Məlumat

3.2: Sahəyə yönəldilmiş mutagenez - Biologiya

3.2: Sahəyə yönəldilmiş mutagenez - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Giriş

Keçən dəfə siz mutagenləşdirilmiş tərs perikamaların dizaynı üçün çoxlu məlumatla naviqasiya etdiniz – gözəl iş! Bu gün siz dizaynlarınızı praktikada tətbiq edəcəksiniz.

İstifadə edəcəyiniz sahəyə yönəldilmiş mutagenez (SDM) strategiyası DNT amplifikasiyası üçün polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) ilə bəzi xüsusiyyətləri paylaşır. Modul 1-dən xatırladaq ki, PCR gücləndirilməsi çoxlu ərimə, yumşalma və uzanma dövrlərini əhatə edir. Məhsulun DNT-sində bir və ya bir neçə əsas cüt mutasiya yaratmaq üçün orijinal şablona cüzi uyğunsuzluğu olan primerlərdən istifadə edilə bilər. Kifayət qədər aşağı yumşalma temperaturunda (primer ərimə temperaturundan ~25 °C aşağı), bu demək olar ki, tamamlayıcı primerlər hələ də şablon DNT-yə bağlanacaq, lakin uzadılma mərhələsində yaradılmış nüsxələr mutasiyanı ehtiva edəcək.

Bu gün siz vəhşi tipli tərs perikamı kodlayan plazmid DNT-ni hazırladığınız mutagen primerlərlə birləşdirməklə başlayacaqsınız. Bunlar mutant plazmid yaratmaq üçün DNT polimeraza tərəfindən təsirlənəcək. Mutant plazmidin daha çox nüsxəsi onu transformasiya adlanan prosesdə bakteriyalara daxil etməklə hazırlana bilər, biz bunu növbəti dəfə müzakirə edəcəyik (və edəcəyik!). Unutmayın ki, SDM reaksiya qarışığınızda hələ də valideyn, yəni mutant olmayan DNT mövcuddur. Təbliğ etmək üçün yalnız mutant plazmid bakteriyalara daxil olduqdan sonra valideyn DNT-si xüsusi olaraq həzm olunur. DpnI bakteriya çevrilməsindən əvvəl ferment. (Çünki DpnI yalnız metilləşdirilmiş DNT-ni həzm edir, sintetik olaraq hazırlanmış və beləliklə də metilləşməmiş mutant DNT həzm olunmur.) Yaranan kiçik xətti valideyn DNT parçaları sadəcə olaraq bakteriyalar tərəfindən parçalanır, halbuki, əsasən tam (lakin ləqəbli) mutant DNT əslində bunlar tərəfindən təmir olunur. çox eyni bakteriyalar.

Bu gün termosikl reaksiyası iki saatdan bir qədər çox davam edəcək. Bu inkubasiya dövründə biz ilkin ədəbiyyatdan iki məqaləni müzakirə edəcəyik. Heim, Prasher və Tsien (1994) tərəfindən yazılan məqaləni müzakirə edərək "istiləşəcəyik". Bu, GFP-ni mutagenləşdirməyə ilk cəhdi təsvir edən qısa məqalə və bu modulda istifadə olunan bəzi anlayış və üsullara gözəl girişdir. Sonra Nagai, et al (2001) tərəfindən tərs perikamı təqdim edən kağızı yaxından oxuyacağıq. Tərs perikamın (IPC) çoxkomponentli kalsium sensorunun qurulmasını və təhlilini müəyyən dərinlikdə araşdıracağıq.

İndi ilk növbədə hüceyrədaxili kalsiumun ölçülməsinə niyə əhəmiyyət verdiyimizi qeyd etmək üçün yaxşı vaxt ola bilər. Kalsium bir çox siqnal ötürülməsi kaskadlarında iştirak edir, bunlar immun hüceyrələrin aktivləşdirilməsindən əzələlərin yığılmasına, yapışmadan apoptoza qədər hər şeyi tənzimləyir - məsələn, Hüceyrədə David Clapham (2007) və ya PNAS-da Ernesto Carafoli (2002) rəylərinə baxın. Hüceyrədaxili kalsium (Ca2+) normal olaraq ~100 nM səviyyəsində saxlanılır, hüceyrə xaricindəki ~mM konsentrasiyadan daha az böyüklük sıraları. ATPase nasosları sitoplazmik kalsiumun bazal konsentrasiyasını aşağı səviyyədə saxlamaq üçün fəaliyyət göstərir. Çox vaxt kalsium ikincil xəbərçi rolunu oynayır, yəni hüceyrə səthindən onun sitoplazmasına bir mesaj ötürür. Məsələn, müəyyən bir liqand hüceyrə səthi reseptorunu bağlaya bilər və bu, kalsium ionlarının adətən sekvestr olunduğu hüceyrədaxili bölmələrdən sərbəst buraxılmasına səbəb olur. Bu sərbəst ionlar öz növbəsində fosforlaşmanı və ya digər aşağı axın siqnalını təşviq edə bilər.

Kalsiumu bağlayan zülallar bunu çox müxtəlif yaxınlıqlarla yerinə yetirir və sekvestrdən tutmuş hiss etməyə qədər müxtəlif rollara malikdir. Bəzi kalsium reaksiyaları, xüsusən də kalsiumu bağlaya bilən transkripsiya faktorları halında uzunmüddətli təsirlərə malik ola bilər. Keçən dəfə öyrəndiyiniz kimi, kalmodulin kalsiumun bağlanması zamanı konformasiya dəyişikliyinə məruz qalaraq kalsium sensoru kimi işləyir. Bu gün məqsədiniz meydana gələn zülalın kalsiuma yaxınlığını dəyişdirmək üçün mutant kalmodulini (tərs perikam kontekstində) DNT hazırlamaqdır.

İstinadlar

Heim, R., D. C. Prasher və R. Y. Tsien. "Dalğa uzunluğu mutasiyaları və yaşıl floresan zülalın posttranslational avtooksidləşməsi." PNAS 91, yox. 26 (20 dekabr 1994-cü il): 12501-4. [Tam mətn]

Nagai, T. və b. "Dairəvi olaraq dəyişdirilmiş yaşıl floresan zülallar Ca2+ hiss etmək üçün hazırlanmışdır." PNAS 98, yox. 6 (6 mart 2001): 3197-3202. [Tam mətn]

Clapham, D. E. "Kalsium siqnalı." Hüceyrə 131, yox. 6 (14 dekabr 2007): 1047-1058.

Karafoli, E."Kalsium siqnalı: Bütün fəsillər üçün bir nağıl." PNAS 99, yox. 3 (5 fevral 2002): 1115-22. [Tam mətn]

Protokollar

1-ci hissə: Astarın hazırlanması

  1. Lazım olan suyun miqdarını hesablayın hər bir primer üçün 1 mq/mL konsentrasiyası vermək üçün (irəli və geri).
  2. Astarlarınızı toxunuşla fırladın, hər birini müvafiq su həcmində yenidən dayandırın və yenidən toxunun.
    • Döndürməyə toxunmaq üçün "qısa" düyməsini 3-5 saniyə basıb saxlayın, sonra buraxın.
  3. 125 ng-a sahib olmaq üçün sizə lazım olan primerlərin seyreltilməsini hesablayın hər biri 5 μL üçün primer mövcuddur ümumi məhlul (hər iki primeri ehtiva edir). Bu durulaşmadan 100-200 μL hazırlayın və buz üzərində saxlayın. Astarlar arasında ipuçlarını dəyişdirdiyinizə əmin olun.

2-ci hissə: Sahəyə yönəldilmiş mutagenez

QuickChange-dən istifadə edəcəyik® saytımıza istiqamətlənmiş mutagenezləri yerinə yetirmək üçün Stratagene-dən dəst. Hər qrup seçdikləri X#Z mutasiyası üçün bir reaksiya quracaq. Eyni zamanda, müəllim heyəti bütün reagentlərin düzgün işləməsini təmin etmək üçün vahid müsbət nəzarət reaksiyası quracaq. Siz tez, lakin diqqətlə işləməlisiniz və borunuzu hər zaman soyudulmuş bir qabda saxlamalısınız. Lütfən, ortaq reagentlərlə işiniz bitdikdən sonra onları ön skamyadakı buz qablarına qaytarın.

  1. Nümunələrinizin fiziki manipulyasiyasına başlamazdan əvvəl aşağıdakı protokolu oxuyun və bütün hesablamaları hazırlayın.
  2. Bir PCR borusu alın və üstünü mutasiya və laboratoriya bölmənizlə etiketləyin (kiçik yazın!). Borunuza 43 μL "Master Mix" - tərkibində tampon və dNTP-lər əlavə edin. Təzə pipet ucundan istifadə etdiyinizə əmin olun, çünki bir neçə qrup Master Mix-in hər bir hissəsini paylaşacaq!
  3. Reaksiya borusuna 2 μL şablon DNT ("IPC plazmid") əlavə edin.
    • Qeyd: mutagenez reaksiyalarının 5-50 ng plazmid DNT ilə rəvan getməsi gözlənilir. Sizə miniprep DNT-nin 1:200 nisbətində seyreltilməsi verilmişdir.
  4. Boruya 5 μL seyreltilmiş primer məhlulu əlavə edin (həm irəli, həm də tərs primerləri ehtiva edir). İndi reaksiyanın həcmi 50 μL olmalıdır.
  5. Nəhayət, 1 μL əlavə edin PfuTurbo DNT polimerazını (ondan götürərkən ferment ehtiyatını qarışdırmayın) P20-dən istifadə edərək reaksiyaya daxil edin və 40 μL-lik P200 dəstinizlə pipetləmə yolu ilə reaksiyanı hərtərəfli qarışdırın.
  6. Hər qrup hazır olduqdan sonra aşağıdakı şərtlər altında termosikleri işə salacağıq:
SEQMENTDÖVRLƏRTEMRATURA (° C)ZAMAN
119530 san
2189530 san
551 dəq
685 dəq
314qeyri-müəyyən
  1. Velosiped sürmə başa çatdıqdan sonra, reaksiyanızdan 10 μL yaxşı etiketlənmiş eppendorf borusuna (mutasiya, laboratoriya bölməsi, komanda rəngi) ayırın. Növbəti dəfə bu həzm olunmamış nümunəyə ehtiyacınız olacaq.
  2. 1 μL əlavə edin DpnI PCR borusunda qalan reaksiya qarışığına və qarışdırmaq üçün pipetlə. Nümunələr 37 °C temperaturda bir saat inkubasiya ediləcək.
  3. Bu son inkubasiya addımı bizi laboratoriyanın bağlanma vaxtını keçirəcək və bu zaman həzm olunmuş (və həzm olunmamış) DNT növbəti dəfəyə qədər dondurulacaq.

3-cü hissə: Jurnal məqaləsinin müzakirəsi

Mutagenləşdirilmiş DNT-nin istehsalı zamanı biz girişdə istinad edilən iki jurnal məqaləsini müzakirə edəcəyik. Bu müzakirənin məqsədi ikitərəfli olacaq: 1) zülal dizaynının tarixi ilə tanış olmaq və 2) elmi ədəbiyyat haqqında danışmağın yollarını araşdırmağa davam etmək. (Yəqin ki, Modul 1 jurnal klublarından sonra hamınız peşəkarsınız!)

Heim, Prasher və Tsienin məqaləsini oxuyarkən aşağıdakı sualları nəzərdən keçirin.

  • Sintetik floresan boyalarla müqayisədə GFP-nin üstünlükləri nələrdir və onun məhdudiyyətləri nələrdir? Bu məhdudiyyətlərdən hansı Heim et al. ünvanlamağa çalışırsan?
  • Müəlliflər mutagenez üçün hansı üsullardan istifadə ediblər və onlar bizim istifadə etdiyimiz üsulla necə müqayisə olunur?
  • Mutagen zülallar ilkin olaraq necə seçildi və seçilmişlər daha sonra necə təhlil edildi?
  • Şəkil 1-də göstərilən müxtəlif vəhşi tipli protein fraksiyalarının əhəmiyyəti nədir?
  • GFP yetişməsi kimyəvi reaksiya üçün heç bir kofaktor tələb etmirsə, niyə dörd saat çəkir? Hansı sübut xətləri kofaktorların olmadığını göstərir?
  • Zülalın hansı hissə(lər)ində faydalı amin turşusu əvəzediciləri aşkar edilmişdir?

Bu gün laboratoriyaya gəldiyiniz zaman, hər qrupa sinifin qalan hissəsinə təqdim etmək və müzakirə etmək üçün aşağıdakı nömrələnmiş mövzulardan biri təyin olunacaq. Eyni qrup #1 və #8 mövzuları əhatə edəcək. Siz indiyə qədər bütün Nagai və digərləri ilə bir qədər tanış olmalısınız, lakin yaddaşınızı təzələmək və aşağıdakı sahələrdən birində daimi ekspert olmaq üçün sinifdə bir az vaxtınız olacaq (qeyd edək ki, bəzən Nəticələr/Müzakirə mətni xüsusi rəqəm ədədi sıradan kənar ola bilər - məsələn, Şəkil 5-dən sonra Şəkil 4 yazılır):

  1. Giriş, Metodlar (Gen Konstruksiyası) və Şəkil 1
    • Fikir verin: kimerik zülal nədir? Dairəvi dəyişdirilmiş bir?
    • Kimerik protein perikamı sensor kimi necə işləyir? (Müxtəlif növ perikamlar haqqında təfərrüatlara hələ ehtiyac yoxdur.)
    • Perikamın gen səviyyəsində necə qurulduğunu qısaca xülasə edin. Bakteriya hüceyrələrində deyil, məməlilərdə perikamı ifadə etmək üçün hansı dəyişikliklər edilməlidir?
  2. Şəkil 2
    • Müəlliflər absorbans spektrlərindən cpEYFP strukturu haqqında nə öyrənirlər?
    • Perikamın sınaqdan keçirilməsi üçün istifadə olunan dalğa uzunluğunu cpEYFP-nin həyəcanlanma maksimumu ilə müqayisə edin. Niyə onlar bir az fərqli ola bilər?
    • Cədvəl 1-də göstərilən mutasiyaları yerinə yetirməklə yanaşı, müəlliflər işləyən (flüoresan, kalsiuma həssas) perikam hazırlamaq üçün nə etməli idilər?
    • İlk işləyən cpEYFP-nin dinamik diapazonu (kalsium əlavəsi ilə intensivliyin dəyişməsi) nə idi?
  3. Cədvəl 1 (mutasiyalar) və Şəkil 3, A-I (diqqət D-F)
    • Əvvəlcə qurulmuş və sınaqdan keçirilmiş üç növ perikamı və onların kalsiuma necə reaksiya verdiyini təsvir edin.
    • Hansı növ amin turşusu əvəzetmələri edildi və onlar nə üçün qeyd olunan təsirlərə səbəb ola bilər?
  4. Cədvəl 1 (Kd) və Şəkil 3, J-L
    • Bu rəqəmlər dəsti laboratoriya hesabatlarınız üçün sonda yaradacağınız rəqəmlərə çox bənzəyir. Mətndə uzun-uzadı təsvir olunmur, buna görə də lazım gələrsə, kənar resurslardan istifadə edərək baltaları və nəticələri mümkün olduğu qədər deşifrə etmək üçün bir az vaxt ayırın.
  5. Şəkil 4
    • Flaş-perikam nüvə və sitozolda kalsiumun görüntülənməsi üçün əvvəlki məhdudiyyətləri necə yaxşılaşdırır?
    • Hüceyrədaxili kalsiumda mərhələli dəyişikliklər yaratmaq üçün hansı kimyəvi maddələrdən istifadə edilə bilər və onlar necə işləyə bilər?
  6. Şəkil 5
    • Müəlliflər kalsium səviyyələrini necə kalibrlədilər?
    • Digər perikamlarla müqayisədə split-pericam funksiyalarının özəlliyi nədir?
    • Split-pericamın kalsium sensoru kimi istifadə edilməsində hansı məhdudiyyətlər var?
  7. Şəkil 6
    • Orqanoid səviyyəsində tədqiqat üçün perikamda hansı dəyişikliklər edildi və perikamlardan istifadə əvvəlki prosedurlara nisbətən necə yaxşılaşır?
    • Müəlliflər müxtəlif orqanoidlərdə kalsium keçidləri haqqında nə öyrənə bildilər?
  8. Toplama
    • Bəzi digər (perikam əsaslı olmayan) kalsium göstəricilərini təsvir edin.
    • FRET necə işləyir və FRET əsaslı sensorlardan istifadə etməyin müsbət/eksik tərəfləri nələrdir?

Nəhayət, hamınız yuxarıdakı məqalələrdə təsvir olunan araşdırma ilə bu modulda apardığınız tədqiqat arasındakı oxşarlıqları və fərqləri nəzərə almalısınız.

Növbəti dəfə

  1. Miniprep prosedurunun 1 μg/μL tipik konsentrasiyalarla nəticələndiyini fərz edərək, mutagenez reaksiyanızda nə qədər (çəki) plazmid DNT istifadə etdiyinizi hesablayın.
  2. Gəlin tərs perikam konstruksiyasının ən kiçik komponentini araşdıraq. M13 peptidi hansı zülaldan alınır və bu zülal adətən nə edir? Konkret olaraq, onun molekulyar və makroskopik funksiyasını bir-iki cümlə ilə təsvir etməlisiniz.
  3. Eksponensial artım nümayiş etdirən gücləndirmə üçün PCR-dən fərqli olaraq, sahəyə yönəldilmiş mutagenez istənilən DNT məhsulunun miqdarında xətti artıma səbəb olur. Bunun səbəbi, DNT amplifikasiyası yalnız SDM-dəki orijinal şablondan baş verə bilər, heç vaxt həmin şablonun surətindən deyil. Niyə bu olmalıdır? Unutmayın ki, DNT yalnız 5'-3' istiqamətdə sintez edilə bilər. Üstəlik, şablondan kopyalanan DNT bütöv bir çevrə şəklində deyil, nicked formada mövcuddur. Nəhayət, nəzərə alın ki, irəli və tərs astarlarınız birbaşa tamamlayıcıdır. SDM-nin niyə yalnız orijinal şablon DNT-nin nüsxələrini istehsal etdiyini göstərən bir şəkil çəkmək üçün bu üç faktdan istifadə edin və onu qısaca izah edin. Diaqramınızın/izahınızın verilən suala açıq şəkildə cavab verdiyinə əmin olun.

Reagent siyahısı

Stratagene-dən QuikChange II Sayta yönəldilmiş mutagenez dəsti

  • 10X Reaksiya Buferi (100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 200 mM Tris-HCl, 20 mM MgSO4, 1% Triton® X-100, 1 mq/mL BSA)
  • PfuUltra® DNT polimeraza (2,5 U/μL, rxn başına 1 μL)
  • dNTP qarışığı (mülkiyyət qarışığı, hər rxn üçün 1 μL)
  • Dpn I (10 U/μL)

Anabaena sp.-nin həddindən artıq ekspressiyası, immunodeteksiyası və sahəyə yönəldilmiş mutagenezi. PCC 7120 flavodoksin: Molekulyar biologiya üzrə hərtərəfli laboratoriya təcrübəsi

Rekombinant zülal ifadəsi və hədəf genlərin sahəyə yönəldilmiş mutagenezi molekulyar biologiya, biokimya, biotexnologiya və tibb sahələrində artan əhəmiyyətini nümayiş etdirmişdir. Model siyanobakterium Anabaena sp flavodoksini istifadə edərək. PCC 7120 laboratoriya aləti olaraq, iki əsas məqsədi yerinə yetirmək üçün bir neçə yaxşı qurulmuş molekulyar biologiya texnikasını və prosedurlarını əhatə edən hərtərəfli laboratoriya təcrübəsi hazırladıq: (1) rekombinant Escherichia coli hüceyrə ekstraktlarında Anabaena flavodoksinin həddindən artıq ifadəsi və immunodeteksiyası və (2). ) Anabaena flavodoksin geninin isiB istiqamətli mutagenezi. Bu laboratoriya təcrübəsi bakalavr tələbələrinə bu sahədə bir neçə vacib texnikanı özləri yerinə yetirmək imkanı verir. Professorların köməyi ilə tələbələr əvvəlki nəzəri kurslarda öyrəndikləri əsasında düşünmək, şərh etmək və nəticələri müzakirə etmək üçün stimullaşdırılır. © 2018 Beynəlxalq Biokimya və Molekulyar Biologiya İttifaqı, 46(5):493-501, 2018.

Açar sözlər: Anabaena flavodoksin Rekombinant zülal ifadəli zülal immunodeteksiya sahəsinə istiqamətlənmiş mutagenez.


Əhəmiyyət:

Mutagenez etmək üçün müxtəlif üsullardan, məsələn, yuvalanmış PCR, tərs PCR və ya adi PCR gücləndirilməsi istifadə olunur. Burada heç bir xülya üsulları və ya flüoresan kimya tələb olunmur.

Bəs niyə sayta istiqamətlənmiş mutagenez etməliyik? Bunu etməyin əhəmiyyəti nədir? indiki metodların bəzi mühüm istifadələrinə baxaq.

Məhdudiyyət yerlərini aradan qaldırmaq üçün sahəyə yönəldilmiş mutagenezdən istifadə edilir. Məhdudiyyətli həzm müəyyən bir məhdudlaşdırıcı endonükleaz üçün tanınma yeri olan DNT-nin fraqmentlərə bölündüyü bir prosesdir.

Sonra, dəyişdirilmiş ardıcıllıq plazmidə köçürülür və sonra tanınma sahəsinin çıxarılıb-çıxarılmadığını yoxlamaq üçün yenidən məhdudlaşdırma həzmi həyata keçirilir.

Lakin bizim maraqlandıran DNT-də məhdudlaşdırma yeri varsa, məhdudlaşdırıcı endonükleaz hədəf DNT-ni, eləcə də plazmid DNT-nin qalan hissəsini parçalayır və bu, eksperimental uğursuzluğu göstərir.

Funda sadədir, əgər RE tanınma yerində hər hansı bir mutasiya tətbiq etsək, ferment onu müəyyən edə bilməz və onu kəsə bilməz. Bu, yalnız sahəyə yönəldilmiş mutagenezdən istifadə etməklə edilə bilər.

Sonra, zülalın quruluşunu və funksiyasını təhlil etmək tətbiq olunur. Metod bir genin əmələ gətirdiyi zülalın funksiyasını öyrənmək üçün kifayət qədər güclüdür.

Məsələn, fərz edək ki, bir gen bir vəhşi tip proteini kodlayır və bu, bir orqanizmin metabolik yolunda tələb olunur. Bu zülal kodlayan geni mutasiya etməklə, orqanizmin metabolik yolunda həmin zülalın olmamasının təsirini öyrənmək olar.

Həmçinin, sayta yönəldilmiş mutagenezin mühüm funksiyalarından biri gen redaktəsinin və ya gen manipulyasiyasının öyrənilməsidir. Gen manipulyasiyası vasitəsilə müəyyən bir zülalın fəaliyyəti də müəyyən edilə bilər.

Bu vacib tətbiqlərdən əlavə, metod tez-tez zülal-zülal qarşılıqlı təsirini, fermentlərin dəyişdirilməsini və fermentin susdurulmasını öyrənmək üçün tətbiq olunur.


D-nin əraziyə xas mutagenezi1 yabanı tipli Chlamydomonas-da fotosistem II-nin alt bölməsi.

E Przibilla, S Heiss, U Johanningmeier, A Trebst, D-nin sayta xas mutagenezi1 Vəhşi tipli Chlamydomonas-da fotosistem II alt bölməsi., Bitki hüceyrəsi, Cild 3, Sayı 2, fevral 1991, Səhifələr 169–174, https://doi.org/10.1105/tpc.3.2.169

Fotosistem II reaksiya mərkəzi zülal D1-in strukturu və funksional rejimi, II fotosisteminin ikinci stabil elektron qəbuledicisi olan QB üçün bağlanma yuvası daxilində amin turşularının əvəzlənməsinin herbisid bağlanmasına təsirini təhlil etməklə öyrənilə bilər. Burada birhüceyrəli yosun Chlamydomonas reinhardtii-də D1 zülalını kodlayan psbA geninin sayta yönəldilmiş mutagenezi haqqında məlumat veririk. Vəhşi tipli hüceyrələrin xloroplastları hissəcik tabancasından istifadə edərək çevrildi. Təqdim olunan plazmidlər psbA geninin in vitro mutasiyaya uğramış fraqmentini daşıyırdı. Biz 264 və 266 amin turşularının dəyişdirilməsi ilə ikiqat mutant və 259-cu mövqedə əlavə əvəzetməyə malik üçlü mutant əldə etdik. Hər iki mutantın bir neçə növ herbisidlərə qarşı həssaslığı verilmiş və yalnız mövqedə əvəzedicisi olan mutantın həssaslığı ilə müqayisə edilmişdir. 264.


Oliqonukleotidlə idarə olunan mutagenez: iki oliqonukleotid primerindən və tək iplikli DNT şablonundan istifadə edən sadə üsul

Bu yazıda tək zəncirli faqdan əldə edilən vektorlardan istifadə edərək oliqonukleotidlərə istiqamətlənmiş mutagenez üçün sadə və səmərəli metod təqdim olunur. Əvvəllər dərc olunmuş prosedurumuzun bu modifikasiyası (Zoller və Smith, 1982) biri standart M13 ardıcıllığı primeri, digəri isə mutagen oliqonukleotid olan iki primerdən istifadə edir. Hər iki primer eyni vaxtda tək zəncirli şablon DNT-yə bağlanır, DNT polimeraza I (böyük fraqment) tərəfindən genişləndirilir və mutant vəhşi tipli boşluqlu heterodupleks yaratmaq üçün bir-birinə bağlanır. Escherichia coli Bu DNT ilə birbaşa çevrilirsə, əvvəlki hesabatımızda olduğu kimi kovalent qapalı dairəvi DNT-nin təcrid olunmasına ehtiyac yoxdur. Mutantlar bir zond kimi mutagen oliqonukleotiddən istifadə edərək lövhə qaldıran hibridləşmə yolu ilə müəyyən edilir. Metodun nümunəsi olaraq, T → G transversiyasını yaratmaq üçün heptadekanükleotiddən istifadə edilmişdir. MATbir geni Saccharomyces cerevisiae M13mp5 vektoruna klonlanmışdır. Mutagenezin effektivliyi təxminən 50% təşkil etmişdir. İstədiyiniz mutasiyanın istehsalı DNT ardıcıllığı ilə təsdiqləndi. Eyni prosedur məhdudiyyət saytlarının daxil edilməsi, eləcə də 500 bazanın xüsusi silinməsi üçün heç bir dəyişiklik edilmədən istifadə edilmişdir.


Videoya baxın: Mutagenesis types of mutations mutational variability (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Slayton

    It not absolutely approaches me. Who else, what can prompt?

  2. Calbhach

    She visited the simply excellent idea

  3. Mette

    Kulny heykəlcəklər))))))))

  4. Saville

    Siz nişanı vurdunuz. Yaxşı fikir, sizinlə razıyam.

  5. Kejar

    Belə işləməyəcək.



Mesaj yazmaq