Məlumat

Siçan modellərində müalicənin yoxlanılması

Siçan modellərində müalicənin yoxlanılması



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Siçan modellərində metastatik kolorektal xərçəng üçün məlum müalicənin təsdiqi üçün layihə təklifi hazırlamaqda çətinlik çəkirəm. Xəstələrdə SNP-lərin onların dərmana qarşı müqavimətinə və/və ya toksikliyinə necə töhfə verdiyini görmək istəyirəm. Bu SNP-lərin proqnozlaşdırıcı biomarkerlər kimi təsdiqlənməsi üçün hüceyrə xətlərindən və siçan modellərindən istifadə edəcəyəm. Bəs, siçanlarda bu xüsusi SNP-ləri necə "induksiya etməliyəm"? CRISPR/Cas9 daha böyük hissələrin dəyişdirilməsi üçün istifadə edilə bilər. Hər hansı bir fikir faydalı fikirdir!


Metastatik beyin şişi modelləri və narkotik beyinə nüfuz analizi

3.3.3 GEMM-lərin üstünlükləri

İnsan beyin şişlərində müşahidə edilən spesifik genetik dəyişikliklərə malik beyin şişlərinin GEMM-ləri yaradılmış və səciyyələndirilmişdir. GEMM-lərdə yaradılmış mutasiyalar insan xəstələrdə müşahidə olunanlara bənzədiyindən, GEMM-lər klinik beyin şişlərinin mühüm genomik xüsusiyyətlərini daha dəqiq əks etdirir. Bir çox hallarda, GEMM-lər insan beyin şişləri ilə oxşar histopatoloji və bioloji xüsusiyyətlərə malikdir. Buna görə də, bu GEMM-lər beyin şişinin inkişafı, irəliləməsi, genetik dəyişikliklər və terapevtik strategiyanın tədqiqi üçün istifadə edilə bilər. GEMM-lərin ksenoqraft modelləri ilə müqayisədə ən mühüm üstünlüklərindən biri odur ki, GEMM-lərdən istifadə beyin şişinin inkişafı və inkişafı üçün xüsusi molekulyar dəyişikliyin cavabdeh olub-olmadığını həll edə bilər. Bundan əlavə, GEMM-lər xüsusi gen mutasiyalarından sonra ardıcıl hadisələr və ya dəyişikliklər haqqında məlumat verir. Bundan əlavə, GEMM-lər həm də metastatik beyin şişinin axtarışı, invaziyası və inkişafı zamanı şiş və stroma qarşılıqlı təsirlərinin tədqiqi üçün bir vasitə təqdim edir. GEMM-lər immunokompetent heyvanlarda genetik cəhətdən dəyişdirilmiş xərçənglərin bioloji xüsusiyyətlərinin tədqiqi üçün yaxşı modellərdir. O, həmçinin BBB vasitəsilə beyinə narkotik nüfuzu ilə bağlı tədqiqatlarda istifadə edilə bilər.


Fon

Xərçəng xərçəngin başlanğıcını, inkişafını və müalicəsini təyin edən, şişdaxili və şişlərarası genomik müxtəlifliyə malik heterojen bir xəstəlikdir. Xərçəng biologiyasının anlaşılması və terapevtiklərin inkişafına müxtəlif siçan şiş modelləri, o cümlədən hüceyrə xəttindən əldə edilən ksenoqraftlar (CDXs), xəstədən əldə edilən ksenoqraftlar (PDX), genetik mühəndislik siçan modelləri (GEMMs), hüceyrə xətti böyük köməklik göstərmişdir. - və ya singenik siçanlarda ilkin şişdən qaynaqlanan homoqreftlər və s ([1,2,3,4] tərəfindən nəzərdən keçirilir). Bu modellər nəsil, ev sahibi və şiş genomikası və biologiyası, mövcudluğu və tədqiqat istifadələrində fərqlənir. Məsələn, immunoterapiyalar GEMM və singenik modellər kimi immunokompetent modellərdə sınaqdan keçirilir.

Keçən onilliklər siçan şişi modellərinin sürətləndirilmiş yaradılması, paylanması, profilləşdirilməsi və səciyyələndirilməsinin şahidi oldu [5,6,7,8,9,10]. Zəngin kolleksiyalar terapevtik effektivliyi qiymətləndirmək, biomarkerləri aşkar etmək/təsdiq etmək, şiş biologiyasını öyrənmək və s. üçün onlarla və yüzlərlə siçan modellərindən ibarət paneldən istifadə olunduğu "siçanların klinik sınaqları (MCTs)" adlanan sınaqları keçirməyə imkan verdi. haqqında. MCT-lər çoxsaylı tədqiqatlarda sadiq klinik proqnozlar nümayiş etdirdilər [6, 11,12,13,14,15]. Ən çox bildirilmiş MCT-lər PDX-lərdən istifadə etsə də, singenik modellər kimi digər siçan modellərindən istifadə edən MCT-lər də indi geniş şəkildə həyata keçirilir.

Klinik sınaqlara bənzədiklərinə görə, MCT-lər tez-tez klinik sınaqlar üçün metodlarla təhlil edilir. Məsələn, ümumi sağ qalma (OS) və irəliləməsiz sağ qalma (PFS) şiş həcminin artması ilə qiymətləndirilir, sağ qalma təhlili üçün Kox proporsional təhlükə modelləri istifadə olunur, cavab kateqoriyaları şiş həcminin dəyişməsi ilə müəyyən edilir və obyektiv cavab dərəcəsi (ORR) hesablanır. [6, 13, 16]. Bununla belə, MCT-lər bir çox cəhətdən klinik sınaqlardan fərqlənir. (1) Onkoloji klinik sınaqda xəstə yalnız bir qolda qeydə alınır, MCT-də isə eyni siçan modelindən çoxlu şiş daşıyan siçan hazırlanır ki, siçan bütün qollara yerləşdirilə bilsin. Eyni siçan modelindən olan siçanlar şiş böyüməsi və dərman reaksiyası üçün şişdaxili heterojenliyi, müxtəlif siçan modellərindən olan siçanlar isə şişlərarası heterojenliyi tutur. Hər qolda birdən çox siçan istifadə edildikdə ölçmə xətası ölçülə bilər. Bundan əlavə, hər iki qolda eyni siçan modellərinin siçanları olduğundan, onların özləri dərmanın effektivliyinin daha yaxşı ölçülməsi üçün qollar arasında nəzarət rolunu oynaya bilərlər. (2) şiş həcmləri müntəzəm olaraq bir neçə gündən bir ölçülür (3) siçan modelləri adətən genomik/farmakoloji/histopatoloji qeydlərlə xarakterizə olunur (4) MCT-lər kliniki sınaqlarda rast gəlinən müxtəlif səs-küy və narahatlığı azaldan/ardıran laboratoriyalarda aparılır, məsələn, dərsi buraxanlar , uzun sınaq müddəti və müşayiət olunan dərmanlar.

Bu işdə biz MCT-lər üçün bəzi əsas məsələləri həll etmək üçün empirik məlumatların təhlilini, statistik modelləşdirməni və hesablama simulyasiyalarını birləşdiririk, o cümlədən heyvan sayının müəyyən edilməsi (siçan modellərinin sayı və siçan modelinə düşən siçanların sayı), statistik gücün hesablanması, effektivliyin kəmiyyəti siçanlar/siçan modelləri/dərmanlar arasında fərq, sağ qalma analizi, sadə effektivlik oxunuşları ilə və ondan kənarda biomarkerin aşkarlanması/təsdiqlənməsi, siçan düşmələrinin idarə edilməsi, çatışmayan məlumatlar və şiş böyümə sürətindəki fərq, dərmanlar üçün təsir mexanizmlərinin (MoA) öyrənilməsi. MCT-lərin uyğun olmayan klinik sınaq nəticələrini izah edə biləcəyini də göstərəcəyik.


İstifadəsi Asan, Ucuz Modeldir

Aydındır ki, singenik modellərin əsas xüsusiyyəti onların tam siçan toxunulmazlığına və hərtərəfli stromaya malik olan immunokompetent olmasıdır. Onların artan istifadəsində digər əsas amil digər immunokompetent modellərlə (məsələn, GEMM, insanlaşmış siçanlar) ilə müqayisədə onların nisbi sadəliyidir.

Singeniklər standart ksenoqraft tədqiqatını həyata keçirməyə ən çox bənzəyən immunokompetent modeldir. Singenik hüceyrə xətləri istənilən laboratoriyada asanlıqla yetişdirilə və genişləndirilə bilər. Modellər 100% nüfuza malikdir və şiş inkişafını sinxronlaşdırmaq və ksenoqraft tədqiqat dizaynını təqlid etmək üçün dərialtı inyeksiyaların vaxtı diqqətlə təyin edilə bilər. Bu, hər qrup üzrə statistik cəhətdən əhəmiyyətli sayda siçan ilə aparılan qısa effektivlik tədqiqatları (potensial olaraq 2-4 həftə) ilə nəticələnir ki, bu da ucuz və idarə edilməsi kifayət qədər sadədir.


Hüceyrəvi Təmizlik: Siçanlarda otofagiya modelləri insanlarda müalicəyə necə səbəb ola bilər

Müasir tibb və tədqiqat dövründə necə qocaldığımıza və yaşa bağlı xəstəlikləri necə inkişaf etdirdiyimizə daha çox diqqət yetirilir. Bu istiqamətdə UT Southwestern-dəki Levine laboratoriyası otofagiya prosesi ilə bağlı araşdırmalar aparıb. Otofagiya yüksək tənzimlənən təbii prosesdir ki, bu proses vasitəsilə hüceyrələr xəstəliklərdən və aclıqdan qorunmaq üçün vacib olan disfunksiyalı hüceyrə komponentlərini deqradasiya edir və təkrar emal edir. Biz bilirik ki, bizim otofagiya qabiliyyətimiz yaşlandıqca azalır və heyvanların otofagiya qabiliyyətinin azalması onların ömrünü əhəmiyyətli dərəcədə azaldır. Bundan əlavə, otofagiyanın uzunömürlülük üzərində təsiri yaxşı başa düşülmür.

Otofagiyanın ən geniş yayılmış formasında təkrar emal üçün qeyd olunan komponentlər udaraq otofaqosom adlanan bir quruluş əmələ gətirir. Sonra komponentlər çox turşulu lizosoma köçürülür və nəticədə xüsusi fermentlər vasitəsilə parçalanır. Tədqiqatçılar bir orqanizmin nə qədər autofagiya edə biləcəyini dəyişdirmək üçün bu proseslərdən istifadə edə bilərlər.

Tədqiqatçılar otofagiyanı öyrənmək üçün otofagiya səviyyəsini artıran siçan modeli yaradıblar. Bu, beclin 1 -BCL2 tənzimləmə kompleksi adlanan komponentin mutasiya edilməsi ilə həyata keçirilir. BCL2 beclin 1-i bağladıqda, autofagiya söndürülür. Beclin 1-də hazırlanmış mutasiya BCL2-nin bağlanmasının qarşısını alır və beclin 1-ə siçanlarda davamlı olaraq yüksək səviyyəli avtofaqiya ilə nəticələnən avtofaqosomun formalaşmasını təşviq etməyə davam etməyə imkan verir.

Bu tədqiqatın nəticələri göstərir ki, artan otofagiya səviyyəsi olan siçanların ömrü əhəmiyyətli dərəcədə artıb. Tədqiqatlar göstərdi ki, bu beclin 1 mutant siçanları nəinki daha uzun yaşayır, həm də daha sağlamdır, daha yaxşı böyrək və ürək funksiyasına malikdir, həmçinin daha az spontan şiş əmələ gətirir. Bundan əlavə, onların vaxtından əvvəl ölümcüllük və sonsuzluq xilas edilir. Bu nəticələr göstərir ki, otofagiyanın bu şəkildə təşviq edilməsi məməlilərin sağlamlığını və ömrünü artıra bilər və daha da öyrənilməlidir.

Tədqiqatçılar daha sonra məlum qocalma əleyhinə birləşmələrin genetik siçan modelinə bənzər bir yol vasitəsilə təsirlərini yarada biləcəyi ilə maraqlandılar. Onların tədqiq etdikləri belə birləşmələrdən biri membran zülalı olan Klotho idi. Əvvəllər sübut edilmişdi ki, genetik olaraq klotho çatışmazlığı olan heyvanların ömrü azalıb və klotho tətbiqi ömrü uzada bilər. Bundan əlavə, klotho tətbiqinin daha çox otofagiyaya kömək etdiyi müşahidə edildi. Levine laboratoriyası klotho çatışmazlığı olan siçanları götürdü və beclin 1 - BCL2 bağlanmasında nəzərəçarpacaq artım müşahidə etdi, bu da daha az autofagiyaya səbəb oldu. Bu klotho çatışmazlığı olan siçanları götürərək və mutasiyaya uğrayan beclin 1 ilə onlar klotho çatışmazlığının təsirlərini xilas edə və otofagiyanı normal vəziyyətə gətirə bildilər. Bundan əlavə, insan HeLa hüceyrələrinə klotho tətbiq etməklə, beclin 1- BCL2 bağlanmasını azalda bildilər ki, bu təsir siçanlara təcrid olunmur, lakin insanlar üçün də tətbiq oluna bilər.


1.2. DAVRANIŞ TESTLƏRİ

AD xəstəsində ən üstünlük təşkil edən və diqqəti çəkən əlamət, ilk növbədə, hipokampal formalaşmada və əlaqəli sahələrdə neyronların və sinapsların itirilməsi səbəbindən idrakın mütərəqqi azalmasıdır [18]. Beləliklə, etibarlı AD-transgen modelinin xüsusiyyəti, modelin insan AD xəstələrində müşahidə olunan davranış dəyişikliklərini dəqiq əks etdirmə qabiliyyətidir. AD-nin transgenik siçan modellərinin davranış nəticələrini dəqiq şərh etmək üçün siçanlarda koqnitiv dəyişiklikləri yoxlamaq üçün ən çox istifadə edilən davranış tapşırıqlarını, eləcə də hər bir koqnitiv testin əslində nəyi ölçdüyünü yaxından anlamaq vacibdir. Heyvanlarda idrakı tədqiq edərkən davranış tapşırıqları adətən ya assosiativ, ya da operativ öyrənmə tapşırıqlarına bölünür. Assosiativ öyrənmə tapşırıqları heyvanda müəyyən reaksiyanı şərtləndirmək üçün ətraf mühitdəki işarələrdən istifadə edir. Operant öyrənmə tapşırıqları, nəticə əldə etmək üçün heyvandan müəyyən bir stimula xüsusi cavab verməsini tələb edir. İdrak tapşırıqları daha sonra yoxlanılan yaddaş növünə görə qruplara bölünür. Siçan modellərində, transgen və ya başqa cür idrak dəyişikliklərini müəyyən etmək üçün ən çox istifadə edilən tapşırıqlardan bəziləri aşağıdakılardır.

1.2.1. Məkan yaddaş tapşırıqları

1.2.1.1. Morris Su Labirenti

Morris su labirenti (MWM) yaşa bağlı/AD kimi çatışmazlıqları araşdırmaq üçün xüsusilə həssas bir işdir, çünki o, AD-də ilk və ən çox təsirlənən beyin bölgələrindən biri olan hipokampal funksiya üçün yüksək spesifikdir [18]. Nəticədə, MWM testi hipokampal məkan yaddaş çatışmazlığını təyin etmək üçün istifadə edilən ən ümumi davranış tapşırıqlarından biridir [19]. Test gəmiricinin buludlu su ilə doldurulmuş dairəvi çənə yerləşdirilməsindən ibarətdir ki, bu da heyvanı suyun səthinin düz altında yerləşən gizli platformaya üzərək sudan qaçmağa həvəsləndirmək üçün istifadə olunur. Bir neçə gün ərzində gəmirici sınaq otağında su labirintindən kənarda divarlara strateji olaraq yerləşdirilmiş posterlər və ya lentlə yapışdırılmış obyektlər kimi məkan işarələrindən istifadə edərək gizli platformanı tapmağı öyrənir. Ən çox videoda qeydə alınan məsafə, platformaya çatmaq üçün gecikmə və üzmə sürəti bu testin ümumi ölçüləridir. Heyvanın öyrənilmiş məlumatı əldə etmək və saxlamaq qabiliyyəti və ya yeni strategiyaları təmizləmək və yenidən öyrənmək üçün çeviklik sınaq sınaqları və geri qaytarma sınaqları vasitəsilə müəyyən edilə bilər. Prob sınağında platforma çıxarılır və heyvanların hovuzda üzməsinə icazə verilir. Əvvəllər platformanın yerləşdiyi bölgədə sərf olunan vaxt, platforma sahəsi üzərindən keçidlər və platformanın yerinə çatmaq üçün vaxt ölçülür. Geri çevrilmə sınağı təlim sınaqları ilə eynidir, lakin bu halda platforma yeni bir yeri yenidən öyrənmək üçün zəruri olan heyvanın koqnitiv çevikliyini yoxlayaraq hovuzun əks bölgəsinə keçirilir. Platformanı görünən edən bu tapşırığın müəyyən edilmiş versiyası, həm də qeyri-məkan strategiyalarını, eləcə də görmə kəskinliyini ölçmək üçün istifadə edilə bilər [20]. Varyasyonlara radial qollu su labirenti (RAWM) və ya plyus formalı su labirenti daxildir [21].

Bu tapşırığın arzuolunan cəhətlərindən biri odur ki, həvəsləndirici stimul, yəni sudan qaçmaq, digər məkan yaddaşı işlərində ümumi olan qida və ya su məhrumiyyətini tələb etmir. Bununla belə, onun müəyyən məhdudiyyətləri də var, bunlardan biri də yaddaşın müxtəlif komponentlərinin, yəni istinad və işləyən yaddaşın eyni vaxtda sınaqdan keçirilə bilməməsidir.

1.2.1.2. Radial Qol Maze

Yaddaş komponentlərinin eyni vaxtda ölçülməsini təmin edə bilən və gəmiricilərdə məkan yaddaş performansını öyrənmək üçün də geniş istifadə olunan bir vəzifə radial qol labirintidir (RAM). Bu labirint mərkəzi platformadan yayılan, eyni məsafədə yerləşən 8 qoldan ibarətdir və gəmiricilər bəzi qollarına yerləşdirilmiş yemək və ya su mükafatını əldə etmək üçün onlara daxil olmalıdırlar. Bu tapşırığı yerinə yetirərkən heyvanlar otaqdakı məkan işarələrindən istifadə edərək, ən qısa müddətdə və ən az səylə maksimum yemək və ya su mükafatı almaq üçün hər bir qola yalnız bir dəfə daxil olmaq məqsədi daşıyırlar. Bu labirint qısa müddət ərzində vacib olan məlumatı (sınaq məlumatı daxilində) saxlamaq üçün iş yaddaşından istifadəni, eləcə də tapşırığın ümumi qaydalarını günlər ərzində saxlamaq üçün istinad yaddaşından istifadəni tələb edir. Xüsusilə, heyvan hansı qolların yemləndiyini və hansının artıq daxil olduğunu xatırlamağı bacarmalıdır (iş yaddaşı), lakin o, həm də sınaqlar zamanı yem olmayan qollardan qaçmağı da bilməlidir (istinad yaddaşı). məkan məlumatlarını uğurla kodlaya bilir. Bununla belə, bu tapşırıq həm istinad, həm də işlək yaddaşın tədqiqinə icazə versə də, əsas məhdudiyyətlər bu işdə qida və ya su çatışmazlığından istifadə, həmçinin qoxu qarışıqlığının olmasıdır [22�].

1.2.1.3. Radial qol su labirenti

Nisbətən yeni məkan yaddaş tapşırığı RAWM, MWM və RAM-ın müsbət cəhətlərini birləşdirərək yuxarıda qeyd olunan tapşırıqların məhdudiyyətlərini aradan qaldırmaq üçün nəzərdə tutulmuşdur. MWM və RAWM arasındakı fərq ondan ibarətdir ki, RAWM-də performans yalnız açıq üzgüçülük sahəsinə malik klassik MWM ilə müqayisədə su banyosunda bir neçə qoldan birində (6𠄸) yerləşən suya batırılmış platformanın tapılmasını tələb edir. . Bu, tapşırığı bir qədər çətinləşdirir, lakin heyvanı platformanın harada yerləşdiyini xatırlamaq üçün məkan işarələrindən və iş yaddaşından (artıq ziyarət etdiyi qolları izləmək) istifadə etməyə məcbur edir. Fərqli sayda platformalardan və platformanın yerləşdirmə təşkilatından istifadə edərək bu tapşırığın bir neçə variantı farmakoloji müalicədən sonra məkan yaddaş fərqlərini [25,26] və növlər [27], cins [28] və ən əsası modellər arasındakı fərqləri araşdırmaq üçün istifadə edilmişdir. eramızın [24,29].

1.2.2. Kontekstual yaddaş

1.2.2.1. Qorxu Kondisioneri

Hərəkətin tam olmaması kimi təyin olunan donma reaksiyası gəmiricilərin qorxuya fitri reaksiyasıdır. Qorxu kondisioner paradiqmasında, heyvan iki dəqiqə ərzində yüngül aqressiv stimul verən bir şəbəkə olan qutuya yerləşdirilir. Qutuda heyvana sınağın sonunda mülayim bir şok (şərtsiz stimul) ilə birləşdirilən ton (adətən 80 dB) (şərtli stimul) təqdim olunur və nəticədə ton dondurucu reaksiya verir. İstifadə olunan gərginliyə və ya ton və şok arasındakı intervaldan asılı olaraq bəzən təkrar məruz qalma zəruri olur. Bəzi tədqiqatçılar prefrontal kortikal fəaliyyəti araşdırmaq üçün ton və şok arasındakı vaxt fərqini artıran iz qorxu kondisionerindən istifadə edirlər. Burada heyvan qutudan çıxarılır və ton və ya aqressiv stimul olmadıqda dondurucu davranışı ölçməklə, mülayim aqressiv stimul (kontekstdən asılı qorxu) ilə əlaqəli mühitdən öyrənilmiş ikrahını qiymətləndirmək üçün 24 saat sonra geri qaytarılır. İstiqamətdən asılı qorxu, heyvanı rəngi, forması və s. fərqli olan yeni bir qutuya yerləşdirməklə və tonla əlaqəli yeni mühiti araşdırarkən onu tonla təqdim etməklə ölçülə bilər.

Qorxu kondisioneri, hipokampaldan asılı assosiativ öyrənməni ölçmək üçün geniş istifadə olunan bir testdir. Bu testin emosiya ilə əlaqəli öyrənməyə həssas olduğu düşünülür və buna görə də amigdalar hipokampal ünsiyyətin faydalı bir ölçüsüdür. AD-nin transgenik siçan modellərinin çoxunda qorxu və narahatlıq pozğunluqları müşahidə edilir ki, bu da ilk növbədə amigdalanın funksiyasıdır. Qorxu kondisionerində istifadə olunan hipokampal funksiya məkan tapşırıqda öyrənməkdən fərqli ola bilər [30�].

1.2.2.2. Passiv-Qaçma Öyrənmə

Passiv-qaçma öyrənmə tapşırığında heyvan iki kameralı aparatın yaxşı işıqlandırılmış tərəfində qalmaqla və aqressiv stimulu qəbul etdiyi yerdə qaranlığa girməməklə, yüngül aqressiv stimuldan, bu halda qaranlıqdan qaçmağı öyrənməlidir. Qeyd edək ki, gəmiricilər fitri olaraq qaranlığa çəkildiklərindən, heyvan bu meyli mənfi stimulu istədiyiniz bölmə ilə birləşdirərək yatırmalıdır. Mənfi stimulu xatırlamayan heyvanlar xatırlayan heyvanlardan daha tez keçəcəklər. Asılı ölçülərə median addım-addım gecikmə (təhlükəsiz tərəfə keçmək üçün gecikmə) və hər bir eksperimental qrupdan ayrılmış vaxt ərzində həddi keçən heyvanların faizi daxildir [20,33,34].

1.2.3. İş yaddaşı/yenilik/fəaliyyət

1.2.3.1. Y-labirint

Bu test siçanların yeni mühiti kəşf edərkən alternativ qollara olan fitri üstünlüklərinə əsaslanır. Müxtəlif çətinlik səviyyələri və müəyyən idrak növlərinə fərqli tələblər ilə müxtəlif modifikasiyalar mövcuddur. AD transgen modellərində koqnitiv dəyişikliklərin öyrənilməsi üçün xüsusilə məşhur olan bir versiya Y-labirintinin kortəbii alternativ versiyasıdır. Bu halda, sınaq heyvanları 6 dəqiqə ərzində Y formalı labirintdə yerləşdirilir və daxil edilən qolların sayı, eləcə də girişlərin ardıcıllığı qeyd olunur və növbə sürətini (qol girişlərinin dərəcəsi) müəyyən etmək üçün xal hesablanır. təkrarlar olmadan). Yüksək növbə nisbəti davamlı idrakın göstəricisidir, çünki heyvanlar yenidən daxil olmamaq üçün hansı qola sonuncu daxil olduğunu xatırlamalıdırlar [35].

Qısamüddətli yaddaş versiyası da həyata keçirilə bilər ki, burada Y-labirintinin bir qolu bloklanır və subyektə iki qolu 15 dəqiqə ərzində tədqiq etməyə icazə verilir. Heyvan daha sonra eksperimental manipulyasiyadan asılı olaraq bir neçə dəqiqə və ya bir neçə saat ərzində labirintdən çıxarılır və sonra 5 dəqiqə ərzində araşdırmaq üçün bu dəfə bütün qolları açıq vəziyyətdə yenidən labirentə yerləşdirilir. Koqnitiv funksiyası qorunub saxlanılan heyvanlar əvvəllər bloklanmış qolu xatırlayacaq və ikinci sınaqda həmin qolu ilk olaraq daxil edəcəklər. Bu test, uzunmüddətli yaddaşı və heyvanın tapşırığı yenidən öyrənməsi üçün lazım olan vaxtı yoxlamaq üçün sınaqlar arasında yalnız 2 dəqiqə gecikmə ilə son sınaqdan bir həftə sonra təkrarlana bilər. Tipik olaraq ölçülən parametrlərə daxil edilən ilk qol, hər bir qolda sərf olunan vaxt və qol girişlərinin ümumi sayı daxildir [35].

1.2.3.2. T-labirint

T-labirint tapşırıqları inanılmaz dərəcədə yaxşı xarakterizə olunur və həm siçanlarda, həm də siçovullarda koqnitiv davranış testləri üçün geniş istifadə olunur. Heyvanlar T-nin altından başlayır və gövdənin digər ucuna bitişik qol qollarından birini seçməyə icazə verilir. İki sınaq ardıcıl olaraq verilirsə, ikinci sınaqda gəmirici ilk seçimin yaddaşını əks etdirən əvvəllər ziyarət edilməmiş qolu seçməyə meyllidir. Buna “spontan növbələşmə” deyilir.” Bu meyl heyvanı ac vəziyyətə salmaqla və növbələşərsə, onu üstünlük verilən qida ilə mükafatlandırmaqla gücləndirilə bilər. Həm kortəbii, həm də mükafatlandırılmış alternativlər hipokampusun disfunksiyasına çox həssasdır və buna görə də AD kimi simptomlara həssasdır, lakin digər beyin strukturları da iştirak edir. Hər sınaq 2 dəqiqədən az müddətdə tamamlanmalıdır, lakin tələb olunan sınaqların ümumi sayı statistik və elmi tələblərə uyğun olaraq dəyişəcək [36].

1.2.3.3. Obyektin tanınması

Obyektin tanınması testi gəmiricilərin tanış obyektin əvəzinə yeni obyekti araşdırmaq təbii meylinə, eləcə də onlara yeni mühit təqdim edildikdə kəşfiyyata yenidən başlamaq üçün fitri meylinə əsaslanır. Yeni obyekti tədqiq etmək seçimi, həmçinin obyektin yerdəyişməsindən sonra kəşfiyyatın yenidən aktivləşdirilməsi öyrənmə və tanınma yaddaş proseslərindən istifadəni əks etdirir. Gəmiricilərdə idrakı yoxlamaq üçün mövcud obyekt tanıma tapşırıqları, digər şeylər arasında, müxtəlif sayda mövcud obyektlərdən və heyvanların sınaqdan keçirildiyi mühitlərdən, eləcə də məkan tanınması və yeniliyi yoxlamaq məqsədi daşıyan konfiqurasiya növlərindən istifadə edir. Yaşla əlaqəli çatışmazlıqlara həssas olan xüsusi bir obyektin tanınması tapşırığı AD ilə əlaqəli çatışmazlıqları yoxlamaq üçün çox uyğundur [37�]. Bu tapşırıqda gəmirici 6 dəqiqə ərzində müxtəlif əşyalarla (yəni müxtəlif ölçülü və formalı müxtəlif plastik oyuncaqlar) doldurulmuş dairəvi açıq sahəyə yerləşdirilir. Heyvanın müxtəlif obyektlərin konfiqurasiyasına və xassələrinə alışdığı bir sıra sınaqlardan sonra fəzanın tanınmasını qiymətləndirmək üçün bəzi obyektlər bir yerdən digərinə dəyişdirilir. Sonradan, yeni obyektin tanınmasını qiymətləndirmək üçün bəzi obyektlər yeniləri ilə əvəz olunur. Açıq sahənin tədqiqinə sərf olunan vaxt (hərəkət/hərəkətsizlik), eləcə də müxtəlif sınaqlar zamanı hər bir obyekti yoxlamağa neçə dəfə və vaxtın uzunluğu hesablanır.

1.2.3.4. Açıq sahə

Açıq sahədə hərəkət testi ilk növbədə açıq sahədə kortəbii fəaliyyəti ölçməklə motor funksiyasını yoxlamaq üçün istifadə olunur. Dairəvi və ya kvadrat açıq sahələr təcrübədən asılı olaraq ölçülərinə görə dəyişir və fərqli kvadrantlara və ya bölmələrə bölünür. Heyvan açıq yerə yerləşdirilir və heyvanın hərəkətləri ya video lentə alınır, ya da avtomatlaşdırılmış kompüter proqramları vasitəsilə izlənilir. Yetişdirmə, xətlərin kəsişməsi, təmizlik, ümumi hərəkət, keçən xətlərin sayı, xüsusi bölmələrə üstünlük verilməsi və/və ya nəcis hərəkətləri davranış və narahatlığı yoxlamaq üçün hesablana bilər [40,41].


5. GƏLƏCƏK İSTİQAMƏTLƏRİ

5.1. Fərdiləşdirilmiş tibb: şiş neoantigen əsaslı müalicələr

Şişlərin mutasiya mənzərəsini öyrənmək üçün yeni nəsil sekvensiya texnologiyalarından istifadə şiş neoantigenlərini müəyyən etməyə imkan verir. Şiş spesifik mutasiyalar üçün yaranan bu neoantigenlər, fərdiləşdirilmiş xərçəng immunoterapiyaları üçün ideal hədəfləri təmsil edir, çünki onlar normal toxumalarda olmamalı və immun hüceyrələri tərəfindən öz-özünə antigen kimi tanınmalıdır. Baxmayaraq ki, HIS modelləri bu gün neoantigenlərdən istifadə edərək peyvənd strategiyalarını öyrənmək üçün istifadə olunmasa da, onlar övladlığa götürülmüş T hüceyrə transferi yanaşmalarında siliko-proqnozlaşdırılan neoantigenlərdə namizədin in vivo təsdiqi üçün faydalı ola bilər. Məsələn, proqnozlaşdırılan döş xərçəngi neoantigenləri üçün zənginləşdirilmiş insan CD8 + T hüceyrələri siçanları otoloji PDX-lərlə şiş problemindən qoruya bildi (Zhang et al. 2017) və neoantigenə xas TCR transduksiya edilmiş T hüceyrələri NSG siçanlarında antitümör effektivliyini göstərdi. neoantigeni ifadə edən kəskin miyeloid lösemi hüceyrə xətti (Van Der Lee et al. 2019).

5.2. Fərdiləşdirilmiş Tibb: Avatar Modelləri

Otoloq insan immun hüceyrələri və PDX-lərlə həkk olunmuş HIS siçanları ideal avatar modelləri təşkil edir, çünki onlar xəstənin immunoterapiyalara reaksiyasını proqnozlaşdırmaq üçün istifadə edilə bilər və residiv zamanı fərdi müalicəni tənzimləməyə kömək edə bilər. Buna baxmayaraq, inkişaf etmiş xərçəngli xəstələrin nisbətən az hissəsi öz PDX ilə həyata keçirilən avatar sınağından faydalanmaq üçün kifayət qədər uzun müddət sağ qalır. Həqiqətən, avatar modelinin qurulması üç vaxt aparan addım tələb edir: PDX qurulması (ümumiyyətlə, PDX nə qədər tez aşılanırsa, xəstədə şiş bir o qədər aqressivdir), kifayət qədər şiş toxuması əldə etmək üçün onun in vivo genişlənməsi və standart və yeni terapevtik strategiyaların preklinik qiymətləndirilməsi. Bəzi tədqiqatlar artıq avtoloq PBMC və PDX-lərdən istifadə edərək PBL-HIS modellərini yaratmağa müvəffəq olmuşdur. Belə parametrlərdə nəzarət nöqtəsinə qarşı mAb mədə şişinin böyüməsini gecikdirdi (Sanmamed et al. 2015) və bispesifik Ab, siçanlar uyğun olmayan PBMC'ləri qəbul etdikdən daha yaxşı otolog PBMC qəbul etdikdə HER2 + döş şişini daha yaxşı tormozladı (Rius Ruiz et al. 2018). Maraqlıdır ki, bəzi tədqiqatlar avatar siçanlarda və xəstələrdə olan terapevtik nəticələr arasında korrelyasiya olduğunu göstərdi. Bu xətlər boyunca, otolog TIL-lərin qəbuledici ötürülməsi, ACT ilə eyni şəkildə müalicə olunan xəstədə analoji cavab verən/cavab verməyən nümunədən sonra hIL2-NOG siçanlarında melanoma PDX böyüməsini maneə törətdi (Jespersen et al. 2017). Bundan əlavə, xəstənin öz melanoma PDX və TIL-lərindən istifadə edən avatar modelində müşahidə edilən anti-PD1 reaksiyası bu xəstə üçün terapevtik qərarı dəstəklədi (Ny et al. 2020). HIS modellərindən istifadə edən avatar yanaşması hələ də təsdiq edilməlidir, lakin o, nəticədə immunoterapiyaların dəqiq tibb kimi gələcəkdə istifadəsinə rəhbərlik edə bilər və klinik reaksiyaların proqnozlaşdırıcı biomarkerlərini müəyyən etməyə kömək edə bilər.


Əlyazma ilə bağlı faydalı müzakirə və rəyə görə Hayley Donnella və Attila Qabora təşəkkür edirik. Diana Panayotova Dimitrovaya və Mariya Feoktistovaya apoptoz yolu haqqında konstruktiv müzakirəyə görə təşəkkür edirik. FE maliyyələşdirməyə görə Avropa Molekulyar Biologiya Laboratoriyasına Fənlərarası Post-Docs (EMBL EIPOD) və Marie Curie Actions (COFUND) və Bayer AG tərəfindən qismən maliyyələşdirilən Hesablama Biotibbi üçün JRC-yə təşəkkür edir.

JS-R və CAM layihəni düşünüblər. Layihəni JS-R və FE tərtib etmişdir. FE analizi JS-R-nin nəzarəti altında həyata keçirib. PJ, MJG, JW və TC eksperimental qiymətləndirmə həyata keçirdi və nəticələrin şərhinə kömək etdi. FE və JS-R əlyazmanı yazdı. PJ əlyazmanın tamamlanmasına töhfə verdi. Bütün müəlliflər son əlyazmanı təsdiq etdilər.


Məlumatın mövcudluğu haqqında bəyanat

Tədqiqatda təqdim olunan orijinal töhfələr ictimaiyyətə açıqdır. Bu məlumatı burada tapa bilərsiniz: Siçan RNT seq/mikroarray məlumatları NCBI Bioproject verilənlər bazasında PRJNA690520 qoşulma nömrəsi altında saxlanılıb və ona aşağıdakı linkdən daxil olmaq olar: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ biolayihə/690520. İnsan mikroarray məlumatları http://dx.doi.org/10.17632/hzmfshy7hp.1 ünvanında DOI linki ilə Mendeley Data Repository vasitəsilə onlayn əldə edilə bilər. İvermektin müalicəsindən sonra siçan GC-də RNAseq məlumatları sorğu əsasında müəlliflərdən əldə edilə bilər.


Tək Hüceyrəli Metod Xərçəngin Müalicə Müqavimətini Öyrənmək üçün Siçan Modellərinə Ehtiyac Yoxlaya bilər

NEW YORK - Xərçəng hüceyrələrinin müalicəyə necə müqavimət göstərdiyini öyrənmək üçün tədqiqatçılar əsasən xəstədən alınan hüceyrə xətləri və ya siçan modellərindən istifadə etməklə məhdudlaşırlar. Lakin bu cür üsullar informativ olsa da, həmişə tam mənzərəni vermir: Məsələn, onlar müalicədən yayına bilən mutasiyaya uğramış hüceyrələrin şiş mikromühiti ilə necə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu göstərə bilmirlər.

Bu hüceyrələri və onların təkamülünü doğma kontekstdə öyrənmək üçün tədqiqatçılar onları xəstə nümunələrində öyrənmək üçün bir yola ehtiyac duyurlar. Weill Cornell Medicine, Nyu-York Genom Mərkəzində və başqa yerlərdə tədqiqatçılar tərəfindən hazırlanmış yeni bir hüceyrəli transkriptomik üsul tədqiqatçılara bu fürsəti təklif edə bilər.

Bu yaxınlarda nəşr olunan bir araşdırmada Təbiət, tədqiqatçılar yüksək məhsuldarlıqlı damcı əsaslı tək hüceyrəli RNT ardıcıllığı ilə genotipləşdirməni birləşdirən bir üsul olan Transkriptomların Genotiplənməsini (GoT) inkişaf etdirdiklərini təsvir etdilər.

Weill Cornell Medicine-nin xərçəng tədqiqatçısı və Nyu-York Genom Mərkəzinin əsas üzvü, məqalənin baş müəllifi Dan Landau, onların həll etdiyi problem genotipləri tək hüceyrələrdəki fenotiplərə necə bağlamaq idi. Tək hüceyrələrdə onkogen mutasiyaları araşdıran çoxlu tədqiqatlar olmasına baxmayaraq, yüksək ötürmə qabiliyyəti ilə somatik mutasiyaları qeyd etmək problem olmuşdur.

"Somatik mutasiyalar tək hüceyrə transkriptomunda mövcuddur, çünki kodlaşdırma mutasiyaları tez-tez transkripsiya edilir" dedi Landau. "Biz yazıda bəzi təhlillər apardıq ki, sürücü mutasiyalarının böyük əksəriyyəti tez-tez ya ekvivalent sürətlə, ya da ekzomda gördüyümüzlə müqayisədə daha yüksək sürətlə transkripsiya edilir."

Bundan əlavə, xərçəng klonlarında onları bir-birindən fərqləndirə bilən hər hansı hüceyrə səthi markerləri olmadıqda, bədxassəli hüceyrələrin transkriptomik şəxsiyyətini müəyyən etmək çətin olur. Lakin, damcı əsaslı ardıcıllıq - məsələn, komandanın GoT metodunu yaratmaq üçün dəyişdirdiyi 10x Genomics platforması - tədqiqatçılara minlərlə hüceyrənin transkriptomlarını profilləməyə imkan verir, indiki üsullar transkript sonunda yalnız qısa fraqmentlər üçün ardıcıllıq məlumatı təmin edir. bu üsulların somatik mutasiyaları birgə genotip etmək qabiliyyəti.

"Bir hüceyrəli üsullar [10x Genomics platforması kimi] rəqəmsal ardıcıllıqdan istifadə etdi, bu o deməkdir ki, onlar hər bir hüceyrədə tapılan transkriptlərin sayını ölçmək üçün yalnız transkriptin sonunda kiçik bir etiket saxlayırlar" dedi Landau. "Biz düşündük ki, biz bunu maraq dairələrinə genişləndirməliyik. Bu, mahiyyətcə metodun mahiyyətidir."

Tədqiqatçılar hədəf transkriptini və maraq dairəsini gücləndirmək üçün 10x Genomics platformasını dəyişdirdilər, sonra mutasiya statusu üçün amplikon oxunuşlarını araşdırdılar və paylaşılan hüceyrə barkodlarından istifadə edərək genotipi tək hüceyrəli gen ifadəsi profilləri ilə əlaqələndirdilər. Onlar somatik mutasiyaların insan hematopoez prosesini necə poza biləcəyini öyrənmək üçün CALR-mutasiyaya uğramış miyeloproliferativ neoplazmaları olan xəstələrin 38,290 CD34+ hüceyrələrini profilləşdirmək üçün GoT-dən istifadə ediblər.

Onlar mutant insan CALR transgenini saxlayan siçan hüceyrələrini vəhşi tip insan CALR transgeni olan insan hüceyrələri ilə qarışdırdılar və qarışıq növ kontekstində tək hüceyrəli genotipləri və transkriptomları birgə xəritələmək qabiliyyətini yoxlamaq üçün GoT tətbiq etdilər. Onlar tapdılar ki, siçan genomuna uyğunlaşdırılmış transkriptləri olan hüceyrələrin əhəmiyyətli əksəriyyəti mutant CALR, insan genomuna uyğunlaşdırılmış transkriptləri olan hüceyrələr isə vəhşi tipli CALR göstərdi - ümumilikdə hüceyrələrin 96,7 faizi gözlənilən növlərə uyğun gəldi.

"CALR sümük iliyi hüceyrələrində 200-300 [milyonda transkript] kimi bir şey səviyyəsində ifadə edilir və biz hüceyrənin 90 faizini genotiplədik" dedi Landau. "Düşünürəm ki, bizim burada təklif etdiyimiz, ifadə diapazonunda yüksək effektivlik baxımından geniş ssenarilər üzrə genotipləmə qabiliyyətini özündə birləşdirən bir üsuldur. Aydındır ki, gen nə qədər çox ifadə olunarsa, onu ələ keçirmək bir o qədər asan olar. transkriptom [və] əgər mutasiya transkript ucuna çox yaxındırsa, onu tutmaq daha asandır. Əgər o, daha uzaqdadırsa, bizim inkişaf etdirdiyimiz üsullara ehtiyacınız olacaq."

The researchers have also created an analytical platform called Iron Throne that is capable of connecting the single cell transcriptome to the genotype information, while filtering out multiple sources of background noise such as PCR recombination and PCR errors, to provide high-accuracy precision genotyping, Landau noted. They've made both tools available on GitHub.

The potential for being able to perform controlled gene expression analysis experiments is significant, according to Landau. Using this method, a researcher can compare wild-type and mutant cells within the same individual, with the wild-type cells serving as the ultimate controls.

"Everything is the same — the microenvironmental conditions, the technical confounders, the patient's breakfast. The only thing that's different is the genotyping," Landau said. "Now, we can read it out with this very high-precision tool."

In the context of myeloproliferative neoplasms, which the team studied for the Nature paper, the ability to distinguish cells from one another with high fidelity is especially important. "These patients have both normal and mutated bone marrow development coexisting within their marrow, and in this case the cells are phenotypically indistinguishable with current methods. If you look under the microscope, you'll see that there are too many cells, but you can't distinguish between the wild-type and the mutant — the flow markers are the same," Landau said. "Therefore, there was a significant challenge. We also show that in the RNA-seq data alone, again these two processes are intermingled."

Another context to which the researchers applied GoT was clonal growths in normal tissues. "It's been reported by multiple groups that each one of us essentially harbors hundreds of distinct clonal growths in multiple tissues," Landau said. "And this is in normal-appearing tissue — the tissue is morphologically normal, and the cells look the same. And yet somehow, these clones are growing, and they contain somatic mutations."

Studies have described mutations affecting NOTCH1 in the esophagus, NOTCH1 and p53 in the skin, and mutations in various genes affecting the blood, he added. In this context, studying the transcriptome is not likely to provide answers, so there's a need for a method that can annotate cells that look alike and yet may be differentially mutated.

"We need to be able to start reading out what allows these cells to grow better than their wild-type counterparts," Landau said.

Importantly, this method could change the way that treatment resistance is studied. The way researchers currently probe questions on resistance is by using mouse models or cells lines, but to understand how resistance forms in a native context, "if we want to know what's the relation to the immune microenvironment, we need a method that can actually capture this information in patients," Landau said.

By isolating cells that are both wild-type and mutated for a particular subclonal mutation that confers resistance, and studying them within patient samples, researchers can begin to look at the differences between them in a well-controlled way, without the problem of patient-specific confounders.

"Let's say that you have a genotype that you hypothesize is related to therapeutic resistance. Now you're faced with the question of finding the mechanism. Why are these cells more resistant or less resistant?" Landau said. "The cells are not distinguishable by any other means. They don't have different cell surface markers. They're morphologically the same, so you can't sort them."

Therefore, he added, "you need a method that can annotate individual cells by their genotype and, at the same time, capture at high throughput their single-cell transcriptomes. That allows you to develop a hypothesis directly in patients. You take these cells and you ask what's different about them when they are exposed to therapy in the patient's blood or in the patient's tissue."

At this point, he noted, the GoT method is better suited for basic research, though there wouldn't be a limit to the types of cancers it could be used to study. The method could even be used as a drug discovery tool, to help pharmaceutical companies determine treatment efficacy.

"I think that this could be something that would empower a combination therapy design because you can — and we are collecting this sort of data — have a sort of clinical trial where combination therapies are introduced gradually," Landau added. "And again, you have this unique ability to compare wild-type and mutated subclones."

The team is continuing to develop GoT in multiple ways, and is looking at the possibility of adding layers of information to the analysis, such as DNA methylation.


Authors' Contributions

Conception and design: E. Bruckheimer, V.E. Velculescu, D. Sidransky, M. Hidalgo

Development of methodology: K. Paz, P.P. López-Casas, F. López-Rios, F. Sarno, V.E. Velculescu, M. Hidalgo

Acquisition of data (provided animals, acquired and managed patients, provided facilities, etc.): E. Garralda, P.P. López-Casas, A. Katz, F. López-Rios, F. Sarno, D. Vasquez, E. Bruckheimer, A. Calles, D. Sidransky, M. Hidalgo

Analysis and interpretation of data (e.g., statistical analysis, biostatistics, computational analysis): E. Garralda, K. Paz, P.P. López-Casas, S. Jones, F. López-Rios, F. Al-Shahrour, S.V. Angiuoli, L.A. Diaz, V.E. Velculescu, D. Sidransky, M. Hidalgo

Writing, review, and/or revision of the manuscript: E. Garralda, K. Paz, P.P. López-Casas, S. Jones, F. López-Rios, A. Calles, L.A. Diaz, V.E. Velculescu, M. Hidalgo

Administrative, technical, or material support (i.e., reporting or organizing data, constructing databases): E. Garralda, L.M. Kann, F. Sarno, D. Vasquez, E. Bruckheimer, A. Calles

Study supervision: K. Paz, V.E. Velculescu, A. Valencia


Videoya baxın: Kedinin Gelincik, Avı Saros Körfezi (Avqust 2022).