-of-the-art OPQ laboratories and through external partnerships with academic institutions. For example, ion-mobility spectrometry mass spectrometry (IMS-MS) and complex two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy (2-D NMR) techniques, and separation and characterization of complex natural products were used in characterizing the complex API mixtures and providing a basis for demonstrating API sameness.

      FDA also conducted research in peptide impurity identification and characterization using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) to analyze calcitonin salmon nasal spray products from different manufacturers. FDA also studied immunogenicity potential of these peptide products in vitro using a cell-based assay. Computational algorithms, commonly referred to as big data analysis, based on LC-MS data acquired at FDA allowed FDA to identify key structural fingerprint information of glatiramer acetate, a mixture of synthetic peptides of varying lengths and sequences of four amino acids, creating a foundation for evaluating API sameness and generic drug approval. Internal research led to the approval of generic glatiramer acetate in 2015 and publication of the glatiramer acetate PSG in 2016. Through GDUFA-funded research, FDA published several new PSGs for complex API drugs, and revised many other PSGs to include API sameness. All these achievements were made possible with the GDUFA-funded research support.

      Research and Collaborations

      Integrated Approach to Determine Equivalence in Complex Drug Mixtures
      FDA awarded Grant 1U01FD005291 to Ram Sasisekharan at Massachusetts Institute of Technology on September 10, 2014, and the study was completed in August 2017. The grant aimed to characterize the complex drug pentosan polysulfate sodium (PPS) and use the information gathered in the characterization process to build mathematical models. This information can be used to predict the structures of the individual components and their relative abundances in the complex mixture. Researchers identified analytical technologies and implemented them at different levels based on heterogeneity of the APIs to provide orthogonal measurements on overlapping structural attributes of the API between each level the structural attributes obtained from those measurements were cross validated to make sure the variations in the attributes were captured in the measurements. The data were used to develop a model that describes the varying chemical compositions of the API and evaluate the sufficiency of API characterization and API sameness in composition.

      Development of an Integrated Mathematical Model for Comparative Characterization of Complex Molecules

      FDA awarded Grant 1U01FD005285 to David Volkin at the University of Kansas on September 10, 2014, and the study was completed in August 2017. The goal of this grant was to build a mathematical model using data collected in the characterization of complex molecules to assess the similarity and determine if the data were sufficient for API sameness evaluation. The active ingredient and its degradation products were studied with a variety of physicochemical and biological assays to characterize the critical quality attributes. All the data collected were used to develop a mathematical model which can be used to assess API sameness of generic drug applications.

      Statistical Methodology for Characterization of Macromolecular Similarity

      FDA awarded Grant 1U01FD005288 to John Cort at Battelle Pacific Northwest National Laboratories on September 10, 2014, and the study was completed in August 2017. The goal of this project was to develop a statistical methodology to assess macromolecular similarity of pentosan polysulfate (PPS). In this project, IMS-MS and 2D-NMR data were collected on PPS and these data were used to build PPS signatures. Similarity between two sets of data were measured and variability was captured with a subset of features so that sufficiency may be established through a similarity metric. The data collected were used to develop a macromolecular similarity model which can be used to assess similarity between different samples.

      Mass Spectrometry Profiling of Pentosan Polysulfate in Urine

      FDA awarded Contract HHSF223201610114C to John Cort at Battelle Pacific Northwest National Laboratories on September 22, 2016, and the project is ongoing. The goal of this project is to use MS to profile PPS and its metabolites in urine with the final goal of assisting with the development of a bioanalytical method to establish bioequivalence for PPS as an alternative to clinical endpoint bioequivalence studies. In this project, it was found that reverse phase ion-pair chromatography can separate PPS from salts, metabolites, and other small molecules in urine prior to analysis with a mass spectrometer. High resolution and accurate MS can help the identification and characterization of PPS components. Preliminary data show that urine samples from patients taking PPS have a different profile compared to urine samples spiked with PPS indicating PPS in patient urine is different from the original PPS.

      Characterization of Glatiramer Acetate

      Glatiramer acetate is a mixture of synthetic peptides containing four amino acids, glutamic acid, alanine, tyrosine, and lysine, with an average molecular weight of 5,000- 9,000 Daltons. FDA labs used the brand-name product, COPAXONE®, and a commercially available comparator, Copolymer-1, to develop a set of characterization methods for comparison and characterization of glatiramoids. These orthogonal approaches include asymmetric field flow fractionation coupled with multi-angle light scattering (AFFF-MALS), NMR and LC-MS. AFFF-MALS was used to calculate the average molecular weight, Mw, polydispersity, and provided molecular weight distribution of the polymers. NMR was used to evaluate the amino acid composition and LC-MS was used to separate and identify the peptide fragments generated from enzymatic degradation. Principal component analysis (PCA) was applied to LC-MS results to identify differences between lots of COPAXONE® and comparator lots. These methods, combined, constitute an analytical approach to characterize and compare glatiramoids. These methods have been successfully used in the characterization and evaluation of different generic glatiramer acetate applications, and led to the approval of the first generic glatiramer acetate product in 2015.

      Analytical Method Development for the Characterization of Conjugated Estrogens

      Conjugated estrogens are a mixture of conjugated steroids made from pregnant mares’ urine. It is used primarily for estrogen replacement therapy to treat menopausal symptoms and to prevent post-menopausal osteoporosis. The complexity of the chemical composition has been a barrier to the introduction of generics. For this internal project, the FDA labs first developed a robust LC-MS method to characterize and quantify the steroidal components of the conjugated estrogen from the commercial product, PREMARIN®, then the method was used to profile 23 lots of the brand-name product and identified 60 steroidal conjugates which consistently present at average levels above 0.1%. The results of this collaboration have been published and became the foundation of Agency’s PSG documents on conjugated estrogens. It has also been used as an analytical tool to evaluate the API sameness of potential generic conjugated estrogens.

      Characterization of Impurities in Peptides

      Comprehensive characterization of a peptide API is important in ensuring the API sameness for generic peptide drug development. The presence of impurities may lead to altered efficacy and/or safety, including increased immunogenicity risk. The collaborations were aimed to develop a sensitive and effective approach to profile impurities in peptide drugs. In an initial study, a data-dependent LC-MS/MS approach was developed to screen low level peptide impurities. This methodology was then applied to the impurity profiling of calcitonin salmon nasal spray, a polypeptide drug for the treatment of osteoporosis. Five marketed calcitonin salmon products were evaluated, and over 120 peptide impurities were identified. Each impurity and its monoisotopic mass and charge states were confirmed by extracted ion chromatography and manual examination of the mass spectra. Differences were observed among different products (Fig. 1, peptide impurities of >0.1% were selected to display differences in samples).

      Fig. 1: Differences in Peptide Impurities in Calcitonin Salmon Nasal Spray Products

      This approach allows for screening of those impurities that can be separated from the API peak and observed in total ion chromatography. It also allows for screening of impurities that co-eluted with the API peaks, and those that can be separated from the API peak but cannot be observed as individual peak in the total ion chromatography. This data-dependent LC-MS/MS scan greatly facilitates rapid screening of impurities in peptide drugs and provides an efficient approach for peptide drug quality control and generic drug development. Combination of LC-MS and LC-MS/MS methods provides a powerful tool in analyzing complex peptide mixtures, including mixtures purified from natural sources.

      Characterization of Host-cell Protein Impurities in Peptide Products of rDNA Origin

      The goal of this ongoing collaboration with OPQ is to develop an MS-based characterization method to identify and characterize host-cell protein (HCP) impurities in peptide drug products of rDNA origin. Literature shows that even highly purified peptide products prepared from recombinant DNA technology contain some HCPs as impurities and different host cell systems used in the manufacturing process would generate different HCPs. The potential immunogenicity risk of the HCPs for brand-name products can be evaluated in clinical studies, but clinical evaluation of immunogenicity risk is usually not part of the ANDA pathway for generic drugs. The Agency does not believe that current technology can provide sufficient information to address potential immunogenicity risk for products produced using recombinant technology without also considering clinical data. FDA is also working to develop new technologies to address this problem. MS can provide very sensitive detection and characterizations of peptides and proteins. Characterization of HCPs with MS will help us understand the HCP impurity level, composition, and impurity control of HCPs in the corresponding products. This will open the possibility of accepting ANDAs for peptide drugs produced by recombinant technology in the future.

      Assessment of Innate Immune Response Modulating Impurities in Peptide Drugs

      Immune response to peptide drugs can compromise the safety and efficacy of the products. Peptide-related impurities in synthetic peptides, HCPs and other impurities in recombinant peptides might be present in peptide drugs which can activate the innate immune system and enhance product immunogenicity. The Office of Biotechnology Products lab recently described a new approach to screen products for the presence of broad spectrum known or unknown innate immune response modulating impurities by using multiple myeloid cell lines. In this collaboration, the lab will test calcitonin salmon nasal sprays manufactured by different companies for their ability to activate innate immune response using the cell based assays. These results will be used to look for a correlation between the impurity profile of the product and the risk of immunogenicity. The benefit of this research to generic drug development is that when immunogenicity risks are identified in product development or review there can be an alternative to clinical studies to address the immunogenicity risk.

      Solid State Characterization of Polymeric Drugs

      Polymeric drugs such as sevelamer carbonate, patiromer, and colesevelam hydrochloride have been used in the treatment of various diseases. The manufacturing processes of polymeric drugs are complex and involve polymerization of different components. To facilitate the development of generic versions of these drugs, OGD and OPQ worked to characterize these complex polymeric drugs and develop criteria for active ingredient sameness evaluations. Solid state carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy (13C NMR) was used as a powerful tool in studying the composition of the polymeric drugs. Fourier transform infrared spectroscopy, thermogravimetric analysis and differential scanning calorimetrywere used to further analyze the physicochemical properties of these drugs. This project led to a better understanding of the critical quality attributes of the polymeric APIs and revision of several PSGs for polymeric drugs. It also allowed for the approval of the first generic sevelamer carbonate product in 2017.

      Key Outcomes

      The efforts of Agency research and external collaboration collectively contributed to the understanding of generic drug development for drug products with complex drug substances. During the first five years of GDUFA, the Agency published 12 PSGs for those drug products as part of the effort to establish clear, efficient and consistent regulatory standards for generic products containing complex APIs. These PSGs contributed directly to the development and approval of multiple generic drugs containing complex APIs, including three first generic approvals: glatiramer acetate for injection, sevelamer carbonate tablet, and sevelamer carbonate powder for suspension.

      The Agency also published a draft general guidance on ANDA submission of certain highly purified synthetic peptide drug products referencing products of rDNA origin. This guidance provides recommendations for generic competition in a class of reference products where it was previously not generally recommended to use the ANDA submission process.

      GDUFA regulatory research projects provided a better understanding on the nature and the complexities of the drug products with complex APIs. Results and insights gained from the research help the development of the PSGs, which directly support the review and approval of the generic versions of these complex products. Research in this area also led to the development of novel analytical technologies and characterization methods and further advanced the science through publications and presentations.

      Gələcək istiqamətlər

      Significant progress has been made in our understanding and development of complex API and peptide products. However, further regulatory research efforts are needed. Research in botanical drugs, which are inherently complex, are in the early stages, and newer brand-name complex API products, such as oligonucleotide drug products, are being approved more frequently. Future research is needed for the development of characterization methods and API sameness standards on natural-sourced complex drug substances development of sensitive MS-based method to support bioequivalence demonstration in place of traditional clinical endpoint approach on drugs with complex API mixtures continued development of analytical methods for polymeric drugs development of analytical methods to characterize complex excipients and their interactions with drug substances and evaluations on host-cell protein impurities for peptide drug products of rDNA origin and non-clinical immunogenicity assays for generic drug products. These unmet regulatory needs will be a focus in GDUFA II that was reauthorized in 2017 for additional 5 years from 2017-2022. Scientific advances in these areas will help the development of the generic complex drugs which would otherwise be impossible. These future regulatory research priorities will contribute significantly to the ability of the American public to access generic version of these complex products.


      Giriş seçimləri

      1 il ərzində jurnala tam giriş əldə edin

      Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.
      ƏDV daha sonra ödəniş zamanı əlavə olunacaq.
      Vergi hesablanması yoxlama zamanı yekunlaşacaq.

      ReadCube-da vaxt məhdud və ya tam məqaləyə giriş əldə edin.

      Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.


      Müzakirə

      The term cellulite is often used to describe a complex architectural disorder of the skin with multifactorial etiologies. 3 In general, the formation of cellulite is a natural process and not a disease, reflected by an incidence of about 85% in adult females. However, the appearance of cellulite can negatively affect the quality of life in women and some seriously suffer from their dimpling orange peel skin.

      The pathophysiology of cellulite is not yet fully understood, but it is generally accepted that, beside an altered connective tissue structure and a disturbed dermal extracellular matrix, overweight also has a negative effect on cellulite-prone skin areas such as thighs and buttocks. Mirrashed və b. 4 demonstrated a correlation between overweight and cellulite pathophysiology in a pilot study with magnetic resonance imaging technique. Even though cellulite formation is exacerbated in combination with being overweight, it is predominantly dependent on the perpendicular orientation and status of dermal septae with regard to the skin surface. These dermal septae are much thinner and more radially oriented in cellulite-affected females compared to unaffected men and women. 20

      Today, a wide variety of cellulite treatment options exist, 21 ranging from topically applied products and massages to laser and intense pulsed light treatment among others. 1 Recently, an oral supplementation with polyphenol-rich chokeberry juice taken over a period of 90 days improved cellulite with a marked reduction in the subcutaneous tissue thickness and edema. 22 Most therapeutic approaches focus on the induction of lipolysis. However, the efficacy of such cellulite treatments seems to be less than completely satisfying, as reported by Wanner and Avram. 23

      In contrast to these various forms of treatment, an oral therapy with BCP is based on the premise that specific collagen peptides can improve and increase dermal firmness and skin elasticity from the inside.

      It is known that the improvements of dermal strength and skin elasticity are two important therapeutic aims in cellulite treatment. 21 Incidentally, Ortonne və b. 24 observed that, regardless of age, the presence of cellulite corresponds to a thinning of the dermal layer, a greater length of the dermis–hypodermis interface, and a decrease of dermal density and biomechanical parameters of skin elasticity and extensibility that are negatively affected by the degree of involvement of cellulite. The authors argue that women with cellulite exhibit skin characteristics typical of older ages.

      In addition, Dobke və b. 25 observed that women without cellulite had a better skin quality (firmer, with less compliance, laxity, and capacity of deformation) in the upper posterior part of the thigh. In contrast, women with cellulite showed greater laxity and weakness of the dermis and connective tissue, which extended into the superficial fascia.

      The efficacy of the BCP used in this study (VERISOL) on skin health and dermal connective tissue metabolism was recently demonstrated in two monocentric, double-blinded, randomized, placebo-control clinical trials on healthy women. Proksch və b. demonstrated that skin elasticity increased statistically significantly by up to 30% (average 7%) after 8 weeks of oral BCP ingestion in comparison to placebo treatment. 11 In addition, in a follow-up study, an elastic improvement of the skin resulting from an increased biosynthesis of collagen and elastin in the dermal connective tissue was shown. 18 Hundred and fourteen women aged 45–65 years received 2.5 g BCP or placebo once daily. After 8 weeks of intake, a statistically significant higher content of new generated procollagen type I (65%) and tropoelastin (18%) in interstitial skin fluid compared to the placebo treatment was observed.

      In the present study, it could be demonstrated that a daily dosage of 2.5 g BCP has a positive impact on women affected by moderate cellulite. Beside a significant improvement in the cellulite score, results also revealed a significant decrease in the waviness of the thigh skin as well as dermis density strengthening after BCP treatment.

      With regard to the mode of action, it could be speculated that the efficacy of BCP on cellulite treatment is based on its positive impact on dermal connective tissue synthesis. This assumption was confirmed by the results of the dermal density measurements. After 6 months of oral BCP intake, a statistically significant higher dermal density (P < 0.01) could be detected compared to placebo.

      One of the reasons for the dimpling effect in skin seems to be an abnormal pattern of distribution of elastic and collagen fibers in dermal septae. 26

      In cellulite-prone skin, both fiber types are unevenly located and partly clumped and, contrarily, in other parts of the dermal septae, rare and thinly distributed. The irregular strength of the connective tissue septae is considered as the most important distinguishing characteristic between cellulite-prone skin and unaffected skin. 3 It is known that fibrillin, as the main component of elastic fibers, is of particular importance for the integrity of these fiber bundles. 27 In a previous study, it could be demonstrated that, beside type I collagen and elastin, the fibrillin syntheses were also affected by the oral administration of BCP (VERISOL). 18 This increased synthesis of the fiber matrix molecules became clinically apparent in a statistically significant reduction of eye wrinkle deepness of 20% compared to the placebo group.

      Based on these findings, it could be speculated that the improvement in skin waviness in cellulite-prone skin observed here might be caused by the same effect. In comparison to the control group, a statistically significantly reduced skin waviness (−11%) was detected on thighs in normal weight volunteers after BCP administration.

      The efficacy of a BCP treatment could also be confirmed in overweight women (BMI >25), although the impact in this group was less pronounced in comparison to the results in women of normal weight. This observation was reflected by almost all the results obtained from the different investigations.

      It could be speculated that, especially in the group of overweight women, the duration of the treatment might be too short to see the maximum effect, as the data revealed an improvement trend but failed to reach statistical significance. It has to be stated that, at baseline, the degree of cellulite in the overweight women was statistically significantly (P < 0.01) more pronounced than with women of normal weight, so that an extended therapy might be useful.

      Moreover, as the therapeutic effect of a BCP treatment seems to predominantly influence the dermal matrix synthesis and, thus, strengthen dermal connective tissue, the observed effect might be more distinct when the cellulite is specifically caused by connective tissue alterations. This may support the hypothesis that BCP treatment particularly influences the positive impact on fiber septae regeneration. The evaluation of the ultrasound images documents a visually detectable change in tissue structure. It was observed that the network of collagen/elastic fibers in the dermis and subcutis becomes denser.

      It has been shown that noninvasive measures such as skin profile and those obtained from ultrasound images exhibit a positive correlation among them and the subjective perception of cellulite. 28 Dermal thickness may be reduced when it is more compact, and the dermal/hypodermal interface may be shortened when the invagination of adipose tissue toward the deep dermis is reduced as in the slight degree of cellulite. 29,30 Ultrasound images captured before treatment clearly represented the irregular broken line between dermis and hypodermis, and hypoechoic structures can be interpreted as fat bulging from subcutaneous tissue into the upper-layer dermal tissue. After treatment with BCP, a significant reduction in dermal thickness, elevated echogenicity indicating increased and organized collagen tissue, and reduction of hypoechoic areas were demonstrated.

      The results obtained in this study demonstrated that an oral supplementation with specific BCP over a period of 6 months led to a clear improvement of the skin appearance in women suffering from moderate cellulite. In addition, the data showed the marked potential of BCP to improve the skin morphology of cellulite-affected areas, providing new evidence of BCP's beneficial effects and postulating a new therapy strategy for cellulite treatment.