Məlumat

QPCR üçün hovuz


3 müxtəlif qrupda miRNA ifadə səviyyələrini müqayisə edirəm, lakin pul və vaxtım azdır. Mən faktiki tədqiqatı davam etdirmək üçün bəzi ilkin nəticələr əldə etməliyəm, ona görə də nümunələrimi bir yerə toplamaq və 372 miRNA üçün nəticələri əldə etmək qərarına gəldim və sonra onlardan hər hansı biri görkəmli diferensial ifadəni göstərsə, həmin namizəd miRNA-ların ifadə səviyyələrini daha böyük ölçüdə araşdıracağam. qruplar. Amma nümunələrimi birləşdirmək üçün necə qruplaşdıracağıma qərar verə bilmirəm. 3 qrupun hər biri üçün 3 fərdi nümunə götürməliyəmmi (cəmi 9 nümunə) yoxsa hər qrup üçün hər bir nümunə üçün ümumi RNT çıxarmalı, 3 RNT hovuzu hazırlamalı və sonra hər hovuz üçün sadəcə üç nüsxə etməliyəm? Hər iki vəziyyətdə sərf olunan vaxt və pul eyni olacaq. Düşünürəm ki, ikinci üsul daha məqsədəuyğundur, amma qorxuram ki, bu, bəzi deflated p-dəyərləri yarada bilər və nəticədə yalan kəşfə səbəb ola bilər.


3 qrupun hər biri üçün 3 fərdi nümunə götürməliyəmmi (cəmi 9 nümunə) yoxsa hər qrup üçün hər bir nümunə üçün ümumi RNT çıxarmalı, 3 RNT hovuzu hazırlamalı və sonra hər hovuz üçün sadəcə üç nüsxə etməliyəm?

Nümunələrinizin xarakterindən asılıdır. Ümumiyyətlə, birləşdirmə müxtəlif şəxslərin ifadəsini orta hesabla çıxaracaq. Birləşdirmə ümumiyyətlə fərdi nümunə üçün aşağı RNT məhsuldarlığınız olduqda edilir. Əgər belə deyilsə, onda siz qrup başına bir neçə fərddən nümunə götürməlisiniz (üç yaxşı olmalıdır; daha çoxu daha yaxşıdır). Bu, bir qrup daxilində fərdlərarası/nümunə dəyişikliyini sizə xəbər verəcəkdir. Siz öz növbəsində texniki dəyişkənliyi ölçmək üçün qPCR üçün üç texniki təkrar qura bilərsiniz. Beləliklə, ümumilikdə 27 PCR reaksiyanız olacaq. Bu o qədər də baha başa gəlməyəcək (əgər siz TaqMan kimi analizdən istifadə etməsəniz. Hətta bu halda da bəzən daha çox nümunə ilə işləmək hər bir nümunə üçün istifadə olunan reagentin miqdarına qənaət etməyə imkan verir.


RT-qPCR-nin Əsas Prinsipləri

Kəmiyyət tərs transkripsiya PCR (RT-qPCR) başlanğıc material RNT olduqda istifadə olunur. Bu üsulda RNT əvvəlcə ümumi RNT və ya messenger RNT-dən (mRNT) əks transkriptaza ilə tamamlayıcı DNT-yə (cDNA) transkripsiya edilir. Daha sonra cDNA qPCR reaksiyası üçün şablon kimi istifadə olunur. RT-qPCR gen ifadə analizi, RNT-nin yoxlanılması, mikroarray yoxlaması, patogen aşkarlanması, genetik test və xəstəlik tədqiqatı daxil olmaqla müxtəlif tətbiqlərdə istifadə olunur.

Bir addımlı və iki addımlı RT-qPCR

RT-qPCR bir addımlı və ya iki addımlı analizdə həyata keçirilə bilər (Şəkil 1, Cədvəl 1). Bir addımlı analizlər bir DNT polimeraza ilə birlikdə əks transkriptazdan istifadə edərək, əks transkripsiyanı və PCR-ni tək boru və tamponda birləşdirir. Bir addımlı RT-qPCR yalnız ardıcıllıqla xüsusi primerlərdən istifadə edir. İki addımlı analizlərdə əks transkripsiya və PCR mərhələləri müxtəlif optimallaşdırılmış tamponlar, reaksiya şəraiti və hazırlıq strategiyaları ilə ayrı-ayrı borularda həyata keçirilir.

Şəkil 1. Bir Addımlı və İki Addımlı RT-qPCR.

Cədvəl 1. RT-qPCR-də bir addımlı və iki addımlı analizlərdən istifadə edərkən üstünlüklər və çatışmazlıqlar

  • Hər iki reaksiya eyni boruda baş verdiyi üçün daha az eksperimental variasiya
  • Daha az pipetləmə addımları çirklənmə riskini azaldır
  • Yüksək ötürücülü gücləndirmə/ekran üçün uyğundur
  • Sürətli və yüksək reproduktiv
  • İki reaksiyanı ayrıca optimallaşdırmaq mümkün deyil
  • İki addımdan daha az həssasdır, çünki reaksiya şərtləri iki birləşmiş reaksiyalar arasında bir kompromisdir
  • Nümunə başına daha az hədəfin aşkarlanması
  • Uzun müddət saxlanıla bilən və çoxsaylı reaksiyalar üçün istifadə edilə bilən sabit cDNA hovuzu yaradılır.
  • Hədəf və istinad genləri multipleksləşmədən eyni cDNA hovuzundan gücləndirilə bilər
  • Optimallaşdırılmış reaksiya tamponları və reaksiya şərtləri hər bir fərdi reaksiya üçün istifadə edilə bilər
  • Çevik astarlama variantları
  • Bir neçə borunun istifadəsi və pipetləmə addımları reaksiyanı daha çox DNT ilə çirklənmə riskinə məruz qoyur
    Vaxt aparan
  • Bir addımdan daha çox optimallaşdırma tələb edir

Ümumi RNT-nin mRNA-ya qarşı seçilməsi

RT-qPCR analizini tərtib edərkən, əks transkripsiya üçün şablon kimi ümumi RNT və ya təmizlənmiş mRNT-dən istifadə etmək qərarına gəlmək vacibdir. mRNT bir az daha həssaslıq təmin edə bilər, lakin ümumi RNT tez-tez istifadə olunur, çünki başlanğıc material kimi mRNT-dən əhəmiyyətli üstünlüklərə malikdir. Birincisi, daha az təmizləmə addımları tələb olunur ki, bu da şablonun daha kəmiyyətcə bərpasını və nəticələri hüceyrələrin başlanğıc sayına qədər normallaşdırmaq qabiliyyətini təmin edir. İkincisi, hər hansı mRNT zənginləşdirmə addımlarından qaçmaqla, müxtəlif mRNA-lar üçün müxtəlif bərpa məhsuldarlığı səbəbindən əyri nəticələrin mümkünlüyünün qarşısını alır. Birlikdə götürüldükdə, ümumi RNT əksər hallarda istifadə üçün daha uyğundur, çünki hədəflərin nisbi kəmiyyəti əksər tətbiqlər üçün aşkarlamanın mütləq həssaslığından daha vacibdir 1 .

Əks transkripsiya üçün primerlər

İki mərhələli analizlərdə cDNT reaksiyalarının hazırlanması üçün üç fərqli yanaşma istifadə edilə bilər: oliqo(dT) primerləri, təsadüfi primerlər və ya ardıcıllıqla spesifik primerlər (Şəkil 2, Cədvəl 2). Çox vaxt oliqo(dT)s və təsadüfi primerlərin qarışığı istifadə olunur. Bu primerlər şablon mRNT zəncirinə bağlanır və əks transkriptaza fermentlərini sintez üçün başlanğıc nöqtəsi təmin edir.

Şəkil 2. RT-qPCR-nin iki addımlı analizlərində əks transkripsiya addımı üçün dörd müxtəlif astarlama üsulu.

Cədvəl 2. RT-qPCR-nin cDNA sintez mərhələsi üçün əsas mülahizələr. Təsadüfi primerləri və ankrajlı oliqo(dT) primerləri birləşdirmək tərs transkripsiyanın səmərəliliyini və qPCR həssaslığını yaxşılaşdırır.

  • Poli(A) quyruqlu mRNT-dən tam uzunluqda cDNT-nin yaradılması
  • Başlanğıc materialı az olduqda istifadə etmək yaxşıdır
  • Çapa oliqo(dT) primerinin mRNT-nin poli(A) quyruğunun 5′ ucunda bağlanmasını təmin edir.
  • Yalnız poli(A) quyruğu olan geni gücləndirin
  • Daxili poli(A) yerlərinin hazırlanmasından kəsilmiş cDNA*2
  • 3′ sonuna doğru əyilmə*
  • Bütün RNT-yə (tRNT, rRNA və mRNA) bağlanır
  • Əhəmiyyətli ikinci dərəcəli strukturları olan transkriptlər üçün və ya başlanğıc material az olduqda istifadə etmək yaxşıdır
  • Yüksək cDNA məhsuldarlığı
  • cDNA bütün RNT-lərdən hazırlanır, bu da həmişə arzuolunmazdır və mRNT siqnalını sulandıra bilər
  • Kəsilmiş cDNA
  • Xüsusi cDNA hovuzu
  • Artan həssaslıq
  • Əks qPCR primerindən istifadə edin
  • Sintez maraq doğuran bir genlə məhdudlaşır

Əks transkriptaza fermentləri

Əks Transkriptaza RNT-dən DNT əmələ gətirən fermentdir. Bəzi fermentlər transkripsiyadan sonra RNT-DNT hibridində RNT zəncirinin parçalanması üçün RNaz aktivliyinə malikdir. Əgər ferment RNaz aktivliyinə malik deyilsə, daha yaxşı qPCR effektivliyi üçün RNaseH əlavə edilə bilər. Tez-tez istifadə olunan fermentlərə Moloney fare lösemi virusunun əks transkriptazı və quş mieloblastozu virusunun əks transkriptazı daxildir. RT-qPCR üçün yüksək istilik sabitliyinə malik əks transkriptaza seçmək idealdır, çünki bu, cDNT sintezini daha yüksək temperaturda həyata keçirməyə imkan verir, RNT-nin yüksək səviyyəli ikincili struktura malik uğurlu transkripsiyasını təmin edir, eyni zamanda bütün reaksiya boyu tam aktivliyini qoruyur. daha yüksək cDNA məhsulu istehsal edir.

RNase H Əks Transkriptazın Fəaliyyəti

RNase H aktivliyi RNT-ni RNT-DNT duplekslərindən deqradasiya edir, ikiqat zəncirli DNT-nin səmərəli sintezinə imkan verir. Bununla belə, uzun mRNT şablonları ilə RNT vaxtından əvvəl pozula bilər və nəticədə cDNA kəsilir. Beləliklə, cDNA klonlanması üçün uzun transkriptlər hazırlamağa çalışarkən RNase H aktivliyini minimuma endirmək ümumiyyətlə faydalıdır. Bunun əksinə olaraq, daxili RNase H aktivliyi olan əks transkriptazalar qPCR tətbiqlərində tez-tez üstünlük təşkil edir, çünki onlar PCR-nin ilk dövrlərində RNT-DNT dupleksinin əriməsini gücləndirirlər.Şəkil 3).

Şəkil 3. RNase H Əks transkriptazaların fəaliyyəti. qPCR-də RNTaz fəaliyyəti ilə əks transkriptaza istifadə edin.


PCR, qPCR - Biologiya biblioqrafiyaları - Harvard üslubunda

Biblioqrafiyanız: Bunnell, T., Burbach, B., Shimizu, Y. and Ervasti, J., 2011. -Aktin xüsusi olaraq hüceyrə böyüməsini, miqrasiyasını və G-aktin hovuzunu idarə edir. Hüceyrənin Molekulyar Biologiyası, 22(21), s.4047-4058.

Campbell, N. A. və Reece, J. B.

Biologiya

2005 - Pearson, Benjamin Cummings - San Francisco

Mətn içi: (Campbell və Reece, 2005)

Biblioqrafiyanız: Campbell, N. və Reece, J., 2005. Biologiya. San Fransisko: Pearson, Benjamin Cummings.

Kişi, P.

Polimeraz Zəncirvari Reaksiya: Nə Əhəmiyyətə Sahibdir?

Mətn içi: (Kişi, 2015)

Biblioqrafiyanız: Man, P., 2015. Polimeraz Zəncirvari Reaksiya: Nə Əhəmiyyətə Sahibdir?. [online] Info.gbiosciences.com. Burada mövcuddur: <http://info.gbiosciences.com/blog/bid/172095/Polymerase-Chain-Reaction-What-Importance-Does-It-Hold> [Giriş tarixi 17 dekabr 2015].

PCR Məhsullarının Gel Elektroforezi | Milli Diaqnostika

Mətn içi: (PZR Məhsullarının Gel Elektroforezi | Milli Diaqnostika, 2015)

Biblioqrafiyanız: Nationaldiagnostics.com. 2015. PCR Məhsullarının Gel Elektroforezi | Milli Diaqnostika. [online] Burada mövcuddur: <https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/gel-electrophoresis-pcr-products> [Çıxış tarixi 16 dekabr 2015].

DNT nümunəsinin keyfiyyətindəki dəyişiklikləri başa düşmək və ölçmək

Mətn içi: (DNT nümunəsinin keyfiyyətindəki dəyişikliklərin başa düşülməsi və ölçülməsi, 2015)

Biblioqrafiyanız: Ogt.co.uk. 2015. DNT nümunəsinin keyfiyyətindəki dəyişiklikləri başa düşmək və ölçmək. [online] Burada mövcuddur: <http://www.ogt.co.uk/resources/literature/483_understanding_and_measuring_variations_in_dna_sample_quality> [Giriş tarixi 16 dekabr 2015].

Packwood, T.

Mətn içi: (Packwood, 2015)

Biblioqrafiyanız: Packwood, T., 2015. PCR. [online] Geneticseducation.nhs.uk. Burada mövcuddur: <http://www.geneticsseducation.nhs.uk/laboratory-process-and-testing-techniques/pcr> [Giriş tarixi 16 dekabr 2015].

QPCR və Rəqəmsal PCR və Ənənəvi PCR | Thermo Fisher Scientific

Mətn içi: (qPCR vs. Rəqəmsal PCR və Ənənəvi PCR | Thermo Fisher Scientific, 2015)


Çox nümunəli hovuzlarda COVID-19 RT-qPCR testinin qiymətləndirilməsi

SARS-CoV-2-nin bu yaxınlarda ortaya çıxması indiki görünməmiş səviyyədə pandemiyaya səbəb olur. Diaqnostik testlər aşkar etmək və cavab vermək qabiliyyəti üçün əsas olsa da, bir çox sağlamlıq sistemləri artıq bu testlə əlaqəli reagentlərin çatışmazlığı ilə üzləşir. Burada, standart RT-qPCR testi üçün birləşdirmə yanaşmasını sınaqdan keçirərək, bir müsbət nümunənin hətta 32 nümunəyə qədər olan hovuzlarda təsbit edilə biləcəyini, təxmini yanlış mənfi nisbətin 10% olduğunu gördük. Hətta 64-ə qədər nümunədə seyreltilmiş müsbət nümunələrin aşkarlanması da əldə edilə bilər, lakin əlavə gücləndirmə dövrləri tələb oluna bilər. Standart protokollardan, reagentlərdən və avadanlıqlardan istifadə etdiyi üçün bu birləşdirmə metodu dərhal mövcud klinik sınaq laboratoriyalarında tətbiq oluna bilər. Ümid edirik ki, COVID-19 üçün hovuz testinin bu cür həyata keçirilməsi mövcud skrininq imkanlarını genişləndirməyə imkan verəcək və bununla da cəmiyyətdə, eləcə də xəstəxana şöbələri, ordu hissələri və ya fabrik növbələri kimi yaxın inteqral qruplarda aşkarlanmanın genişləndirilməsinə imkan verəcək.

Rəqabətli Maraq Bəyannaməsi

Müəlliflər heç bir rəqabətli maraq elan etmədilər.

Maliyyələşdirmə Bəyanatı

Yad Hanadiv - İsraildəki Rotşild Fondu

Müəllif Bəyanatları

Bütün müvafiq etik qaydalara əməl edilib, hər hansı zəruri IRB və/və ya etika komitəsinin təsdiqləri alınıb və IRB/nəzarət orqanının təfərrüatları əlyazmada yer alıb.

Bütün lazımi xəstə/iştirakçı razılığı alınmış və müvafiq institusional formalar arxivləşdirilmişdir.

Mən başa düşürəm ki, bütün klinik sınaqlar və hər hansı digər perspektiv müdaxilə tədqiqatları ClinicalTrials.gov kimi ICMJE tərəfindən təsdiqlənmiş reyestrdə qeydiyyata alınmalıdır. Əlyazmada bildirilən hər hansı belə tədqiqatın qeydə alındığını və sınaq qeydiyyatı ID-sinin təqdim edildiyini təsdiq edirəm (qeyd: retrospektiv olaraq qeydə alınmış perspektivli tədqiqatı dərc edirsinizsə, lütfən, sınaq ID sahəsində tədqiqatın niyə əvvəlcədən qeydiyyata alınmadığını izah edən bəyanat təqdim edin) .

Mən bütün müvafiq tədqiqat hesabatı qaydalarına əməl etdim və müvafiq EQUATOR Şəbəkə tədqiqat hesabatı üzrə yoxlama siyahı(lar)ını və əgər varsa, əlavə fayllar kimi digər müvafiq materialı yüklədim.


COVID-19 testi üçün birləşmə strategiyaları

David Ostin
Grand Valley Dövlət Universiteti
David Austin-ə e-poçt göndərin

COVID-19 pandemiyası faciə və pozulma gətirsə də, riyaziyyatın cəmiyyətimizin üzləşdiyi aktual problemin həllində mühüm və görünən rol oynaması üçün unikal bir fürsət də təmin etdi.

İndiyə qədər yaxşı başa düşülür ki, sınaq SARS-CoV-2 koronavirusunun yayılmasına nəzarət etmək üçün istənilən effektiv strategiyanın mühüm tərkib hissəsidir. Effektiv sınaq rejimlərini inkişaf etdirən ölkələr daha çox normal fəaliyyətə davam edə bildi, qeyri-adekvat sınaqdan keçənlər isə koronavirusun təhlükəli dərəcədə yüksək səviyyədə qaldığını gördülər.

Effektiv sınaq strategiyasının hazırlanması bəzi mühüm problemlərlə üzləşmək deməkdir. Onlardan biri virusun yayılmasının hazırkı vəziyyəti haqqında dəqiq təsəvvür yaratmaq üçün kifayət qədər testlər hazırlamaq və idarə etməkdir. Bu, adekvat reagentlər və sınaq maşınları təchizatı ilə yanaşı, nümunələri toplamaq və emal etmək üçün adekvat sayda təlim keçmiş səhiyyə mütəxəssislərinin olması deməkdir. Bundan əlavə, nəticələr dərhal əldə edilməlidir. Özü də bilmədən yoluxmuş şəxs virusu bir həftə ərzində bir çox başqalarına ötürə bilər, buna görə də nəticələr bir neçə gün və ya hətta saat ərzində əldə edilməlidir.

Məhdud resursların və məhdud vaxtın bu problemlərini həll etməyin bir yolu, hər bir fərdi xəstədən nümunələri ayrıca sınaqdan keçirməkdənsə, bir çox xəstələrdən nümunələri strateji olaraq sınaq hovuzlarında birləşdirməkdir. Həqiqətən, bəzi yaxşı işlənmiş birləşdirmə strategiyaları tələb olunan testlərin sayını on dəfə azalda bilər, yəni cəmi 10 testlə, məsələn, 100 xəstəni effektiv şəkildə test etmək mümkündür.

İlk düşünəndə elə görünə bilər ki, biz yoxdan nəsə əldə edirik. 10 test 100 xəstə üçün necə dəqiq nəticə verə bilər? Bu sütun sıxılmış hissetmə nəzəriyyəsindən bəzi riyazi fikirlərin açarı necə təmin etdiyini təsvir edəcəkdir.

COVID-19 pandemiyasının maraqlı xüsusiyyətlərindən biri də bu barədə öyrənmə sürətidir. İctimaiyyət elmin ictimaiyyət qarşısında və real vaxtda edildiyini görür və yeni tapıntılar bəzən bizə əvvəlki tövsiyə və davranışları dəyişdirməyimizə səbəb olur. Bu, elmi tapıntıların çatdırılması işini xüsusilə çətinləşdirdi. Beləliklə, bu məqalədəki bəzi şeylərin yaxın gələcəkdə yenilənməsi tələb oluna bilsə də, bizim məqsədimiz daha çox aktual qalmalı olan riyazi məsələlərə diqqəti yönəltmək və oxucuya uyğun olaraq yeniləməyə etibar etməkdir.

Bəzi sadə birləşdirmə strategiyaları

SARS-CoV-2 virusu yeni olsa da, böyük bir populyasiyada fərdlərin sınaqdan keçirilməsi problemi deyil. Hekayəmiz 1943-cü ildə Robert Dorfmanın müharibə vaxtı layihəsi vasitəsilə induksiyaya çağırılan sifilitik kişiləri müəyyən etmək üçün aşağıdakı sadə metodu təklif etdiyi zaman başlayır.

1941-ci il posteri sifilis testini təşviq edir (Konqres Kitabxanası)

Tutaq ki, 100 xəstədən nümunələrimiz var. Nümunələrin hər birini ayrı-ayrılıqda sınaqdan keçirmək əvəzinə, Dorfman onları hər biri 10-dan ibarət 10 hovuzda qruplaşdırmağı və hər hovuzu sınaqdan keçirməyi təklif etdi.

Hovuzun test nəticəsi mənfi olarsa, o hovuzdakı hər kəsin infeksiyadan azad olduğu qənaətinə gəlirik. Hovuz müsbət test edərsə, o zaman hovuzdakı hər bir fərdi test edirik.

Yuxarıda təsvir olunan vəziyyətdə, 100 nümunədən ikisi yoluxmuşdur, ona görə də biz onları müəyyən etmək üçün cəmi 30 test həyata keçiririk: orijinal 10 hovuz üçün 10 test, sonra iki yoluxmuş hovuzun hər bir üzvü üçün 20 test. Burada, hər bir fərdi test etdikdə, yerinə yetirilən testlərin sayı tələb olunan sayın 30%-ni təşkil edir.

Təbii ki, bu strategiyanın zərərli olduğu vəziyyətlər var. Hər hovuzda bir yoluxmuş şəxs varsa, biz orijinal 10 testi yerinə yetiririk və sonra hər bir fərdi test edərək təqib edirik. Bu o deməkdir ki, biz hər kəsi ayrı-ayrılıqda sınaqdan keçirmiş olduğumuzdan daha çox 110 test edirik.

Əhəmiyyətli olan budur yayılması infeksiyanın $p$, tapmağı gözlədiyimiz yoluxmuş şəxslərin gözlənilən hissəsi və ya təsadüfi bir şəxsin yoluxma ehtimalı. Əgər yayılma azdırsa, Dorfmanın strategiyasının həyata keçirməyi gözlədiyimiz testlərin sayının azalmasına səbəb ola biləcəyi ağlabatan görünür. Yayılma artdıqca, artıq təsirsiz ola bilər.

Adam başına gözlənilən testlərin sayının yayılma ilə necə dəyişdiyini tapmaq o qədər də çətin deyil. Əgər $k^2$ nümunələrini hər biri $k$ nümunələrindən ibarət $k$ hovuzlarına təşkil etsək, onda adam başına gözlənilən testlərin sayı $ E_k = frac1k + (1-(1-p)^k) təşkil edir. $ $k=10$ olduqda, gözlənilən $E_<10>$ rəqəmi sağda göstərilir. Təbii ki, hər bir fərdi test etmək o deməkdir ki, biz adam başına bir testdən istifadə edirik, ona görə də $E_kgeq 1$ olduqda Dorfmanın strategiyası öz üstünlüyünü itirir. Qrafikdən göründüyü kimi, $p>0.2$, yəni hər 100 nəfərə 20-dən çox yoluxma olduğu halda, hər bir fərdi test etmək daha yaxşıdır.

Xoşbəxtlikdən, SARS-CoV-2 infeksiyalarının yayılması ümumi əhali arasında nisbətən aşağıdır. Payız semestri başlayan kimi mənim universitetim kampus icmasında yayılmasının təxminən $p əqribən 0,01$ olduğunu göstərən təsadüfi sınaq proqramına başladı. Artıq bu rəqəmin 0,04-ə yaxınlaşması narahatlıq doğurur. İstənilən halda, biz fərz edəcəyik ki, əhalimizdə yoluxmuş fərdlərin yayılması kifayət qədər aşağıdır ki, birləşməni real strategiyaya çevirsin.

Təbii ki, heç bir imtahan mükəmməl deyil. Məsələn, yoluxmuş bir nümunənin mənfi test nəticəsi verəcəyi mümkündür. Müəyyən bir sınaq protokolunun effektivliyini iki ölçüdən istifadə edərək xarakterizə etmək tipikdir: həssaslıqspesifiklik. Həssaslıq testin yoluxmuş nümunə üçün müsbət nəticə verməsi ehtimalını ölçür. Eynilə, spesifiklik nümunə yoluxmadıqda testin mənfi nəticə verməsi ehtimalını ölçür. İdeal olaraq, bu rəqəmlərin hər ikisi 100%-ə yaxındır.

Dorfmanın birləşdirmə metodundan istifadə edərək, gözlənilən test sayını birdən aşağı salmaq üçün ödədiyimiz qiymət həssaslığın azalmasıdır. Bu iki addımlı prosesdə yoluxmuş nümunənin müəyyən edilməsi testin hər iki testimizdə müsbət nəticə verməsini tələb edir. Buna görə də, əgər $S_e$ tək testin həssaslığıdırsa, Dorfmanın metodu $S_e^2$ həssaslığına malikdir. Məsələn, 95% həssaslığa malik bir test, testlər birləşdirildikdə təxminən 90% həssaslıq verir.

Bununla belə, spesifiklikdə artım var. Nümunə yoluxmamışdırsa, ikinci dəfə sınaqdan keçirmək onu aşkar etmək şansını artırır. Göstərmək olar ki, həssaslıq və spesifiklik təxminən 95% və yayılma 1% olarsa, yuxarıda göstərildiyi kimi 10 nümunənin birləşdirilməsi spesifikliyi təxminən 99%-ə qaldırır.

Dorfman metodunun bəzi modifikasiyaları

Dorfmanın metodunun bir neçə yolla dəyişdirilməsini təsəvvür etmək mümkündür. Məsələn, testlərin birinci mərhələsində yoluxmuş hovuzları müəyyən etdikdən sonra hələ də sınaq tələb edən daha kiçik nümunələr toplusunda birləşdirmə strategiyası tətbiq edə bilərik.

İkinci imkan aşağıda təsvir edilmişdir, burada 100 nümunə kvadrat $10 imes10$ massivində təsəvvür edilir. Hər bir nümunə öz sıra və sütununa görə iki hovuza daxil edilir ki, birinci turda cəmi 20 test aparılır. Şəkildə iki yoluxmuş nümunə dörd hovuzda, iki cərgədə və iki sütunda müsbət nəticələrə gətirib çıxarır.

Bilirik ki, yoluxmuş nümunələr bu iki cərgənin və iki sütunun kəsişməsində görünür və bu, ikinci turda cəmi dörd testə səbəb olur. Yenə də $E_k$, hər bir fərd üçün gözlənilən testlərin sayını $p$ yayılması baxımından ifadə etmək mümkündür. Əgər $k imes k$ massivində düzülmüş $k^2$ testlərimiz varsa, görərik ki, $ E_k =frac2k + p + (1-p)(1-(1-p)^, $ həssaslıq və spesifikliyin 100% olduğunu fərz etsək.

Sağdakı qrafik iki ölçülü massivdən istifadə edərək gözlənilən test sayını $k=10$ fərz edərək, qırmızı rənglə, Dorfmanın orijinal metodundan istifadə edərək nəticəni mavi rəngdə göstərir. Göründüyü kimi, testlərin gözlənilən sayı ikiölçülü yanaşmadan istifadə etməklə daha çox olur, çünki biz sınaqların birinci mərhələsində iki dəfə çox test sərf edirik. Bununla belə, hər bir nümunə ilkin mərhələdə iki testə daxil edilir. Yoluxmuş nümunənin səhv müəyyən edilməsi üçün hər iki test mənfi nəticələr verməlidir. Bu o deməkdir ki, ikiölçülü yanaşma arzuolunandır, çünki bu strategiyanın həssaslığı fərdi testlərin həssaslığından daha yüksəkdir və yayılma az olduqda biz hələ də gözlənilən test sayını azaldırıq.

Hər hansı birləşdirmə strategiyasının bu mühüm tədbirlərə təsirini nəzərə almaq vacib olsa da, diqqətimiz, əksər hallarda, bizi spesifiklik və həssaslıq müzakirələrindən uzaqlaşdıracaq. Onların aktuallığına dərindən nəzər salmaq üçün bu son Xüsusiyyət sütununa baxın.

Nəzəri məhdudiyyətlər

Birləşdirmə strategiyalarının üstünlük təşkil etdiyi yayılma dəyərlərinin diapazonu ilə bağlı bəzi nəzəri işlər aparılmışdır. İnformasiya nəzəriyyəsinin dilində test nəticələrinin ardıcıllığını $I(p) = -plog_2(p) - (1-p)log_2(1-p)$ entropiyasına malik olan informasiya mənbəyi kimi nəzərdən keçirə bilərik. Bu çərçivədə birləşdirmə strategiyası yaradılan məlumatı effektiv şəkildə sıxışdırmaq üçün mənbənin kodlaşdırılması kimi görünə bilər.

Sobel və Groll göstərdi ki, hər hansı effektiv birləşdirmə metodu üçün adambaşına gözlənilən test sayı olan $E$ $E geq I(p)$-a cavab verməlidir. Sağda $k=10$ olan Dorfman metodu altında gözlənilən testlərin sayı ilə birlikdə bu nəzəri limit qırmızı rəngdə göstərilir.

Unqarın sonrakı işi göstərdi ki, yayılma həddi $pgeq (3-sqrt<5>)/2 əxminən 38\%$ artdıqda, biz hər kəsi ayrı-ayrılıqda sınamaqdan daha yaxşı bir birləşmə strategiyası tapa bilmərik. .

RT-qPCR testi

SARS-CoV-2 virusu üçün bir neçə fərqli test olsa da, hazırda RT-qPCR testi "qızıl standartı" hesab olunur. sonrakı nəzərdən keçirəcəyik.

Nümunə xəstədən tez-tez burun çubuqları vasitəsilə toplanır və maye mühitə səpilir. Test virusun RNT molekullarını adlanan bir proses vasitəsilə tamamlayıcı DNT-yə çevirməklə başlayır. əks transkripsiya (RT). kimi tanınan gücləndirmə dövrlərinin ardıcıllığı kəmiyyət polimeraza zəncirvari reaksiya (qPCR) sonra başlayır. Hər dövr üç mərhələdən ibarətdir:

Maye qaynamağa yaxın qızdırılır ki, transkripsiya edilmiş DNT iki ayrı zəncirdə denatürasiya olunsun.

Sonra maye soyudulur ki, mayeyə əlavə edilmiş primer 100-200 nukleotiddən ibarət xüsusi ardıcıllıqla DNT zəncirinə yapışsın. Bu ardıcıllıq SARS-CoV-2 virusunun tamamlayıcı DNT-sini xarakterizə edir və onu unikal şəkildə müəyyən etmək üçün kifayət qədər uzundur. Bu, testin yüksək həssaslığa malik olmasına zəmanət verir. Astara bir flüoresan marker əlavə olunur.

Son istiləşmə mərhələsində əlavə nukleotidlər tamamlayıcı DNT molekulunun surətini tamamlamaq üçün primerə bağlanır.

RT-qPCR testi nümunəni 30-40 gücləndirmə dövründən keçir və nəticədə hər birində flüoresan marker əlavə olunmuş DNT molekullarının sayında əhəmiyyətli artım olur. Hər bir dövrədən sonra biz flüoresansın miqdarını ölçə və onu virusdan yaranan DNT molekullarının sayının ölçüsünə çevirə bilərik.

Flüoresan, dövrlərin sayından asılı olduğu üçün aşağıda göstərilmişdir. Nisbətən yüksək virus yükü olan nümunə erkən dövrədə əhəmiyyətli flüoresan göstərəcək. Aşağıdakı əyrilər müxtəlif nümunələri təmsil edir və ölçülmüş flüoresansın gücləndirmə dövrləri vasitəsilə necə artdığını göstərir. Sağa doğru hərəkət edərək, hər bir əyri nümunənin ilkin viral yükünün on qat azalması ilə əlaqələndirilir. Birlikdə götürdükdə, bu əyrilər viral yükün milyon dəfə azalması diapazonunu təmsil edir. Əslində, test nümunədə sadəcə 10 virus hissəciyini aşkar etmək üçün kifayət qədər həssasdır.

FDA qırmızı üfüqi xətt kimi göstərilən bir hədd təyin etdi və yuxarıda SARS-CoV-2 virusunun orijinal nümunədə olduğu qənaətinə gələ bilərik. Bununla belə, test müəyyən bir nümunədən flüoresan əyrisini yuxarıdakı əyrilərə uyğunlaşdırmaqla ikili müsbət/mənfi nəticədən daha çoxunu təmin edir, biz orijinal nümunədə mövcud olan viral yük haqqında nəticə çıxara bilərik. Bu şəkildə, test viral yükün kəmiyyət ölçüsünü təmin edir ki, biz tezliklə birləşdirmə metodunun hazırlanmasında istifadə edəcəyik.

Yalnız biri yoluxmuş bir neçə şəxsdən nümunələrin toplanması yoluxmuş nümunəni sulandıracaq. Təsiri, sadəcə olaraq, flüoresan reaksiyasının sonrakı dövrədə FDA həddini keçməsidir. Bununla belə, bir məhdudiyyət var. Səs-küy 40-cı dövrə ətrafında flüoresan oxunuşlara daxil ola bildiyi üçün FDA standartları yalnız ilk 39 dövrün nəticələrinin etibarlı olduğunu bildirir.

Bilder və Yelin tərəfindən son araşdırmalar və b RT-qPCR testində nümunələrin birləşdirilməsinin praktiki hədlərini araşdırdı və aşkar etdi ki, bir yoluxmuş nümunə 32-yə qədər hovuzda etibarlı şəkildə aşkar edilə bilər. (Lakin CDC tərəfindən aparılan son araşdırma, virusun aşkarlanması ilə bağlı narahatlıqları artırır. 33-cü gücləndirmə dövründən keçmiş RT-qPCR testi. )

Qeyri-adaptiv sınaq strategiyaları

Dorfmanın birləşdirmə metodu və onun yuxarıda təsvir edilən variantları kimi tanınır adaptiv üsullar, çünki onlar testlərin ilkin raundu ilə başlayır və ikinci raundla necə davam edəcəyini müəyyən etmək üçün həmin nəticələrdən istifadə edirlər. RT-qPCR testinin tamamlanması 3 - 4 saat tələb olunduğundan, testin ikinci raundu nəticələrin əldə edilməsində gecikməyə səbəb olur və sınaq qurğuları və personalı birləşdirir. Qeyri-adaptiv üsula, bir qrup fərdlər üçün bir test turunda nəticələr çıxaran üsula üstünlük veriləcək.

Bu yaxınlarda bir neçə qeyri-adaptiv üsullar təklif edilmişdir və indi də istifadə olunur, məsələn, P-BEST. Bu müxtəlif metodların əsasında duran riyazi fikirlər olduqca oxşardır. Biz Qobelen adlı birinə diqqət yetirəcəyik.

Biz əvvəlcə $N$ fərdlərindən nümunələr toplayırıq və hər bir nümunənin virus yükünü $x_j$ ilə işarə edirik. Daha sonra bu nümunələri bir az sonra izah ediləcək şəkildə $T$ hovuzlarına çeviririk. Bu, $A_i^j$ birləşmə matrisinə gətirib çıxarır ki, burada $A_i^j = 1$ fərdi $j$-dan nümunə $i^-də mövcuddursa.$ testi və başqa halda 0. $i^-də ümumi virus yükü$ testi sonra $ y_i = sum_ RT-qPCR testi ilə ölçülə bilən A_i^j x_j, $. Təcrübədə $y_i$-ın ölçülməsində müəyyən qeyri-müəyyənlik olacaq, lakin bu, bizim təsvir etdiyimiz nəzəri çərçivədə həll edilə bilər.

İndi xətti cəbr problemimiz var. Hər bir test nəticəsində yaranan $T$ tənliklərini $ yvec = Axvec, $ kimi ifadə edə bilərik, burada $yvec$ test nəticələrinin məlum vektorudur, $A$ $T imes N$ birləşmə matrisidir, və $xvec$ xəstələrdən alınan virus yüklərinin naməlum vektorudur.

Çünki $Tlt N$, bu, az təyin olunmuş tənliklər sistemidir, yəni biz ümumiyyətlə $xvec$ vektoru üçün həll etməyi gözləyə bilmərik. Bununla belə, bizdə bəzi əlavə məlumatlar var: $p$ yayılmasının aşağı olduğunu fərz etdiyimiz üçün $xvec$ vektoru belə olacaq. seyrək, bu o deməkdir ki, onun girişlərinin çoxu sıfırdır. Bu, bütün mövcud qeyri-uyğunlaşma metodlarının əsaslandığı əsas müşahidədir.

Məlum olur ki, bu problem ərazi daxilində geniş şəkildə öyrənilib sıxılmış algılama, az sayda müşahidədən seyrək siqnalı yenidən qurmağa imkan verən siqnal emalı texnikalarının toplusu. Burada bəzi vacib fikirlərin konturları verilmişdir.

Birincisi, vektorun ölçüsünün bir neçə müxtəlif ölçülərini nəzərdən keçirmək fürsətimiz olacaq.

Birincisi, $ orm<0>$ $zvec$ vektorunda sıfırdan fərqli qeydlərin sayıdır. SARS-CoV-2 müsbət nümunələrinin yayılmasının kiçik olacağı gözlənildiyi üçün biz $ orm<0>$-nın kiçik olduğu $yvec=Axvec$ tənliyinə həll axtarırıq.

1-norma $ orm <1>= sum_j-dir

və 2-norma adi Evklid uzunluğudur: $ orm <2>= sqrt $

Unutmayın ki, izometriya vektorların uzunluğunu saxlayan xətti çevrilmədir. $zvec$ vektorunun adi Evklid uzunluğu ilə $||zvec||_2$ kimi yazılmışdır, onda $M$ matrisi $||Mzvec||_2 = ||zvec|| əgər izometriyanı təyin edir. _2$ bütün vektorlar üçün $zvec$. Belə bir matrisin sütunları ortonormal çoxluq təşkil edir.

Biz $A$ birləşdirmə matrisini elə quracağıq ki, o, a-nı təmin etsin məhdud izometriya xüsusiyyəti (RIP), bu o deməkdir ki, $A$ sütunlarının kiçik alt çoxluqları demək olar ki, ortonormaldır. Daha dəqiq desək, əgər $R$ $<1,2,ldots, N>$ alt çoxluğudursa, $A$-ın $R ilə işarələnmiş sütunlarını çıxarmaqla əmələ gələn matrisi $A^R$ ilə işarə edirik. $ məsələn, $A^<<2,5>>$ $A$-ın ikinci və beşinci sütunlarından əmələ gələn matrisdir. $S$ müsbət tam ədədi üçün biz $delta_S$ sabitini elə təyin edirik ki, $ (1-delta_S)||xvec||_2 leq ||A^Rxvec||_2 leq (1+) delta_S)||xvec||_2 $ əsaslığı $S$-dan çox olmayan hər hansı $R$ dəsti üçün. Əgər $delta_S = 0$ olarsa, $A^R$ matrisləri izometriyalardır və bu, $A^R$ sütunlarının ortonormal olduğunu bildirir. Ümumiyyətlə, fikir ondan ibarətdir ki, $delta_S$ kiçik olduqda, $A^R$ sütunları ortonormal olmağa yaxındır.

Gəlin görək bu $delta_S$ sabitlərindən necə istifadə edə bilərik.

Biz $p$ yayılmasının aşağı olduğunu fərz etdiyimiz üçün virus yüklərinin vektoru olan $xvec$-nın seyrək olduğunu bilirik. $yvec = Axvec$ üçün kifayət qədər seyrək həllin unikal olduğunu göstərəcəyik.

Məsələn, tutaq ki, $delta_ <2S>lt 1$, $xvec_1$ və $xvec_2$ $yvec = Axvec$ tənliyinin iki seyrək həllidir və $ orm<0>, orm <0>leq S$. Sonuncu şərt o deməkdir ki, $xvec_1$ və $xvec_2$ onların $S$-dan az sıfırdan fərqli komponentləri olması mənasında seyrəkdir.

İndi $Axvec_1 = Axvec_2 = yvec$ belə çıxır ki, $A(xvec_1-xvec_2) = 0$. Əslində, əgər $R$ $xvec_1-xvec_2$ komponentlərinin sıfırdan fərqli olduğu indekslərdən ibarətdirsə, onda $A^R(xvec_1-xvec_2) = 0$.

Amma biz bilirik ki, $R$-ın kardinallığı $ orm <0>leq 2S$-a bərabərdir, bu da bizə deyir ki, $ 0 = ||A^R(xvec_1-xvec_2)|| _2 geq (1-delta_<2S>)||xvec_1-xvec_2||_2. $ Çünki $delta_<2S>lt 1$, biz bilirik ki, $xvec_1 - xvec = 0$ və ya $xvec_1 = xvec_2$.

Buna görə də, əgər $delta_ <2S>lt 1$, $ orm <0>leq S$ ilə $yvec=Axvec$ həlli unikaldır, yəni kifayət qədər seyrək olan istənilən həll unikal.

İndi seyrək həllərin unikal olduğunu ifadə edən bir şərt gördük, seyrək həlləri necə tapa biləcəyimizi izah etməliyik. Candès və Tao $delta_S + delta_ <2S>+ delta_ <3S>lt 1$ fərz etsək, $ orm ilə $yvec = Axvec$ üçün seyrək həlli necə tapa biləcəyimizi göstərir. <0>leq S$ minimuma endirməklə: $ min orm

yvec = Axvec. $ Bu qabarıq optimallaşdırma problemidir və minimumu tapmaq üçün standart üsullar mövcuddur.

$ orm-u minimuma endirmək nə üçün ağlabatandır?<1>$ seyrək həllə gətirib çıxaracaq? $xvec$-ın 2 ölçülü vektor olduğu halı vizual olaraq düşünək. $ orm <1>= |x_1|-ni qane edən bütün $xvec$ dəsti. + |x_2| Bəzi sabit $C$ üçün leq C$ aşağıdakı kölgəli dəstdir:

Diqqət yetirin ki, bu çoxluğun küncləri bəzi komponentlərin sıfır olduğu koordinat oxlarına düşür. Aşağıdakı xətt kimi görünən $yvec=Axvec$ həllərini nəzərdən keçirsək, görərik ki, $ orm<1>$ minimum olduğu həllər koordinat oxlarına düşür. Bu, $xvec$-ın bəzi komponentlərini sıfır olmağa məcbur edir və seyrək həll ilə nəticələnir.

Bu texnika adlanan birinə aiddir kəmənd (least absolute shrinkage and selection operator), which is well known in data science where it is used to eliminate unnecessary features from a data set.

All that remains is for us to find a pooling matrix $A$ that satisfies $delta_ + delta_ <2S>+ delta_ <3S>lt 1$ for some $S$ large enough to find vectors $xvec$ whose sparsity $ orm<0>$ is consistent with the expected prevalence. There are several ways to do this. Indeed, a matrix chosen at random will work with high probability, but the application to pooling SARS-CoV-2 samples that we have in mind leads us to ask that $A$ satisfy some additional properties.

The Tapestry method uses a pooling matrix $A$ formed from a Steiner triple system, an object studied in combinatorial design theory. For instance, one of Tapestry's pooling matrices is shown below, where red represents a 1 and white a 0.

This is a $16 imes40$ matrix, which means that we perform 16 tests on 40 individuals. Notice that each individual's sample appears in 3 tests. This is a relatively low number, which means that the viral load in a sample is not divided too much and that, in the laboratory, time spent pipetting the samples is minimzed. Each test consists of samples from about eight patients, well below the maximum of 32 needed for reliable RT-qPCR readings.

It is also important to note that two samples appear together in at most one test. Therefore, if $A^j$ is the $j^$ column of $A$, it follows that the dot product $A^jcdot A^k = 0$ or $1$. This means that two columns are either orthogonal or span an angle of $arccos(1/3) approx 70^circ$. If we scale $A$ by $1/sqrt<3>$, we therefore obtain a matrix whose columns are almost orthonormal and from which we can derive the required condition, $delta_S + delta_ <2S>+ delta_ <3S>lt 1$ for some sufficiently large value of $S$.

There is an additional simplification we can apply. For instance, if we have a sample $x_j$ that produces a negative result $y_i=0$ in at least one test in which it is included, then we can conclude that $x_j = 0$. This means that we can remove the component $x_j$ from the vector $xvec$ and the column $A^j$ from the matrix $A$. Removing all these sure negatives often leads to a dramatic simplication in the convex optimization problem.

Tapestry has created a variety of pooling matrices that can be deployed across a range of prevalences. For instance, a $45 imes 105$ pooling matrix, which means we perform 45 tests on 105 individuals, is appropriate when the prevalence is roughly 10%, a relatively high prevalence.

However, there is also a $93 imes 961$ pooling matrix that is appropriate for use when the prevalence is around 1%. Here we perform 93 tests on 961 patients in pools of size 32, which means we can test about 10 times the number of patients with a given number of tests. This is a dramatic improvement over performing single tests on individual samples.

If the prevalence turns out to be too high for the pooling matrix used, the Tapestry algorithm detects it and fails gracefully.

Along with non-adaptive methods comes an increase in the complexity of their implementation. This is especially concerning since reliability and speed are crucial. For this reason, the Tapestry team built an Android app that guides a laboratory technician though the pipetting process, receives the test results $y_i$, and solves for the resulting viral loads $x_j$ returning a list of positive samples.

Using both simulated and actual lab data, the authors of Tapestry studied the sensitivity and specificity of their algorithm and found that it performs well. They also compared the number of tests Tapestry performs with Dorfman's adaptive method and found that Tapestry requires many fewer tests, often several times fewer, in addition to finishing in a single round.

Xülasə

As we've seen here, non-adaptive pooling provides a significant opportunity to improve our testing capacity by increasing the number of samples we can test, decreasing the amount of time it takes to obtain results, and decreasing the costs of testing. These improvements can play an important role in a wider effort to test, trace, and isolate infected patients and hence control the spread of the coronavirus.

In addition, the FDA recently gave emergency use authorization for the use of these ideas. Not only is there a practical framework for deploying the Tapestry method, made possible by their Android app, it's now legal to do so.

Interestingly, the mathematics used here already existed before the COVID-19 pandemic. Dating back to Dorfman's original work of 1943, group pooling strategies have continued to evolve over the years. Indeed, the team of Shental və b. introduced P-BEST, their SARS-CoV-2 pooling strategy, as an extension of their earlier work to detect rare alleles associated to some diseases.

Təşəkkürlər

Mike Breen, recently of the AMS Public Awareness Office, oversaw the publication of the monthly Feature Column for many years. Mike retired in August 2020, and I'd like to thank him for his leadership, good judgment, and never-failing humor.

İstinadlar

David Donoho. A Mathematical Data Scientist's perspective on Covid-19 Testing Scale-up. SIAM Mathematics of Data Science Distinguished Lecture Series. June 29, 2020.

Donoho's talk is a wonderful introduction to and overview of the problem, several approaches to it, and the workings of the scientific community.

This survey article provides a good overview of Dorfman's method and similar techniques.

Bilder was prolific in the area of group testing before (and after) the COVID-19 pandemic, and this page has many good resources, including this page of Shiny apps.

Milton Sobel and Phyllis A. Groll. Group testing to eliminate efficiently all defectives in a binomial sample. Bell System Technical Journal, Cild. 38, Issue 5, Sep 1959. Pages 1179&ndash1252.

Peter Ungar. The cutoff point for group testing. Communications on Pure and Applied Mathematics, Cild. 13, Issue 1, Feb 1960. Pages 49-54.

This paper and the next outline the Tapestry method.

This article and the next describe the P-BEST technique.

Noam Shental, Amnon Amir, and Or Zuk. Identification of rare alleles and their carriers using compressed se(que)nsing. Nucleic Acids Research, 2010, Vol. 38, No. 19.

David L. Donoho. Compressed Sensing. IEEE Transactions on Information Theory. Cild. 52, No. 4, April 2006.

Emamnuel J. Candès. Compressive sampling. Proceedings of the international congress of mathematicians. Cild. 2, 2006. Pages 1433-1452.

Emmanuel Candès, Justin Romberg, and Terence Tao. Stable Signal Recovery from Incomplete and Inaccurate Measurements. Communications in Pure and Applied Mathematics. Cild. 59, Issue 8, August 2006. Pages 1207-1223.

Emmanuel Candès and Terence Tao. Decoding by Linear Programming. IEEE Transactions on Information Theory. Cild. 51, Issue 12, Dec. 2005. Pages 4203-4215.

Chun Lam Chan, Pak Hou Che and Sidharth Jaggi. Non-adaptive probabilistic group testing with noisy measurements: Near-optimal bounds with efficient algorithms. 2011 49th Annual Allerton Conference on Communication, Control, and Computing (Allerton). Monticello, IL, 2011. Pages 1832-1839.

David Austin
Grand Valley State University
Email David Austin

Welcome to the Feature Column!

These web essays are designed for those who have already discovered the joys of mathematics as well as for those who may be uncomfortable with mathematics.
Read more . . .


4 MÜZAKİRƏ

The COVID-19 can present as symptomatic or symptomatic infections. Earlier it was thought that viral loads in symptomatic patients are higher compared with asymptomatic cases. However, in a recent study, it has been documented that viral loads are similar in symptomatic and asymptomatic patients thus, pool testing will produce similar results in all patients with COVID-19. 5 The present study is concordant with the findings of Abdalhamid et al 6 who reported that pool testing is effective in saving resources in the population having prevalence less than 10%. Laboratories have begun to demonstrate that SARS-CoV-2 can be detected in RT-qPCR performed on pooled samples, despite potential dilution. One limitation of pooling which authors feel is that positive sample reporting is delayed by a couple of hours which is taken in deconvoluting and retesting the specimen. They further concluded in his study of assessment of pooled testing to conserve resources that when the incidence rate of SARS-CoV-2 infection is 10% or less, group testing will result in the saving of reagents and personnel time with an overall increase in the testing capability of at least 69%.

A recent study from Lancet showed that over a range of pool sizes, from 4 to 30 samples per pool, Ct values of positive pools were between 22 and 29 for the envelope protein gene (E-gene) assay and between 21 and 29 for the spike protein gene (S-gene) assay. Ct values were lower in retested positive individual samples. The Ct values for both E-gene and S-gene assays in pools and individual positive samples were below 30 and easily categorized as positive. Ct value differences between pooled tests and individual positive samples (Ct pool − Ct positive sample) were in the range of up to five. 7 In another study on specimen pooling, it was observed that pooling did not affect the sensitivity of detecting SARS-CoV-2 when the PCR cycle threshold (Ct) of the original specimen was lower than 35. However, in specimens with low viral load (Ct > 35), 13.3% were false negative. 8 It can be explained by the fact that for each two-fold dilution Ct value increased by 1.24. 9 That means that all samples with Ct value greater than 38, when diluted to 1:5 and above, will show Ct value more than 40 and reported as negative on RT-PCR. Thus, in pooled samples, graphs should be analyzed for the sigmoid curve even beyond Ct value 40 and in case of the appearance of any graph, the RT-PCR should be repeated with deconvoluted samples. Further unpublished data from our center suggest that less than 37 and by following the above-mentioned precautions we picked maximum possible positive cases. Similar cases have been reported by another recent study. 10

To understand the advantages of a pooling approach, consider a laboratory receiving N = 100 samples and prevalence is 5%, that is, 5/100 samples are positive. If 10 pools are created for 100 samples then as a best-case scenario, we can have one pool positive and nine pool negative, and the total PCR reagent used to test 100 samples is 20. In the worst-case scenario, five pools will be positive thus total consumable used will be 60. So, taking the mean value as 40, we propose that for 100 samples in pooled testing we require 40 test reagents, thus saving 60% reagents. Each negative result, obtained by a single RT-qPCR reaction, determines that 100 individual samples are negative without the need for individual testing.


Reaction- and sample-specific inhibition affect standardization of qPCR assays of soil bacterial communities

Quantitative PCR (qPCR) is a popular technique used to quantify target sequences from DNA isolated from soil, but PCR inhibition makes it difficult to estimate gene copy number. Here, we evaluated the extent to which inhibition associated with reaction conditions and sample-specific properties influence the linear range of amplification, and the efficiency and sensitivity of qPCR assays of three bacterial gene targets. We adopted a sample pool approach and exploited the mathematical basis of qPCR to correct for sample-specific effects on amplification. Results revealed that qPCR efficiency and sensitivity were dependent on all conditions tested. In addition, the effect of annealing temperature and SYBR green PCR kit was target-specific, suggesting that the sample pool approach is appropriate for evaluating the quality of new primers. Likewise, the efficiency and sensitivity of qPCR amplification was sample-specific and is likely a result of site and date-specific co-extractants. When relativized against calculations based on plasmid curves alone, reaction-specific and sample-specific inhibition influenced calculations of gene copy number. To account for these differences, we present a brief protocol for soil samples that will facilitate comparison of future datasets.

Vurğulananlar

► We compare reaction- and sample-specific inhibition of qPCR amplification of soil DNA. ► Sample-specific properties affect quantification of soil bacterial communities. ► Reaction-specific amplification affects quantification of soil bacterial communities. ► Data on qPCR amplification of samples can be used to standardize these differences.


Nəticələr

Although it is easy to produce data from qPCR reactions, only through the application of a rigorous, stepwise approach will the data and interpretations be reflective of the tested experimental conditions. Bio‑Rad not only offers excellent reagent and instrument solutions but also a superior technical team to guide and support the scientific community in producing excellent results.

To learn the fundamentals and best practices of qPCR and to schedule a departmental qPCR workshop with a member of our Field Application Scientist team, contact your local Bio‑Rad representative today.


Pooling for qPCR - Biology

MDPI tərəfindən nəşr olunan bütün məqalələr açıq giriş lisenziyası altında dərhal bütün dünyada mövcuddur. MDPI tərəfindən dərc edilmiş məqalənin, o cümlədən rəqəmlər və cədvəllər də daxil olmaqla, hamısının və ya bir hissəsinin təkrar istifadəsi üçün xüsusi icazə tələb olunmur. Açıq giriş Creative Common CC BY lisenziyası altında dərc olunan məqalələr üçün məqalənin hər hansı hissəsi orijinal məqaləyə aydın şəkildə istinad etmək şərti ilə icazəsiz təkrar istifadə edilə bilər.

Feature Papers sahədə yüksək təsir üçün əhəmiyyətli potensiala malik ən qabaqcıl tədqiqatları təmsil edir. Bədii məqalələr elmi redaktorlar tərəfindən fərdi dəvət və ya tövsiyə əsasında təqdim olunur və dərc edilməzdən əvvəl ekspert rəyindən keçir.

Bədii məqalə ya orijinal tədqiqat məqaləsi, tez-tez bir neçə texnika və ya yanaşmanı özündə cəmləşdirən əsaslı yeni tədqiqat işi, ya da elmi sahədə ən maraqlı nailiyyətləri sistematik şəkildə nəzərdən keçirən sahədəki ən son irəliləyişlərə dair qısa və dəqiq yenilikləri olan hərtərəfli icmal sənədi ola bilər. ədəbiyyat. Bu tip kağız tədqiqatın gələcək istiqamətləri və ya mümkün tətbiqlər haqqında dünyagörüşünü təqdim edir.

Redaktorun Seçimi məqalələri dünyanın hər yerindən MDPI jurnallarının elmi redaktorlarının tövsiyələrinə əsaslanır. Redaktorlar jurnalda bu yaxınlarda dərc edilmiş az sayda məqaləni seçirlər ki, onlar müəlliflər üçün xüsusilə maraqlı və ya bu sahədə vacib olacaq. Məqsəd jurnalın müxtəlif tədqiqat sahələrində dərc edilmiş ən maraqlı işlərdən bəzilərinin şəklini təqdim etməkdir.


PCR output applications

PCR has become an indispensable tool in modern molecular biology and has completely transformed scientific research. The technique has also opened up the investigation of cellular and molecular processes to those outside the field of molecular biology and consequently also finds utility by scientists in many disciplines.

Whilst PCR is itself a powerful standalone technique, it has also been incorporated into wider techniques, such as cloning and sequencing, as one small but important part of these workflows.

Research applications of PCR include:


Gene transcription - PCR can examine variations in gene transcription among cell types, tissues and organisms at a specific time point. In this process, RNA is isolated from samples of interest, and reverse-transcribed into cDNA. The original levels of RNA for a specific gene can then be quantified from the amount of cDNA amplified in PCR.

Genotipləşdirmə - PCR can detect sequence variations in alleles of specific cells or organisms. A common example is the genotyping of transgenic organisms, such as knock-out and knock-in mice. In this application, primers are designed to amplify either a transgene portion (in a transgenic animal) or the mutation (in a mutant animal).

Cloning and mutagenesis - PCR cloning is a widely used technique where double-stranded DNA fragments amplified by PCR are inserted into vectors (e.g., gDNA, cDNA, plasmid DNA). This for example, enables the creation of bacterial strains from which genetic material has been deleted or inserted. Site-directed mutagenesis can also be used to introduce point mutations via cloning. This often employs a technique known as recombinant PCR , in which overlapping primers are specifically designed to incorporate base substitutions (Figure 4). This technique can also be used to create novel gene fusions.


Genetic research - PCR is used in most laboratories worldwide. One of the most common applications is gene transcription analysis 9 , aimed at evaluating the presence or abundance of particular gene transcripts. It is a powerful technique in manipulating the genetic sequence of organisms – animal, plant and microbe - through cloning. This enables genes or sections of genes to be inserted, deleted or mutated to engineer in genetic markers alter phenotypes, elucidate gene functions and develop vaccines to name but a few. In genotyping, PCR can be used to detect sequence variations in alleles in specific cells or organisms. Its use isn’t restricted to humans either. Genotyping plants in agriculture assists plant breeders in selecting, refining, and improving their breeding stock. PCR is also the first step to enrich sequencing samples, as discussed above. Məsələn, İnsan Genom Layihəsində (HGP) əksər xəritəçəkmə üsulları PCR-ə əsaslanırdı.

Medicine and biomedical research - PCR is used in a host of medical applications, from diagnostic testing for disease-associated genetic mutations, to the identification of infectious agents. Another great example of PCR use in the medical realm is prenatal genetic testing. Prenatal genetic testing through PCR can identify chromosome abnormalities and genetic mutations in the fetus, giving parents-to-be important information about whether their baby has certain genetic disorders. PCR can also be used as a preimplantation genetic diagnosis tool to screen embryos for in vitro fertilization (IVF) procedures.

Forensic science - Our unique genetic fingerprints mean that PCR can be instrumental in both paternity testing and forensic investigations to pinpoint samples' sources. Small DNA samples isolated from a crime scene can be compared with a DNA database or with suspects' DNA, for example. These procedures have really changed the way police investigations are carried out. Authenticity testing also makes use of PCR genetic markers, for example, to determine the species from which meat is derived. Molecular archaeology too utilizes PCR to amplify DNA from archaeological remains.

Environmental microbiology and food safety - Detection of pathogens by PCR, not only in patients' samples but also in matrices like food or water, can be vital in diagnosing and preventing infectious disease.

PCR is the benchmark technology for detecting nucleic acids in every area, from biomedical research to forensic applications. Kary Mullis's idea, written on the back of a receipt on the side of the road, turned out to be a revolutionary one.

İstinadlar

1. Chien A, Edgar DB, Trela JM. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol 1976127(3):1550-57 doi: 10.1128/JB.127.3.1550-1557.1976

2. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985230(4732):1350 doi: 10.1126/science.2999980

3. Arya M, Shergill IS, Williamson M, Gommersall L, Arya N, Patel HRH. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics 20055(2):209-19 doi: 10.1586/14737159.5.2.209

4. Bachman J. Chapter Two - Reverse-Transcription PCR (RT-PCR). In: Lorsch J, ed. Methods in Enzymology: Academic Press, 2013:67-74. doi : 10.1016/B978-0-12-420037-1.00002-6

5. Morley AA. Digital PCR: A brief history. Biomol Detect Quantif 20141(1):1-2 doi: 10.1016/j.bdq.2014.06.001

6. Taylor SC, Laperriere G, Germain H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports 20177(1):2409 doi: 10.1038/s41598-017-02217-x

7. Ahrberg CD, Manz A, Chung BG. Polymerase chain reaction in microfluidic devices. Lab on a Chip 201616(20):3866-84 doi: 10.1039/C6LC00984K

8. Garibyan L, Avashia N. Polymerase chain reaction. J Invest Dermatol 2013133(3):1-4 doi: 10.1038/jid.2013.1

9. VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis. BioTechniques 200844(5):619-26 doi: 10.2144/000112776


Videoya baxın: Polymerase Chain Reaction PCR (Yanvar 2022).