Məlumat

Elektroporasiya ilə bakterial transformasiya problemi

Elektroporasiya ilə bakterial transformasiya problemi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən həll edə bilmədiyim bir maya geninin bakterial çevrilməsi ilə bağlı problemim var.

Mən maya DNT-sini təcrid etdim və məhsulumu əldə etmək üçün PCR etdim. Mən GFP konstruksiyası ilə pCGCUm vektorundan istifadə edirəm. SmaI və ClaI ilə həm plazmidimi, həm də məhsulumu hər biri 4 saat ərzində həzm edirəm. Bundan sonra mən məhsulu geldən təmizləyirəm və 22°C-də 30 dəqiqə ərzində yüksək effektivlik T4 ligaza ilə ligasiya həyata keçirirəm. Sonra mən elektrokompetent hüceyrələrimi elektroporasiya ilə (2000V, 5ms) dəyişdirirəm, onu 2 saat ərzində 0,5 ml LB-də bərpa edirəm və LB-A plitələrinə yapışdırıram.

İlk dəfə yalnız etdim:

  • daxil edin 1
  • daxil edin2
  • Boş vektor

və işləmədi (EV-də bəzi qəribə koloniyaların daxil edilməsi və birləşən böyüməsi (18 saatdan sonra) üçün boş lövhələr).

Eyni ligasyonu yenidən etdim və bu dəfə nəzarətləri daxil etdim

Etdiyim budur:

  • daxil edin 1
  • daxil edin2
  • Boş vektor
  • mənfi nəzarət (EK hüceyrələri + elektroporasiya)
  • müsbət nəzarət (EK hüceyrələri + həzm olunmamış vektor)

İndi aldım:

  • əlavə 1 (koloniya yoxdur)
  • insert2 (böyük koloniyalar çox)
  • Boş vektor (böyük koloniyalar çoxdur)
  • mənfi nəzarət (EK hüceyrələri + elektroporasiya) (koloniyalar yoxdur)
  • müsbət nəzarət (EK hüceyrələri + həzm olunmamış vektor) (böyük koloniyalar çox)

Mənfi nəzarət mənim səlahiyyətli hüceyrələrimin yaxşı olduğunu, ən azı AMP-yə davamlı olmadığını göstərir.

Məni çaşdıran odur ki, müsbət nəzarət olsa belə, bəzi qəribə böyük koloniyalar əldə edirəm - burada gözəl transformantlar əldə etsəydim, ya ligasyonun həzminin uğurlu olmadığını güman edərdim, amma indi buna şübhə edirəm).

Qəribə olan başqa bir şey odur ki, indi o koloniyaları insert2 boşqabımda da aldım.

Böyük koloniyaların skan edilmiş şəkli belə görünür:

Mənim bir sualım var ki, kiminsə belə koloniyaları olub? Mən bəlkə də elektroporasiya üçün çirklənmiş küvetlərə sahib olmağı düşünürdüm, amma onları 3 gün ərzində 100% EtOH-da saxladım və sonra elektroporasiyadan əvvəl 3 saat ərzində buxar başlığında qurudum.


Başqa bir çevrilməni sınadım:

  • yenidən elektrokompetent hüceyrələrimizlə
  • Hüceyrələr başqa laboratoriyanı meydana gətirir
  • kimyəvi cəhətdən bacarıqlı hüceyrələr hazırladım

Yaxşısı odur ki, kimyəvi cəhətdən səriştəli hüceyrələrdə çubuq koloniyaları yoxdur, lakin transformasiyanın effektivliyi çox aşağı idi, amma yenə də, məncə, yaxşıdır - əgər mən həqiqətən düzgün əlavə almışamsa, növbəti gün bunu təsdiqləyəcəyəm.

Digər tərəfdən mənim elektroporasiyam hələ də aydınlaşmayıb. Həm hüceyrələrimizdə, həm də digər laboratoriyadan hüceyrələrdə koloniyalar əldə etdim, lakin orada çox az miqdarda. Küvetləri dəyişdirməyə və fərqli elektroporatordan istifadə etməyə çalışacağam, çünki problem yarada biləcək yeganə şey budur - baxmayaraq ki, hələ də buna əmin deyiləm :)

Yardımınız üçün təşəkkür edirəm və mən tərəqqi barədə məlumat verəcəyəm ki, başqası bu problemlə yenidən qarşılaşarsa, o, mənim tapıntılarımdan faydalana bilər.


Başlayanlar üçün Bakterial Transformasiya Problemlərinin Giderilməsi

İlk dəfə sayta yönəldilmiş mutagenez ilə işlədiyim zaman transformasiya etdim. Protein ardıcıllığını p15TVL vektoruna klonladım, mutantlarımı yaratdım (lakin bu başqa hekayədir) və nəhayət növbəti addıma hazır idim: arzuladığım zülalın transformasiyası və ifadəsi. İlk cəhdlərim uğursuzluğa düçar olanda (və ilk dedikdə, bir ay uğursuzluğu nəzərdə tuturam) həvəsimdən düşəcəyini bilmirdim. Mən bu texnikada yeni başlayan biri olduğum üçün həmkarlarım nəyin səhv ola biləcəyi ilə bağlı faydalı təkliflər və məsləhətlər verdilər. Aşağıda o kiçik və qiymətli koloniyaları görmədiyiniz zaman istifadə etmək üçün sadə bir yoxlama siyahısı verilmişdir:


Clostridioides difficile Ştammlarının Elektroporasiyasına Təsir Edən Faktorlar və Şərtlər

Almaq üçün mühüm risk faktoru Clostridioides difficile infeksiya antibiotik istifadəsidir. Buna görə də, fiziologiya və virulentlik faktorları haqqında ətraflı məlumat bu orqanizmlərlə mübarizə aparmaq üçün yeni diaqnostik vasitələrin və antibiotik olmayan terapevtik agentlərin işlənib hazırlanmasına kömək edə bilər. Tədqiq etmək üçün bir neçə genetik sistem mövcuddur C. difficile laboratoriya mühitində və hamısı sabit təkrarlanan və ya seqreqasiya baxımından qeyri-sabit plazmidlərə əsaslanır. Hal-hazırda plazmidlərin içəriyə köçürülməsi C. difficile istifadə etməklə yalnız konyuqasiya ilə yerinə yetirilə bilər Escherichia coli və ya Bacillus subtilis nikah donorları kimi. Burada plazmid DNT-ni daxil etmək üçün bir üsul haqqında məlumat veririk C. difficile daha yüksək transformasiya səmərəliliyinə kömək edə biləcək elektroporasiya və test amillərindən istifadə etməklə: zəifləmiş hüceyrələri, DNT konsentrasiyasını və elektroporasiyadan sonrakı bərpa müddətini sabitləşdirmək üçün istifadə olunan osmolit. -dən asılı olaraq C. difficile Ştamm və plazmid istifadə edildikdə, bu transformasiya protokolu hər mikroqram DNT üçün 20 ilə 200 arasında koloniya əldə edir və əsasən elektroporasiyadan sonrakı bərpa müddətindən təsirlənir. Nəticələrimizə əsasən, hər bir laboratoriyada hər bir ştammın optimal bərpa müddəti üçün sınaqdan keçirilməsini tövsiyə edirik.ƏHƏMİYYƏTİ Patogenlərin əsas biologiyasını başa düşmək yeni müalicə variantlarını inkişaf etdirmək üçün vacibdir. Bu anlayışı idarə etmək üçün genetik alətlər vacibdir. Son illərdə genetik alətlər qutusu mövcuddur Clostridioides difficile tədqiqatçılar əhəmiyyətli dərəcədə genişlənmişdir, lakin hələ də bir donor ştammından DNT-nin konjugal transferini tələb edir C. difficile Burada biz mövcud genetik vasitələrin müxtəlif üsullara daxil edilməsində təsirli olan elektroporasiyaya əsaslanan transformasiya protokolunu təsvir edirik. C. difficile suşlar.

Açar sözlər: Clostridioides difficile elektroporasiya genetik transformasiyası.

Copyright © 2020 Bhattacharjee və Sorg.

Rəqəmlər

C. difficile R20291-in elektroporasiyası…

Sorbitol tərkibli mühitdə yetişdirilmiş C. difficile R20291 səlahiyyətli hüceyrələrin elektroporasiyası. (A) Elektroporasiya edilmiş...

C. difficile R20291-in elektroporasiyası…

Saxaroza tərkibli mühitdə yetişdirilmiş C. difficile R20291 səlahiyyətli hüceyrələrin elektroporasiyası. (A) Elektroporasiya edilmiş...

C. difficile səlahiyyətli hüceyrə xüsusiyyətləri. (A)…

C. difficile səlahiyyətli hüceyrə xüsusiyyətləri. (A) C. difficile R20291 və CD630 səlahiyyətli hüceyrələri…

C. difficile ştammlarının transformasiyası...

C. difficile ştammlarının CD630 və JSC10 transformasiyası. (A) C. difficile CD630 səlahiyyətli…

-80°C-nin təsirini sınaqdan keçirir...

-80°C saxlamanın eletrokompetensiyaya təsirinin sınaqdan keçirilməsi. Səlahiyyətli C. difficile R20291 hüceyrələri…

Anaerob kameranın velosiped sürməsi...

Anaerob kameranın hava kilidinin sürüşməsi transformasiya səmərəliliyinə təsir göstərmir ...

Səlahiyyətli C. difficile R20291 hüceyrələri…

Müxtəlif plazmidlərlə transformasiya edilmiş səlahiyyətli C. difficile R20291 hüceyrələri. pMTL-YN4, pDB29 (a pMTL-YN4…

Mövcudluğunun təsdiqlənməsi…

C. difficile hüceyrələrində göstərilən plazmidlərin mövcudluğunun təsdiqlənməsi. Tiamfenikola davamlı koloniyalar...


Transformasiya

Bu məhsul New England Biolabs, Inc (NEB) şirkətinə məxsus və ya nəzarət edilən bir və ya bir neçə patent, ticarət nişanı və/yaxud müəllif hüquqları ilə əhatə olunur.

NEB məhsullarını müxtəlif tətbiqlər üçün inkişaf etdirib təsdiqləsə də, bu məhsulun istifadəsi alıcıdan müəyyən proqramlar üçün əlavə üçüncü tərəf əqli mülkiyyət hüquqlarını əldə etməyi tələb edə bilər.

Kommersiya hüquqları haqqında ətraflı məlumat üçün [email protected] ünvanında NEB-in Qlobal Biznes İnkişafı komandası ilə əlaqə saxlayın.

Bu məhsul yalnız tədqiqat məqsədləri üçün nəzərdə tutulub. Bu məhsul insanlarda və ya heyvanlarda terapevtik və ya diaqnostik məqsədlər üçün istifadə edilmək üçün nəzərdə tutulmayıb.

Videolar

Səlahiyyətli Hüceyrələrlə Transformasiya Mexanizmi

Transformasiya bakteriyaların ekzogen DNT-ni götürməsi prosesidir. Bu söz Qriffitin “çevrilmə prinsipi”ni kəşfindən götürülmüşdür. Transformasiya və onun iş axınlarının klonlaşdırılmasında necə istifadə edildiyi haqqında daha çox məlumat əldə edin.

NEB ® Səlahiyyətli Hüceyrələrlə Uğurlu Transformasiyalar üçün Məsləhətlər

Üstün nəticələr əldə etmək üçün bu tövsiyələrə əməl edin.

NEB ® Səlahiyyətli Hüceyrələri ilə Çevrilməni Necə Etmək olar

Maksimum transformasiya səmərəliliyi üçün bu protokoldan istifadə edin.

Şüşə boncuklarla sürətli çevrilmə örtükləri

Bu videoda şüşə muncuqlardan istifadə edərək transformasiya örtüyünün necə sürətli və asan ola biləcəyinə baxın.


Elektroporasiya yolu ilə genlərin bitkilərə ötürülməsi: üsullar və tətbiqlər

Gen transferi texnologiyalarının inkişafı canlı orqanizmlərin genetik manipulyasiyasını daha səmərəli həyata keçirməyə imkan verir. Gen transferi üçün istifadə olunan üsullar iki əsas kateqoriyaya bölünür təbii və süni transformasiya. Təbii üsullara konyuqasiya, transpozisiya, bakterial transformasiya, həmçinin fag və retrovirus transduksiya daxildir, fiziki üsulları ehtiva edir, halbuki süni üsullar, məsələn, biolitik transformasiya, mikro-genləri istifadə edərək, fiziki olaraq bir orqanizmin hüceyrəsinə genləri dəyişdirə və köçürə bilər. və makroinyeksiya və protoplastların birləşməsi və s. Süni gen transformasiyası həmçinin kalsium fosfat vasitəçiliyi, polietilen qlikol vasitəçiliyi, DEAE-dekstran və liposom vasitəçiliyi ilə ötürülmələri daxil edən kimyəvi üsullarla həyata keçirilə bilər. Elektrik üsulları da elektroporasiya və elektrofüzyonla həyata keçirilə bilən genləri ötürmək üçün süni üsullardır. Müqayisəli olaraq, yuxarıda qeyd olunan bütün üsullar arasında elektroporasiya yüksək səmərəliliyi və daha geniş tətbiqi sayəsində geniş istifadə olunur. Elektroporasiya hüceyrə membranlarında keçici elektroməsamələrin əmələ gəldiyi elektrik transformasiya üsuludur. Tətbiqlərə əsasən, membrandakı elektroməsamələrin yenidən bağlana bildiyi və hüceyrələr canlılığı qoruduğu və ya membranın yenidən bağlana bilmədiyi və hüceyrənin nəhayət öldüyü yerlərdə geri dönən ola bilər. Hüceyrə ölçüsünü, formasını, sayını və elektrod mövqelərini nəzərə alaraq, sahənin homojenliyini iterativ olaraq optimallaşdırmaq üçün ədədi modellər hazırlamaqla bu problemi minimuma endirmək olar. Müasir biotexnologiyada ədədi üsullardan elektrotransformasiya, elektroporasiyaya əsaslanan inaktivləşdirmə, elektroekstraksiya və elektroporativ biokütlə qurudulmasında istifadə edilmişdir. Bundan əlavə, elektroporasiyanın cari tətbiqləri gələcəkdə müxtəlif istismarlar üçün bəzi digər açıq potensiallara da işarə edir.


Prelab Suallar

Aşağıdakıları öz aranızda müzakirə edin. Fikirlərinizi sinfin qalan hissəsi ilə bölüşməyə hazır olun.

  1. Ampisillin antibiotik penisilinin törəməsidir. Hüceyrələri öldürən bakterial hüceyrələrdə hüceyrə divarının formalaşmasını pozur. Bununla belə, bizim rekombinant plazmidimizdə ampisillini parçalayan zülal istehsal edərək antibiotiklərə qarşı müqaviməti təmin edən bir gen var. Nə üçün ampisillini test mühitinə daxil edirik?
  2. Transformasiya edilmiş hüceyrələr kimyəvi induktorun iştirakı ilə böyüməsə nə olacaq?
  3. Təcrübədə siz nəzarət və eksperimental hüceyrə qruplarını müxtəlif media birləşmələrinə əlavə edəcəksiniz. Hər bir vəziyyət üçün nə proqnozlaşdırırsınız? Doldurun Cədvəl 1 artımı proqnozlaşdırdığınızı və ya artımın olmadığını və artım varsa, minimal artım və ya çoxlu artım olacağını göstərməklə.

Aşağıdakı Prosedurları oxuyun və laboratoriya dəftərinizdə sözlərdən və hərəkət sxemindən istifadə edərək addımları təsvir edin.


Molekulyar Biologiya üçün Laboratoriya Texnikaları- Transformasiya

2. Onlar bizə malik olduğumuz DNT-nin miqdarını artırmağa imkan verir→ Əgər sizdə maraqlandığınız konkret konstruksiyanın bir nüsxəsi varsa, onu E.coli-yə qoya bilərsiniz ki, bu da plazmidin bir çox nüsxəsini yarada bilər. qısa müddət

3. Çox yüksək dəqiqliyə malikdirlər (yeni nüsxə orijinal nüsxəyə nə qədər bənzəyir)→ Bakteriyalar çoxalarkən çox az səhv edirlər.

4. Laboratoriyada təmiri daha çətin olan şeyləri təmir etmək üçün hostdan istifadə edə bilərik.
məsələn: öz-özünə bağlanmaması üçün defosforilat vektoru. Vektoru maraqlandıran genimizə bağladıqdan sonra biz həmin vektoru E. coli-yə yerləşdirə bilərik və E. coli DNT-də 5' uclarında çatışmayan fosfatın yaratdığı nickləri düzəldə bilər.

2. Bu, bizə DNT-ni daha da manipulyasiya etməyə imkan verir, çünki bizdə çox var. Məsələn, biz maraqlı geni GFP-yə və ya onu ER-yə yönəldəcək tək ardıcıllığa bağlaya bilərik.

3. Shuttle-vektorlar→ Biz E. coli kimi sadə bir sistemdə DNT istehsal edə və plazmidi götürüb şikl vektorunun da işləyəcəyi başqa bir orqanizmə yerləşdirə və onu başqa hüceyrədə böyüdə bilərik.

-yaxşı transformasiya sonrası bərpa dövrü olmalıdır. Bu bərpa dövrü həmin hüceyrələrdə antibiotik müqavimətindən məsul olan zülallara (əgər plazmiddə antibiotik müqavimət markerindən istifadə edirsinizsə) imkan verəcək. Hüceyrəyə bu zülalları hazırlamaq üçün kifayət qədər vaxt verilməzsə, o antibiotikə məruz qaldıqda, genə sahib olan bəzi hüceyrələr hələ də öləcək. Yaxşı bir bərpa dövrü adətən 37 dərəcə C-də 60 dəqiqədir.

-Orta log fazında olan hüceyrələrdən istifadə edin (boşqabda olan hüceyrələr əvəzinə) → sürətlə böyüyən hüceyrələr daha nazik membrana sahib olacaq və hüceyrə divarı kimi çarpaz bağlı olmayacaq. Log faza hüceyrələri daha bacarıqlı olmaq qabiliyyətinə malikdir.

-istifadə edilən bakteriyaların ştammı→ DH5α normal olaraq istifadə olunur. K-12 ştammları və NAB5α laboratoriya üçün yaradılmışdır (laboratoriyadan kənarda yaxşı inkişaf edə bilməz). Ştamm və istifadə etdiyiniz ştamın xüsusiyyətləri onun nə qədər sürətlə böyüməsi və hüceyrə divarından nə qədər səmərəli keçməsi kimi bir çox şeyi müəyyən edəcək.

-hansı divalent kationdan istifadə edirsiniz → bəzən Rb və Ca-nı birlikdə istifadə edəcəksiniz, bu da çox Ca+-nın potensial zərərini azaltmağa kömək edəcək.

-istilik şokunun vaxtı və temperaturu→ istilik zərbəsi üçün vaxt və temperaturun miqdarı empirik olaraq müəyyən edilir. Hüceyrələrin necə qurulduğu və istifadə etdiyiniz suşlar bu dəyərləri müəyyən edəcək. Zaman üçün siz empirik olaraq müəyyən edilmiş şeylərə əməl etməlisiniz. Temperatur üçün 42 dərəcə adətən gedə biləcəyiniz ən yüksək temperaturdur. Daha yüksəklərə qalxsanız, adətən baş verəcək şey hüceyrələr çevriləcək, lakin siz onları öldürəcəksiniz.

-hüceyrələri istilik şokundan sonra buz üzərində sabitləşdirmək (4 dərəcə C)→ bu addımı atsanız, səmərəlilik xeyli azalacaq. Bu, onların tərkibindəki maddələrin ətraf mühitə sızmaması üçün istilik şokundan membrandakı məsamələri bağlamağa kömək edir.

-hüceyrələrə qoyulan DNT-nin növü → super qıvrılmış DNT hüceyrələrə asanlıqla daxil olur. Rekombinant DNT istifadə edərkən, plazmid ona başqa parçalar əlavə etmək üçün kəsilmişdir. Bu o deməkdir ki, siz rahat dairəvi DNT-yə sahib olacaqsınız, bu da hüceyrəyə daxil olmaqda daha az effektivdir. Bunun üçün membrandakı məsamələrə sürətlə daxil olmaq daha çətindir. Xətti DNT zəif çevrilir, çünki hüceyrəyə daxil olsa belə, adətən bakteriya hüceyrəsindəki endonükleazlar tərəfindən uclardan parçalanır.

-plazmidin ölçüsü→ plazmid nə qədər kiçik olsa, o, daha asan daxil olar və çevrilmə bir o qədər yaxşı olar. Bu membran vasitəsilə diffuziya kimi işləyir. Plazmid çox böyükdürsə, zamanla məsaməni keçə bilməyəcək.

Nəticə odur ki, laboratoriyada transformasiyalar edərkən istifadə etdiyiniz hüceyrələrin bacarıqlarına daha çox diqqət yetirmək istəyirsiniz. Hüceyrələrin səriştəsi, daxil etdiyiniz DNT-nin faktiki miqdarından daha məhdud olur.


Transformasiya

Bu məhsul New England Biolabs, Inc (NEB) şirkətinə məxsus və ya nəzarət edilən bir və ya bir neçə patent, ticarət nişanı və/yaxud müəllif hüquqları ilə əhatə olunur.

NEB məhsullarını müxtəlif tətbiqlər üçün inkişaf etdirib təsdiqləyərkən, bu məhsulun istifadəsi alıcıdan müəyyən proqramlar üçün əlavə üçüncü tərəf əqli mülkiyyət hüquqlarını əldə etməyi tələb edə bilər.

Kommersiya hüquqları haqqında ətraflı məlumat üçün [email protected] ünvanında NEB-in Qlobal Biznes İnkişafı komandası ilə əlaqə saxlayın.

Bu məhsul yalnız tədqiqat məqsədləri üçün nəzərdə tutulub. Bu məhsul insanlarda və ya heyvanlarda terapevtik və ya diaqnostik məqsədlər üçün istifadə edilmək üçün nəzərdə tutulmayıb.

Videolar

Səlahiyyətli Hüceyrələrlə Transformasiya Mexanizmi

Transformasiya bakteriyaların ekzogen DNT-ni götürməsi prosesidir. Bu söz Qriffitin “çevrilmə prinsipi”ni kəşfindən götürülmüşdür. Transformasiya və onun iş axınlarının klonlaşdırılmasında necə istifadə edildiyi haqqında daha çox məlumat əldə edin.

NEB ® Səlahiyyətli Hüceyrələrlə Uğurlu Transformasiyalar üçün Məsləhətlər

Üstün nəticələr əldə etmək üçün bu tövsiyələrə əməl edin.

NEB ® Səlahiyyətli Hüceyrələri ilə Çevrilməni Necə Etmək olar

Maksimum transformasiya səmərəliliyi üçün bu protokoldan istifadə edin.

Şüşə boncuklarla sürətli çevrilmə örtükləri

Bu videoda şüşə muncuqlardan istifadə edərək transformasiya örtüyünün necə sürətli və asan ola biləcəyinə baxın.


Gen Pulser Xcell Elektroporasiya Sistemi

The Gen Pulser Xcell ilkin, asma və çətin transfeksiya olunan hüceyrələrdən, o cümlədən T hüceyrələrindən bakteriya və göbələklərə qədər hər növ hüceyrənin transfeksiyası üçün çevik, modul elektroporasiya sistemidir. Elektroporasiya sistemi hüceyrə tipiniz üçün optimal impulsları çatdırmaq üçün eksponensial və ya kvadrat dalğa impulslarından istifadə edir və o, əsas vahid üzərində qurulur. CE modulu məməlilərin hüceyrələri və bitki protoplastları üçün tələb olunan aşağı gərginlikli kondansatörləri ehtiva edir. PC modulu yüksək gərginlikli elektroporasiya üçün lazım olan rezistorları ehtiva edir. Hüceyrə canlılığını qoruyarkən ən yüksək effektivlik üçün ən çox yayılmış hüceyrə növləri və çətin köçürülən hüceyrələr üçün əvvəlcədən təyin edilmiş protokollardan istifadə edin və ya hüceyrə tipiniz üçün ən yaxşı optimallaşdırılmış şərtlər üçün lazım olduqda parametrləri əl ilə tənzimləyin.

Müxtəlif hüceyrə növləri üçün ən yaxşı səmərəliliyi və canlılığı təmin edəcək şərtləri optimallaşdırmaq üçün həm eukaryotik, həm də prokaryotik hüceyrələri eksponensial çürümə və ya kvadrat dalğa impulsları ilə elektroporasiya etmək üçün tam imkan.
Aşağı gərginlikli və yüksək tutumlu kvadrat dalğa impulslarını həssas hüceyrələrə müəyyən edilmiş impuls müddətləri və impuls nömrələri ilə aşağı müqavimətli mühitə çatdırır və səmərəliliyi və canlılığı artırmağa kömək edir.
Yüksək müqavimətə malik kiçik həcmli nümunələrə qarşı müqaviməti idarə etmək qabiliyyəti ilə yüksək gərginlikli impulslar verir, buna görə də eksponensial çürümə impulsunun vaxt sabitini azaldır.

Listeria-nın elektroporasiyası ilə bağlı problemlər - hər hansı bir fikriniz varsa, xahiş edirəm.. (İyun/09/2011)

Mən 6 aydan çoxdur ki, Listeria monocytogenes EGD-ni plazmidlə çevirməyə çalışıram və həqiqətən də bəzi məsləhətlərə ehtiyacım var, çünki heç bir transformasiya olunmuş bakteriya əldə etmirəm.

Mən bir neçə texnikanı sınadım, indi Monk et al., 2008 (http://aem.asm.org/cgi/reprint/74/13/3921) uyğun olaraq elektroporasiya edirəm, çünki onlar Park və Stewart metodu EGD zəif çevrilmişdir (mən heç nə almadım) və hələ də heç bir koloniya müşahidə etmirəm. Ctrls (plazmid əvəzinə su ilə çevrilən bakteriyalar) adətən olduğundan bir qədər kiçik olsa da, gözəl şəkildə böyüyür.
Kimsə bu üsulu sınadı, yoxsa onun üçün işləyən başqa üsul var? L.m.-nin çevrilməsində həlledici məqamlar hansılardır. EGD buna təsir edə bilərmi? Mən də E.coli ilə işləyirəm və onu çevirmək həqiqətən asandır, həm istilik şoku, həm də elektroporasiya üsulu ilə çoxlu koloniya əldə etdim, buna görə də bu L.m. EGD problemləri məni dəli edir..

Zəhmət olmasa kiminsə fikri varsa..

Çox-çox-çox sağ olun!!!

Bədəndə olan məhdudiyyət sistemlərinə diqqət yetirmisinizmi? Məhdudiyyət yerlərinin aradan qaldırılması və ya onların müvafiq metilazlarla metilasiyası probleminizi həll edə bilər. L.m.-də müqavimət kasetlərinizin işləməsinə əminsinizmi? Növlərdə fəaliyyət göstərdiyi bilinən plazmid ilə nəzarət transformasiyasını sınamısınız?

phage434 9 iyun 2011-ci il 23:48:34 tarixində dedi:

Əslində mən bunu etməmişəm. Listeria monocytogenes-də yerli məhdudiyyət sistemləri ilə bağlı heç bir istinad tapa bilmirəm. Bunu yoxlamaq üçün istifadə edə biləcəyim proqram varmı və ya necə edilir?

phage434 9 iyun 2011-ci il 23:48:34 tarixində dedi:

Mən L.m.-də çevrilmiş başqa konstruksiyada əvvəllər istifadə edilmiş eritromisin kasetindən istifadə edirəm.

phage434 9 iyun 2011-ci il 23:48:34 tarixində dedi:

Bəli, sınamışam (bu yaxınlarda hədiyyə olaraq almışam), amma hələ də işləmir, buna görə də çarəsizəm..


Xoş fikirlərinizə və köməyinizə görə təşəkkür edirik

Beləliklə, görünür ki, ilk iş sifarişiniz L.m.-ə məlum işləyən plazmidi daxil etməkdir. hüceyrələr. Müsbət nəzarət edə bilməyincə, etibar etmədiyiniz yenilərini qurmağa və onlarla işləməyə çalışmağın mənası yoxdur. Mən L.m.-nin dəyişdirilməsi ilə bağlı əvvəlki işlərə çox diqqətlə baxardım. və onu təkrarlamağa çalışın. Ehtimal ki, işləyən plazmidi inkişaf etdirən şəxsin təcrübələrini birbaşa təkrarlamağa çalışmaq başlamaq üçün yerdir.

phage434 Cümə 1 İyul 00:08:50 2011 dedi:

Bu protokolu 5 dəfə işləyən plazmidlə eyni şəkildə sınadım. Bilirəm ki, plazmid/bakteriya nisbəti ilə bağlı bəzi problemlər ola bilər, lakin mən plazmidin konsentrasiyasını ölçürəm, onların təsvir etdiyi kimi tam olaraq 1ug verirəm, həcmin bakteriyaların həcminin 10%-dən çox olmamasına diqqət yetirirəm. Bundan əlavə, elektrokompetent hüceyrələrin hazırlanması ilə bağlı bəzi problemlər ola bilər, lakin onlar həqiqətən bütün media və tamponların necə hazırlanacağını (avtoklav üçün və ya yox, filtrlə sterilizasiya etmək və ya etməmək, pH-ı tənzimləmək və ya etməmək) necə hazırlanacağını çox yaxşı izah etdilər.
Dedikləri kimi dəqiq olmayan yeganə şey elektroporatordur. Bizdə bu kiçik Biorad elektroporator (Micropulser) var ki, artıq müxtəlif bakteriya və mayalar üçün proqramlar var və əlavə olaraq siz gərginliyi dəyişə bilərsiniz (mən onu 1kV təyin etmişəm), lakin siz müqaviməti (400 ohm olmalıdır) və tutumunu dəyişə bilməzsiniz. (25uF olmalıdır) və mən təlimatda və internetdə heç bir yerdə bu məsələ ilə bağlı spesifikasiya tapa bilmədim.
Bu, həqiqətən belə böyük bir amil ola bilərmi, ona görə də mən transformasiya olunmuş bakteriyaların HEÇ BİRİNİ müşahidə etmirəm? :/

Küvetin düzgün genişliyindən istifadə etdiyinizə əmin olun. Onlar 4 mm, 2 mm və 1 mm genişlikdə olurlar və siz kağızınızla eyni şəkildə istifadə etməlisiniz.

Hüceyrələri necə hazırladıqlarına da diqqət yetirin. Onlar böyümənin hansı mərhələsində məhsul yığırlar? Onlar necə yuyulur? Mən qeyri-selektiv plitələrə seriyalı seyreltmələri örtməklə həm elektroporasiyadan əvvəl, həm də sonra hazırlanmış hüceyrələrdə canlı koloniya hesabını aparardım.

Hüceyrələri necə bərpa edirsiniz? Onları bir saat və ya daha çox müddətə qeyri-selektiv mühitlə yetişdirirsiniz, ardınca selektiv lövhələrə yapışdırırsınız? İş yoldaşlarınız nə edir?

Ən pis halda, siz bu təcrübələri aparan laboratoriyaya baş çəkib onların necə etdiklərinə baxa bilərsinizmi?

phage434 Cümə 1 İyul 12:31:52 2011 dedi:

Mən bu protokolda etdikləri kimi 1 mm-dən istifadə edirəm, buna görə də problem olmamalıdır.

phage434 Cümə 1 İyul 12:31:52 2011 dedi:

Elektrokompetent hüceyrələrin hazırlanması protokolu uzun və yorucudur. Qısacası: bu suspenziyanı BHI mühitində + 0,5M saxarozada (BHIS) 10%-ə qədər seyreltməkdənsə, BHI-də O/N kulturasını yetişdirməlisiniz. Bir mərhələyə qədər böyüyün. Penicillium əlavə edin. OD ikiqat artana qədər böyüdün və sonra cfg və azalan həcmdə soyuq saxaroza-qliserin yuma tamponu (SGWB) ilə bir neçə dəfə yuyun. bir addımda lizozim də əlavə edin. sonra cfg və yenidən SGWB və cfg ilə yuyun və SGWB ilə yuyun. süspansiyonu 50uL həcmdə ayırın və -80 dərəcədə saxlayın. Hər şey buz üzərində.

phage434 1 iyul 2011-ci il, Cümə 12:31:52 dedi:

Mən həmişə mənfi nəzarət edirəm (bakteriya+ su) və qeyri-selektiv plitələrə 3-cü və 5-ci seyreltmə ilə örtürəm və bakteriyalar gözəl şəkildə böyüyür (boşqab bakteriyalarla doludur, ona görə də Nu. saymadım). Ancaq mən dəqiq yaşaya bilən koloniya sayını görmək üçün bunu etməyə çalışacağam. Bu qeyd üçün təşəkkür edirəm)

phage434 1 iyul 2011-ci il, Cümə 12:31:52 dedi:

Mən onları protokolda dedikləri kimi bərpa edirəm (əslində protokol çoxlu qeydləri olan məqalə üçün çox, çox təfərrüatlıdır, lakin hələ də işləmir () : 1 ml otaq temperaturu ilə BHIS, statik olaraq 30 dərəcə inkubatorda 1, 5 saat BHIS ilə ardıcıl seyreltmələri edin və plazmidi aldığım bu digər laboratoriyadan olan insanların mənə tövsiyə etdiyi kimi, onları selektiv antibiotik konsentrasiyası olan selektiv lövhələrə qoyun.
Laboratoriyamda klonlama işləri ilə məşğul olan yeganə insanam, həm də ən gəncəm və mən müəlliflərə artıq çoxlu suallar vermişəm və həqiqətən onların məsləhətlərinə sadiqəm, amma yenə də nəticə yoxdur. Ona görə də kiminsə əlavə məsləhəti olub-olmadığını burada soruşdum. Bütün şərhləriniz və qeydləriniz üçün təşəkkür edirik. Yenidən protokol vasitəsilə başqası ilə getmək və onun vacib məqamlarını yoxlamaq həqiqətən yaxşıdır.

phage434 Cümə 1 İyul 12:31:52 2011 dedi:

Ola bilsin ki, tətilim zamanı öz hesabıma bunu təşkil edə bilərəm

salam dostum. Bu yaxınlarda mən bu transformasiyanı uğurla həyata keçirdim, ümid edirəm ki, aşağıda göstərdiyim üsul sizə kömək edə bilər. Siz rejimi "Vaxt Sabiti"nə keçirməli, sonra gərginliyi və vaxtı müvafiq olaraq 1000v və 5ms-ə təyin etməlisiniz. Mən 1 mm kyuvet və Biorad elektroporatordan istifadə edirdim. Uğurlar sənə.


Videoya baxın: REPRODUKSI SEKSUAL BAKTERI: KONJUGASI, TRANSDUKSI DAN TRANSFORMASI (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Tojazilkree

    Bəli həqiqətən. Yuxarıda göstərilənlərin hamısı ilə razıyam. Bu mövzuda ünsiyyət qura bilərik. Burada və ya axşam.

  2. Nesar

    Remarkable phrase

  3. Marline

    Yerini vurdun. Bu barədə bir şey var və məncə yaxşı bir fikirdir.



Mesaj yazmaq