Məlumat

8.3: PZR ilə xüsusi ardıcıllığın təcrid edilməsi və ya aşkarlanması - Biologiya

8.3: PZR ilə xüsusi ardıcıllığın təcrid edilməsi və ya aşkarlanması - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

PCR reaksiyasının komponentləri

The Polimeraza Zəncirvari Reaksiya (PCR) sınaq borusunda həyata keçirilən DNT replikasiyası üsuludur (yəni. in vitro). Burada “polimeraza” bakteriyalardan çıxarılan və təmizlənmiş DNT polimeraza fermentinə, “zəncirvari reaksiya” isə bu texnikanın hər bir yeni replikasiya olunmuş qoşa sarmaldan şablon kimi istifadə edərək, DNT molekulunun milyonlarla nüsxəsini çıxarmaq qabiliyyətinə aiddir. yeni DNT cüt spiralları. Buna görə də PCR DNT-ni gücləndirmək üçün çox təsirli bir üsuldur.

Böyük miqdarda DNT yaratmaq qabiliyyəti ilə yanaşı, PCR-nin onu son dərəcə faydalı edən ikinci bir xüsusiyyəti var. Xatırladaq ki, əksər DNT polimerazaları yalnız mövcud DNT zəncirinin sonuna nukleotidlər əlavə edə bilər və buna görə də primer replikasiya prosesinə başlamaq. PCR üçün təxminən 20 nukleotiddən ibarət kimyəvi sintez edilmiş primerlər istifadə olunur. İdeal PCR-də primerlər yalnız şablon zəncirindəki tam tamamlayıcı ardıcıllıqla hibridləşirlər (Şəkil (PageIndex{3})).

Beləliklə, eksperimentator reaksiyada istifadə olunan primerlərin ardıcıllığına nəzarət etməklə DNT şablonunun hansı bölgəsinin gücləndirildiyini dəqiq idarə edə bilər.

PCR gücləndirilməsini aparmaq üçün eksperimentator kiçik, nazik divarlı boruda (Şəkil (PageIndex{4})) DNT replikasiyası üçün bütün zəruri komponentləri, o cümlədən DNT polimeraza və nukleotidləri (dATP, dCTP) ehtiva edən məhlulları birləşdirir. , dGTP, dTTP), DNT şablonu, DNT primerləri, pH tamponu və ionlar (məsələn, Mg)2+) polimeraza tərəfindən tələb olunur. Uğurlu PCR reaksiyaları şablon olaraq yalnız bir DNT molekulundan istifadə etməklə aparılmışdır, lakin praktikada əksər PCR reaksiyaları minlərlə şablon molekuldan ibarətdir. Şablon DNT (məsələn, ümumi genomik DNT) adətən yuxarıda təsvir edilən üsullardan istifadə etməklə hüceyrələrdən və ya toxumalardan təmizlənmişdir. Bununla belə, bəzi hallarda şablon kimi istifadə üçün bütün hüceyrələri birbaşa PCR reaksiyasına qoymaq mümkündür.

PCR-nin vacib bir tərəfidir termal velosiped, reaksiyanın bir sıra dəqiq müəyyən edilmiş temperaturlara məruz qalması deməkdir (Şəkil (PageIndex{5})). Reaksiya qarışığı əvvəlcə 95°C-ə qədər qızdırılır. Bu, şablon DNT molekullarının zəncirləri arasındakı hidrogen bağlarının əriməsinə və ya denatürasiya etmək. Bu, hər ikiqat sarmaldan iki təkzəncirli DNT molekulu istehsal edir (Şəkil (PageIndex{6})). Növbəti addımda (tavlama), qarışıq 45-65°C-ə qədər soyudulur. Dəqiq temperatur istifadə olunan primer ardıcıllığından və təcrübənin məqsədlərindən asılıdır. Bu, primerlərin şablona bağlanması da daxil olmaqla, tamamlayıcı DNT molekulları arasında ikiqat zəncirli sarmalların əmələ gəlməsinə imkan verir. son mərhələdə (uzadılması) qarışıq 72°C-ə qədər qızdırılır. Bu, PCR-də istifadə olunan xüsusi DNT polimerazanın ən aktiv olduğu temperaturdur. Uzatma zamanı yeni DNT zənciri, primerin 3' ucundan başlayaraq şablon zəncirinin uzunluğu boyunca sintez olunur. Bütün PCR prosesi çox sürətlidir, hər bir temperatur mərhələsi adətən 30 saniyə və ya daha az davam edir. Üç temperaturun hər dövrü (denaturasiya, yumşalma, uzanma) adətən təxminən 30 dəfə təkrarlanır və hədəf bölgəni təxminən 2 gücləndirir.30-qat. Şəkildən diqqət yetirin ki, PZR-də yeni sintez edilmiş iplərin əksəriyyəti primer ardıcıllıqla eyni və ya tamamlayıcı ardıcıllıqla başlayır və bitir; bir neçə tel bundan daha uzun olsa da, o qədər kiçik bir azlıqdadırlar ki, demək olar ki, həmişə onlara məhəl qoyula bilməz.

Şəkil (PageIndex{6}): Termal siklin üç fazası nömrələnmiş PCR. Şablon ipi (mavi) primerlərdən (qırmızı), yaşıl rəngdə yeni sintez edilmiş iplərlə təkrarlanır. İki primer bağlanma yeri ilə əhatə olunan yaşıl iplər ardıcıl PCR dövrləri vasitəsilə eksponent olaraq bolluqda artacaq. (Vikipediya-madprime-GFDL)

Ən erkən PCR reaksiyalarında bir polimerazdan istifadə edilmişdir E. coli. Denatürasiya mərhələsinin yüksək temperaturu fermenti məhv etdiyi üçün hər sikldən sonra yeni polimeraza əlavə edilməli idi. Bunun aradan qaldırılması üçün tədqiqatçılar müəyyən etdilər termostabil kimi DNT polimerazları Taq DNA pol, dən Thermus aquaticus, isti bulaqlarda yaşayan termofilik bakteriya. Taq və digər isti mühitlərdən olan oxşar termostabil polimerazlar təkrarlanan gücləndirmə dövrlərində funksional olaraq qala bilirlər. Taq polimeraza adətən təxminən 3kbp-dən uzun fraqmentləri gücləndirə bilməz, lakin bəzi ixtisaslaşdırılmış şərtlərdə PCR fraqmentləri təxminən 10kbp-ə qədər gücləndirə bilər. Digər polimerazlar, ya özləri, ya da Taq ilə birlikdə, gücləndirilmiş fraqmentlərin uzunluğunu artırmaq və ya replikasiyanın etibarlılığını artırmaq üçün istifadə olunur.

Termal dövriyyə (amplifikasiya) başa çatdıqdan sonra, adətən PCR reaksiyasından bir alikvot bir çuxura yüklənir. elektroforetik gel (aşağıda təsvir edilmişdir) gözlənilən uzunluqdakı DNT fraqmentinin uğurla gücləndirilib-gücləndirilmədiyini müəyyən etmək üçün. Adətən, orijinal şablon DNT o qədər seyreltiləcək ki, geldə görünməyəcək, yalnız gücləndirilmiş PCR məhsulu. Gözlənilən uzunluqda kəskin zolağın olması onu göstərir ki, PCR öz hədəfini gücləndirə bilmişdir. Əgər PCR-nin məqsədi müəyyən bir şablon ardıcıllığının mövcudluğunu yoxlamaq idisə, bu, təcrübənin sonudur. Əks halda, qalan PCR məhsulu ardıcıllaşdırma və ya klonlaşdırma kimi müxtəlif digər texnikalar üçün başlanğıc material kimi istifadə edilə bilər.

PCR tətbiqi: StarLink işi

PCR çox həssasdır (bu, DNT-nin çox kiçik başlanğıc miqdarını gücləndirə bilər) və spesifikdir (bir çox DNT ardıcıllığının qarışığından yalnız hədəf ardıcıllığını gücləndirə bilər). Bu, PCR-ni supermarket rəflərindəki istehlak məhsullarında geni dəyişdirilmiş qarğıdalının olub-olmadığını yoxlamaq üçün mükəmməl alət etdi. Hal-hazırda (2013) ABŞ-da qarğıdalıların 85%-i genetik cəhətdən dəyişdirilmiş olsa da və hökumət tənzimləyicilərinin insan istehlakı üçün təsdiq etdiyi genləri ehtiva etsə də, hələ 2000-ci ildə ətraf mühit qrupları göstərdi ki, genetik modifikasiya edilmiş qarğıdalı növü yalnız heyvan yemi kimi istifadə, taco qabıqları kimi insan qidası istehsalında istifadə edilən qarğıdalı ilə qarışdırılmışdır.

Bunun üçün qruplar Vaşinqton bölgəsindəki mağazalardan tako qabıqları aldılar, tako qabıqlarından DNT çıxardılar və ondan icazəsiz genə xas primerlərlə PCR reaksiyasında şablon kimi istifadə etdilər.Cry9C). Onların şübhələri bu PCR məhsulunu agaroza gel üzərində işlətdikdə və gözlənilən ölçüdə bir zolaq gördükdə təsdiqləndi. PCR testi bütün qarğıdalı buşelində bir transgen ləpəni (100.000-ə 1) aşkar edə bildi. Transgen toxumu fermerlərə satan şirkət (Aventis) böyük miqdarda qarğıdalıların məhv edilməsi üçün pul ödəməli oldu və taco qabıqları ilə xəstələndiklərini iddia edən qəzəbli istehlakçılar tərəfindən sinif davasının hədəfi oldu. Heç bir qanuni zərər halları sübut olunmasa da, iddiaçılara 9 milyon dollar mükafat verildi, bunun 3 milyon dolları hüquqi ödənişlərə getdi və qərarın qalan hissəsi istehlakçılara taco qabıqları üçün kuponlar şəklində getdi. Münaqişə şirkətə ziyan vurdu və o zaman ABŞ-da geni dəyişdirilmiş məhsullarla işləmə üsulunun zəifliyini üzə çıxardı.


DNT amplifikasiyası prosesinin 3 əsas PCR addımı

PCR, molekulyar biologiyanın əsas üsullarından biri olan Polimeraza Zəncirvari Reaksiya deməkdir.

Əsasən, polimeraza zəncirvari reaksiyasının əsas məqsədi xüsusi DNT bölgələrinin nüsxələrinin sayını sürətlə artırmaqdır.

Polimeraza zəncirvari reaksiyasının məhsulu sonrakı analiz vasitəsi kimi çıxış edir. Məsələn, PCR ilə birlikdə istifadə olunur gel elektroforezi fərqli aşkar etmək DNT ardıcıllıqlar.

Bu gün, müxtəlif növ PCR texnikası, digər texnologiyalarla birlikdə tapın çoxsaylı tətbiqlər tədqiqat, məhkəmə ekspertizası, kənd təsərrüfatı elmləri, tibb və s. kimi sahələrdə. Xəstəliklərin diaqnostikası, genlərin klonlanması və ardıcıllığının təyin edilməsi üçün istifadə olunur.

Polimeraza zəncirvari reaksiya müxtəlif mənbələrdən DNT istifadə edərək həyata keçirilə bilər. O, çox həssasdır və adi laboratoriya analizi üçün kifayət qədər nüsxə çıxarmaq üçün yalnız az miqdarda nuklein turşularına ehtiyac duyur.

Polimeraza zəncirvari reaksiya prosesi DNT fraqmentlərinin sayını artırmağa xidmət edir


PCR nə üçün istifadə olunur?

Gücləndirildikdən sonra PCR tərəfindən istehsal olunan DNT bir çox müxtəlif laboratoriya prosedurlarında istifadə edilə bilər. Məsələn, İnsan Genom Layihəsində (HGP) əksər xəritəçəkmə üsulları PCR-ə əsaslanırdı.

PCR həmçinin bir sıra laboratoriya və klinik üsullarda, o cümlədən DNT-nin barmaq izinin götürülməsi, bakteriya və ya virusların (xüsusilə QİÇS) aşkarlanması və genetik pozğunluqların diaqnostikasında dəyərlidir.

Gücləndirildikdən sonra PCR tərəfindən istehsal olunan DNT bir çox müxtəlif laboratoriya prosedurlarında istifadə edilə bilər. Məsələn, İnsan Genom Layihəsində (HGP) əksər xəritəçəkmə üsulları PCR-ə əsaslanırdı.

PCR həmçinin bir sıra laboratoriya və klinik üsullarda, o cümlədən DNT-nin barmaq izinin götürülməsi, bakteriya və ya virusların (xüsusilə QİÇS) aşkarlanması və genetik pozğunluqların diaqnostikasında dəyərlidir.


PCR məhsulunun təhlili

PCR məhsullarının vizuallaşdırılmasının iki əsas üsulu var: (1) gücləndirilmiş DNT məhsulunun dupleksin iki zolağı arasında interkalasiya edən etidium bromid kimi kimyəvi boya ilə boyanması və ya (2) PCR primerlərinin və ya nukleotidlərin flüoresan ilə etiketlənməsi. PCR gücləndirilməsindən əvvəl boyalar (fluoroforlar). Sonuncu üsul etiketlərin birbaşa PCR məhsuluna daxil edilməsinə imkan verir. PCR məhsulunun təhlili üçün ən çox istifadə edilən üsul DNT məhsullarını ölçüsü və yükü əsasında ayıran agaroz gel elektroforezinin istifadəsidir. Agaroz gel elektroforezi PCR məhsulunu vizuallaşdırmaq və təhlil etmək üçün ən asan üsuldur. Bu, PCR məhsulunun mövcudluğunu və ölçüsünü təyin etməyə imkan verir (Şəkil 2). Ölçüləri məlum olan DNT məhsullarının əvvəlcədən müəyyən edilmiş dəsti məhsulun ölçüsünü təyin etməyə kömək etmək üçün standart molekulyar markerlər kimi gel üzərində eyni vaxtda işlədilir.

Riedl və digərlərindən, 2004: Alternativ olaraq birləşdirilmiş siçan Langerin transkriptinin müəyyən edilməsi. (a) C57BL/6 təzə LC (fLC) və fetal dəridən əldə edilən dendritik hüceyrələrdən (FSDDC) əldə edilmiş tam uzunluqlu siçan Langerindən PCR məhsullarını göstərən etidium bromidlə boyanmış agaroz gel.

Tipik olaraq, müəyyən bir DNT məhsulunun varlığını və ya olmamasını aşkar etmək üçün PCR istifadə edildikdə, buna deyilir. keyfiyyətli PCR. Keyfiyyətli PCR, PCR klonlaşdırma məqsədləri və ya patogeni müəyyən etmək üçün həyata keçirildikdə istifadə etmək üçün yaxşı bir texnikadır. Məsələn, Dworkin və digərlərinin hesabatında immunokompetent şəxslərdə dəri skuamöz hüceyrəli karsinomada (SCC) Merkel hüceyrəli poliomavirusunun mövcudluğunu aşkar etmək üçün keyfiyyətli PCR istifadə edilmişdir (2009). Müstəntiqlər immunokompetent fərdlərdən və virus genlərinə xas primerlərdən çıxarılan SCC-lərdən təcrid olunmuş genomik DNT-dən istifadə edərək, PCR-məhsulunun mövcudluğu ilə sınaqdan keçirilmiş 16 nümunədən 6-da 351 baza cütü (bp) viral genin mövcudluğunu nümayiş etdirə bilmişlər. etidium bromid ilə 2% agaroz geldə göründüyü kimi təxminən 351 bp uzunluğunda zolaq (Şəkil 3). Təcrübə həmçinin müsbət nəzarət (P) və mənfi su nəzarəti (W) kimi plazmid ehtiva edən poliomavirusdan şablon DNT də daxil idi. (M) ilə işarələnmiş birinci zolaq aşkar edilmiş PCR məhsulunun ölçüsünü müəyyən etmək üçün istifadə edilən molekulyar markerdir. PCR ilə aşkar edilən viral spesifik genin olması (+) viral genin olmaması (−) ilə işarələnir.

Drowkin və digərlərindən, 2009: MCPyV aşkarlanması. (a) SCC-lərdə, genomik normal DNT-də və bitişik dəri DNT-də MCPyV-nin olması VP1 primerlərindən istifadə etməklə PCR ilə müəyyən edilmişdir. Nümunəvi nəticə 351 bp-də PCR məhsulunu göstərən sınaqdan keçirilmiş 16 nümunədən 6-sı ilə göstərilir. Bütün təcrübələrə müsbət nəzarət (P) və mənfi su nəzarəti (W) kimi MCPyV plazmidindən DNT daxil edilmişdir. M, molekulyar çəki markeri +, virus üçün müsbət −, virus üçün mənfi.


COVID-19 Virusunun Testinin Arxasındakı Elm

Mayo Clinic-in COVID-19-a səbəb olan virus üçün yeni testi son xəbərlərdə PCR testi kimi təsvir edilmişdir. Çoxları bunun nə demək olduğunu bilməsə də, PCR laboratoriya və tibbi testlərdə yaxşı istifadə olunan bir vasitədir. Larry Pease, Ph.D., Mayo Clinic immunoloq və Gordon H. və Violet Bartels Professor Hüceyrə Biologiyası və Kyle Rodino, Ph.D., klinik mikrobioloq, bu testin necə işlədiyini izah edir.

Başlamaq üçün, PCR polimeraza zəncirvari reaksiya kimi tanınan laboratoriya texnikasını ifadə edir. Bu testdə məqsəd DNT-nin xüsusi hissələrini müəyyən edərək, genetik materialın iz miqdarını seçici şəkildə gücləndirməkdir. Bir xatırlatma olaraq, DNT bədənin hər hüceyrəsində mövcud olan genetik koddur. Hüceyrə bölündükdə DNT-ni kopyalayır, iki ipi ayırır və sonra şablonu kopyalayaraq yeni DNT zəncirini yaradır. PCR normal olaraq hüceyrələrdə baş verənləri təqlid edir.

Mayo Clinic 12 mart 2020-ci ildə klinik nümunələrdə SARS-CoV-2 virusunu aşkarlaya bilən bir test hazırladığını elan edir. SARS-CoV-2 virusu COVID-19-a səbəb olur.

DNT istifadə olunur, çünki ən ayrı-seçkilik səviyyəsində DNT strukturu sizə hansı orqanizmə baxıldığını söyləyə bilər. İnsanlara gəldikdə, PCR bir insanı onun genetik imzasından istifadə edərək müəyyən edə bilər. COVID-19 vəziyyətində, tədqiqatçılar bu xəstəliyə səbəb olan virusun əsas xüsusiyyətlərini, SARS-CoV-2-ni müəyyən etmək üçün xəstələrdən toplanmış 100-dən çox genomu dərc etdilər.

PCR yalnız DNT üzərində işləyir və COVID-19 virusu öz genetik kodu kimi RNT-dən istifadə edir. RNT DNT-yə bənzəyir, lakin yalnız bir zəncirdən ibarətdir. Xoşbəxtlikdən, RNT-ni DNT-yə çevirən viral fermentlər onilliklər əvvəl kəşf edilmiş və RNT-də də unikal imzalar tapmaq üçün PCR ilə birlikdə istifadə edilmişdir. Bu halda, PCR əks transkripsiya PCR və ya RT-PCR kimi istinad edilir.

Əvvəlcə COVID-19 simptomları olan bir şəxs yerli tibb xidmətinə zəng edir və necə qiymətləndiriləcəyini soruşur. Unutmayın: Əvvəlcə zəng edin. Testdən keçməyin ən təhlükəsiz yolunu tapmaq üçün zəng etmədən klinikanıza və ya xəstəxanaya getməyin. Xəstə təhlükəsiz sınaq sahəsinə gəldikdən sonra sağlamlıq qrupu tərəfindən nümunə götürülür. Adətən bu, boğazın arxasından hüceyrələri toplamaq üçün insanın burnuna və ya ağzına dar bir tampon qoyulması deməkdir.

Doktor Rodino deyir: "Üst tənəffüs yolu nümunəsi, xüsusən də nazofarengeal tampon virusu etibarlı şəkildə aşkar etmək üçün toplanan ən ümumi nümunədir". "Bəlğəm kimi bəzi aşağı tənəffüs nümunələri də bəzi parametrlərdə məqbuldur."

Laboratoriyada nümunə işlənir, beləliklə RNT təcrid olunur və toplanır. Qalan hər şey silinir. RNT digər inqrediyentlərlə qarışdırılır: fermentlər (DNT polimeraza və tərs transkriptaza), DNT tikinti blokları, kofaktorlar, zondlar və SARS-CoV-2-ni tanıyan və bağlayan primerlər.

Daha sonra viral RNT DNT nüsxəsinə çevrilir və həmin tək nüsxə asanlıqla aşkarlana bilən PCR istifadə edərək milyonlarla nüsxəyə çevrilir.

Proses belədir: İstilik və fermentlərdən istifadə edərək çevrilmiş viral DNT zəncirləri zorla ayrılır. Viral DNT şablonunun tamamlayıcı zəncirinə uyğun gələn qısa DNT primerləri bir-birinə yapışaraq DNT sintezi üçün süni başlanğıc yeri kimi fəaliyyət göstərir.

DNT-nin kimyəvi tikinti blokları əlavə edilir və bir-birinə birləşdirilir, viral DNT şablonunun surətini yaratmaq üçün sintetik DNT primerini genişləndirir. Reaksiyada birinci astarın aşağı axınında əks istiqamətdə hazırlanmış ikinci primer də mövcuddur. Bu, ilk sintez edilmiş ipi tamamlayan bir nüsxə yaradır.

DNT sintezinin bir raundundan sonra reaksiya qarışığı iki zənciri əritmək üçün qızdırılır və növbəti mərhələdə daha da gücləndirilə bilən iki şablon əmələ gətirir. Nüsxələr adi yanaşmalardan istifadə etməklə öyrənilmək üçün milyonlarla və milyonlarla nüsxə yaradılsın ki, dəyirmi-dəyirmi, eksponensial şəkildə toplanır.

Reaksiya borusuna əlavə olunan fermentlər və kimyəvi maddələr nisbətən istiliyədavamlı olduğundan – “İstiliyə həssas fermentlər isti bulaqlardan gələn termal davamlı bakteriyalardan təcrid olunur” – Dr.Piz deyir – reaksiya avtomatlaşdırılmış şəkildə qızdırmaq, soyutmaq və DNT sintezi. Analizi tamamlamaq və nəticələri əldə etmək üçün yalnız saatlar lazımdır.

Nümunədə SARS-CoV-2 tamamlayıcı DNT varsa, primerlər hədəflənmiş bölgələri kopyalaya bilər. Bu bölgələri köçürdükcə, bu yeni fraqmentlərə yapışan zondlar bu prosesdə istifadə olunan alət tərəfindən oxuna bilən vizual siqnal buraxır.

"Milyonlarla nüsxə bu siqnalı gücləndirir ki, o, müsbət nəticə kimi asanlıqla aşkarlana bilsin. Əgər virus yoxdursa, zondlar yapışmır, heç bir siqnal buraxılmır və bu, mənfi nəticədir", - doktor Rodino izah edir.

Bu analiz növü tədqiqat və klinik laboratoriya testləri üçün istifadə olunur. PCR DNT və ya RNT-dən başlayaraq bütün növ bakteriya, parazit, virus və göbələkləri aşkar edə bilir. Prinsip və tərkib hissələri oxşar olsa da, hər istifadə müxtəlif orqanizmləri aşkar etmək üçün xüsusi primerlər və ya zondlar tələb edir. Buna görə də SARS-CoV-2 üçün bir şey sıfırdan hazırlanmalı idi. İnkişaf zamanı bu cür testlər, onların maraq doğuran orqanizmi (həssas) aşkar etməkdə çox yaxşı olduğuna və orqanizm olmadıqda (xüsusi) testin müsbət nəticə göstərməməsinə əmin olmaq üçün dəyişdirilir.

“PZR-də iştirak edən addımların əhəmiyyəti onilliklər ərzində bir sıra Nobel mükafatları tərəfindən tanınıb” dedi Dr.Pis. "Tibb elmi canlı sistemlərin molekulyar əsasları ilə bağlı əsas kəşflər nəticəsində inkişaf edir və bu, bu kəşflərin həyatımızda mühüm bir problemi həll etmək üçün bir araya gəlməsinin bir nümunəsidir."

Tədqiqat və klinik qrup kimi işləyən Mayo mütəxəssisləri bir neçə həftə ərzində SARS-CoV-2 üçün PCR testini həyata keçirə bildilər - adətən aylar və ya illər tələb edən işləri qırxmaq.


DNT Ardıcıllığının İdentifikasiyası Prinsipləri: 3 Prinsip

Bu məqalə DNT ardıcıllığının identifikasiyasının üç prinsipinə işıq salır. Üç prinsip bunlardır: (1) Nuklein turşusunun hibridləşdirilməsi (2) DNT zondları və (3) gen zondlarının DNT çipi-mikroarrası.

Prinsip № 1. Nuklein turşularının hibridləşməsi:

Nuklein turşularının (xüsusilə DNT) hibridləşməsi etibarlı DNT analizi üçün əsasdır. Hibridləşmə bir zəncirli DNT molekulunun digər DNT zəncirlərinin qarışığı arasında tamamlayıcı DNT zəncirini tanıması və xüsusi olaraq ona bağlanması prinsipinə əsaslanır. Bu, müəyyən bir açar və kilid əlaqəsi ilə müqayisə edilə bilər. Nuklein turşusunun hibridləşməsi üçün qəbul edilən ümumi prosedur aşağıdakı kimidir (şəkil 14.1).

Tək zəncirli hədəf DNT membran dəstəyinə bağlıdır. İndi DNT zondu (bir zəncirli və detektor maddə ilə etiketlənmiş) əlavə olunur. Müvafiq şəraitdə (temperatur, ion gücü) DNT zondu tamamlayıcı hədəf DNT ilə cütləşir.

Bağlanmamış DNT zondu çıxarılır. Hədəf DNT-dəki nukleotidlərin ardıcıllığı DNT zondunun məlum ardıcıllığından müəyyən edilə bilər. DNT hibridizasiyasının iki növü var - detektor kimi izotoplar və qeyri-izotoplarla etiketlənmiş DNT zondlarından istifadə edərək müvafiq olaraq radioaktiv və qeyri-radioaktiv.

Prinsip № 2. DNT Probları:

DNT zondu və ya gen zondu, biomolekulların qarışığında hədəf DNT-ni (tamamlayıcı əsas cütləşməsi ilə) tanıya və xüsusi olaraq bağlaya bilən sintetik, tək zəncirli DNT molekuludur. DNT zondları ya uzun (> 100 nukleotid) və ya qısa (< 50 nukleotid) olur və hədəf DNT-nin ümumi və ya kiçik bir hissəsinə bağlana bilər. İstifadə olunan DNT zondlarının ölçüsündə geniş dəyişiklik var (10 əsasdan 10.000 bazaya qədər dəyişə bilər). Ən vacib tələb onların hədəf DNT-lərlə spesifik və sabit bağlanmasıdır.

DNT zondlarını əldə etmək üçün istifadə olunan üsullar:

DNT zondlarının böyük əksəriyyəti laboratoriyada kimyəvi sintez edilir. Bununla belə, onları əldə etməyin bir çox başqa yolu var - genlərin seçilmiş bölgələrinin təcrid edilməsi, bütöv genlərin klonlanması, mRNT-lərdən istehsal.

Genlərin seçilmiş bölgələrinin təcrid edilməsi:

Bir orqanizmin DNT-si (məsələn, patogen) məhdudlaşdırıcı endonükleazlardan istifadə etməklə kəsilə bilər. Bu DNT fraqmentləri vektorlarda klonlanır və DNT zondları skrininqlə seçilə bilər.

mRNT-dən DNT zondlarının sintezi:

Müəyyən bir DNT ardıcıllığına xas olan mRNT molekulları (zülalı kodlayan) təcrid olunur. Əks transkriptaza fermentindən istifadə edərək tamamlayıcı DNT (cDNA) molekulları sintez edilir. Bu cDNA hədəf DNT-ni aşkar etmək üçün zond kimi istifadə edilə bilər.

DNT zondlarının fəaliyyət mexanizmi:

DNT zondlarının əsas prinsipi DNT-nin denaturasiyası və renaturasiyasına (hibridləşməsinə) əsaslanır. İki zəncirli DNT molekulu fiziki (temperatur > 95°C və ya pH <10,5) və ya kimyəvi (karbamid və ya formaldehidin əlavə edilməsi) dəyişikliklərə məruz qaldıqda, hidrogen bağları qırılır və tamamlayıcı zəncirlər ayrılır.

Bu proses denatürasiya adlanır. Müvafiq şəraitdə (yəni, temperatur, pH, duz konsentrasiyası) iki ayrılmış tək DNT zəncirləri orijinal ikiqat zəncirli DNT yaratmaq üçün yenidən birləşə bilər və bu fenomen renaturasiya və ya hibridləşmə adlanır.

Radioaktiv aşkarlama sistemi:

DNT zondu adətən radioaktiv izotopla (adətən fosfor-32) işarələnir. Hədəf DNT təmizlənir və denatürasiya edilir və DNT probu ilə qarışdırılır. İzotop etiketli DNT molekulları xüsusi olaraq hədəf DNT ilə hibridləşir (Şəkil 14.1).

Hibridləşməmiş zond DNT-si yuyulur. Hibridləşdirilmiş DNT-də radioaktivliyin olması avtoradioqrafiya ilə müəyyən edilə bilər. Bu, hər hansı bir bağlı (hibridləşdirilmiş) zond molekullarının və bununla da hədəf DNT-də tamamlayıcı DNT ardıcıllığının mövcudluğunu ortaya qoyur.

Qeyri-radioaktiv aşkarlama sistemi:

Radioaktiv etiketin istifadəsinin dezavantajı, izotopların qısa yarı ömrünə malik olması və xüsusi laboratoriya avadanlığı tələb olunmaqla yanaşı, idarəolunmasında risklərin olmasıdır. Beləliklə, radioaktiv olmayan aşkarlama sistemləri (məsələn, biotinilasiya) da hazırlanmışdır. Biotinlə işarələnmiş (biotinilə edilmiş) nukleotidlər DNT zonduna daxil edilir. Aşkarlama sistemi xromogen (rəng yaradan) və ya kimilüminesans (işıq yayan) substratların fermentativ çevrilməsinə əsaslanır.

Hədəf DNT-nin kemilüminessent aşkarlanması üçün adətən qəbul edilən prosedur Şəkil 14.2-də təsvir edilmişdir. Biotin etiketli DNT zondu hədəf DNT ilə hibridləşdirilir. Yumurta ağ proteini avidin və ya onun bakterial analoqu streptavidin biotinə bağlanmaq üçün əlavə edilir. İndi avidin və ya streptavidinlə birləşən qələvi fosfataza kimi biotin etiketli bir ferment əlavə olunur. Bu zülalların dörd ayrı biotin bağlayan yeri var.

Beləliklə, tək bir molekul (avidin və ya streptavidin) biotin etiketli DNT zonduna, eləcə də biotinlə işarələnmiş fermentə bağlana bilər. Kimilüminesans substrat əlavə edildikdə, qələvi fosfataz fermenti fəaliyyət göstərir və onu ölçülə bilən işıq yayan məhsula çevirir.

Biotin etiketli DNT otaq temperaturunda təxminən bir il kifayət qədər sabitdir. Kimilüminesansdan istifadə edən aşkarlama cihazlarına üstünlük verilir, çünki onlar radioizotop aşkarlanması qədər həssasdır və xromogen aşkarlama sistemlərinin istifadəsindən daha həssasdır.

DNT zondlarının istifadəsində PCR:

DNT zondları müxtəlif nümunələrdən - qan, sidik, nəcis, toxumalar, boğaz yuyulması, çox təmizlənmədən hədəf DNT-lərin müəyyən edilməsi üçün uğurla istifadə edilə bilər. DNT-nin miqdarı çox aşağı olarsa, hədəf ardıcıllığının aşkarlanması olduqca çətinləşir. Belə bir vəziyyətdə, polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) əvvəlcə hədəf DNT-nin kiçik miqdarlarını gücləndirmək üçün istifadə olunur və bir DNT zondla müəyyən edilir.

DNT zondları və siqnalın gücləndirilməsi:

Siqnalın gücləndirilməsi DNT zondlarından istifadə etməklə az miqdarda DNT-nin müəyyən edilməsi üçün PCR-ə alternativdir. PCR vəziyyətində hədəf DNT gücləndirilir, siqnal gücləndirilməsində isə gücləndirilən DNT zonduna bağlı hədəf DNT olur.

Siqnal gücləndirilməsinə nail olmaq üçün iki ümumi üsul var.

1. DNT hədəfi—DNT zond kompleksini digər DNT molekullarından ayırın və sonra onu gücləndirin.

2. İkinci zonddan istifadə etməklə DNT zondunu (hədəf DNT-yə bağlı) gücləndirin. DNT zondunu tamamlayan RNT ikinci prob kimi xidmət edə bilər. RNT-DNT-DNT kompleksi ayrıla və gücləndirilə bilər. RNT replikasiyasını kataliz edən O-beta replikaza fermenti adətən istifadə olunur.

Prinsip # 3. Gen Zondlarının DNT Çipi-Mikroarrası:

DNT çipi və ya Gen-çipi poçt markası ölçüsündə kiçik bir şüşə slaydda düzülmüş minlərlə DNT zondunu (4000,000 və ya daha çox) ehtiva edir. Bu yeni və qabaqcıl yanaşma ilə minlərlə hədəf DNT molekulu eyni vaxtda skan edilə bilər.

DNT Çipindən İstifadə Texnikası:

Naməlum DNT molekulları məhdudlaşdırıcı endonükleazlar tərəfindən fraqmentlərə kəsilir. Bu DNT fraqmentlərinə flüoresan markerlər yapışdırılır. Onlara DNT çipinin zondlarına reaksiya verməyə icazə verilir. Tamamlayıcı ardıcıllıqla hədəf DNT fraqmentləri DNT zondlarına bağlanır. Qalan DNT fraqmentləri yuyulur. Hədəf DNT parçaları bir lazer şüasından keçərək flüoresan emissiyaları ilə müəyyən edilə bilər. Bir kompüter floresan emissiya və DNT identifikasiyası nümunəsini qeyd etmək üçün istifadə olunur.

DNT çiplərindən istifadə texnikası çox sürətlidir, eyni zamanda bir neçə DNT fraqmentinin identifikasiyası üçün həssas və spesifik olmaqla yanaşı. Alimlər orqanizmin bütün genomu üçün Gen-çiplər hazırlamağa çalışırlar.

DNT Çipinin Tətbiqləri:

DNT ardıcıllığında mutasiyaların mövcudluğu rahat şəkildə müəyyən edilə bilər. Əslində, Gene-chip zond massivi p53 və BRCA I genlərində mutasiyaların aşkarlanması üçün uğurla istifadə edilmişdir. Bu genlərin hər ikisi xərçəngdə iştirak edir.


Protein-DNT qarşılıqlı təsirlərinin aşkarlanması üsulları

Xromatin immunoprecipitation (ChIP) metodu histon modifikasiyası (epigenetika) və ya transkripsiya faktoru-DNT-ni bağlayan qarşılıqlı təsirlər vasitəsilə transkripsiya tənzimlənməsinə nəzarət etmək üçün istifadə edilə bilər. ChIP analiz metodu, aşağı axının təmizlənməsi və aşkarlanması üçün qarşılıqlı əlaqəni sabitləşdirmək üçün hüceyrələri formaldehid və ya digər çarpaz əlaqə reagentləri ilə müalicə etməklə canlı hüceyrələrdə DNT-protein qarşılıqlı təsirlərini təhlil etməyə imkan verir. ChIP analizlərinin yerinə yetirilməsi təhlil ediləcək hədəf zülal və DNT ardıcıllığı haqqında bilik tələb edir, çünki tədqiqatçılar maraq doğuran zülala qarşı antikor və maraq doğuran DNT ardıcıllığı üçün PCR primerləri təmin etməlidirlər. Antikor zülal-DNT kompleksini digər genomik DNT fraqmentlərindən və protein-DNT komplekslərindən seçici olaraq çökdürmək üçün istifadə olunur. PCR primerləri hədəf DNT ardıcıllığının spesifik gücləndirilməsinə və aşkarlanmasına imkan verir. Kəmiyyət PCR (qPCR) texnikası hədəf DNT ardıcıllığının miqdarını kəmiyyətcə hesablamağa imkan verir. ChIP analizi massiv əsaslı formatlara (ChIP-on-chip) və ya immunoçökülmüş zülal (ChIP-seq) tərəfindən tutulan DNT-nin birbaşa ardıcıllığına uyğundur.

  • xüsusi protein-DNT-nin şəklini çəkin
    canlı hüceyrələrdə meydana gələn qarşılıqlı əlaqə
  • qPCR analizi ilə birləşdirildikdə kəmiyyət
  • müxtəlif zülallar üçün promotor profili yaratmaq bacarığı
  • tədqiqatçı ChIP dərəcəli antikorları əldə etməlidir
  • xüsusi astarların layihələndirilməsini tələb edir
  • yüksək məhsuldarlıqlı skrininq üçün uyğunlaşmaq çətindir

Uğurlu xromatin immunoprecipitation (ChIP) analizləri üçün addım-addım təlimat

ChIP prosedurunun bu yenilənmiş icmalına ilkin antikor seçimi (yəni, ChIP ilə təsdiqlənmiş antikorlar) haqqında əlavə təfərrüatlar daxildir. Tətbiq qeydi həmçinin epigenetikanı öyrənmək üçün bir üsul olaraq xromatin immunopresipitasının (ChIP) nümunələrini təsvir edir və təqdim edir, çünki bu, tədqiqatçılara spesifik zülal-DNT qarşılıqlı təsirlərinin şəklini çəkməyə imkan verir.

72 səhifəlik Zülal Qarşılıqlı Texniki Təlimatımız zülalla qarşılıqlı əlaqə tədqiqatları üçün nəticələri maksimuma çatdırmağa kömək etmək üçün protokollar, texniki və məhsul məlumatları təqdim edir. Bu kitabça immunoprecipitation və co-immunoprecipitation testləri, aşağı açılan təhlillər, uzaq-qərb blot və crosslinking üçün fon, faydalı göstərişlər və problemlərin aradan qaldırılması məsləhətləri təmin edir. Təlimatda həmçinin ChIP, EMSA və RNT EMSA daxil olmaqla, zülal-nuklein turşusu qarşılıqlı təsirlərini öyrənmək üsullarına dair genişləndirilmiş bölmə var. Təlimat zülalların qarşılıqlı təsirini öyrənən hər bir laboratoriya üçün vacib mənbədir.

Məzmuna daxildir: Zülal qarşılıqlı təsirlərinə giriş, Ko-immunopresipitasiya analizləri, Aşağı açılan analizlər, Uzaq-qərb blotlama, Zülal qarşılıqlı əlaqənin xəritəsi, Maya iki hibrid reportyor analizləri, Elektroforetik hərəkətliliyin dəyişməsi analizləri [EMSA], Xromatin immunopresipitasiya testləri (ChIP), -nuklein turşusu konjuqatları və s.

Daha ətraflı

Məhsulları seçin

DNT elektroforetik hərəkətliliyin dəyişməsi analizi (EMSA) məlum DNT oliqonukleotid zondlarına bağlanan zülalları öyrənmək üçün istifadə olunur və qarşılıqlı təsirin yaxınlıq və ya spesifiklik dərəcəsini qiymətləndirmək üçün istifadə edilə bilər. Texnika zülal-DNT komplekslərinin denaturasiya olunmayan poliakrilamid və ya agaroz gel elektroforezinə məruz qaldıqda sərbəst DNT molekullarından daha yavaş miqrasiya etdiyi müşahidəsinə əsaslanır. DNT miqrasiyasının sürəti zülalın bağlanması ilə dəyişdiyinə və ya yavaşladığına görə, analiz həmçinin gel sürüşməsi və ya gel gecikdirmə analizi adlanır. Bağlayıcı komponentlərə zülal spesifik antikorun əlavə edilməsi elektroforez zamanı daha da yavaş miqrasiya edən daha böyük kompleks (antikor-protein-DNT) yaradır. Bu "super shift" kimi tanınır və zülal şəxsiyyətlərini təsdiqləmək üçün istifadə edilə bilər. EMSA konsepsiyasına qədər, zülal-DNT qarşılıqlı əlaqəsi radioaktiv olaraq etiketlənmiş zondlardan istifadə edərək, ilk növbədə nitroselüloz filtrini bağlayan analizlərlə öyrənildi.

  • lizatlardan az miqdarda DNT bağlayan zülalları aşkar edin
  • eyni lizat ilə bir çox prob konfiqurasiyasından istifadə edərək, bağlanma yeri mutasiyalarını sınayın
  • DNT zondunun mutasiya analizi vasitəsilə bağlanma yaxınlığını test edin
  • qeyri-radioaktiv EMSA biotinləşdirilmiş və ya floresan etiketli DNT zondlarından istifadə etməklə mümkündür
  • zülal-DNT qarşılıqlı əlaqəsini in vitro təhlil edin
  • kəmiyyətini müəyyən etmək çətindir
  • Kompleksdə zülalın kimliyinə əmin olmaq üçün antikorla supershift analizi aparmaq lazımdır

Ənənəvi olaraq, DNT zondları Klenow fraqmentindən istifadə edərək 3' doldurma reaksiyası zamanı [γ-³²P]dNTP daxil etməklə və ya [γ-³²P]ATP və T4 polinükleotid kinazdan istifadə edərək 5' ucluq işarəsi ilə ³²P ilə radioaktiv işarələnmişdir. Elektroforezdən sonra, nəticələri sənədləşdirmək üçün gel rentgen filminə məruz qalır. Thermo Scientific LightShift Chemiluminescent EMSA Kit möhkəm və həssas performans təmin edən qeyri-radioaktiv analizdir. Kitə DNT bağlama reaksiyalarının qurulması və fərdiləşdirilməsi üçün reagentlər, dəst sistemini sınaqdan keçirmək üçün DNT və zülal ekstraktı nəzarət dəsti, biotinlə işarələnmiş DNT hədəfini yoxlamaq üçün stabilləşdirilmiş streptavidin-HRP konjugatı və müstəsna həssas kimilüminesans substrat modulu daxildir. aşkarlanması üçün.

Dörd müxtəlif DNT-zülal kompleksinin kemilüminesans EMSA. Biotin etiketli hədəf duplekslərin ölçüləri 21-25 bp arasında dəyişirdi. Oktyabr-1, AP1 və NF-κB transkripsiya faktorları HeLa nüvə ekstraktından əldə edilmişdir. EBNA-1 ekstraktı LightShift Chemiluminescent EMSA Kit-də nəzarət kimi verilir. Etiketlənməmiş xüsusi rəqib ardıcıllıqları (istifadə edildiyi yerlərdə) etiketlənmiş hədəfdən 200 qat molar artıqlıqda mövcud idi. Hər sistem üçün rentgen filminin məruz qalma müddəti EBNA, Okt-1 və AP1 üçün 2 dəqiqə və NF-κB üçün 5 dəqiqə arasında dəyişdi.


MİKROBİOLOGİYADA PRİNSİPLƏR VƏ TƏTBİQ YERLƏRİ

Conventional PCR has been used for over a decade in clinical microbiology laboratory research for the identification of microbial pathogens (114). However, for a number of reasons, this technique has been restricted to the detection of microorganisms that either have slow growth or cannot be cultivated. Most tests based on conventional PCR involve multiple steps and, therefore, require careful expertise. These assays often require both time and culture-based methods, thereby increasing the costs. Conventional PCR also involves an open-reaction system, which is more susceptible to contamination from foreign amplified DNA. Conventional PCR assays have been developed for Bacillus anthracis, the Anthrax agent (9) and Variola Major (26), but clinical validation of these assays is limited due to the unavailability of the human specimen. Real-time PCR has important, immediate implications to diagnostic tests in the clinical microbiology laboratory. The enhanced sensitivity, ease of use and quickness of this technology make it an attractive alternative for detecting microorganisms in humans (18).

Bacteriology

Anaerobic bacteria are involved in a broad range of infections that are commonly associated to considerable morbidity and mortality rates (98,116). Although different types of these bacteria are frequently found in diverse infections, evidence suggests that a number of these clinically important pathogens are as yet poorly characterized due to the inadequacy of conventional anaerobic bacteriological methods and phenotype tests. According to recent studies, 50 to 75 percent of anaerobic bacteria are satisfactorily characterized and 27 percent of laboratories indicated that they have never identified such bacteria (2). This occurs mainly because conventional identification is complicated, expensive and time-consuming. It is also not reliable, as it is based on antiquated taxonomy (97).

Molecular detection methods are a powerful means of identifying these pathogens in the study of the parasite-host relationship, clarifying the taxonomic positions of known pathogens. Thus, there is a growing trust in genotyping for microbial characterization. Genotypes are more specific and more easily quantified and standardized between different organisms than traditional phenotype markers. In the last ten years, a number of advances have been made in molecular bacterial diagnostics, including the greatest discovery: PCR technology (97,116). Real-time PCR has recently emerged and has been used in the detection and quantification of anaerobic bacteria. This provides users with the ability to amplify DNA as well as detect and confirm the specific sequences of microorganisms. Each cycle in real time also provides greater sensitivity.

PCR for the detection of Lactobacillus, Gadnerella vaginallisMycoplasmas hominis, genital tract bacteria was used (119). In another study, Aliyu və b. (1) reported the importance of Fusobacterium necrophorum as a cause of acute pharyngitis. There are a considerable number of studies using real-time PCR in the characterization of bacterial communities in the human intestine (6,40,58).

The diagnosis of infections due to specific bacteria has greatly benefited from molecular detection. Many of these bacteria are public health concerns, such as Micobacterium tuberculosis, Chlamydia Trachomatis, Neisseria gonorrheaeBordetella boğmaca. Tests based on molecular methods have the advantage of avoiding days or weeks of delay and allow early recognition and treatment. Commercial assays are available for M. tuberculosis, Micobacterium avium complex, C. trachomatisN. gonoreya (116).

Due to the increased sensitivity, the use of molecular detection methods for sexually transmitted bacteria has led to an increase in the proportion of cases confirmed in laboratory of the diseases such bacteria cause. Traditional sexual health exams require the use of a speculum in women and a urethral swab in men. These exams require special equipment and can cause both embarrassment and discomfort. Molecular detection is a noninvasive method, which increases trust and reduces discomfort. Molecular testing also encompasses a range of genital pathogens, such as C.Trachomatis, N. gonorrheae, etc. (100).


METHODOLOGICAL ASPECTS

The PCR assay in diagnosis involves several critical steps, such as DNA extraction from specimens, PCR amplification, and detection of amplicons. In particular, when specific clinical specimens, such as CSF, with only a few bacteria present are tested by PCR, each procedure must be carefully designed and performed.

CSF is widely utilized for diagnosis of diseases of the central nervous system (CNS). Because CSF has important functions, including cushioning the brain, maintaining a constant intracranial pressure, providing nutrients, and removing toxic metabolites from the CNS, an indirect assessment of brain status can be obtained from the CSF. Since CSF is considered germfree, detection of microbes in CSF, even in low numbers, provides valuable information about possible infection. However, it must be noted that detection of microbes in the CSF does not always indicate a CNS infection, since impairment of the blood-brain barrier may permit transit of microbes. Nevertheless, detection, identification, and quantitation of microorganisms in CSF is important in diagnosis of meningitis and other CNS infections. In particular, recent studies indicate possible involvement of microorganisms in specific diseases of the CNS, including Alzheimer's disease and MS (3, 30, 45, 56). Therefore, detection of even a few microorganisms in CSF by a standardized protocol is a critical matter for diagnosis of such diseases. The normal adult produces approximately 500 ml of CSF per day, with approximately 150 ml of CSF in the CNS at any given time (34). Thus, the available amount of CSF and numbers of samplings for diagnosis are limited. Therefore, performing PCR using a CSF specimen will become the first-line diagnostic test for CNS infections (11, 33), due to a sensitivity requiring only a limited amount of CSF, the specificity of the assay, and speed. In fact, a number of trials using PCR for detection of a broad range of bacteria in CSF specimens have been reported (37, 38, 42, 66). However, the sensitivity and specificity of PCR assay for detection of pathogens may not be better than those of culture assay, which has been standardized and validated for most pathogens, due to the dependability of PCR sensitivity on the assay process. Therefore, a negative PCR result can be used with moderate confidence to rule out a diagnosis of infection (33).

The stability of target bacterial DNA during CSF storage is an important practical matter in clinical laboratories. However, only limited information on the effects of various handling and storage conditions on the stability of bacterial DNA in CSF is available. Exposure of CSF to various environmental conditions, such as room temperature versus 4ଌ for up to 96 h and freeze-thawing up to three times, does not affect the ability of a highly sensitive PCR assay to detect bacterial DNA in CSF samples (60). That report, however, tested only limited environmental conditions. Therefore, proper storage and handling of CSF are still essential for detection of microbes after PCR amplification.

Contamination.

Since PCR is based on DNA amplification, false-positive or -negative outcomes may easily occur. In particular, a single PCR cycle results in very large numbers of amplifiable molecules that can potentially contaminate subsequent amplifications of the same target sequence (39). In fact, a primary source of false-positive reactions has been identified as carryover of amplified product from previous reactions (41). Carryover contamination of reagents, pipetting devices, laboratory surfaces, or even the skin of workers (35) can yield false-positive results. To control such carryover contamination, one must prevent physical transfer of DNA between amplified samples, and between positive and negative experimental controls. For this purpose, preparation of samples for PCR assay must be in a room or biosafety hood separate from that in which the reactions are performed. Using a pipette tip with an aerosol barrier is essential for avoiding cross contamination as well as carryover contamination. UV exposure is also able to destroy contaminating amplicons but is efficient only on surfaces and with amplicons greater than 300 bp size (19). Using uracil N-glycosylase (UNG) to cleave the dUTP incorporated in PCR products is considered a powerful protocol to prevent carryover amplicon contamination enzymatically (41), particularly in a clinical laboratory that is performing PCR extensively. This is performed by substituting dUTP for dTTP and adding UNG to the master mixture. To protect the dUTP-containing product, UNG must be inactivated chemically or by heat before the PCR product can be analyzed further. Therefore, the dUTP protocol requires only two changes in a standard PCR protocol: the substitution of dUTP for dTTP in all reactions and the incubation of all PCR mixtures with UNG prior to temperature cycling. In fact, this protocol has been applied successfully to detection of Toxoplasma gondii in CSF as well as other clinical specimens (46).

DNT çıxarılması.

Since clinical specimens have PCR inhibitors, such as hemin, which binds to Taq polymerase and inhibits its activity (10), DNA purification is important to avoid such effects. In fact, inhibitors are detected frequently in CSF specimens (14), and boiling of CSF is not sufficient for removal of inhibitors which affect the detection of microbes by PCR (9). The extraction yield of target DNA is also a critical factor in the PCR detection of bacteria in clinical specimens, particularly when only a few bacteria are expected to be in specimens. Since bacteria have a rigid cell wall, which may resist an ordinary digestion protocol for DNA extraction, the extraction protocol for bacterial DNA in clinical specimens should be an additional consideration for sample preparation.

The classical DNA extraction protocol is based on purification with organic solvents like phenol-chloroform, followed by precipitation with ethanol. The precipitates obtained from CSF containing only a few bacteria may contain too little material and may not be visible. Therefore, handling of these precipitates may require guesswork, particularly during the washing of the precipitates. Thus, it seems likely that the resulting yield of bacterial DNA from CSF with only a few bacteria may not be consistent. In this regard, a recent study developed a new protocol for purification of DNA by using solid-phase carriers, which selectively absorb nucleic acids (7). This protocol is based on the nature of nucleic acids, which can bind to silica or glass particles in the presence of chaotropic agents such as NaI or NaClO4 (44, 62, 65). A chaotropic extraction-glass fiber filter DNA purification (GFX Pharmacia Biotech, Milwaukee, Wis.) is such a protocol and utilizes a glass fiber matrix for DNA isolation. A DNA isolation kit based on the guanidinium isothiocyanate-silica bead method (7) is also commercially available (NucliSens isolation kit Organon Teknika, Durham, N.C.). The NucliSens isolation kit results in sufficient DNA yield and a highly reproducible PCR for β-globin on fixed cells (16). However, there is no report regarding application of such kits to the isolation of bacterial DNA from clinical specimens. Fahle and Fischer (22) examined the efficacy of viral DNA isolation from clinical specimens, including CSF, using six different commercial DNA extraction kits. It was concluded in the report that the NucliSens isolation kit and the Puregene DNA isolation kit (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, Minn.) were the most sensitive among the kits tested, including the Generation capture column kit (Gentra Systems), MasterPure DNA purification kit (Epicentre Technologies, Madison, Wis.), IsoQuick nucleic acid extraction kit (MicroProbe Corp., Bothell, Wash.), and QIAamp blood kit (Qiagen, Valencia, Calf.), for extracting cytomegalovirus DNA from clinical specimens, based on DNA recovery with the broad range of specimen types evaluated. Similar evaluations of DNA extractions with commercial kits were also performed by three other groups (13, 36, 61). From these studies, the QIAamp kit was found to be more suitable than other commercial and noncommercial methods evaluated for the extraction of DNA for PCR. Some commercially available extraction and purification kits based on a solid-phase purification protocol are listed in Table ​ Table1. 1 . These kits eliminate not only guesswork but also labor-intensive phenol-chloroform extraction steps. However, there is only limited information regarding bacterial DNA isolation from clinical specimens, particularly CSF, with these commercial kits.

TABLE 1.

Commercial DNA extraction kits based on the solid-phase purification protocol

KitVendorMetod
Generation capture column kitGentra SystemsNon-silica-based column
NucliSens isolation kitOrganon TeknikaSilica particles
QIAmp DNA Mini KitQiagenSilica-based membrane-column
UltraClean blood spin kitMoBio LaboratoriesSilica-based membrane
MagPrep blood genomic DNA kitNovagenMagnetic silica particles
SNAP whole blood DNA kitİnvitrogenSilica-based membrane-column
GFX genomic blood DNA purification kitAmershamGlass fiber matrix

Target genes.

The choice of target genes and the design of oligonucleotide primers are critical elements in determining the sensitivity of PCR (29, 53). Even when the same gene is selected as a target, PCR with different primer sets shows a 100- to 1,000-fold sensitivity difference between primer sets (29). Therefore, the sequence of primers is important in the sensitivity and specificity of PCR. The sensitivity of PCR is also dependent on the target gene selected, because copy numbers of genes or operons per bacterium vary. In this regard, if only the sensitivity of PCR is considered, reverse transcription-PCR is another selection method due to the multiple copy numbers of mRNAs per bacterium. However, the practical value of reverse transcription-PCR in diagnosis is limited due to the short life span and the vulnerability of bacterial mRNAs.

Sequence polymorphism of a target gene is another concern in regard to PCR specificity. Some bacterial genes, such as the C. trachomatis outer membrane protein gene, have hypervariable regions within the gene (23). Therefore, PCR products of different sizes as well as different sequences may occur between clinical isolates of the bacterium when such a gene is selected as a target for PCR.

A universal PCR that amplifies conserved regions in various bacteria is ideal to detect any pathogen in screening of clinical specimens (8, 40, 42, 49, 63). For this purpose, the conserved region of the 16S rRNA gene has been selected as a target gene for the universal PCR due to the fact that almost all common bacterial pathogens found in body fluids have been sequenced (27, 42, 49). Utilizing this universal PCR, a high detection sensitivity of PCR for 10 gram-negative and 250 gram-positive bacteria in CSF has been reported (42). However, since the universal PCR can detect almost all bacteria, including normal flora such as staphylococci on the skin, discrimination for contaminants is difficult, particularly when specimens contain few bacteria.

PCR protocols.

There are several PCR protocols to enhance sensitivity, especially when dealing with small numbers of bacteria as the target. Nested PCR is one of these protocols for detection of only a few bacteria in clinical specimens. The process utilizes two consecutive PCRs. The first PCR contains an external pair of primers, while the second contains either two nested primers that are internal to the first primer pair or one of the first primers and a single nested primer. The larger fragment produced by the first reaction is used as the template for the second PCR. The sensitivity and specificity of DNA amplification can be considerably improved by using such nested PCR, sometimes with 1,000 times more sensitivity than a standard PCR. However, in the case of detection of C. pneumoniae by nested PCR in a standard solution spiked with bacteria, sensitivity was not always improved compared with that of a standard single PCR. For example, nested and single PCRs with primers specific for the C. pneumoniae omp-1 gene showed the same sensitivity (0.005 inclusion or 2.5 elementary bodies per PCR) (2).

A frequently encountered problem in PCR amplification of target gene sequences is the appearance of spurious smaller bands in the product spectrum (17). This is usually interpreted to be due to mispriming by one or both of the oligonucleotide amplimers to the target template. Touchdown PCR is designed to avoid such problems and provides a clearly specific PCR band. The touchdown PCR utilizes a protocol with decreasing annealing temperatures at every cycle from above to below the expected annealing temperature (17). The application of this technique to detection of C. pneumoniae provided an improved analytical sensitivity (0.004 to 0.063 inclusion-forming unit per PCR) (43).

Detection of PCR products.

There are several different detection protocols reported for PCR products besides the traditional electrophoresis method on an ethidium bromide-containing agarose gel. Southern hybridization with a specific probe labeled with a radioisotope or nonradioisotope marker to PCR amplicons has been widely utilized for the study of PCR specificity. This detection protocol also provides a higher sensitivity than the ethidium bromide detection method but requires extra blotting and hybridization steps. The digoxigenin (DIG)-PCR-enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is one of the PCR amplicon detection methods utilizing a microtiter plate and is now commercially available (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Ind.). This method involves capture amplicons labeled with DIG by the probe immobilized onto the surface of a streptavidin-coated ELISA plate. The bound hybrid is detected with an anti-DIG-peroxidase conjugate and the colorimetric substrate. This ELISA system has been shown to be 10 to 100 times more sensitive than the traditional electrophoresis method (48). The PCR-immunoassay detection method utilizing a special small device (Clearview Immunoassay Detection Device Oxoid Inc., Ogdensburg, N.Y.), which holds a membrane and a sample application pad containing latex beads labeled with an anti-2,4-dinitrophenol antibody, is another type of detection method for amplicons designed to detect specific bacteria in clinical isolates (12, 59). The membrane utilized in this system is coated with lines of antibiotin antibody and anti-DIG antibody. Therefore, an evaluation of PCR results as positive or negative by utilizing this detection kit in clinical laboratories which do not have electrophoresis equipment is relatively easy. The application of this kit for detection of Neisseria meningitidis in CSF showed a detection limit of one to three organisms per PCR, which is 10 times more sensitive than detection of PCR products on traditional electrophoresis with agarose gels (54). Fluorescent probe-based assays with labeled primers or specific probes labeled with a fluorescent dye have been developed with the advantages of a closed system that avoids carryover contamination during the PCR and increased detection sensitivity for amplicons. There are two types of assays, using real-time and end point readings. Particularly the real-time PCR, which provides quick and accurate information regarding target genes, has been increasingly utilized. This approach has the advantage of quantitating the PCR in the exponential phase rather than using the end point accumulation of PCR product or trying to capture the PCR in the exponential phase, as was done previously in many quantitative PCRs (52). This non-gel-based technique has several other advantages over ordinary agarose gel-based techniques. For instance, this system allows a large increase in throughput. The fluorescent-probe assay is run in a 96-well format, and many of the steps in the assay are automated. The assay is a closed system in which the reaction tube is never opened after amplification. In addition, it uses an automated detection system that quantitates and calculates the degree of fluorescence over that for the control at each cycle and hence accurately defines the cycle number and linear range for a positive result (52). Even though presently there are few reports on detection and quantitation of bacteria in CSF by real-time PCR, this technique has excellent potential as a major protocol for PCR detection of bacteria in clinical specimens, including CSF, due to these advantages.


The polymerase chain reaction (PCR) is a biochemistry and molecular biology technique for isolating and exponentially amplifying a fragment of DNA, via enzymatic replication, without using a living organism. It enables the detection of specific strands of DNA by making millions of copies of a target genetic sequence. The target sequence is essentially photocopied at an exponential rate, and simple visualisation techniques can make the millions of copies easy to see.

The method works by pairing the targeted genetic sequence with custom designed complementary bits of DNA called primers. In the presence of the target sequence, the primers match with it and trigger a chain reaction. DNA replication enzymes use the primers as docking points and start doubling the target sequences. The process is repeated over and over again by sequential heating and cooling until doubling and redoubling has multiplied the target sequence several million-fold. The millions of identical fragments are then purified in a slab of gel, dyed, and can be seen with UV light. It is not prone to contamination. Irrespective of the variety of methods used for DNA analysis, only PCR in its different formats has been widely applied in GMO detection/analysis and generally accepted for regulatory compliance purposes. Detection methods based on DNA rely on the complementarity of two strands of DNA double helix that hybridize in a sequence-specific manner. The DNA of GMO consists of several elements that govern its functioning. The elements are promoter sequence, structural gene and stop sequence for the gene. [1]

Quantitative detection Edit

Quantitative PCR (Q-PCR) is used to measure the quantity of a PCR product (preferably real-time, QRT-PCR). [2] It is the method of choice to quantitatively measure amounts of transgene DNA in a food or feed sample. Q-PCR is commonly used to determine whether a DNA sequence is present in a sample and the number of its copies in the sample. The method with currently the highest level of accuracy is quantitative real-time PCR. QRT-PCR methods use fluorescent dyes, such as Sybr Green, or fluorophore-containing DNA probes, such as TaqMan, to measure the amount of amplified product in real time. If the targeted genetic sequence is unique to a certain GMO, a positive PCR test proves that the GMO is present in the sample.

Qualitative detection Edit

Whether or not a GMO is present in a sample can be tested by Q-PCR, but also by multiplex PCR. Multiplex PCR uses multiple, unique primer sets within a single PCR reaction to produce amplicons of varying sizes specific to different DNA sequences, i.e. different transgenes. By targeting multiple genes at once, additional information may be gained from a single test run that otherwise would require several times the reagents and more time to perform. Annealing temperatures for each of the primer sets must be optimized to work correctly within a single reaction, and amplicon sizes, i.e., their base pair length, should be different enough to form distinct bands when visualized by gel electrophoresis.

When producers, importers or authorities test a sample for the unintended presence of GMOs, they usually do not know which GMO to expect. While EU authorities prefer an event-specific approach to this problem, US authorities rely on construct-specific test schemes.

Event-specific detection Edit

An event-specific detection searches for the presence of a DNA sequence unique to a certain GMO, usually the junction between the transgene and the organism's original DNA. This approach is ideal to precisely identify a GMO, yet highly similar GMOs will pass completely unnoticed. Event-specific detection is PCR-based.

Construct-specific detection Edit

The construct-specific detection methods can either be DNA or protein based. DNA based detection looks for a part of the foreign DNA inserted in a GMO. For technical reasons, certain DNA sequences are shared by several GMOs. Protein-based methods detect the product of the transgene, for example the Bt toxin. Since different GMOs may produce the same protein, construct-specific detection can test a sample for several GMOs in one step, but is unable to tell precisely which of the similar GMOs are present. Especially in the USA, protein-based detection is used for the construct-specific approach.

Currently, it is highly unlikely that the presence of unexpected or even unknown GMOs will be detected, since either the DNA sequence of the transgene or its product, the protein, must be known for detection. In addition, even testing for known GMOs is time-consuming and costly, as current reliable detection methods can test for only one GMO at a time. Therefore, research programmes such as Co-Extra are developing improved and alternative testing methods, for example DNA microarrays.

Improving PCR based detection Edit

Improving PCR based detection of GMOs is a further goal of the European research programme Co-Extra. Research is now underway to develop multiplex PCR methods that can simultaneously detect many different transgenic lines. Another major challenge is the increasing prevalence of transgenic crops with stacked traits. This refers to transgenic cultivars derived from crosses between transgenic parent lines, combining the transgenic traits of both parents. One GM maize variety now awaiting a decision by the European Commission, MON863 x MON810 x NK603, has three stacked traits. It is resistant to an herbicide and to two different kinds of insect pests. Some combined testing methods could give results that would triple the actual GM content of a sample containing this GMO.

Detecting unknown GMOs Edit

Almost all transgenic plants contain a few common building blocks that make unknown GMOs easier to find. Even though detecting a novel gene in a GMO can be like finding a needle in a haystack, the fact that the needles are usually similar makes it much easier. To trigger gene expression, scientists couple the gene they want to add with what is known as a transcription promoter. The high-performing 35S promoter is a common feature to many GMOs. In addition, the stop signal for gene transcription in most GMOs is often the same: the NOS terminator. Researchers now compile a set of genetic sequences characteristic of GMOs. After genetic elements characteristic of GMOs are selected, methods and tools are developed for detecting them in test samples. Approaches being considered include microarrays and anchor PCR profiling.

Near infrared fluorescence (NIR) Edit

Near infrared fluorescence (NIR) detection is a method that can reveal what kinds of chemicals are present in a sample based on their physical properties. By hitting a sample with near infrared light, chemical bonds in the sample vibrate and re-release the light energy at a wavelength characteristic for a specific molecule or chemical bond. It is not yet known if the differences between GMOs and conventional plants are large enough to detect with NIR imaging. Although the technique would require advanced machinery and data processing tools, a non-chemical approach could have some advantages such as lower costs and enhanced speed and mobility.

European Union Edit

İsveçrə Redaktə

The Cantons of Switzerland perform tests to assess the presence of genetically modified organisms in foodstuffs. In 2008, 3% of the tested samples contained detectable amounts of GMOs. [3] In 2012, 12% of the samples analysed contained detectable amounts of GMOs (including 2.4% of GMOs forbidden in Switzerland). [3] Except one, all the samples tested contained less than 0.9% of GMOs which is the threshold that impose labelling indicating the presence of GMOs. [3]